（环境工程专业论文）巢湖沉积物中土著微生物对mclr的降解及其群落结构变化.pdf

独创性声明 i i i ii ii ti llt i i iitl liii y 18 8 0 0 9 6 本人声明，所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得武汉理工大学或其它教育机构的学位或证书而使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示了谢意。 研究生( 签名) ：茎盈拯日期尘丝：笸 关于论文使用授权的说明 本人完全了解武汉理工大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授 权武汉理工大学可以将本学位论文的全部内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或其他复制手段保存或汇编本学位论文。同时授权经武汉理工大学认可的国家 有关机构或论文数据库使用或收录本学位论文，并向社会公众提供信息服务。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 研究生( 签名) ：盈蛆导师( 签名) ：_ 2 亟塑奎) 日期丝丝：笸 ，由于 转化规 除的主 要途径之一，目前已从不同环境中分离鉴定出多种m c 降解菌，并且对纯菌株对 于m c 的降解途径已有一定的认识，但是对于实际环境中不同介质对m c 的降 解能力、降解菌的分布以及对m c 降解过程对微生物群落结构的影响方面认识尚 浅。本文通过室内模拟实验，分别研究了好氧和厌氧状态下，沉积物中土著微生 物对于m c l r 的降解，以加深对实际环境中m c 降解及降解菌分布情况的认识； 并且研究了不同深度沉积物中微生物群落结构以及m c 降解前后微生物群落结 构的变化，以获得m c 降解过程对于微生物群落结构影响的信息。本研究内容和 结果如下： 1 ) 不同深度沉积物中土著微生物对m c l r 的降解能力 在好氧与厌氧条件下，不同深度的沉积物中m c l r 均可以发生快速降解， m c l r 经过4 _ 5d 的迟滞期后，在3d 内降解到检测限以下。巢湖表层水中m c l r 在1 5d 内仍未发生降解。 在好氧条件下，沉积物中m c l r 的降解速率随着沉积物深度的升高而逐渐 下降。在厌氧条件下，最上层沉积物和最下层沉积物中m c l r 降解速率最快， 中间层降解速率较慢。 重复添加m c l r 后，沉积物中微生物降解能力提高，在1d 内即可将5m g l m c l r 降解到检测限以下，并且降解过程没有迟滞期。 厌氧降解过程中检测到了一种降解产物的产生，该产物在m c l r 开始降解 时产生，在m c l r 降解完全后也会被降解至检测限以下，推断该产物为a d d a 。 2 ) 沉积物中微生物群落结构的垂直分布情况 通过d g g e 图谱分析发现，在靠近水柱的上层沉积物中，微生物群落结构 更复杂，生物多样性最大，并且随着沉积物深度的增加，d g g e 上的条带数逐渐 减少。这说明沉积物中微生物多样性随着深度增加逐渐降低。 3 ) m c l r 降解前后沉积物中微生物群落结构变化 好氧降解后d g g e 图谱中出现的条带数有所上升，出现了一些新的条带， 并且沉积物中细菌的优势种群发生了一定的变化。这说明m c l r 的加入及其降 解过程会对沉积物中微生物群落结构产生影响。 关键词：微囊藻毒素；沉积物；垂直分布：降解；微生物群落结构 武汉理工大学硕士学位论文 a b s t r a c t m i c r o c y s t i n ( m c s ) a r eag r o u po fc y c l i ch e p t a p e p t i d eh e p a t o t o x i n sm a i n l y p r o d u c e db yf r e s h w a t e rc y a n o b a c t e r i ab l o o m s m c sa r er e s p o n s i b l ef o rl i v e rf a i l u r ei n w i l da n i m a l sa n dh u m a n a sb i o d e g r a d a t i o ni so n eo ft h em a i na p p r o a c h e st o e l i m i n a t em i c r o c y s t i ni nt h ew a t e rb o d y , i ti sv e r yi m p o r t a n tt ou n d e r s t a n dt h e b i o d e g r a d a t i o np r o c e s so fm i c r o c y s t i ni nw a t e rb o d yi nt h i st