（环境工程专业论文）小分子双水相气浮浮选光度法测定污水中痕量氯霉素.pdf

摘要 本论文对氯霉素的性质、作用与残留进行了综述，针对目前痕量抗生素检测存在的 普遍性问题，首次将小分子双水相体系与溶剂浮选结合起来，建立了一种简便快速、成 本低廉、无毒、无环境污染测定污水中痕量氯霉素的新方法，并对其原理进行了分析讨 论。 为了取得较好的氯霉素浮选效果，本文研究了低分子有机溶剂和无机盐成相能力的 大小、氯霉素在小分子双水相体系中的分配行为，尝试了遴选出的乙醇磷酸氢二钾双 水相体系萃取分离富集环境中的痕量氯霉素，优化了萃取条件。同时，针对小分子浮选 体系本身，讨论了无机盐的百分含量、有机溶剂的体积、p h 、气体流速、通气时间等 因素对氯霉素浮选效率和富集倍数的影响。 通过试验研究，建立了一种初步判断小分子有机溶剂和无机盐分相能力的新方法： xt a 判据法。通过ap 判据法得出无机盐和有机溶剂的分相能力大小分别为： ( n h 4 ) 。s 0 4 k 2 h p 0 。 k o h ，乙醇 丙酮 异丙醇。根据双水相浮选的原理和浮选装置的特点， 提出了浮选所需双水相体系的三个条件，结合氯霉素在小分子双水相体系中的分配行 为，最终选定乙醇磷酸氢二钾双水相体系作进一步的萃取和浮选尝试。结果表明，在 体系总体积1 0 m l 情况下，氯霉素的最佳萃取条件为：乙醇加入量为3 m l ，k 2 h p 0 4 3 h 2 0 加入量为5 9 ，p h 控制在1 0 3 0 左右( 即体系自身的p h ) 。此时，氯霉素的萃取效率高 达9 5 5 ，富集倍数达到2 7 ；在自制的5 0 m l 浮选池中，当磷酸氢二钾的质量分数为 4 5 ，乙醇的加入量为5 m l ，保持n 2 流速为2 5 m l m i n ，浮选5 0 m i n 后，氯霉素的富集 倍数为15 0 6 ，分离效率高达9 6 5 ，该方法线性范围为7 - 10 0 9 9 m l ，检出限为2 7 5 n g m l 。 将所建双水相萃取和浮选方法用于河水和鱼塘水样品的检测，结果均没有氯霉素检出， 体系加标回收率为8 9 4 4 1 0 1 2 ，相对标准偏差r s d 为1 1 2 2 ，结果重复性良好， 适用于污水中痕量氯霉素的分离富集及分析测定。 关键词：小分子双水相、溶剂浮选、氯霉素、检测 a b s t r a c t t h ep r o p e r t y , f u n c t i o na n dr e s i d u a lo fc h l o r a m p h e n i c o lw e r er e v i v e di nt h i sp a p e r t h e a d v a n t a g e sa n dd i s a d v a n t a g e so ft h ec u r r e n td o m e s t i ca n di n t e r n a t i o n a lm e t h o d sf o rt h e d e t e r m i n a t i o no ft h et r a c ec a pw e r es u m m a r i z e d a i m i m go nt h ec o m m o np r o b l e m so ft h e c u r r e n td e t e r m i n a t i o no ft h et r a c ea n t i b i o t i c ，t h i ss t u d y , w h i c hc o m b i n e ss m a l lm o l e c u l e a q u e o u st w o p h a s e 谢t 1 1s o l v e n tf l o t a t i o nf o rt h ef i r s tt i m e ，p r o p o s e dar a p i d ，s i m p l e ，l o wc o s t ， n o n - t o x i c ，p o l l u t i o n - f r e em e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no ft h et r a c ec a pi nw a s t e w a t e ra n d d i s c u s s e dt h em e c h a n i s mo ft h i sm e t h o d i no r d e rt og e tb e t t e re f f e c t ，t h i sp a p e rs t u d i e ds m a l lm o l e c u l eo r g a n i cs o l v e n ta n d i n o r g a n i cs a l t st h ea b i l i t i e sf o rp h a s es e p a r a t i o n ；t h ep a r t i t i o no fc a pi nt h es m a l lm o l e c u l e a q u e o u st w o p h a