（环境工程专业论文）废羽毛生物水解技术的研究.pdf

摘要 角蛋白作为一种硬性蛋白，具有不溶于水和抗分解的性质，一般条件下不溶 解，且不能被一般的蛋白酶水解，因此这给角蛋白的处理提出了难题。我国的角 蛋白资源极其丰富，它们大部分没有被充分利用，有的甚至造成环境污染。而近 年来畜牧业及氨基酸工业的大力发展使得蛋白资源极其紧缺，因此，当前应大力 研究最有效的处理方法使废弃的羽毛角蛋白直接转变成蛋白质或复合氨基酸，使 之能直接得到应用或作为进一步提纯氨基酸的廉价易得的原料，从而变废为宝， 即保护环境又资源利用，这将具有十分显著的经济效益和深远的社会效益。 本课题针对羽毛角蛋白废弃物的资源化利用，进行了如下的研究： 1 、化学法水解羽毛角蛋白的研究 通过对水解介质浓度、固液比、反应时间、反应温度进行单因素实验，确定 了化学法( 酸解和碱解) 水解羽毛角蛋白的最佳工艺条件并进行了最佳水解条件 下的动力学分析。比较分析酸解和碱解羽毛提取复合氨基酸的效果可知，硫酸水 解羽毛角蛋白的能力明显优于氢氧化钠，氨基酸转化率高出1 0 左右。这可能是 由于氢氧化钠水解液采用活性炭脱色，活性炭在脱色过程中对产物具有一定的吸 附作用，从而降低了氨基酸含量。该法存在着高能耗、高物耗的问题，且水解过 程中挥发的气体易腐蚀设备污染环境，水解液的脱色也会使复合氨基酸得率降 低。 2 、角蛋白降解菌的分离选育及鉴定 以某长期堆积腐烂羽毛的土壤为分离源，分离得到六株能高效降解羽毛角蛋 白的细菌( 分别为l l 、l 2 、l 3 、l 4 、l 5 、l 6 ) 。通过对这些菌株降解羽毛能力的 对比实验，证明其中菌株l 1 降解羽毛能力最为突出。该菌株经形态观察和1 6 s r r n a 测序初步鉴定为黄单胞菌，与嗜麦芽窄食单胞菌( s t e n o t r o p h o m o n a s m a l t o p h i l i a ) 相似性达9 8 ， 命名为黄单胞菌 d h h j ( s t e n o t r o p h o m o n a sm a l t o p h i l i ad r m j ) 。迄今为止，国内还未见黄单胞菌降 解羽毛角蛋白的相关报道。该菌株接种于含灭菌处理过的完整羽毛的基础培养基 中，发酵1 天后即可见羽毛有明显脱落，发酵5 天后羽毛已完全脱落，羽梗也有 一定程度的降解。经6 天发酵后降解率可达8 6 6 ，发酵液蛋白质含量最大也可 达2 3 9 8m g m l 。这表明菌株l l 具有较强降解羽毛角蛋白的能力。 3 、菌株d h h j 发酵条件的研究 经优化实验后得到黄单胞菌d h h j 的最佳发酵培养基( g 1 0 0 m l ) i 为：葡萄糖 1 9 、羽毛粉2 5 9 、干酪素0 2 9 、k c l0 0 3 7 3 9 、n a c lo 0 2 9 4 9 、吐温8 0o 4 9 、磷 酸氢二钠：磷酸二氢钾= o 4 ：o 0 3 、p h 7 5 。最适发酵条件为：装液量2 5 m l 2 5 0 m l 、 温度4 0 c 、发酵时间4 8 h 。该条件下黄单胞菌d h h j 的产酶能力及降解羽毛能力 显著高于未优化发酵条件。其中，粗酶液酶活力提高约5 3 倍之多，最大值达 4 9 3 u m l ，蛋白质含量3 4 3 l m g m l ，提高约3 4 倍左右。这表明该菌株具有潜 在的实际开发价值。 采用l 1 6 ( 4 5 ) j e 交实验对黄单胞菌d h h j 与蛋白酶配伍降解羽毛进行了初步 研究，结果表明其初步最佳方案为：菌株d h h j 在最佳发酵条件下降解羽毛角蛋 白4 8 h 后，再加入1 0 0m g m l 木瓜蛋白酶p s i 继续降解反应1 2 h 。验证实验证明 在该种配伍条件下羽毛角蛋白降解更加彻底，蛋白质含量达7 0 6 2 m g m l ，氨基 酸含量达0 8 5 4 m g m l 。 关键词：羽毛角蛋白化学水解法角蛋白降解菌微生物降解角蛋白酶 a b s t r a c t a se n c r u s t e d p r o t e i n ，k e r a t i n h a st h ec h a r a c t e r i s t i c so fu o d i s s o l v e 、 a n t i d e c o m p o s i t i o na n da n t i p a i n a n di ta l s oc a n n o tb ed i s s o l v e di l ln o m a lc o n d i t i o n s s ok e r a t i ni sv e r yd i f f i c u l tt ob ed e l tw i t h a n da tt h es a m et i m eal o to fk e r a t i n m a t e r i a l sa r er e l e a s e di i lc h i n a , b u tt h e yh a v en o tb e e nu s e dp r o p e r l y w i t ht h er a