h e s i s ，b i o d e g r a d a t i o no f m i c r o c y s t i ni ns e d i m e n t sc o l l e c t e df r o md i f f e r e n td e p t h su n d e ra e r o b i ca n da n a e r o b i c c o n d i t i o n sw a si n v e s t i g a t e dt h r o u g hl a b o r a t o r ys i m u l a t i o n 田h em i c r o b i a lc o m m u n i t y s t r u c t u r eo fs e d i m e n tw a sa n a l y s e db yp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n - d e n s i t yg r a d i e n tg e l e l e c t r o p h o r e s i s ( p c r - d g g e ) o f16s r d n a t h eg o a lo ft h i ss t u d yi st oo b t a i nt h e i n - d e p t hu n d e r s t a n d i n go f b i o d e g r a d a t i o no fm i c r o c y s t i na n dt h ee f f e c to fr n i c r o c y s t i n a d d i t i o no nt h em i c r o b i a lc o m m u n i t ys t r u c t u r eo fs e d i m e n t t h em a i nc o n c l u s i o n s o b m i n e da t l i s t e da sf o l l o w s ： ( 1 ) b i o d e g r a d a t i o no fm i c r o c y s t i n - l ri ns e d i m e n tc o l l e c t e df r o md i f f e r e n td e p t h s u n d e ra e r o b i ca n da n a e r o b i cc o n d i t i o n s m i c r o c y s t i n - l ri ns e d i m e tc o l l e c t e df r o md i f f e r e n td e p h t so ft h r e es a m p l i n g p o i n t s c o u l db er a p i d l yd e g r a d e du n d e rb o t ha e r o b i ca n da n e a r o b i cc o n d i t i o n s m i e r o c y s t i n - l rc o u l db ed e g r a d e dt ob e l o wd e t e c t i o nl i m i t ei n3d a y sa f t e ral a g p h a s ea b o u t4t o5d a y s t h eb i o d e g r a d a t i o nr a t eo fm i c r o c y s t i ni nl a k ew a t e rw a s m u c hl o w e rt h a nt h a ti ns e d i m e n ti n d i c a t i n gt h a tt h eb i o m a s so fm i c r o c y s t i n d e g r a d i n gb a c t e r i ai ns u r f a c el a k ew a t e r w a sm u c hl o w e rt h a nt h a ti ns e d i m e n t u n d e rt h ea e r o b i cc o n d i t i o n , t h eb i o d e g r a d a t i o nr a t ei ns e d i m e n td e c r e a s e dw i t h d e p t h u n d e rt h ea n a e r o b i cc o n d i t i o n , t h eh i h g e s tr a t e sw 0 1 0f o u n di ns u r f a c el a y e r a n dd e e p e s tl a y e r ab i o d e g r a d a t i o np