s e ；a n dt r i e st oa p p l ys e l e c t e dc 2 h s o h k 2 h p 0 4a q u e o u st w o - p h a s ef o r e x t r a c t i o n , s e p a r a t i o na n dc o n c e n t r a t i o no ft h e t r a c ec a pi ne n v i r o n m e n t ，o p t i m i z i n gt h e e x t r a c t i o nc o n d i t i o n s m e a n w h i l ea i m i n go nt h es m a l lm o l e c u l ef l o t a t i o n ，t h ef a c t o r so nt h e f l o t a t i o ne f f i c i e n c ya n de n r i c h m e n tc o e f f i c i e n ts u c ha st h ep e r c e n t a g eo fi n o r g a n i cs a l t s ，t h e v o l u m eo fo r g a n i cs o l v e n t ，s o l u t i o np h ，n i t r o g e nf l o wr a t e ，a e r a t i o nt i m ew e r ed i s c u s s e di n d e t a i l s t h r o u g he x p e r i m e n t a lr e s e a r c h ，an e wm e t h o dp r e l i m i n a r yt od e t e r m i n es m a l lm o l e c u l e o r g a n i cs o l v e n t sa n di n o r g a n i cs a l t st h ea b i l i t i e sf o rp h a s es e p a r a t i o n ：a pc r i t e r i o nm e t h o d ， w a se s t a b l i s h e d b a s e do na pc r i t e r i o nm e t h o d ，t h ea b i l i t i e so ft h ei n o r g a n i cs a l t sa n do r g a n i c s o l v e n t sf o r p h a s es e p a r a t i o n f o l l o w e dt h eo r d e ro f ( n h 4 ) 2 s 0 4 k 2 h p 0 4 k o h ，c h 3 c h 2 0 h c h 3 c o c h 3 c h 3 c h 2 c h 2 0 h a c c o r d i n gt o t h e m e c h a n i s mo fa q u e o u st w o - p h a s ef l o t a t i o na n dt h ec h a r a c t e r i z e so ft h ef l o t a t i o nd e v i c e s ，w e p r o p o s e df l o t a t i o nr e q u i r e dt h r e ea q u e o u st w o - p h a s es y s t e mc o n d i t i o n s ，c o m b i n e dw i t ht h e p a r t i t i o no fc a pi nt h es m a l lm o l e c u l ea q u e o u st w o - p h a s e ，c h 3 c h 2 0 h k 2 h p 0 4a q u e o u s t w o - p h a s es y s t e mw a sc h o s e ni nt h ef o l l o w i n ge x t r a c t i o na n df l o t a t i o ne x p e r i m e n t t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tw h e nt h et o t a lv o l u m ew a s10 m l ，t h eo p t i m a lt h ee x t r a c t i o nc o n d i t i o n so f c a pw e r e ：t h ev o l u m eo fc h 3 c h 2 0 hw a s3 m l ，t h em a s so fk 2 h p 0 4w a s 5 9 ，p hc o n t r o l l e da t a r o u n d10 3 u n d e rt h eo p t i o n