p i d d e v e l o p m e n to fs t o c k b r e e d i n ga n da m i n oa c i di n d u s t r y , t h e d e m a n do fp r o t e i n r e s o u r c ei si n c r e a s i n gt h e s ey e a r s s oi ti sv e r yn e c e s s a r yt or e s e a r c he f f e c t i v e m e t h o d st om a k ew a s t ef e a t h e rc o n v e r tt op r o t e i na n dm i x i n ga m i n oa c i da n dt om a k e i tt ob eu s e dd i r e c t l yo rt ob et h ec h e a pr e s o u r c e sf o rt h ep u r l f yo fa m i n oa c i d b y d o i n gt h i sw e c a l lt u r nw a s t e st ot r e a s u r e sa n dp r o t e c to u re n v i r o n m e n ta n dm a k ef u l l u s eo f t h er e s o u r c e s t h ef o l l o w i n gt h i n g sw e r es t u d i e df o rt h er e u s eo ff e a t h e rw a s t e s ： l 、t h es t u d yo fc h e m i c a lh y d r o l y s i so nf e a t h e rk e r a t i n t h eo p t i m u mh y d r o l y t i cc o n d i t i o n sw e r es p e c i f i e db ys t u d y i n gt h ee f f e c t so f m e d i u mc o n c e n t r a t i o n ，t h ep r o p o r t i o no fs o l i da n dl i q u i d ，t h er e a c t i o nt i m e ，t h e r e a c t i o nt e m p e r a t u r e a n dt h ed y n a m i c sa n a l y s i sw a sd o n eu n d e rt h i sc o n d i t i o n i t s h o w e dt h a tt h ey i e l dw a sh i g h e ri nh 2 s 0 4t h a ni nn a o h b u ta n y w a yt h e r ew e r e m a n yp r o b l e m si nc h e m i c a lm e t h o d ，s u c ha sh i g he n e r g ya n dm a t e r i a lc o n s u m p t i o n ， 1 1 i g hp o l l u t i o na n de q u i p m e n te r o s i o n 2 、t h ei s o l a t i o n a l s c r e e n i n g a n di d e n t i f i c a t i o no f f e a t h e r - d e g r a d i n g m i c r o o r g a n i s m s s i xs t r a i n so fb a c t e r i a ( l 1 、l 2 、l 3 、i a 、l 5 、l 6 ) 、v i t l l1 l i g ha c t i v i t yf o r f e a t h e r - d e g r a d a t i o nw e r ei s o l a t e df r o ms o i l s ，s t r a i nl 1o fw h i c hs h o w e dt h eh i g h e s t a c t i v i t yo ff e a t h e rd e g r a d a t i o nb a s e do nt h e c o n t r a s t i v ee x p e r i m e n t a n da f t e r o b s e r v i n gt h es h a p ef e a t u r ea n ds e q u e n c i n gt h e16 s r r n a ，s t r a i nl iw a si d e n t i f i e d a n dn a m e da ss t e n o t r o p h o m o n a