r o d u c tw a sd e t e c t e dd u r i n gt h ea n e a r o b i c b i o d e g r a d a t i o np r o c e s sa n di td i s a p p e a r e da f t e rm i c r o c y s t i nc o m p l e t l yd e g r a d e d n e b i o d e g r a d a t i o np o t e n t i a lo fm i c r o o r g a n i s mi ns e d i m e n tw a se n h a n c e db yt h ea d d i t i o n o fm i c r o c y s t i n a f t e rt h ei n i t i a lb i o d e g r a d a t i o np r o c e s s ，e x t r aa d d e dm i c r o c y s t i no f5 m g l lc o u l db ec o m p l e t e l yd e g r a d e dw i t h i nld a yw i t h o u tal a gp h a s e ( 2 ) t h ed e p t h - r e l a t e dm i c r o b i a lc o m m u n i t ys t r u c t u r ei ns e d i m e n t a c c o r d i n gt oc l u s t e ra n a l y s i s ，t h ed g g e b a n d sd e c r e a s e dw i t hd e p t h , i n d i c a t i n g m a tt h eo v e r a l lc o m m u n i t ys 仰c 1 胍d i v e r s i t yw a sd e c r e a s e dw i t hd e p t h 武汉理工大学硕士学位论文 ( 3 ) c h a n g eo f m i c r o b i a lc o m m u n i t ys t r u c t u r eb e f o r ea n da f t e rt h eb i o d e g r a d a t i o no f m i c r o c y s t i n l r a f t e rt h ea e r o b i cb i o d e g r a d a t i o no fm c l r , t o t a lb a n d so fd g g ei n c r e a s e da n d s o m ea b u n d a n ts p e c i e sg e n e r a t e d ，s u g g e s t i n gt h a tt h em i c r o b i a lc o m m u n i t ys 们l 纰 h a sb e e na f f e c t e db yt h ea d d i t i o na n db i o d e g r a d a t i o np r o c e s so fm c l r k e y w o r d s ：m i c r o c y s t i n ；s e d i m e n t ；v e r t i c a ld i s t r i b u t i o n ；b i o d e g r a d a t i o n ；m i c r o b i a l c o m m u n i t ys 缸u c t i l r c i o i i 1 1 1 微囊藻毒素( m c s ) 简介1 1 2 微囊藻毒素在自然水体中的归趋2 1 3 微囊藻毒素生物降解3 1 4m c 降解菌。4 1 5m c 降解过程中微生物群落结构研究5 1 6 微生物群落结构研究方法p c r - d g g e 技术7 1 7 本课题研究意义及主要内容8 第2 章不同深度沉积物中微生物对m c l r 的降解能力l o 2 1 实验材料与方法10 2 1 1 实验材料l o 2 1 2 实验方法ll 2 2 不同深度沉积物中微生物m c l r 降解实验结果。1 3 2 2 1 不同深度沉积物中m c l r 降解1 3 2 2 2 重复添加m c l r 的降解19 2 2 3m c l r 降解中间产物2 0 2 3 小结2 2 第3 章沉积物中细菌群落结构研究2 3 3 1 实验材料与方法2 3 3 1 1 实验材料2 3 3 1 2 沉积物样品基因组d n a 提取2 6 3 1 3 基因组d n a 纯化2 7 3 1 4 细菌1 6s r d n a p c r 扩增2 8 3 1 5d g g e 实验2 9 3 1 6d g g e 电泳图谱分析3 0 3 2 实验结果31 武汉理工大学硕士学位论文 3 2 1 沉积物基因组d n a 的提取3 1 3 2 2 细菌基因组d n a 纯化结果3 2 3 2 3 细菌1 6s r d n a 扩增结果。