a lc o n d i t i o n s ，t h ee x t r a c t i o ne f f i c i e n c yo fc a pw a su pt o9 5 5 ， t h ec o n c e n t r a t i o nc o e f f i c i e n tw a su pt o2 7 i n5 0 m lh o m e m a d ef l o t a t i o nc e l l ，w h e nt h em a s s i i c o n c e n t r a t i o no fk 2 h p 0 4w a s4 5 ，t h ev o l u m eo fc h 3 c h 2 0 hw a s5 m l ，t h en i t r o g e nf l o w r a t ew a s2 5 m l m i n , a n dt h ef l o t a t i o nt i m ew a s5 0m i n ，t h ec o n c e n t r a t i o nc o e f f i c i e n to fc a p w a su pt o15 0 6 ；t h es u b l a t i o ne f f i c i e n c yw a su pt o9 6 5 1 1 1 el i n e a rr a n g ew a s7 - 10 0 t g m l ； t h el i m i to fd e t e c t i o nw a s2 7 5 n g m 1 i th a sb e e na p p l i e dt ot h ed e t e c t i o no ff i v e rw a t e ra n d p o n d ss a m p l e s ，t h e s es a m p l e sc o n f i r m e da sh a v i n gn od e t e c t a b l ec 胜1 1 l e r e l a t i v er e c o v e r y w a s8 9 4 4 - - - 1 0 1 2 ，t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o nw a s1 1 ，2 2 t h er e p r o d u c i b i l i t yo f r e s u l tw a sg o o d t h u s ，t h em e t h o dc o u l da p p l yt os e p a r a t i o n , c o n c e n t r a t i o na n dd e t e r m i n a t i o n o f t r a c ec a pi nw a s t e w a t e r k e yw o r d s ：s m a l lm o l e c u l ea q u e o u s ；t w o - p h a s e ；s o l v e n ts u b l a t i o n ；c h l o r a m p h e n i c o l ； d e t e r m i n a t i o n i i i 长安大学硕士学位论文 第一章绪论 氯霉素( c h l o r a m p h e n i c o l ，c a p ) 是由委内瑞拉链丝菌产生的一种抗生素，属于广谱抗 生素，对动物的多种传染性疾病有很好的治疗效果。氯霉素对革兰氏阳性、阴性细菌在 内的多种病原菌有较强的抑制作用，特别是对伤寒杆菌、流感杆菌和百日咳杆菌有明显 的作用，对立克次氏体感染也有治疗效果，因此对各类家禽、家畜、水产品等的多种传 染病起到很好的治疗作用。另一方面，氯霉素因为其效高价廉的特性，被广泛应用于农 业生产。随着氯霉素的广泛应用，其毒性跟副作用逐渐显现：例如由氯霉素引起的人的 再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症，新生儿、早产儿灰色综合征等。低浓度的氯霉素 残留也能诱发致病菌产生耐药性。因此，国际组织以及许多国家和地区已经对氯霉素残 留问题高度重视【l 】。 关于氯霉素残留的检测方法很多，人们关注的焦点是各种方法的检出限问题。发达 国家对氯霉素残留的检出限要求逐渐严格：欧盟的标准从l o p g k g 减至l p g k g ，最终降 到0 1 i t g k g ：美国f d a 关于氯霉素残留检出限的规定从5 p , g k g 减至0 3 1 a g k g ，并且还 在研究更灵敏的检测方法，力图让检出限降到o 1 , g k g 【2 】。 国内外关于氯霉素残留量的检测方法，已经报道的主要有酶免疫法【3 巧】、放射免疫 法【昏7 1 、高效液相色谱法 8 - 1 0 】、气相色谱法【1 1 小1 和气质联用法【1 6 1 9 1 。这些方法的检出限约 为l l x g k g ，但是操作过程相对复杂，而且对样品的预处理也有很高的要求。因此，寻求 一种操作简便、成本低廉的氯霉素监测方法是今年来国内外环保及卫生领域研究的重要 课题。 双水相萃取分离利用的是物质在互不相容的两水相分配系数的差异。