（市政工程专业论文）PCR技术在地表水病原细菌快速检测中的应用研究.pdf

西安建筑科技大学硕二i 二学位论文 p c r 技术在地表水病原细菌快速检测中的应用研究 专业：市政工程 研究生：李 杰 导师：王晓昌教授 摘要 为了建立用多聚酶链反应( p c r ) 技术陕速检测地表水中病原细菌的方法，本试验旨在研 究以跏垃8 ad y s e n t e r i a e ( 志贺氏痢疾菌) 、h b r i oc h o l e r a e ( 霍乱可l 菌) 、s a l m o n e l l ao p h r m u r i u m ( 沙门氏菌) 和e s c h e r i c h i ac o l i ( 大肠埃希杆菌) 作为参考菌株设计的通用引物在地表水病 原细菌检测中的应用价值。利用1 6 sr r n a 基因的高度保守性，设计并合成细菌的通用引物 ( s p i ：5 。a a g g c g a c g a t c c c t a g c t g g t c t g a g a g g a t g a c - 3 ，n t1 2 4 6 - 1 2 8 0 ；s p 2 ： 5 f - g c t t g c c a g t a t c a g a t g c a g t r c c c a g g t f g a g c 一3 ，n t1 5 2 1 1 5 5 6 ) 。- 我1 门提取了西 安市区几个不同水体的水样和某污水处理厂二级出水水样中细菌的总d n a ，使用通用引物对其 进行扩增，爿对p c r 产物分别进行序列测定及序列同源胜分析，同时检测水样中的细菌总数和 粪大肠杆菌指标。 结果显示，通用引物扩增4 种参考菌株，在电泳图谱上3 2 0 b p 处均可得到清晰的电泳条带， 其特异性通过序列测定及同源性分析得到进一步验证；通用引物p c r 可检出2 5 0 n g a ，的大肠杆 菌总d n a ，其检测的灵敏度可达2 7 5c f u 1 0 0 m l ：用通用引物对西安市区不同地表水样进行p c r 扩增，其中一条河流和三个湖泊以及城市污水处理厂的二级出水样品的电泳图谱上，在3 2 0b p 处都得到了清晰的电泳条带，以上的所有水体都被确认为受到了生活污水的影响：而另外一条 被保护的很好并可用作饮用水供应的水样中未扩增出条带。珑们也使用了传统培养的方法对细 菌进行计数，并与p c r 进行比较。与之相对应的粪大肠菌群检测结果显示，只有污水处理厂二 级出水和一条被污染的湖水水样有粪大肠杆菌检出，其它水样未被检出，而使用通用引物p c r 方法除了可以检测到粪大肠杆菌外，还可以检测到水样中其它的一些病原细菌。 本研究中建立的用p c r 方法检测水体中病原细菌与传统检测方法相比较，已经显示出具有 特异、快速等优点，它为水环境中细菌的风险评价提供了一种更为可靠的方法。 关键词：通用引物，痫原菌，多聚酶链反应，地表水 论文类型：基础应用 西安建筑科技大学硕士学位论文 s t u d y o nt h ea p p f i c a f i o no f t h e r a p i d d e t e c t i o n o f p a t h o g e n i nt h es u r f a c ew a t e r b yp c r s p e c i a l i t y ：m u n i c i p a le n g i n e e r i n g a u t h o r ：l i j i e a d v i s o r ：p m fw a n g ) ( j a o c h a n g i no r d e rt oe s t a b l i s ham e t h o df o rr a p i dd e t e c t i o no fp a t h o g e n i cb a c t e r i ai ns u r f a c ew a t e rb y p o l y m e r a s ec h a i r lr e a c t i o n ( p e r ) t e c h n i q u e ，t h i ss t u d yt r i e dt oi n t r o d u c eu n i v e r s a lp r i m e r s 、v i t h 鼢啦肠 d y s e n t e r i a e , v i b r i oc h o l e r a e , s a l m o n e l l ao p h r m u r i u 巩a n de s c h e r i c h i ac o l i a st h em f c r e n c es t r a i n s t h eu n i v e r s a lp r i m e r sw e r ed e s i r e da n ds y n t h e s i z e da c c o r d i n gt ot h eh i g hc o n v e r s a t i o no f1 6 sr r n a g e n e t h ed n a o f b a c t e r i af r o ms e v e r a lw a t e rb o d i e sa n ds