3 3 3 2 4d g g e 实验结果3 6 3 2 5 巢湖沉积物中初始微生物群落结构分析。3 7 3 2 6m c l r 好氧降解后沉积物中微生物群落结构分析3 8 3 2 7m c l r 厌氧降解后沉积物中微生物群落结构分析。4 0 3 3 小结4 2 第4 章结论4 3 致谢5 2 硕士期间已发表的文章5 3 第1 章绪论 1 1 微囊藻毒素( m c s ) 简介 近年来，由于水体富营养化现象日益严重，蓝藻水华现象的发生越来越频繁。 蓝藻能够产生多种次级代谢产物，并且多种蓝藻的代谢产物是具有毒性的。蓝藻 毒素可分为四种：神经毒素、肝毒素、脂多糖和非专性毒素。其中淡水中最常见 的肝毒素是微囊藻毒素( m c s ) ，这一类物质是蓝藻水华中产量最大、毒性最强 的藻毒素【l 】。这些毒素是细胞内毒素，在蓝藻的整个生命周期中都会产生，并且 在蓝藻生长对数末期达到最大值。在水华爆发末期，蓝藻大面积死亡，细胞内的 毒素大量释放到水体中，甚至会使水体中的毒素浓度达到m g l 水平【z 】。 微囊藻毒素为环状七肽结构，相对分子质量约为1 0 0 0 。m c 的分子结构由七 种不同的氨基酸组成，一般结构为环( d a l a i x 2 d m c a s p 3 v a d d a - d - g l u 6 m d h a 7 ) 【5 】，其中，d - m c a s p 是d 赤1 3 甲基天冬氨酸；m d h a 是n 甲基脱氢丙 氨酸；a d d a 是m c 活性的必须基团，它对毒素的生物活性影响很大【3 1 ，它的结 构为( 2 s ，3 s ，8 s ，9 s ) 3 氨基9 甲氧基2 ，6 ，8 三甲基1 0 苯基_ 4 ，6 二烯酸；x 和y 是可变的l - 氨基酸；m c 结构中有七个氨基酸位置能够发生改变，其中变 异程度最大的是x 和y 以及d m e a s p 和m d h a 在3 和7 处的去甲基化作用。由 于x 、y 的不同以及m c a s p 和a d d a 的甲基化或去甲基化产生的差异，能够产生 不同的微囊藻毒素异构体【4 】。m c 的异构体命名就是按照分子结构中两个【广氨基 酸来命名的。x 通常为亮氨酸( l ) ，精氨酸( r ) ，或者酪氨酸( y ) ，而y 通常 是精氨酸( r ) ，丙氨酸( a ) ，或者甲硫氨酸( m ) 。比如m c l r 就是在这些位 置有一个亮氨酸和一个精氨酸。 迄今为止，已发现并鉴定出8 0 多种m c s 不同的异构体。目前已知存在最普 遍、含量相对较大，毒性较大的主要是m c l r ，m c r r ，m c - y r 等【i 儿。m c s 分子结构如图1 1 所示。 武汉理工大学硕士学位论文 泐n q 蛔 xy 峨轴蝴 粕榭舯岫_ 蝴 c 4 m 蛔c l l i 硝抽h 蝴铆倒一- 脚 n h i ( 4 ) l - a r e y 图1 - 1 微囊藻毒素化学结构 f i g 1 - 1s t r u c t u r eo f r a i c r o c y s t i m x 微囊藻毒素的环状结构特征导致其物理化学性质稳定，具有耐热性，耐p h 变化，不挥发。有报道显示微囊藻毒素在水中煮沸几个小时候仍然能够保持活性， 并且在室温下其干粉能够稳定贮藏几年的时间【5 1 。m c s 结构中的氨基酸同时具有 极性和非极性的基团，由于这一性质，m c s 能够溶于水，并且容易进入动物的 脂肪层和细菌的细胞i 中1 4 。 m c s 能够特异性的抑制蛋白磷酸酶p p i a 和p p 2 a 的活性【6 】。蛋白磷酸酶是 催化磷蛋白质中苏氨酸和丝氨酸残基去磷酸作用的酶，并且能够调节动物细胞内 的生物过程，包括碳水化合物代谢，肌肉收缩和细胞分裂等。这些酶被抑制会造 成多种后果，如蛋白过度磷酸化，肝细胞形态改变和促进肿瘤的发生。 饮用水中m c s 慢性暴露的促肿瘤作用以及由于毒素导致的动物和人类死亡 事件引起了世界卫生组织的注意，目前w h o 推荐饮用水中微囊藻毒素浓度标准 为1p 班。 1 2 微囊藻毒素在自然水体中的归趋 微囊藻毒素是一种细胞内毒素，当藻细胞死亡或破裂时，就会释放到水体 中。自然水体中藻类大面积死亡后，细胞内的微囊藻毒素会大量释放到水体中， 而已报道的自然水体中浓度一般都维持在低浓度水平。自然水体中微囊藻毒素浓 度降低有多种途径，包括光降解、微生物降解、颗粒物吸附、水量稀释、生物积 累等。 自然水体中，在无光条件下，微囊藻毒素可稳定存在数月甚至几年闸。而 2 武汉理工大学硕士学位论文 在光照充足时，m c 可发生缓慢的光化学降解或异构化f 2 锕。m c 在自然水体中的 光降解过程受到水溶性细胞色素、腐殖质等光敏性物质的影响。