萃取条件温 和、操作简单、经济高效，并且未使用有毒有机溶剂，因此在生物分离、环境中痕量元 素的提取和测定方面应用前景广泛。 双水相浮选是综合了双水相萃取和溶剂浮选优点的一种全新的分离富集技术，解决 了双水相萃取分离存在的富集倍数低、易乳化和溶剂浮选存在的使用有毒有机溶剂从而 导致二次污染等问题，因此发展潜力更好、应用前景更广。 本研究采用小分子双水相浮选分光光度法进行氯霉素残留量检测，尽管其检测限无 法与上述方法相比较，但其操作简单、成本低廉、容易放大，并且通过检索目前还未发 现类似的实验研究，因此本文在污水中残留氯霉素的检测方面具有探索意义和较强的理 论优势。 第一章绪论 1 1 氯霉素 1 1 1 氯霉素的性质、作用与残留 氯霉素( c h l o r a m p h e n i c o l ，c a p ) 又称左旋霉素，化学名称为：d 一( 一) 苏式l - 对硝基 苯基2 二氯乙酞胺基1 ，3 丙二醇，分子量为3 2 3 1 3 ，其抗菌活性主要与丙二醇有关。 氯霉素呈白色或带黄绿色针状、长片状结晶或结晶性粉末，昧苦，熔点为1 4 9 1 5 1 ， 结构式如图1 1 所示【2 0 1 。氯霉素由委内瑞拉链丝菌( 5 v e n e z r u l a e ) 憨l ：_ ，属于广谱抗生素，。 通过抑制细菌的蛋白质合成，阻碍细菌的生长繁殖。主要是5 0 s 核糖体和m r n a 的结 合受阻，导致肽酰基转移酶受到抑制、肤基转移酶活力受阻，进而影响细菌的繁殖和生 长过程。氯霉素对革兰阳性、阴性细菌均有抑制作用，且对后者的作用较强，但对革兰 阳性球菌的作用不及青霉素和四环素。在体内，氯霉素的代谢主要通过肝脏中葡糖醛酸 转移酶的分解作用，失活后经尿液迅速被排出体外。 o hc l 图1 1 氯霉素的化学结构式 f i g 1 1 t h es t r u c t u r eo fc a p 氯霉素微溶于水( o 2 5 ) ，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、丙二醇等有机溶剂，水溶液 稳定，可在冷藏状态下保存几个月，煮沸5 小时对氯霉素也无影响【2 1 1 。在干燥状态下， 氯霉素的化学性质稳定，抗菌活性可以保持在五年以上。在p h ll 的环境下氯霉素失活。 国际组织、世界上许多国家和地区已经对氯霉素残留问题高度重视，欧盟、美国等 国家的法规中规定氯霉素残留限量的标准为“零容许量 ( z e r ot o l e r a n c e ) ，也就是不允 许检出。我国农业部将氯霉素从2 0 0 0 年版中国兽药典中删除，并且列为禁药，但 我国出口的动物源食品检验还是会出现氯霉素检测呈现阳性。饲料或饮水中的加药、不 规范或不合理的用药、动物产品加工过程中的污染、食物链的蓄积等是导致氯霉素残留 的主要来源【2 2 】。为响应农业部关于禁用兽药的要求，保障民众饮食安全，突破我国农产 品出口技术难题，高灵敏度氯霉素类药物残留检测方法亟待解决。 2 长安大学硕士学位论文 1 1 2 国内外关于氯霉素残留检测的研究现状 近年来，关于氯霉素残留的检测方法有很多，国际上公认的定量确认方法主要是气 相色谱法和高效液相色谱法( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，h p l c ) ，这两种方 法具有高灵敏度，很少出现假阳性，重复性好，但是对样品的前处理过程相对复杂，使 用仪器价格昂贵，并且分析速度慢。液相色谱法由于检出限高( 5 1 0 眺) 、回收率低， 不能满足欧盟、美国等对检出限要求严格的国家，已逐渐被淘汰。随着联用技术的出现， 液相色谱质谱联用( l c m s ) 因为其高灵敏度、低检出限、结果精确、可信度高，在氯霉 素残留的分析中正逐渐替代单一的色谱技术。 在氯霉素残留检测工作中，我国国家水产品质量监督检验中心采用酶联免疫法对样 品进行初筛，再使用装有e c d 的气相色谱和g c m s 联用技术进行确认和定量分析， 可以使检出限达到1 i - t g k g ，符合目前检测工作的要求。即将采用的l c - m s 联用技术， 可以将检出限降低到0 1 i t g k g ，与当前的国际先进水平一致。 1 1 2 1 国外研究现状 关于氯霉素类药物的检测的报道，比利时的d e g r o o d tj m ( 1 9 9 2 ) 通过h p l c 和碘斯 特光阵研究检测了氯霉素和硝基呋喃在鱼中的残留。用乙酸乙酯对氯霉素进行提取，再 用石油醚和n 戊烷纯化提取液，最后用h p l c 及光阵检测器( p h o t o d i o d ea r r a yd e t e c t o r ) 于2 8 0n l n 处检测。该方法的样品回收率达到6 9 8 8 ，检出限为2 1 t g k g 2 3 1 。 1 1 2 2 国内研究现状 叶赛等( 2 0 0 8 ) 应用高效液相色谱法测定海洋环境沉积物中的氯霉素残留。线性范围 为0 5 x 1 0 9 5 x 1 0 母，其相关系数为0 9 9 7 ，最低检出浓度为0 0 9 x 1 0 一，回收率在 8 5 1 9 5 8 之间，相对标准偏差小于3 6 。