sm a l t o p h i l i ad h h jt e m p o r a r i l yi no u rc o l l e g e s t e n o t r o p h o m o n a sm a l t o p h i l i aw a sf o u n df o rt h ef i r s tt i m et ob ea b l et od e g r a d e f e a t h e r a n ds t r a i nl 1c o u l dm a k et h ei n t e g r a t e df e a t h e rf i b r e sb r e a k d o w na f t e r i n c u b a t e df o ro n ed a y t h ef e a t h e rw a sc o m p l e t e l yd i s i n t e g r a t e db ys t r a i nl 1a f t e r i n c u b a t i o nf o rf i v ed a y s ，a n dt h ec a l a m u sw a sd e g r a d e dp a r t i a l l y t h ed e g r a d i n gr a t e r e a c h e d8 6 6 a n dt h em a x i m u mo fp r o t e i nc o n t e n tr e a c h e d2 3 8 8m g m la f t e rs i x d a y s a l lo ft h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a ts t r a i nl 1p o s s e s s e dt h es t r o n g e rc a p a c i t yo f d e g r a d i n gf e a t h e rk e r a t i n 3 、t h es t u d yo nz y m o l y t i cc o n d i t i o no fs t r a i nd h h j t h eo p t i m u mz y m o l y t i cc u l t u r em e d i u mo fs t r a i nd h h jw a so b t a i n e da f t e rt h e o p t i m i z i n ge x p e r i m e m ：g l u c o s el g ，f e a t h e rp o w d e r2 5 9 ，c a s e i no 2 9 ，k c io 0 3 7 3 9 ， n a c io 0 2 9 4 9 ，t w e e n 8 00 4 9 ，n a 2 h p 0 4 ：k h 2 p 0 4 = 0 4 ：0 0 3 ，p h 7 5 t h eo p t i m u m z y m o l y t i cc o n d i t i o ni s a t4 0 c a n da l4 8 h 诵t l ll o a d i n g2 5 m l 2 5 0 m 1 a n du n d e rt h i s c o n d i t i o nt h ek e r a t i n a s ep r o d u c t i o na b i l i t i e sa n df e a t h e rd e g r a d a t i o na b i l i t i e so fs t r a i n d h h jw e f em u c hb e t t e ru n d e rt h eo p f n n i z e dz y m o l y t i cc o n d i t i o nt h a nu n o p t i m i z a b l e z y m o l y t i cc o n d i t i o n t h ec o n d i t i o n so fh y d r o l y z i n gf e a t h e rb yu s i n gs t r a i nd h h ja n do t h e r p r o t e i n a s e sw e r es t u d i e db yo r t h o g o n a lt e s t i ts h o w e dt h a tt h ei n i t i a t i v eo p t i m i z e d h y d r o l y t i cm e t h o dw a st or e a c t1 2 hw i t h1 0 0m g m lp a p a i np s jc o n t i n u o u s l ya f t e r h y d r o l y z i n gf e a t h e r4 8 hb ys t r a i nd h h ju n d e rt h eo p t i m i z e dz y m o l y t i cc o n d i t i o n i t w a sp r o v e dt h a tu s i n gt h i sh y d r o l y t i cm e t h o dw a sm o r ee f f e c t i v e i nf u t u r et h ei n d e p t h s t u d i e do nt h i ss h o u l db ed o n e c h e nl i ( e n v i r o n m e n t a le n g i n e e r i n g ) s u p e r v i s e db y p r o ，f e s s o r z h o u m 。