e c o n d a r ye f f l u e n ti nt h eu r b a na r e ao f x i a n c i t yw e r ee x t r a c t e da n dt h e na m p l i f i e dw i t ht h eu n i v e r s a lp r i m e r s ，a n ds e q u e n c i n ga n dh o m o l o g y a n a l y s e so f t h ep c rp r o d u c t i o nw e r ec o n d u c t e d a sar e s u l t , t h ep c rp r o d u c t so f t h e4r e f e r e n c es t r a i n s w e r ei d e n t i f i e da t3 2 0b po nt h ee l e c t m p h o r e g r a m s , a n dt h e yw e r ef u l t h e rv e r i f i e db ys e q u e n c i n ga n d h o m o l o g ya n a l y s e s t h ed e t e c t i o nl i m i to f t h et o t a ld n ao f e c o l ir e 先r e n c es t r a i nw a sa b o u t2 5 0 n g l a n dt h es e n s i b i l i t yo fp c rd e t e c t i o nw a su pt o2 7 5 c f u 1 0 0 m l r e g a r d i n gd i f f e r e n tw a t e rs a m p l e s ， l i m p i de l e c t r o p h o r e s i ss t r i p sw e r ei d e n t i f i e da t3 2 0b pf o r1f i v e ra n d3l a k e si nt h eu r b a na r e a , a sw e l la s t h es e c o n d a r ye f f i u a n tf r o mad o m e s t i cw a s t e w a t e rt r e a l m e r l tp l a n t , a l lo f w h i c ha r eb e l i e v e dt ob eu n d e r t h ei n f l u e n c eo fd o m e m cp o l l u t i o n , w h i l en os t r i pw a si d e n l i f i e df o ra n o t h e rr i v e rw a t e rw h i c hi st h e w e l l p r o t e c t e d s o u r c ef o r p o t a b l ew a t e rs u p p l y b a c t e r i ae n u m e r a t i o nw a sa l s oc o n d u c t e db y c o n v e n u o n a lc u l t u r em e t h o df o rc o m p a r i s o n r e g a r d i n gf e c a e lc o l i f o r m , i tw a so n l yd e t e c t e df r o mt h e s e c o n d a r ye f f l u e n ta n dap o l l u t e dl a k eb u tn o tt h eo t h e rs u r f a c w a t e rs a m p l e st i v mw h i c hp a t h o g e n i c b a c t e r i aw e r ed e t e c t e db yp c rw i t ht h eu n i v e r s a lp n m e r s t h ep c rm e t h o de s t a b l i s h e db yt h i ss t u d y h a sm m i f e s ta d w m t a g e so v e rc o n v e n t i o n a lc u l t u r em e t h o di ni t sr a p i d n e s sa n ds e n s i b i l i t yf o rt h e d e t e c t i o no fp a t h o g e n i cb a c t e r i af r o ms u r f a c ew a t e r i tp r o v i d e sam o r er e l i a b l ea p p r o a c hf o rt h e a s s e s s m e n to f b a c t e r i