t s u j l 2 1 】等研究发 现，在野外试验中，当水体中蓝藻色素浓度为5 m g m l 时，m c l r 的光降解半 衰期为5 d ，而在只含有m c 的水中，m c 不易被光降解。此外还发现m c l r 的 光降解速率与波长、强度有关，在m c 最大吸收波长附近的光照射下，m c 很容 易发生光降解。当光照强度为1 4 7g w c m 2u v 时，m c l r 的半衰期为1 0m i n ； 而光照强度为2 5 5 0j t w c m 2u v 时，m c 在1 0 m i n 内被完全降解。w 出一2 2 】等研 究发现水体中的腐殖质能够促进m c s 的光降解。在腐殖质存在的条件下，m c s 在日光照射下能够被快速降解，而当水体中存在腐殖质，不采用光照时，没有检 测到m c s 的降解；在超纯水中加入m c s ，并且使用光照的条件下，只检测到 m c s 的少量降解。 m c 在水中的溶解度大于lg l ，并且不易被沉淀或吸附到颗粒物或沉淀物 上。m c s 被释放到水体中后，主要存在于水柱中。张维昊【2 6 】等的研究表明滇池 沉积物对于m c 的吸附量小于1 0 。而t o r u f i s k a 2 7 】等研究发现灭菌的沉积物对 n o d 的吸附量为其初始浓度的2 3 54 - 4 8 ，而去除了有机物质的沉积物对n o d 的吸附量为6 8 54 - 2 6 。并且，该研究结果显示沉积物中m c 的吸附量受沉积 物理化性质、毒素浓度、p h 值和盐度的影响。 微囊藻毒素进入水体后，能够在水生生物体内积累和代谢，这也是m c 重要 的环境归趋之一。m c 可通过水生动物摄食蓝藻、生物呼吸( 如腮) 、皮肤吸收、 生物富集作用【1 l 进入水生动物体内，再通过血液或体液循环分散到动物体内各个 部位被动物体内的各种器官和组织吸收富集，并对其健康造成威胁。不同的无脊 椎动物( 蚌、虾、螺) 均能在体内累积m c ，其肝胰腺中累积的m c 与整体的 m c 之比为4 0 5 5 4 【”。1 0 1 1 。除了水生动物外，水生植物也可以对m c 进行积 累和代谢，这也是m c 在水生环境中的降解途径之一。 t o r u f i s k a e 2 7 】等的研究结果显示，未灭菌的沉积物中比灭菌沉积物中m c 浓度 下降速度快很多，这说明生物降解作用在自然水体中m c 的去除过程中发挥了很 大的作用。 1 3 微囊藻毒素生物降解 由于发生水华的水体表面被藻类覆盖，光线很难投射进入水体【4 】，光降解难 以有效的去除m c s ，而沉积物对m c s 的吸附通常 2 3 k b 的d n a 分子，并 且其电泳结果清晰明亮，d n a 降解程度轻，能够更好的反映沉积物中细菌遗传 多样性，适用于后续的实验研究。而方法一提取出的d n a 片段电泳条带模糊， 降解情况较为严重，难以代表沉积物中微生物种群。此外，方法二采用s d s 裂 解法对沉积物进行了三次提取过程，有效保证了细胞的裂解率，并且实验过程中 溶菌酶的加入也能够保证革兰氏阳性菌的裂解效率，因此，后续的实验都利用方 法二提取沉积物中基因组d n a 。 图3 - 2 方法二提取方法一提取沉积物中基因组d n a ( l a a e l 、2 、3 、4 、5 分别为二号采样点0 - s c r a 、5 1 0 c m 、1 0 - 1 5 c m 、1 5 - 2 0 c m 、 2 0 2 5 c m 层沉积物提取d n a ，m 为入- h i n dl i im a r k e r ) f i g 3 2a g r o s eg c le l e c t r o p h o r e s i so f t o t a ld n ae x t r a c t c db ym e 也o dt w o 3 2 2 细菌基因组d n a 纯化结果 利用p c r 反应检测细菌基因组d n a 纯化结果。p c r 反应结果见表3 4 。 3 2 武汉理工大学硕士学位论文 表3 4 纯化d n a1 6s r d n ap c r 检测结果( + 代表阳性结果，代表阴性结果) t a b l e 3 4e f f e c t so f v a r i o u sp u r i f i c a t i o np r o t o c o l so nd e t e c t i o no f1 6s r d n a 稀释倍数 l o o1 02 03 04 05 06 07 08 0 粗提d n a 胶回收试剂盒纯化d n a 低熔点琼脂糖纯化d n a 一 + 实验发现利用胶回收试剂盒纯化的沉积物d n a 稀释后可扩增出p c r 目标产 物，而低熔点琼脂糖回收d n a 样品经1 0 0 、1 0 1 、2 0 、3 0 、4 0 、5 0 、6 0 、7 0 、8 0 、 9 0 倍稀释后均无法扩增出目标产物，这可能是由于低熔点琼脂糖回收过程中操 作步骤较多，样品震荡、吸取过程都可能造成d n a 片段的断裂，从而导致后续 实验无法进行。后续实验均采用胶回收试剂盒对沉积物基因组d n a 粗提液进行 纯化。 