该方法快速、灵敏、定量范围宽，检测结 果准确可靠，应用性强1 2 4 。 王建华( 2 0 0 1 ) 用毛细管气相色谱法同时测定鱼肉中氯霉素和甲砜霉素残留量，用乙 酸乙酯提取样品中的待测物，干燥浓缩后再溶于水，加入正己烷，脱脂后将水层过 s e p c 1 8 小柱净化，用甲醇洗脱，再用b s t f a t m c s 衍生，在衍生过程中加入甲苯并 用水灭活，最后用装有6 3 n i 电子捕获检测器的气相色谱仪检测，添加水平为5 - 2 0 g k g 时使用该方法得到回收率在8 0 0 旷1 0 8 之间【2 5 1 。 潘莹宇，许茜等用高效液相色谱荧光检测法测定牛奶中氯霉素的残留量。采用十 八烷基键合硅胶固定相，以乙腈四氢呋喃0 0 2 m o l l 醋酸钠醋酸缓冲液( p h = 6 0 ) ( 体积 比为1 6 ：8 ：7 6 ) 为流动相，流速1 0 m l m i n ，柱温4 0 ，荧光检测激发波长为4 1 0 n m ，发 第一章绪论 射波长为5 0 8 n m 。在上述实验条件下，氯霉素检测的线性范围为0 4 - 8 0 0 1 x g k g ( r 2 = 0 9 9 9 9 ) ，检出限为0 2 p g l 。当空白样品中氯霉素添加水平为2 4 0 p g l 时，该方法的回 收率为6 6 6 9 2 8 ，相对标准偏差为4 5 9 4 。该方法适用于牛奶中氯霉素痕量 残留的监测，具有干扰小、选择性好、灵敏度高等优剧2 6 1 。 1 2 双水相萃取技术 b e i j e r i n c k 于1 8 9 6 年发现，将明胶和可溶性淀粉溶液或琼脂混合时，溶液浑浊，随 后分为上下两相，明胶处于上相，而淀粉或琼脂位于下相，这种现象称为聚合物的不相 溶性( i n c o m p a t i b i l i t y ) ，双水相体系( a q u e o u s t w o p h a s es y s t e m ，a t p s ) 的概念在这样的条 件下被提出。瑞典伦德大学a l b e r t s s o n 2 7 1 利用双水相形成的条件，于1 9 5 6 年研究出双 水相萃取法( a q u e o u st w o - p h a s ee x t r a c t i o n ) ，也叫双水相分配法。德国g b f 的k u l a 等 人【2 8 】于1 9 7 9 年将该技术应用于分离生物产品，开辟了蛋白质特别是胞内蛋白质分离和 纯化的新途径。 1 2 1 常用的双水相体系 大多高聚物都可以形成双水相体系，如非离子型高聚物聚乙二醇( p e g ) 、葡聚糖 ( d e x t r a n ，又称右旋糖酐) 、聚丙二醇、聚乙烯醇、甲氧基聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、 羟丙基葡聚糖、羧甲基纤维素钠和d e a e 葡聚糖盐酸盐。常用的双水相体系主要分五 类：非离子型高聚物非离子型高聚物水、聚电解质非离子型高聚物水、聚电解质聚 电解质水、高聚物无机盐水、亲水有机溶剂无机盐水。常用的几种双水相体系列于 表1 1 ，其中最常用的还是p e g d e x t r a n 和p e g 无机盐体系。作为双水相的原料，聚乙 二醇和葡萄糖成本较高，目前很少应用于工业化生产，因此，成本低廉的双水相体系已 经是双水相萃取分离技术今后需要努力的方向。其中，低分子有机物与无机盐所形成的 双水相体系是近几年出现的一种新型、高效、廉价的双水相体系。这种双水相体系的引 入，可以节约能耗、降低成本、简化操作流程、提高产品收率，为大规模工业的实现提 供了可能。 4 长安大学硕士学位论文 表1 1 常用的双水相体系 t a b l e l 1c o m m o n t yu s e da q u e o u st w o - p h a s es y s t e m 1 2 2 双水相体系成相原理【2 9 】 双高聚物双水相体系成相是由于高聚物分子的空间阻碍作用，双高聚物之间无法相 互渗透，无法形成均一相，从而有分离的倾向，当条件符合时即分成两相。通常认为， 只要两种聚合物水溶液的憎水程度存在差异，在混合后这两种聚合物即发生两相分离， 并且分离的倾向随着憎水程度差异的增大而增大。 高聚物和无机盐双水相体系的成相机理尚不十分清楚，但一般认为是高价无机盐的 盐析作用，使高聚物和无机盐富集于两相中。有机溶剂和无机盐双水相体系的形成与三 5 第一章绪论 元体系的离子、分子相互作用有关，而且与成相有机溶剂、无机盐种类及浓度、体系 p h 、温度等条件相关。常见的解释有水的离子化、无机盐的盐析效应以及无机盐与有 机溶剂夺取水分子等。这类体系的液液相分离现象的真正机理有待于进一步研究。 双水相形成的条件和定量关系可以用相图来表示，图1 2 是两种高聚物和水形成的 双水相体系的相图。图中以聚合物q 的质量分数( 叭) 为纵坐标，以聚合物p 的质量分 数( 训：) 为横坐标。图中把均相区和两相区分开的曲线，称为双节线。如果体系总组成 配比取在双节线下方的区域，两高聚物均溶于水中而不分相。如果体系总组成配比取在 双节线上方区域，体系就会形成两相。