e i h u a k e y w o r d s ：f e a t h e rk e r a t i n ；c h e m i c a lh y d r o l y s i s ；f e a t h e r - d e g r a d i n gm i c r o o r g a n i s m s ； b i o d e g r a d a t i o n ；k e r a t i n a s e 东华大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本 人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中己明确注明和引用 的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的 内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律 结果由本人承担。 学位论文作者签名：i g m 日期： m 年月) 日 东华大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。 本人授权东华大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在年解密后适用本版权书。 本学位论文属于 不保密四 学位论文作者签名： 日期：) 伽b 年月) 日 i 司群 日期：剐年a 月邶 东华大学硕士学位论文第一章前言 1 1 课题背景 第一章前言 我国的角蛋白资源极其丰富，尤其在现代农业中，大规模的家禽养殖产生了 大量的角蛋白废物，其中羽毛废弃物产量最多，年产量达7 0 多万吨。据测定， 羽毛角蛋白的粗蛋白含量约在8 0 以上，氨基酸含量在7 0 以上，还含有常量 元素、微量元素、维生素以及一些未知生长因子。因此羽毛角蛋白废弃物经过适 当的处理具有十分广泛的用途。我国从二十世纪八十年代左右开始重视羽毛废物 的资源化利用，但大都只是经过简单处理制成羽毛粉后直接出1 ：3 ，换汇率很低； 其中约1 0 一2 0 主要用于制备动物饲料来加以利用，利用率和利用价值都不高， 而另外大部分没有被充分利用，有的甚至造成局部的环境污染，其分泌物所含有 的致病微生物也会对人类健康造成危害。 近年来，随着工业进步、人民生活水平的提高、医疗保健的加强及畜牧业的 发展，动物蛋白质资源的短缺逐渐明显，已慢慢成为我国饲料工业发展的制约因 素；同时氨基酸的应用【1 l 越来越广泛，可用作食品添加剂、饲料添加剂、医药、 化妆品及表面活性剂等等，其需求量的日益扩大也使得国内对氨基酸原料( 蛋白 质) 的短缺尤为严重。目前国际上的氨基酸工业已比较发达，而我国氨基酸工业 发展相对落后，因此为适应我国社会发展的需要，大力发展饲养业，改善人们的 膳食生活水平，缓解氨基酸原料的供求矛盾，大力的研究开发动物蛋白质、氨基 酸及其连锁产品具有十分深远的现实意义。 1 2 角蛋白概述 角蛋白( k e r a t i n ) 是一种不溶性的纤维状动物蛋白质，是外胚层细胞的结构 蛋白，大量以脊椎动物的皮肤、毛发、羽毛、羽茎、蹄、角、爪等结构蛋白存在 于自然界中。角蛋白按成分和结构可分为- 角蛋白和b - 角蛋白。值一角蛋白富含半 胱氨酸残基，二级结构几乎都呈舡螺旋结构，二级结构之间形成大量的二硫键， 主要存在于毛发、羽毛、羽茎、指甲、角等结构蛋白中，具有很好的伸缩性能； 东华大学硕士学位论文 第一章前言 p 角蛋白富含小侧链甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸残基，二级结构几乎都呈b 折叠平 行片层结构，主要存在于爬虫类动物，以天然存在的蚕丝和蜘蛛丝中的丝心蛋白 为代表。 角蛋白具有不溶于水和抗分解的性质，是一种抗性很强的硬性蛋白，其结构 通过分子间二硫键、氢键、盐键和其他交键作用后具有很高的稳定性，在一般条 件下不溶解，且不能被般的蛋白酶( 如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶) 水 解 2 1 。因此这给角蛋白的处理提出了难题。羽毛角蛋白的结构如图1 1 所示。 