o l o g i c a lr i s ko f w a t e re n v i r o n m e n t j 1 西安建筑科技大学硕士学位论文 7 l h ep c rm e t h o de s t a b l i s h e db yt h i ss t u d yh a sm a n i f e s ta d v a l l t a g e so v e rc o n v e n t i o n a lc u l t u r e m e t h o di ni t sr a p i d n e s sa n ds e n s i b i l i t yf o rt h ed e t e c t i o no fp a t h o g e n i cb a c t e r i af r o ms u r f a c ew a t e r i t p r o v i d e s a m o r e r e l i a b l ea p p r o a c h f o r t h ea s s e s s m e n t o f b a c t e r i o l o g i c a l r i s ko f w a t e r e n v i r o n m e n t k e y w o r d s ：u n i v e r s a lp r i m e r ；p a t h o g e n i c b a c t e r i a ；p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n ；s u r f a c e w a t e r p a p e rt y p e ：a p p l i c a t i o ns t u d y l 】 声明 本人郑重声明我所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人或其他 人在其它单位已申请学位或为其它用途使用过的成果。与我一同工作的同 志对本研究所做的所有贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名： 关于论文使用授权的说明 日期：) 口口易歹8 本人完全了解西安建筑科技大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布 论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或者其它复制手段保存论文。 ( 保密的论文在论文解密后应遵守此规定) 论文作者签名：杏， 导师签 注：请将此页附在论文首页。 日期：。r 一口易 西安建筑科技大学硕士学位论文 l 绪论 1 1国内外地表水病原体污染现状及造成的危害 随着工业进步和社会发展，水污染亦日趋严重，成了世界性的环境治理难题。地表水暴露 在空气之中，较地下水更易受到污染。 据对分布在全球的1 1 0 条河流的监测，其中只有2 0 条河流的水质符合世界卫生组织规定的 饮用水质标准( 总大肠杆菌数小于1 0 个1 0 0 毫升) ，这些河流主要分布在北美地区。而在发展 中国家，由于污水大多未经处理即排入河流，水中细菌严重超标川。 据资料表明，印度亚穆纳河流经新德里前，每1 0 0 毫升水中含大肠杆菌数已达7 5 0 0 个，由 于每天有24 l - 7 t - 未经处理的城市污水直接流z i g _ 条河流，致使流经新德里后，大肠杆菌数高达 2 4 0 0 万个1 0 0 毫升。 我国每年约有4 0 0 多亿废水排入水域，1 3 的工业废水和9 0 以上的生活污水未经处理就 排入水域，全国有临测的12 0 0 多条河流中，e j 前8 5 0 多条受到污染吐因污染而不能饮用的地 表水占全部监测水体的4 0 0 0 l ”，符合国家一、二级水质标准的河流仅占3 2 2 t 日，流经城市的河 段中7 8 不适合作为饮用水源，许多河段鱼虾绝迹，9 0 以上的城市水域也遭到污染【4 】，符合 国家级和二级水质标准的河流仅占3 22 ，污染正d ：i 浅层向深层发展，地下水和近海域海水 也正在受到污染【2 1 ，我国有8 2 的人在饮用浅井和江河水，其水质污染严重，细菌污染超过卫 生标准的7 5 0 j 2 1 。中国有7 0 的人饮用达不到卫生标准的水1 3 】，我们能够饮用和使用的水正在 不知不觉地减少。 虽然人们已经认识到污染江河湖泊等天然水资源的恶果，并着手进行治理，但毕竟已经遭 受了巨大的损失，并将继续为此付出沉重的代价。 城市人口的急剧增长导致了大量未经处理的污水排入城市地表水体中的比例增大，这也是 导致世界范围内人类发病率和死亡率上升的原因之一1 5 j 。 目前，全球大约有1 2 亿人口享受不到安全饬，用水，2 5 亿人口没有卫生设备1 6 j 。据世界卫生 组织调查资料显示：全世界8 0 的疾病、5 0 0 0 f i 4 j 癌症与饮用不洁净水有关p j 。据世界权威机构 调查，每年饮用不卫生水至少会造成全球2 0 0 0 万人死亡，水污染被称为“世界头号杀手”1 2 j 。 在世界发展中国家，介水传播的疾病是引起死亡的主要原因fj 。特别的，介水传播疾病如 伤寒热，霍乱，痢疾和旅行者腹泻都是由不同类型的细菌病原菌引起的，因此引起了主要的公 众健康危害口j 。