此外，在实验过程中发现，将粗提d n a 作为模板使用时，p c r 反应均无目 标产物出现；而经凝胶回收试剂盒纯化的d n a 作为模板使用时，也需要进行一 定倍数的稀释才能获得较好的结果( 如图3 5 所示) ，而粗提d n a 经过稀释后均 不能扩增出目标产物。这说明纯化过程能够去除沉积物d n a 中一定量的抑制 p c r 反应的杂质，如腐植酸、腐殖质、金属离子等，但是仍然残留了部分抑制 t a x i 酶活性的物质。因此，应当在提取、纯化过程中尽量提高d n a 的浓度，将 纯化后的d n a 稀释后作为模板加入p c r 反应体系，以获得代表性较强的p c r 产物。 3 2 3 细菌16s r d n a 扩增结果 3 2 3 1 普通p c r 反应结果 不同的p c r 反应条件会导致扩增出的d n a 片段的差异。由于d g g e 实验 中使用了g c 发夹技术，由于引物中g c 含量较高，因此需要采用较高的退火温 度，而这样又会导致扩增拷贝数降低。因此需要对p c r 反应条件进行优化，以 获得最富有代表性的p c r 扩增片段。图3 3 是普通p c r 反应程序扩增细菌1 6 s r d n a 的结果，由图中可看出，对于含有g c 发卡的引物，普通的p c r 反应程 序扩增结果并不理想。本实验p c r 目标产物条带大小为2 5 0b p ，而这种反应程 序扩增结果有多条非特异性扩增条带。 武汉理工大学硕士学位论文 图3 3 普通p c r 反应条件扩增细菌1 6s r d n a v 3 区结果 f i g 3 3a g r o s eg e le l c c t r o p h o r c s i so f t a r g e tp r o d u c tb y n o r m a lp c rp r o t o c o l 3 2 3 2 降落式p c r 反应结果 图3 - 4 是降落式p c r 扩增细菌1 6s r d n a v 3 区的结果，由图中可看出，虽 然采用本方法能够扩增出清晰的目标条带，但是仍然存在明显的引物二聚体。应 当进一步优化p c r 反应条件，以减少引物二聚体的量，增加p c r 目标产物的量。 图3 _ 4t o u c h d o w np c r 扩增1 6s r d n a v 3 区结果( l a n e l 1 0 分别为d n a 粗提液 分别稀释1 0 0 、1 0 、2 0 、3 0 、4 0 、5 0 、6 0 、7 0 、8 0 、9 0 倍后p c r 结果，l a n e l1 1 2 为阴性对照结果，l a n e l 3 为阳性对照结果，m 为1k bm a r k e r ) f i g 3 - 3a g r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i so ft a r g e tp r o d u c tb yt o u c h d o w np c rp r o t o c o l 武汉理工大学硕士学位论文 3 2 3 3 巢式p c r 反应结果 图3 5 是利用纯化后的沉积物总d n a 进行1 6s r d n a 全长扩增的反应结果。 由图中可看出，反应目标条带片段清晰，片段大小为1 5 0 0b p 左右，没有出现非 特异性扩增，能够进行下一步的凝胶回收。 图3 - 51 6s r d n a 全长扩增反应结果 f i g 3 5a g r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i so f t a r g c tp r o d u c tb y n e s tp c r p r o t o c o l 将沉积物细菌1 6s r d n a 全长d n a 片段经琼脂糖凝胶回收后，取l 皿纯化 d n a 溶液作为模板进行第二轮p c r 扩增。第二轮扩增引物采用3 4 1f g c 和5 3 4 r ，利用降落式p c r 反应程序对细菌1 6s r d n av 3 区进行扩增。扩增结果如图 3 - 6 所示。 图3 6 巢式p c r 扩增细菌1 6s r d n a v 3 区( l a n e l 为1k bm a r k e r ，2 、3 、 4 、5 、6 、7 、8 分别为o 5c m 、0 - 5t i n 、5 1 0c i i l 、5 1 0c m 层沉积物p c r 结果、 9 为2 0 - 2 5 c m 层沉积物提取d n a p c r 结果) f i g 3 6a g r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i so ft a r g e tp r o d u c tb yn e s tp c rp r o t o c o l 3 5 武汉理工大学硕士学位论文 由图可见，与直接以纯化后的沉积物细菌基因组d n a 作为模板扩增v 3 区 的结果相比，巢式p c r 扩增结果中引物二聚体的量明显减少，扩增过程特异性 更高，并且v 3 区扩增目标产物条带清晰明亮，产物产量较前两种方法明显提高。 