上相富集了高聚物q ，下相富集了高聚物p 。a 、 b 、c 称为节点，它们连成的直线成为系线。同一系线上的不同点，总组成不同，而上、 下两相组成相同，只是两相的体积不同。若a 向双节线移动，系线变短，b 、c 两点接 近，即两相组成差别减小，a 点在双节线k 点时，体系变成一相，k 点称为临界点。 图1 2 双水相体系相图 f i g 1 2d i a g r a mo fa q u e o u st w o - p h a s es y s t e m 1 2 3 双水相萃取技术的特点 作为一种新的分离技术，双水相萃取( a q u e o u st w o - p h a s ee x t r a c t i o n ，a t p e ) 在生物物 质、天然产物、抗生素等的提取、纯化过程中表现出如下优势： ( 1 ) 含水量较高，达到7 0 0 0 9 0 ，在近似生理环境的体系中进行萃取，不会导致生 物活性物质失活或变性； ( 2 ) 提取蛋白质、酶时，可以直接使用含有菌体的发酵液和培养液，还可以直接提 取细胞内酶，省略了破碎、过滤等过程； ( 3 ) 自然分相通常只需5 m i n - 1 5 m i n ，耗时较少； 6 零_a鲁量一&；io一of葺皇嚣c8尘ll 长安大学硕士学位论文 ( 4 ) 界面与试管壁之间形成的接触角可以认为是直角，界面张力很小，只有 l o 1 0 4 m n m ，有助于两相之间物质的传递； ( 5 ) 高聚物通常不挥发，对人体无害，不存在有机溶剂残留问题； ( 6 ) 大量杂质可与固体物质一同除去； ( 7 ) 工艺简单，易放大，可连续操作，可以直接与后续提纯工序相连接，不必做特 殊处理； ( 8 ) 操作在常温常压下即可进行，操作条件温和； ( 9 ) 亲和双水相萃取技术可以提高分配系数和萃取的选择性。 1 2 4 影响萃取分配的因素 ( 1 ) 组成双水相体系的高聚物类型 不同类型的高聚物其疏水性能不同，而物质疏水性的差异对被萃取物质与相的相互 作用是十分重要的。 ( 2 ) 高聚物的平均分子量和分子量分布 在高聚物的浓度保持不变的前提下，降低高聚物的分子量，被分配的可溶性生物大 分子或被分配的颗粒将更多的分配于该相。对于p e g d e x t r a n 体系而言，d e x 仃a n 的分 子量减小，分配系数会减小；p e g 的分子量减小，物质的分配系数会增大。这是一条 普遍规律，可用热力学理论进行解释。 ( 3 ) 高聚物的浓度 双水相体系的组成越接近临界点，可溶性生物大分子的分配系数越接近于1 。在 p e o d e x 咖体系中，成相高聚物浓度越高，两相体系距离临界点越远，分配系数越偏 离l 。对于细胞等颗粒，在临界点附近，细胞大多分配于一相中，而不吸附在界面上。 随着高聚物浓度的增加，细胞会越来越多地吸附在界面上。当高聚物浓度增加时，体系 组成偏离临界点，系线长度增加，界面张力也随之增大。一般分配系数与表面张力成指 数关系。 ( 4 ) 成相盐和非成相盐的种类和浓度 双水相的分配系数与盐的种类和浓度有关，主要体现在相见电位差和被萃取物质疏 水性的差异方面。当无机盐存在于双水相体系时，两相会产生不同的相间电位以保持各 自的电中性。如果盐的浓度很大，将会产生强烈的盐析作用，使被萃取物质的溶解度达 7 第一章绪论 到极限，表现为分配系数增大。在无机盐中，磷酸盐的作用非常特殊，它既可作为成相 盐来形成双水相体系，又可作为缓冲剂调节体系的p h 。 ( 5 ) 体系p h 的影响 体系p h 值对两相分配的影响来自两个方面：一方面，体系p h 的改变导致带电分 子的表面电荷数改变，从而改变分配系数；另一方面，体系p h 的改变通过对无机盐解 离度的影响，改变体系的相间电位以及带电分子的分配系数。 ( 6 ) 体系温度的影响 温度对物质分配的影响可用b r o n s t e d t 方程估算。其影响首先会改变相图，在临界 点附近尤为明显。其次温度会影响萃取目标物的生物活性。一般情况下，采用较高的操 作温度，体系黏度较低，有利于相分离。 1 2 5 双水相萃取技术的应用及进展 双水相萃取技术最早被用于生物分离方面【3 0 。1 1 ，f o m a n d e s 等人【3 2 】利用p e g 无机盐 水体系提取纯化重组角质酶；s h i b u s a w a 等人【3 3 】利用p e g 葡聚糖水体系从大肠杆菌细 胞裂解液中萃取组蛋白去乙酰化酶；v a i d y a 等人【3 4 】利用p e g 无机盐水体系提纯马铃薯 多酚氧化酶；j o h a n s s o n 等人【3 5 】利用p e g 聚丙烯酸钠水体系分离蛋白；f e n g 等人【3 6 1 利 用p e g 无机盐水体系选择性分离五种蛋白质；r o s a 等人吲用p e g i 磷酸盐水体系从我 国的仓鼠卵巢中提取纯化人类抗体，得到的蛋白质纯度达到5 5 ；c a o 等人3 跚利用p e g 硫酸铵水体系从罂粟壳中提取罂粟碱，并对其进行定量分析。 双水相萃取技术在中草药有效成分分离富集方面的应用在逐年增加。