介水传播病的范围也在扩展，许多曾一度被认为是已经得到控制的疾病也在增 西安建筑科技大学硕士学位论文 长1 9 】。 2 0 0 4 年4 - 9 月，尼泊尔全国近三分之一的地区因饮用水不卫生而流行肠胃炎、腹泻、痢疾 等疾病，据不完全统m 造成1 2 8 万人染病，其中1 7 7 人死d ”。 在我国也曾发生了震惊中外的淮河水污染事件。1 9 9 4 年7 月，淮河上游的河南境内突降暴 雨，颍一匕水库水位急骤上涨超过防洪警戒线，因此开闸泄洪将积蓄于上游的2 亿立方米水放了 下来。水经之处河水泛浊，河面上泡沫密布，顿时鱼虾丧失。下游一些地方居民饮用了虽经自 来水厂处理，但未能达到饮用标准的河水后，出现恶心、腹泻、呕吐等症状。经取样检验证实 上游来水水质恶化，沿河各自来水厂被迫停止供水达5 4 天之久，百万淮河民众饮水告急。 在发达国家，水环境微生物污染事件也频频爆发。1 9 9 3 年寄生虫侵入美国密尔沃基供水系 统，造成1 0 0 人死亡，4 0 万人致病后，水质问题备受关注。如今纽约市民每天生活在饮水不净 的威胁下。美国前总统克林顿曾宣布了一项投资2 3 亿美元的清洁水行动计划，治理美国已受污 染4 0 的水域。 根据加利福尼亚州奥克兰市的太平洋研究所发表的研究报告的说法，如果不采取紧急行动 使地球上的饮用水供应变清洁，在2 0 2 0 年之前，超过7 6 0 0 万人将死于与水有关的疾病，其中 大半是儿童。 份2 0 0 2 年约翰内斯堡极峰会议开幕之前发表的研究报告说，在今后2 0 年中，因食用不 卫生饮用水而致死的人数可能超越死于艾滋病的人数。 该报告研究了三种不同情况后得出结论，即使联合国要把缺乏清洁食水的人数减少一半的 目标得以实现，但仍然有3 4 0 0 万到7 6 0 0 万人可能在2 0 年内丧命。 这个非牟利的政策研究组织的所长格莱克说：“即使联合国目前目标能达到，但在2 0 2 0 年之前，仍然有多达7 6 0 0 万人主要是儿童一死于与水有关的可预防的疾病。”格莱克说： “即使出现最乐观情况，死于与水有关的疾病的人数还是很惊人的。这个大半被隐瞒的悲剧正 是2 0 世纪最大的发展失败之一。” 综上所述，日趋加剧的水污染，已对人类的生存安全构成重大威胁，成为人类健康、经济 和社会可持续发展的重大障碍口】。 2 水体中的主要病原细菌及其感染特点 水中的细菌虽然很多，但大多数都不是病原微生物。介水传染疾病的病原菌有：伤寒沙门 氏菌，传染菌痢的志贺氏菌，霍乱弧菌等等。 西安建筑科技大学硕士学位论文 1 2 1 沙门氏菌 沙门菌属( s a l m o n e l l a ) 是一大群寄生于人类和动物肠道中，生化反应和抗原构造相似的革 兰氏阴性杆菌。e i 前至少有6 7 利，0 抗原和2 0 0 0 个以上的血清型，但对人致病的仅少数，如引 起肠热症的伤寒、副伤寒沙门菌。其它对动物致病，有些菌种偶可传染给人，引起食物中毒或 败血症，如鼠伤寒沙门菌( s t y p h i m u r i u m ) 、肠炎沙门菌( s e n t e r i t i d i s ) 、鸭沙门菌( s a n a t u m ) 、 猪霍乱沙门菌( s c h o l e r a e - s u i s ) 等十余种，其中鼠伤寒沙门菌最常见，占2 5 3 5 i l “。 沙门菌大小一般是o 5 1 x 2 3 p m 。除鸡沙门菌( s g a l l i m z m ) 和雏沙门菌( s p u l l o r u m ) 等个别菌种外，都有周身鞭毛，一般无荚膜j 。 沙门菌感染一般有四种典型的临床症状：胃肠炎( 从轻微到急剧的腹泻，恶心和呕吐) 、菌 血症和败血症( 血培养阳性，有峰形热) 、伤寒以及肠热症( 持续高烧，有的带有腹泻) ，还有 的成为病原携带者。根据肠道疾病的症状，沙门菌可分为两个完全不同的组：伤寒种和非伤寒 种。非伤寒种沙门菌引起的胃肠炎在患者摄入被污染了的水和食物6 7 2 小时之内出现症状， 持续腹泻3 5 天，伴有发热和腹痛，这种疾病通常是自限性的。伤寒病的潜伏期大约在1 1 4 天，通常是3 5 天。伤寒是非常严重的疾病，可以致命。虽然在卫生条件好的地区伤寒并不 多见，但它在其它地区仍有流行，每年大约有几百万病例。 沙门菌在环境中分布广泛，但是某些种或血清型却表现出宿主特异眭。尽管副伤寒沙门菌 偶尔也会感染牲畜，但伤寒沙门菌和副伤寒沙门菌的宿主主要是人类。许多血清型的沙门菌， 包括鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌，能够感染人类和大部分动物，包括家禽、牛、猪、鸟甚至爬 行动物。病原菌通常是从排放的污水，或者牲畜、野生动物的粪便而污染供水系统。现在已经 从很多种食品中检测到了沙门菌。 沙门菌感染人类的途径主要是粪一口途径。非伤寒种的沙门菌感染主要与人一人接触、摄 入被污染的食物和与动物接触有关。伤寒沙门菌的感染主要是通过摄入被污染的食物或水，直 接通过人一人传播并不常见。 沙门氏伤寒菌和其它沙门氏菌经过胃以后在肠道中繁殖，随后，沙门氏伤寒菌会进入血液 并在骨膜、肝脏、胆囊、骨髓、脾或肾脏中定居。沙门氏伤寒菌可以导致脑膜炎或者肺炎。