巢式p c r 结合降落式p c r 反应条件扩增过程特异性更高，目标产物产量高， 后续的实验中均采用此p c r 反应条件。 后续实验均采用巢式p c r 技术和t o u c h d o w n 反应程序对沉积物细菌1 6 s r d n av 3 区片段进行扩增。 3 2 4d g g e 实验结果 3 2 4 1 垂直d g g e 实验结果 为了使沉积物中不同的d n a 片段能够获得最好的分离效果，本研究利用垂 直变性梯度实验来选择沉积物d n av 3 区的变性剂浓度梯度。垂直d g g e 指的 是电泳方向与变性剂梯度线性增加方向垂直。垂直d g g e 点样孔是宽度占胶板 整个宽度的单一大孔。对于低浓度变性胶的部分，由于未发生变性作用，d n a 能够保持其双链结构，在凝胶中迁移较远；而对于高浓度变性胶的部分，由于 d n a 双链打开形成单链结构，在凝胶中迁移速率慢，因此迁移距离较短；中等 变性剂浓度导致d n a 片段不同的接连程度，因此会停留在凝胶中的不同位置。 电泳后对凝胶进行染色，在凝胶成像系统中会观察到一条“s 型d n a 电泳曲 线( 如图3 7 所示) 。 图3 7 垂直d g g e 结果 f i g 3 - 7p e r p e n d i c u l a rd e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s 选择“s ”型曲线中斜率较大的部分作为实验变性剂梯度范围，此时多数d n a 武汉理工大学硕士学位论文 分子处于部分变性状态，能够将不同分子有效的分离开。 根据本实验垂直d g g e 结果，在后续的水平d g g e 实验中选择4 0 6 0 的变 性剂梯度范围。 3 2 5 巢湖沉积物中初始微生物群落结构分析 提取m c l r 降解实验前巢湖沉积物中微生物总d n a ，经过巢式p c r 扩增 后获得细菌1 6s r d n a v 3 区扩增产物，对其进行凝胶回收纯化后利用水平d g g e 分离。在5 0v ，电泳1 7h 后d g g e 图谱如图3 8 所示。 图3 8 巢湖二号采样点沉积物样品细菌v 3 区d g g e 图谱( l a n e l l a n e 5 分 别为o 5t i n 、5 - 1 0t i n 、1 0 1 5c i i l 、1 5 2 0c n l 、2 0 2 5o n l 层沉积物样品) f i g 3 8d g g eb a n dp r o f i l e so b t a i n e df r o mp r i m e r st a r g e t i n g16s r d n a 3 r e g i o n ) o fd n a e x t r a c t e df r o ms e d i m e n t sa td i f f e r e n td e p t h s 3 7 武汉理工大学硕士学位论文 由d g g e 电泳图可看出，二号采样点五个不同深度沉积物中生物多样性较 丰富。泳道l 是o 5c l n 层沉积物样品，通过q u a n t i t yo n e 软件对泳道上的条带 进行识别，发现该泳道上共出现了3 7 条电泳条带，5 1 0c l i l 层沉积物样品中有 3 3 条电泳条带，l o 1 5g i n 层沉积物样品出现3 2 条条带，1 5 2 0g i n 层沉积物样品 出现了3 0 条条带，2 0 2 5c i n 层沉积物样品中出现了2 9 条条带。d g g e 泳道中条 带数的多寡代表了样品中微生物种类的多少，条带的粗细和深浅代表了该条带对 应的细菌生物量的大小。 由各层沉积物样品中细菌1 6s r d n a d g g e 条带分布情况可看出，在不同的 垂直分布上的沉积物微生物群落结构存在一定的差异。靠近水柱的上层沉积物中 微生物生物多样性较高，并且从上至下呈现生物多样性逐渐下降的趋势。这可能 是因为上层沉积物长期处于好氧状态，微生物活动丰富，优势种群为好氧微生物， 生物多样性较高；而下层沉积物中溶解氧较低，微生物处于厌氧与缺氧状态中， 兼性及厌氧微生物为优势种群，生物多样性降低。在不同深度沉积物中，微生物 优势种群也有所不同。k o i z u m i 4 等的研究也发现了相同的规律。该研究利用 p c r d g g e 技术研究了湖泊沉积物中细菌群落结构的垂直分布情况，通过对比 不同深度沉积物细菌1 6 s r r n a v 3 v 5 区的d g g e 图谱发现，d g g e 图谱中出现 的电泳条带随着沉积物深度逐渐增加，说明细菌生物多样性呈现递减的趋势。基 于细菌1 6s r r n a 的系统发育树显示上层沉积物( o 8e r a ) 和下层沉积物( 8 2 0 c m ) 生物群落结构有显著性差异。