吴敏【3 9 禾l j 用 p e g6 0 0 0 k 2 h p 0 4 水体系从黄芩中分离富集黄芩苷和黄芩素，得到黄芩苷和黄芩素产 品；p a n 等人m 】利用e o i p i i v 磷酸盐7 , 醇水体系从栀子果实中提取栀子苷；c h e t h a n a 等人【4 1 1 利用双水相体系对甜菜红色素进行纯化和浓缩。 双水相萃取技术在金属离子的分离方面应用也很广。v i s s e r 等人【4 2 】在p e g 盐水体 系中，用萘酚和间苯二酚偶氮染料作配合剂，对f e ( i i i ) 、c o ( i i ) 、n i ( i i ) 、c d ( i i ) 、c s ( i ) 、 e u ( i i i ) 进行萃取分离；s h i b u k a w a 等人【4 3 】利用p e g 硫酸盐水体系，研究了在碘离子与 硫氰酸存在时对m n ( i i ) 、f e ( i i i ) 、c o ( i i ) 、n i ( i i ) 、c u ( i i ) 、z n ( i i ) 、c d ( i i ) 、l i ( i ) 的萃 取。 随着萃取技术研究的深入和完善，其在抗生素分离富集方面的报道也越来越多。关 怡新【删采用p e g 硫t b 酸铵体系直接处理发酵液提取青霉素，缩短传统工艺流程，仅用一 8 长安大学硕士学位论文 次双水相萃取和一次有机溶剂萃取便得到了纯度为8 8 4 8 的晶体，总收率达到7 6 5 6 ； y a n g 等人【4 5 】用p e g 3 3 5 0 k 2 h p 0 4 a t p s 处理青霉素g 发酵液，青霉素g 的分配系数可 达1 3 一1 4 5 ，收率达9 3 , - 一9 7 。 在双水相萃取技术进展方面，普通有机溶剂与水也能构成双水相体系，后续处理简 单，价格低廉。有学者对其进行了相关的研究：龙文清【铜利用丙酮和乙醇进行双水相萃 取、并对痕量维生素b 2 采用荧光法测定：李全民等人【4 7 】在硫酸铵存在下，利用碘化钾 乙醇体系对镉进行萃取分离研究。 另外，双水相萃取与其他方法结合也存在一定的发展前景，关于双水相萃取的理论 研究是该体系发展的另一个重要方面。 1 3 溶剂浮选技术 南非学者s e b b a l 4 8 1 于1 9 6 2 年首次提出溶剂浮选技术。它可以将分离与富集同时完 成，是一种新型的浮选分离技术，主要内容是将有机溶剂加在待浮选试液的表面，当某， 种惰性气体通过溶液时，利用溶液中存在表面活性差异的各组分在气液界面吸附能力 的不同而将其进行分离，分离后的组分在有机相得到富集，而后测定有机相中被捕集的 成分。溶剂浮选技术有振荡浮选和通气浮选两种，本研究中提到的溶剂浮选均指通气浮 选。 1 3 1 基本原理 溶剂浮选技术利用气泡的作用对水溶液中痕量物质进行分离富集。目前公认的关于 待测物质进入有机相的机理，有两种：吸附机理和粘附机理。吸附机理是指目标物存在 于水中远不如存在于界面中有利，其非极性端与水分子之间的作用力小于水分子之间的 作用力，所以目标物在气液界面会发生吸附现象，且会伴随气泡而上升，进入有机相。 粘附机理是指目标物对水的润湿性不强，表面与水分子的亲和力较弱，不能让水分子在 其表面稳定附着，从而不能形成牢固的水化膜。当有微粒碰撞到气泡时，水分子易被排 开，导致水化膜破裂，微粒附着在气泡上从而被浮选。可以用物质与水的接触角6 表示 其对水的润湿性，若8 9 0 0 ，则称之为疏水性物质，可随气泡上升而达到浮选目的；若 8 k o h ( n h 4 ) 2 s 0 4 。而根据v 判据，这些 盐的分相能力排序为：( n h 4 ) 2 s 0 4 k o h k 2 h p 0 4 。图2 1 显示，k o h 只有在高浓度下 才会形成双水相，其分相能力比( n h 4 ) 2 s 0 4 和k 2 h p 0 4 弱。因此，单独通过v 判断 k 2 h p 0 4 3 h 2 0 、( n h 4 ) 2 s 0 4 和k o h 的分相能力大小是不科学的，要根据实验要求和双 水相的用途，选择合适的盐。 从前文可知，形成双水相的过程实际也就是无机盐与有机溶剂争夺水分子发生盐析 作用的过程。当无机盐的分相能力较强时，上相中的水分就会较少，而有机溶剂的含量 则相对较多，这样上相的密度就会相应较小，越来越接近于有单纯机溶剂的密度。即上 相的密度越接近于有机溶剂的密度，则盐的分相能力越强。据此，本文提出另一种简单 判定盐分相能力大小的方法：p 判据( 密度差判据) 。即根据上相密度和有机溶剂密度 之差来判断盐的分相能力大小：p 越小，盐的分相能力越强。 在乙醇和水的体积保持不变时，双水相体系的密度差与无机盐加入量之间的关系见 图2 2 。从图中可以看出，若盐的加入量相同，双水相体系的密度差顺序为： k o h k 2 h p 0 4 ( n h 4 ) 2 s 0 4 。根据ap 判据可知，盐的分相能力排序为： ( n h 4 ) 2 s 0 4 k 2 h p 0 4 k o h ，这与盐的盐析能力顺序相一致。 