在 致死病例中，并不是出现肠道感染的初期而是后期并发症才是致死的主要原因。 通过水传播的伤寒病对大众健康的危害极大。虽然非伤寒沙门菌广泛传播，但是却很少引 起饮用水传播病的爆发。包括鼠伤寒沙门菌病的疾病传播都是与饮用了被污染了的地下水或者 地表水有关。在一例与公众雨水供应设施有关的疾病爆发中，鸟粪被认为是传染源。沙门菌对 于消毒较敏感。为了保障安全饮用水，可以用来控制风险的方法包括保护水源水免受人或动物 西安建筑科技大学硕二e 学位论文 粪便的污染、充分的水处理和在配水系统中的保护措施。在饮用水供水系统中，大肠埃希菌( 或 者耐热大肠杆菌) 通常是较为可信的指示沙门菌的指标。 1 2 , 2 志贺氏菌 志贺氏菌属( s h i g e f l a ) 是一类革兰氏阴性杆菌，是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌，属 杆状菌，因此通称痢疾杆菌。大小为0 5 o 7 x 2 3 9 m ，无芽孢，无荚膜，无鞭毛。多数有菌 毛。革兰氏阴性杆菌。兼性厌氧菌，能在普通培养基上生长，形成中等大小，半透明的光滑型 菌落。在肠道杆菌选择性培养基上形成无色菌落。分解葡萄糖，产酸不产气。v p 试验阴性，不 分解尿素，不形成硫化氢，不能利用枸橼酸盐作为碳源。宋内氏志贺氏菌能迟缓发酵乳糖 ( 3 7 。c 3 4 天) j i l l 。 根据生化反应和抗原结构的差别，可将志贺氏菌分为痢疾志贺菌( s d y s e n t e r i a e ) 、福氏志 贺菌( s f l e x n e r i ) 、鲍氏志贺菌( s b o y d i i ) 和宋氏志贺菌( s s o n n e i ) 四个群。 本属细菌对理化因素的抵抗力较其它肠道杆菌为弱。对酸敏感，在外界环境中的抵抗力能 以宋内氏菌最强，福氏菌次之，志贺氏菌最弱。一般5 6 6 0 。c 经1 0 分钟即被杀死。在3 7 水 中存活2 0 天，在冰块中存活9 6 天，蝇肠内可存活9 1 0 天，对化学消毒剂敏感，在1 石炭 酸中，1 5 3 0 分钟即可死i 型”。 在疾病爆发时，四个群的致贺氏菌都可以被分离出来。但大多数是由宋氏志贺菌感染所导 致。这类病通过携带者的粪便传播。与沙门氏菌不同，志贺氏杆菌一般不会在动物体内找到。 人类和其它高等灵长类动物是志贺菌的唯一天然宿主。志贺菌寄生在宿主的肠道上皮细胞中。 志贺菌病都发生在：卫生条件差、拥挤的社区中，大多数病例出现在看护中心、监狱和精神病院。 军事区和到卫生条件差的地区的旅行者也容易感染此病。 志贺菌是肠道病原菌，主要通过人人接触，摄入被污染了的食物和水而由粪口途径传 播。现在己知苍蝇是志贺菌病的传播载体。 已经有很多次大规模的志贺菌病爆发的记录。由于这种细菌在水体中并不是特别的稳定， 所以它们在恻弱水中的存在能够表明水体最近受到人类粪便的污染。但目前普遍使用的检测技 术的敏感f 生和可靠陛比较低，在供水中所使用的数据往往低估了志贺菌的含量。从志贺菌所引 起的疾病的严重性来看，控制饮用水中的志贺菌对于公众的健康尤其重要。志贺菌对于消毒比 较敏感。在安全水计划中，可以用来控制潜在风险的手段包括保护原水免受人类粪便的污染， 充分的处理和在配水过程中的保护。在饮用水供水系统中，大肠埃希菌( 或者耐热大肠杆菌) 通常是较为可信的指示志贺菌的指标。 lr - 西安建筑科技大学硕士学位论文 1 2 3 霍乱弧菌 霍乱弧菌( g c h o l e r a ) 引起的霍乱是烈性传染病，曾在全球引起七次世界性大流行，造成 了人类的大量死亡。 新从病人体内分离出的霍乱弧菌的形态较典型，呈革兰染色阴性，菌体弯曲如弧形或逗点 状。菌体一端有单生鞭毛，运动活泼。 本菌属耐碱不耐酸，在正常胃酸中仅可存活4 分钟。霍乱弧菌对热和消毒剂抵抗力弱，以 i 份漂白粉加4 份水处理病人的排泄物或呕吐物一小时可达到消毒的目的。1 0 0 。c 煮沸1 2 分 钟即可杀死本菌。在5 5 。c 湿热下15 分钟即死亡j “l 。 主要通过污染水源或食物而引起肠道感染。人类是霍乱弧菌的唯一易感者。霍乱弧菌进入 消化道到达小肠，在肠粘膜表面吸附并迅速繁殖。产生的霍乱肠毒素作用于小肠粘膜，引起小 肠液过度的分泌。在霍乱的轻型病例中，只出现腹泻。严重者出现上吐下泻，“米汤样”大便， 腹疼和昏迷等，导致脱水和代谢性酸中毒、循环衰竭，甚至产生休克和死亡。 非毒性的霍乱弧菌广泛分布于水环境中，但毒性的菌株却相反。人类是毒性霍乱弧菌的来 源，与病人或带菌者接触可能被传染，也可由蝇类传播。当有疾病发生时，在污水中能够检测 到这科，微生物。尽管在非疫区也能够从水中分离出来霍乱弧菌0 1 型，但通常都不是毒性的。 毒性的霍乱弧菌的发珊和活着的挠足虫以及其它的水生生物有关，包括软体动物、甲壳类动物、 植物、藻类和蓝细菌“。 霍乱一般通过粪一口途径传播，感染主要是由于食用了被粪便污染了的水和食物引起的。 由于导致感染的微生物需要很大的数量，所以通过人一 接触传播不大可能。 由于卫生条件差而使水受到污染是疾病传播的主要原因，但这并不能完全解释疾病爆发的 季节性。所以除此之外的其它因素也是很重要的。病原性的霍乱弧菌0 1 和0 1 3 9 血清型在饮用 水供水中的存在，会对公众健康产生重要的影响，也会影响到该地区的经济。霍乱弧菌对于消 毒十分敏感。