这些研究结果表明沉积物中微生物群落结构 呈现了空间分布的连续变化。b o w m a n 5 】等对南极冰川湖中微生物群落结构进行 了研究，利用1 6s r d n a 克隆文库技术分别建立了不同深度沉积物微生物1 6 s r d n a 文库。结果显示1 5 2 5c m 深度沉积物中生物多样性较高，而在深度为 2 0 2 1c t n 的沉积物中，生物多样性发生了明显的减少，并且系统分类更加分散。 本实验采用的沉积物取自二号采样点。在好氧状态下，该采样点各层沉积物 中的m c l r 降解速率随着深度的增加逐渐降低。在对其微生物总d n a 进行提取 时发现，上层沉积物中d n a 获得量最高，电泳条带也最亮，并且沉积物中d n a 获得率也是随着深度增加逐渐降低。各层沉积物中d g g e 图谱也表明细菌生物 多样性分布在垂直分布上从上至下逐渐降低。不同深度沉积物中m c l r 降解速 率的差别可能是由沉积物中微生物生物量以及群落结构的垂直分布差异所导致 的。 3 2 6m c l r 好氧降解后沉积物中微生物群落结构分析 提取m c l r 好氧降解后巢湖沉积物中微生物总d n a ，利用p c r 反应扩增 其细菌1 6s r d n av 3 区，扩增产物经凝胶回收纯化后利用水平d g g e 进行分离。 图3 - 9m c l r 好氧降解后沉积物中细菌v 3 区d g g e 图谱( l a n e l l a n e 5 分 别为0 - 5 c m 、5 1 0 c m 、1 0 1 5 c m 、1 5 2 0 c m 、2 0 2 5 c m 层沉积物样品) f i g 3 - 9d g g e b a n dp r o f i l e so b t a i n e df r o mp r i m e r st a r g e t i n g16s r d n a 3 r e g i o n ) o fd n a e x t r a c t e df r o ms e d i m e n t sa td i f f c r e n td e p t h sa f t e rt h ea e r o b i c b i o d e g r a d a t i o no fm c l r 通过q u a n t i t yo n e 对好氧降解后沉积物中微生物1 6s r d n ad g g e 图谱分析 发现，从0 5 c m 至2 0 2 5 c 埴n 层沉积物d g g e 图谱中条带数分别为4 6 、4 2 、4 3 、 4 2 、4 2 条。并且不同层次沉积物中细菌的优势种群有所不同。 与降解实验前沉积物中微生物1 6s r d n ad g g e 图谱相比，好氧降解后 d g g e 图谱中出现的条带数有所上升，出现了一些新的条带，并且沉积物中细菌 的优势种群发生了一定的变化。这说明经过m c l r 的降解过程后，沉积物中微 3 9 武汉理工大学硕士学位论文 生物群落结构发生了变化，m c l r 的加入及其降解过程对沉积物中微生物群落结 构有着重要影响。d g g e 图谱中新出现的条带所代表的微生物可能是在沉积物中 生物量较低，无法利用d g g e 技术检测到，而在m c l r 降解过程中，其生物量 得到了积累，从而被检测出来。 3 2 7m c l r 厌氧降解后沉积物中微生物群落结构分析 m c l r 厌氧降解后沉积物中微生物1 6s r d n a 图谱如图3 1 0 所示。 图3 1 0m c l r 厌氧降解后沉积物中细菌v 3 区d g g e 图谱( l a n e l l a n e 5 分别为0 0 5 c m 、5 1 0 c m 、1 0 1 5 c m 、1 5 2 0 c m 、2 0 2 5 c m 层沉积物样品) f i g 3 - 10d g g eb a n dp r o f i l e so b t a i n e df r o mp r i m e r st a r g e t i n g16s r d n a ( v 3 r e g i o n ) o fd n a e x t r a c t e df r o ms e d i m e n t sa td i f f e r e n td e p t h sa t t e rt h ea n a e r o b i c b i o d e g r a d a t i o no fm c i r 落结构分析造成影响，因此，针对不同的沉积物应当有针对性的选用适宜的实验 方法。本文中使用同样的方法对降解前后沉积物中微生物群落结构进行分析，对 于m c l r 降解前和好氧降解后的沉积物样品均取得了较好的结果，而厌氧降解 后的沉积物样品d g g e 图谱中条带较少，且亮度较弱，还需要进一步优化实验 条件，以获得更多的厌氧降解沉积物中微生物群落结构信息。 4 l 1 ) 利用方法二( 原位裂解法) 能够有效的提取出沉积物中细菌基因组d n a ，并 且不同层次的沉积物中d n a