01234s6789 m a s so fm l t ( a ) 图2 1 乙醇体系中不同无机盐加入量与a v 的关系 f i g 2 1r e l a t i o n s h i po fs a l ta n da v i ne t h a n o ls y s t e m 1 7 5 4 3 2 1 o luj一，l勾 第二章低分子有机溶剂无机盐双水相体系成相能力研究 o 0 8 o 012345678 9 m a s so fs a n ( o ) 图2 2乙醇体系中不同无机盐加入量与p 的关系 f i g 2 2r e l a t i o n s h i po fs a l ta n d pi ne t h a n o ls y s t e m 根据绪论部分双水相浮选原理及浮选装置的论述，本文首次提出最适合浮选的双水 相体系一般应具备的三个条件： ( 1 ) 所形成双水相不能有盐析现象。如果有大量盐析存在，会堵塞浮选池下方的玻 砂滤板，严重影响气泡产生和浮选池的使用寿命； ( 2 ) 所形成双水相体系要有广泛的成相范围，v 越大越好。从浮选的优点和成本角 度考虑，如果少量的有机溶剂加入就能形成体积相对较大的上相，就能既节省有机溶剂 的用量也能提高目标产物的富集倍数。 ( 3 ) 黏度太大的双水相体系不利于浮选，而上相密度过大会阻碍目标物随气泡顺利 进入有机相，故p 越小越好。 由以上条件结合图2 1 和图2 2 可知，k o h 、( n i - h ) 2 s 0 4 和k 2 h p 0 4 3 h 2 0 三种可以 分相的无机盐当中，( n h 4 ) 2 s 0 4 的p 最小，分相能力也最强，但是，少量的( n h 4 ) 2 s 0 4 就会使体系产生盐析，故并不适合双水相浮选。而k o h 的p 最大，分相能力最弱， 也不适合双水相浮选。因此，拥有广泛成相范围、v 最大、并且p 适中、具有较强 分相能力的k 2 h p 0 4 3 h 2 0 显然是双水相浮选的理想用盐。 2 3 2 不同种类的有机溶剂分相能力的差异 筛选出合适的无机盐以后，还需要考察不同种类的有机溶剂对该盐分相能力的大 小。由表1 1 可知，磷酸氢二钾既能与乙醇形成双水相体系，也能与丙酮和异丙醇形成 双水相体系。按照2 2 2 实验方法，固定有机溶剂( p 无水乙醇，2 0 。c = 0 7 8 9 3 9 m l ，p 异 丙醇，2 0 。c = 0 7 9 5 5 9 m 1 ) 的体积为4 m l ，分别加入不同量的k 2 h p 0 4 3 h 2 0 ，考查不同 1 8 长安大学硕士学位论文 有机溶剂的分相能力大小，结果见表2 3 。图2 3 和图2 4 显示了磷酸氢二钾用量对不同 种类的有机溶剂形成双水相时的影响关系。 表2 3 不同种类有机溶剂与磷酸氢二钾形成双水相 t a b l e 2 3 a q u e o u st w o - p h a s ef o r m e db yd i f f e r e n tt y p e so fo r g a n i cs o l v e n t sa n dk z h p 0 4 。3 h 2 0 从前文可知，双水相的形成过程本质上是无机盐与有机溶剂之间争夺水分子的过 程，判断盐分相能力大小的标准是，盐对水分子的争夺能力越强，其分相能力就越强。 按照密度差判据即为：p 越小，盐的分相能力越强。对有机溶剂而言，若一种有机溶 剂的分相能力较强，则它对水分子的争夺能力就较强。这样，形成双水相体系以后，上 相会有较多的水分子因而密度就会相应较大。因此，对于有机溶剂的分相能力大小的考 查，密度差判据应为：a p 越大，有机溶剂的分相能力越强。 从图2 3 可以看出，在k 2 h p 0 4 3 h 2 0 加入量相同时，a v 的顺序是：乙醇 丙酮 异丙醇，可见少量乙醇就能争取到较多的水分，从而形成较大的上相体积。从这个意义 1 9 第二章低分子有机溶剂无机盐双水相体系成相能力研究 上来说，可以判定，对于有机溶剂的分相能力：v 越大，有机溶剂分相能力越强。 同理，由图2 4 可以看出，在k 2 h p 0 4 3 h 2 0 加入量相同时，x p 的顺序为：乙醇 丙酮 异丙醇。由密度差判据可知，有机溶剂的分相能力顺序与p 的顺序保持一致，即： 乙醇 丙酮 异丙醇。有机溶剂的水化能力排序为：乙醇 丙酮 异丙醇，由此可见有机溶 剂的分相能力与其水化能顺序一致，当水化能较大时，有机溶剂与水之间的相互作用力 也较大。因此，有机溶剂的水化能越大，其分相能力越强。 23456 k h p o | 。3 h 2 0 ( g ) 图2 3 有机溶剂的a v 随k z h p 0 4 3 h 2 0 加入量的变化曲线 f i g 2 3r e l a t i o n s h i pb e t w e e na va n dm a s so fk 2 h p 0 4 3 h 2 0 0 1 6 0 1 4 ，、0 1 2 罢 西 q 0 1 0 司 0 0 8 o 23456 h p 0 4 3 h 2 0 ( g ) 图2 4 有机溶剂的a p 随k 2 h p 0 4 3 h 2 0 加入量的变化曲线 f i g 2 4r e l a t i o n s h i pb e t w e e na pa n dm a s so fk 2 h p 0 4 3 h 2 0 2 0 5 4 3 2 1 o 一毛一司 长安大学硕士学位论文 2 3 3 有机溶剂和无机盐的加入量对分相的影响 通过前两节的论