在安全水计划中，用于控制毒性的霍乱弧菌的潜在风险的控制方法包括保护原水 免收人类粪便的污染、充分的消毒和在配水过程中的保护。在没有大肠埃希菌的情况下也可以 检测到霍乱弧菌0 1 和非0 1 的血清型，所以大肠埃希菌( 或者耐热大肠杆菌) 不能作为饮用水中 指示霍乱弧菌的指标。 1 2 4 空肠弯曲菌 空肠弯曲菌( c j e j u n i ) 菌体轻度弯曲似逗点状，长15 5 u m ，宽0 2 0 8h m 。菌体一端或 两端有鞭毛，运动活泼，在暗视野镜下观察似飞蝇。有荚膜，不形成芽趔“】。 空肠弯曲菌为微需氧菌，在含25 5 氧和1 0 c o z 的环境中生长最好。最适温度为3 7 西安建筑科技大学硕二 二学位论文 4 2 。c 。在正常大气或无氧环境中均不能生长。 空肠弯l t t j g e 化反应不活泼，不发酵糖类，不分解尿素，靛基质阴性。可还原硝酸盐，氧化 酶和过氧化氢酶为阳性。能产生微量或不产生疏化氢，枸椽酸盐培养基中不生长。抵抗力不强， 易被干燥、直射日光及弱消毒剂所杀灭，5 6 。c 下5 分钟可被杀死。对红霉素、新霉素、庆大霉 素、四环素、氯霉素、卡那霉紊等抗生素敏感。近年发现了不少耐药菌株】。 空肠弯曲菌的个重要特征是与其它病原体相比，它的感染| 生更强，可感染人类和多种动 物，大多数感染症状出现在婴幼儿身上，是导致胃肠疾病和植物传染疾病最主要的细菌。在废 水和地表水中很常见，倒可弯曲菌属的成员都可以致病。这种病最普遍的症状是腹泻、身体不 适、发热和腹痛( 有的会有血便或粪便中有白细胞) 、呕吐。潜伏期通常为2 4 天，持续时间 为一天至一周以上。其它的临床表现包括反应性关节炎和脑膜炎，还有报告说空肠弯曲菌感染 与g u i lj a i n b a r r 6 综合症( 一种急性外周神经脱髓鞘病) 有关。在有这种地方病的地区，弯曲杆 菌病在早期会出现症状，但到后期症状却消失了。这表明经过重复感染后人体逐渐形成了这种 病症的抗体。 弯曲杆菌可在不同的环境中生存，野生或家养的动物，尤其是家禽、野生鸟类和牛都是主 要的寄生宿主。宠物和其它动物也可能是宿主。食物，包括肉类和未经巴氏消毒的牛奶，都是 弯曲杆菌重要的感染源。水也是重要的感染源，已有充分的证据表明地表水中的弯曲杆菌的出 现率与降雨、水温和水鸟有很大关系。 据报道，大部分弯曲杆菌的感染是偶发的，食物被认为是普遍的感染源。通常是人类摄食 动物产品而被感染，肉类，尤其是家禽肉和未经巴氏消毒的牛奶是重要的感染源。被污染的饮 用水供水系统已被证明是疾病大爆发的来源。这些疾病大爆发当中，病例的人数从几个到几千 个不等，感染源包括未经氯消毒或消毒不充分的地表水和受到野生鸟类污染的水库水。 被污染的饮用水被认为是弯曲菌病爆发的重要来源。对于水传播病的监测正在逐渐增多， 从病人体内及其所饮用的水中分离出相同的菌株，证实了这种疾病是通过水传播的。在安全水 计划中，可以用于控制潜在的弯曲杆菌污染的风险的手段包括保护供水水源免受动物和人类的 污染，以及在水配给过程中的充分的处理和保护措施。已经处理的和消毒过的水应该避免受到 鸟粪的污染。弯曲杆菌是在粪便中生长的细菌，它对于消毒的抵抗力并不是很强。因此，大肠 埃希菌( 或者耐热大肠杆菌) 可以作为弯曲杆菌是否在饮用水中存在的指示物。 12 5 军团菌属 1 9 7 6 在美国费城举行的一次退伍军人协会会议上，爆发流行一种严重肺炎，病死率高，后 来从死者肺组织中分离到一种新的需氧的革兰氏阴性杆菌，称为嗜肺军团菌( l e g i o n e l l a p n e u m o p h i l a ) 。目前已知军团菌属( l e g i o n e l l a ) 至少有2 7 个种和4 3 个血清型1 。大小为o3 西安建筑科技大学硕士学位论文 09 x 2 5 9 m 的革兰氏阴性杆菌，有菌毛和单端鞭毛。在感染组织中为球什菌，人工培养后呈多 型态性| l “。军团菌属为需氧菌。 它们在2 n - - - - 5 c 0 2 环境中生长良好。最适生长温度为3 5 。c ，最适p h 为6 9 70 j 。在 自然界可长期存活，如在自来水中可存活约1 年。对酸有较强抵抗力，但对一些化学消毒剂较 敏感。 军团病流行于夏秋末，其它季节多为散发病例。主要通过呼吸道吸入带菌飞沫而感染。常 见的感染来源为被污染的空调和供水系统。未发现有人与人之间的直接传播。尽管认为所有的 军团菌对人类都有潜在的致病性，但嗜肺军团菌是引起军团病的主要病原体。目前所知引起的 疾病有两种临床表现：军团病和庞提亚科热( 因1 9 6 8 年首先在美国密执安州的庞提阿克热市发 现) 。前者是一种肺炎病，潜伏期为3 6 天。宿主因素影响疾病的发生：男性比女性更易感染， 大多数患者的年龄为4 0 _ _ 7 0 岁l 。危险因素包括吸烟、酗酒、癌症、糖尿病、慢性呼吸道或 肾脏疾病，以及在器官移植中的免疫抑制。肺炎型起病骤然、发热、寒战、干咳、头痛、全身 症状明显。庞提亚科热症状较轻，有自限性，从感染到发病时间很短( 5 小时一3 天) ，症状与 流感相似：发热、头痛、恶心、呕吐、肌肉疼痛和咳嗽。但x 线片未见有肺炎症象，愈后良好。 经过血清阳性样本的调查，发现很多感染都是无症状的。 嗜肺军团菌的致病物质和致病机理还不清楚。菌毛的粘附作用和多种酶、毒素可能是致病 因子。感染始于下呼吸道，病菌被肺泡巨噬细菌吞噬，但能通过某种机制阻抑溶酶体与吞噬体 的融合，圆而不被杀死，可在细胞内生长繁殖，导致细胞死亡和释放子代菌，使更多的细胞受 到感染。 军团菌自然生存于很多清洁的水体中，例如河水、溪水和池塘水，但在这些水体中它们的 数量相对较少。在特定的 造水环境中它们却能生长旺盛，譬如在与空调系统连接的水冷装置 ( 冷却塔和蒸发冷凝器) 中，热水配水系统和矿泉水中，都能为军团菌的生长繁殖提供合适的 温度( 2 5 5 0 。c ) ，凡是可以为军团菌提供增殖条件的环境与军团病的爆发都是有关的。军团 菌能在生物膜和沉淀物上存活生长。军团菌可以被一些棘阿米巴、h a r l l n a n e l l a 和耐格里原虫等 羽侈虫所吞噬，但不会被杀灭，反而能在其空泡内繁殖，这在军团菌在水环境中的存活中起到 了重要作朋。 最普遍的感染途径是吸入了被军团菌污染了的气溶胶。这些气溶胶产生于被污染了的冷却 塔、热水淋浴头、加湿器和矿泉水。在一些病例中，抽吸被认为是与污染了的水、食物和冰有 关的感染途径，还没有人人传播的证据。 军团菌是通过水体传播的微生物，使用水的设备包括冷却塔、热水系统等都和由于军团菌 感染而引起的疾病爆发有关。由于军团菌较为流行，因此应该充分考虑到它进入饮用水系统的 可能性，应该采取一些手段来减少它们存活与繁殖的可能性。设计的刚氐生物膜增长和控制温 度的消毒策略可以减少军团菌引起的潜在风险。这种微生物对消毒剂敏感，尤其是对氯胺。这 西安建筑科技大学硕二e 学位论文 可能是由于氯胺的稳定性好，对生物膜的作用也较强。水温控制也是重要的因素，有可能的情 况下，水温应保持在2 5 5 0 。c 这个范围之外。在热水系统中，储存水的温度应该保持在5 5 。c 以 上，相连的管道中也保持在5 5 刚近，就可以蛐l 二微生物的生长。然而，温度在5 0 ( 2 以上的热 水可能引起小孩、老人和其他体弱人群的烫伤。当在热水和冷水配水系统中，水温要维持在 2 s 一5 0 范围内时，针对限制生物膜生长的消毒策略就显得非常重要了i 】。配水系统中污泥、 水垢、铁锈、藻类和粘二仁沉积物的积累以及静l t 不动的水体都有助于军团菌的生长。军团菌不 大可能在清洁和流动的水体中过度生长，此外应该注意选择那些不易滋生微生物和生物膜的管 道材料。 1 2 6 致病性的大肠埃希菌 埃希菌属( e s c h e r i c h i a ) 的细菌一般不致病，其数量巨大，是人类和动物肠道中的正常菌群。 然而，如果它们在人体的其它部位，则会导致严重的疾病，例如尿道感染，菌血症和脑膜炎。 有限的肠道致病菌株能导致急性腹泻。埃希菌属中以大肠埃希菌( e c o l i ) 晟为重要。已知的大 肠埃希菌有1 4 0 个血清型，其中有11 个型能够导致人类胃肠疾病i l “。 埃希菌属大小约为o 4 o 7 2 3 岬。大多数菌株有周身鞭毛，有普通菌毛和性菌毛，有 些菌株有多糖包膜。 肠致病性大肠杆菌( e n t e r o t x a h o g e n i ce c o l i ：e p e c ) 是导致婴儿腹泻的主要病原菌，严重 者可致死，成人少见。e i ，e c 不产生肠毒素。病菌在十二指肠、空肠和回肠上端大量繁殖，切片 标本可见菌黏附于微绒毛，导致刷状缘破坏、绒毛萎缩、上皮细胞排列紊乱和功能受损，造成 严重腹泻。 肠致病性的大肠埃希菌是肠道微生物，人类是其主要的宿主，尤其是对于e p e c ，e t e c 和e i e c 菌株。牲畜，例如牛、羊、猪、鸡等都是e h e c 菌株的主要传染源。另外，生的蔬菜 上也带有e h e c 。这些致病性的大肠埃希菌在不同的环境水体中都能够监测到。 人与人、人与动物接触，摄食被污染了的食物和水都是感染的途径。人与人的传播途径在 人群接触很紧密的社区中是很普遍的。 已有文献证实了在娱乐用水和被污染了的饮用水中的致病性的大肠埃希菌导致水传播疾 病。很著名的一起案例发生在2 0 0 0 年5 月，加拿大安大略省的w a l k e r t o n 的农业社区中，这是 一起d ： 大肠埃希菌0 1 5 7 ：h 7 ( 和空肠弯曲菌) 引起的疾病大爆发。有7 人死亡，2 3 0 0 人患病”“。 起因是由于铡f j 水被含有牛粪的雨水径流所污染。可用于控制肠致腐洼大肠埃希菌潜在风险的 手段包括防止供水水源受到人或动物粪便的污染，在分配供水过程中进行充分的处理和保护。 目前还没有证据表明肠致病性的大肠埃希菌对于水处理的反应和其它的大肠杆菌有什么不同。 因此，对于大肠埃希菌( 或者耐热大肠杆菌) 的常规测验为饮用水中检测肠致病性大肠杆菌的 西安建筑科技大学硕二i 二学位论文 血清型提供了一个合适的指标，即使应用标准测试无法检测到e h e c 菌株，这种方法也行得通。 自然环境的过程和水消毒处理能够有效地控制大肠埃希菌。此外，大肠埃希菌还是一种指 示菌，能够反映样品是否最近曾受到温血动物的粪便污染。 12 7 幽门螺杆菌 幽门螺杆菌可能与人类b 型胃炎、消化性溃疡以及胃癌等有着密切关系。它们多呈弧形、 s 型或海鸥状。大小为0 5 1 0 35 n n 。在胃粘液层中常呈鱼群样排列。传代培养后可变成杆 状或圆球体形。革兰氏染色阴性。单端或双端有2 6 根鞭毛【l ”。微需氧，营养要求高，需动 物血液或血清。 致病物质与致病机制还不清楚。已知与b 型胃炎、消化性溃疡关系密切。 幽门螺杆菌感染呈全球陛分布，人群感染率与社会经济发展水平呈负相关。这种感染在发 展中国家很常见，与过分拥挤的生活条件有关系，而且家族性发病很常见。 目前缺乏其在环境中分布的数据，但是通过传染病学的试验，理论研究以及聚合酶链式反 应( p c r ) 可以证明该菌在自然水体和饮用水中都有分布。该菌的宿主范围是很小的，仅感染 人类和少数动物。全世界大约有5 0 的人部感染了幽门螺杆菌，但是血清反应呈阳性的人却很 少，很多被感染的人一生也不发病。 家庭成员中通过口一口传播已经被确认为导致幽门螺杆菌感染最可能的途径。幽门螺杆菌可 以存活于粘液和呕吐物中，然而在e 1 腔和粪便样品中检测出来却很【盈难。粪一口传播也被认为是 可能的。 被污染了的饮用水被认为是潜在的感染源，但是需要更进一步的调查来确立在水传播中的 各种关系。人类是幽门螺杆菌的主要来源，这种细菌对于氧化消毒剂很敏感。因此，用于防止 饮用水配水系统受到幽门螺杆菌污染的控制措施包括防止人类垃圾污染和充分的消毒。大肠埃 希菌( 或者耐热大肠杆菌) 不能作为指示幽门螺杆菌存在与否的指标。该菌可被水处理中典型 的氯消毒法和氯胺灭活。 2 8 条件致病菌 g - d l ：致病菌是一些不同种类的细菌的统称，它们很少能使健康的人得病，但是却会导致新 生儿、老人、艾滋病人和那些免疫系统受损的人得严重得疾病。g - d - t ：- 致病菌包括铜绿假单胞菌 和其它假单胞菌、嗜水气单胞菌和其它气单胞菌、鸟分支杆菌、黄质菌、克雷伯杆菌、沙雷氏 菌、变形菌、不动杆菌等。条件致病菌广泛存在于环境中，尤其是在水体和水管的生物膜上。 尽管还没有最终确定条件致病菌与水系疾病的爆发有关，但是它们极易引起医疗感染。在热浴 西安建筑科技大学硕二l 二学位论文 盆和澡堂中，铜绿假单胞菌能导致皮炎。鸟分枝杆菌能定植于供水系统中，能够导致肺部疾病 和其它疾病，尤其是对于那些免疫系统受损的病人( 如艾滋病人) 。据传染病学的研究得知鸟分 枝杆菌能够通过饮用水传播，它对氯消毒有一定的抵抗力。 表11 中列出了1 9 8 7 1 9 9 6 年1 0 年问美国爆发的水传播疾病的致病细菌因子l ” 表1 1 1 9 8 7 1 9 9 6 年1 0 年问美国爆发的水传播疾病的致病细菌医i 子 1 3 水体中病原细菌的传统检测方法 对病原微生物的常规检测对于保护公众健康是非常重要的。然而，由于缺少正确和有效的 监测方法，预防和控制介水传播疾病的感染和爆发仍然存在着巨大的障碍。 多年来，普遍用来检测水体中病原体的方法是寻找生物指示剂，通过它们的存在作为污水 污染的证据。理想的生物指示剂应该满足以下标准： 1 ) 在水体中这种生物体在数量上与病原体成比例，并且其存活时间不少于病原体处于肠 道外的存活时间； 2 ) 这种生物体容易检测，其出现的数量会大于任何潜在的病原体； 3 ) 这种生物体在天然水环境中不存在，除非水体已经被污水或者动物排泄物污染。 在2 0 世纪前半叶，许多水质标准是按照大肠菌( c o l i f o r m ) 的浓度制定的。因为那时认为 所有大肠菌都来自粪便。后来，人们越来越意识到总大肠菌数可能成为粪便污染的误导指示剂， 标准应该根据粪便大肠菌( f e c a lc o l i f o r m ) 重新制定l 】。 西安建筑科技大学硕：i 二学位论文 1 3 1 总大肠菌与粪大肠菌的检则 总大肠菌与粪大肠菌的检测采用多管发酵法和滤膜法。多管发酵法是根据大肠菌群细菌能 发酵乳糖、产酸产气以及具备革兰氏染色阴性、无芽孢、呈杆状等有关特性，通过三个步骤进 行检验，以求得水样中的总大肠菌群数。多管发酵法是以最大可能数( m p n ) 来表示检测结果的。 实际上它是根据统计学理论，估计水体中的大肠杆菌密度的一种方法。 总大肠菌检测过程中用到的培养基有：乳糖蛋白胨培养液；三倍乳糖蛋白胨培养液；品红 亚硫酸钠培养基；伊红美蓝培养基。检测步骤： ( 1 ) 将水样作l o 倍系列稀释。 ( 2 ) 初发酵试验 于各装有5 m l 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的5 个试管中( 内有倒管) ，各加10 m l 水样；于 各装有1 0 m l 乳糖蛋白胨培养液的5 个试管中( 内有倒管) ，各加l m l 水样：于各装有1 0 m l 乳 糖蛋白胨培养液的5 个试管中( 内有倒管) ，各加人l m l l 0 倍稀释系列的水样。共计1 5 管，三个 稀释度，将各管充分混匀，置于3 t c 恒温箱培养2 4 h 。 ( 3 1 平板分离 经初发酵试验培养2 4 h 后，将产酸产气及只产酸发酵管，分别接种于品红亚硫酸钠培养基 或伊红美蓝培养基上，置3 7 恒温箱内培养2 4 h ，挑选符合下列特征的菌落，取菌落的一小部 分迸行涂片、革兰氏染色、镜检。 品红皿硫酸钠培养基上的菌落：紫红色，具有金属光泽的菌落；深红色，不带或带金属光 泽的菌落；淡红色，中心色较深的菌落。 伊红美蓝培养基上的菌落：深紫黑色，具有金属光泽的菌落：紫黑色，不带或略带金属光 泽的菌落淡紫红色，中心色较深的菌落。 ( 4 1 复发酵试验 上述涂片镜检的菌落如