图1 - 1 羽毛角蛋白的结构 f i g u r e l 一1t h es t r u c t u r eo f k e r a t i n 1 3 羽毛角蛋白废弃物的用途 据测定，羽毛角蛋白的粗蛋白含量约在8 0 以上( 见表1 - 1 ) ，含有丰富的 赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、甘氨酸、胱氨酸等1 0 多种动物所 必需的氨基酸，还含有常量元素、微量元素、维生素以及一些未知生长因子。因 此羽毛角蛋白废弃物经过适当的处理具有十分广泛的用途，主要有以下几个方 面。 表1 - 1 羽毛粉成分分析表【3 1 t a b l e l 一1t h ea n a l y s i so f t h ec o m p o n e n to f f e a t h e rp o w d e r 3 成分l 水分i 蛋白质粗纤维脂肪灰分钙磷合计 羽毛中各成分的含量( ) i5 2 2 8 8 8 00 2 22 9 32 _ 3 10 _ 3 30 0 9 9 9 9 0 1 3 1 动物饲料 4 j 或饲料添加剂嗍 关于利用家禽羽毛做饲料的研究，美国、英国和前苏联相继进行了2 0 多年， 羽毛蛋白在国际上被认为是一种有独特价值的优质蛋白质饲料。我国的羽毛资源 及其丰富，但一直以来没有得到合理的利用，而动物饲料资源的缺乏也在一定程 2 东华大学硕士学位论文 第一章前言 度上制约了养殖业的发展。因此我国大力开发和利用羽毛蛋白饲料资源十分紧 迫。目前国内外对羽毛粉蛋白饲料的产业化生产方法【6 j 主要有高压水解法、化学 水解法、膨化处理法等，其中国内广泛使用的是高压蒸煮水解法，但制备所得的 饲料营养价值不高，且存在耗能多、破坏部分氨基酸等问题。因此为更好地利用 羽毛角蛋白资源并保护环境，当前人们开始关注采用生物技术来处理羽毛粉，提 高羽毛粉的蛋白品质，从而节省家禽日粮中大豆、鱼粉的用量，促进家禽业的发 展。 1 3 2 肥料 由角蛋白废弃物生产的复合氨基酸螯合剂，可与畜禽生长所必需的微量金属 离子反应生成具有环状结构的配位化合物，从而能大大提高微量元素的生物利用 率，另外其稳定常数适中，不受土壤p h 值及其它离子的干扰，可被作物直接吸 收。因此以废弃羽毛为原料水解获得复合氨基酸螯合剂并制取氨基酸微, q b 【7 j ，不 仅能大大提高作物对微量元素的吸收利用率，也可大大降低生产成本。此外，废 弃羽毛还可以水解生产液体氨基酸复合微肥【s 】 1 3 3 农药和医药 角蛋白水解制得的氨基酸及其衍生物、金属络合物对农作物具有杀菌防病和 刺激生长的双重效果【9 】。因此将其作为杀菌剂、杀虫剂、除草剂和植物生长促进 剂的功能，正受到人们越来越多的关注。复合氨基酸溶液可直接注入人体补充营 养，替代部分人血浆，对肝病也有一定疗效。胱氨酸可防治脂肪变性、肝硬化以 及其他肝病，也是治疗膀胱炎、秃顶、脱发、神经病、中毒性病症的特效药。 1 3 4 皮革填充剂和复鞣剂 羽毛经适当的碱降解处理可获得一定分子量的蛋白质混合物，它可用作镉鞣 鞋面革及服装革的填充材料，具有改善皮革的丰满性、弹性及染色性能的特点。 此外，经乙烯基类单体接枝改性后即将羽毛角蛋白用作铬革的复鞣剂，具有优良 的选择填充性，并对铬革染色无影响【。 东华大学硕士学位论文 第一章前言 1 3 5 食用浓缩调味液 羽毛蛋白中含有丰富的谷氨酸、天冬氨酸等鲜味氨基酸。以角蛋白为原料水 解提取胱氨酸后，剩余母液可生产营养丰富、味道鲜美的食用浓缩调味液【1 1 】。这 种方法不但充分利用了蛋白质资源，还消除了以角蛋白为原料生产胱氨酸后剩余 母液的环境污染问题。 1 3 6 薄膜和包装材料 对羽毛进行深加工后能制成可食用的薄膜和蒙皮包装材料，这类产品清晰、 坚固、柔韧、无异味，还能制成香肠等产品。 1 3 7 化妆品和洗涤剂 近年来研究发现羽毛角蛋白是制作化妆品的优质材料。从加工处理后的羽毛 角蛋白中可制得棕榈酰缩氨酸，进一步制成皮肤清洁剂、涂擦剂、口红和化妆品 的湿润剂。 1 4 羽毛角蛋白废弃物的处理利用方法 目前羽毛角蛋白的处理方法主要有传统水解方法和生物技术法。另外，在饲 料加工中还有挤压膨化法、熔炼法等，这些方法在我国还没有普遍应用。 1 4 1 传统水解方法 传统水解方法主要有：化学处理法、高压加热水解法。 化学处理法又包括酸解和碱解，即用盐酸、硫酸、过氧乙酸和氢氧化钠等酸 碱溶液使角蛋白分解【1 4 】。酸解法早在2 0 世纪6 0 年代就有报道，主要用于饲 料工业和氨基酸工业，它是将一定量的角蛋白与一定浓度和体积的酸混合后加热 水解，然后中和干燥。近年来对羽毛水解制备复合氨基酸采用不同酸( 盐酸、硫 酸) 水解工艺的研究也有不少 1 5 - 1 6 3 ，结果表明羽毛硫酸水解工艺是最佳生产工 艺，因为采用盐酸水解原料易挥发、易腐蚀设备污染环境，水解液采用活性炭吸 附脱色会强烈吸附氨基酸，使复合氨基酸得率降低，而采用硫酸水解挥发性小， 水解液采用氢氧化钙中和脱酸脱色，造成氨基酸的损失相对较少，从而得到较高 的氨基酸转化率，且中和产生的硫酸钙也可作为一种良好的饲料添加剂，与盐酸 4 东华大学硕士学位论文第一章前言 法相比其对环境的污染较小，更适合工业化的生产。碱解法主要是用氢氧化钠水 解羽毛，采用该方法较易引起氨基酸构型的变化，其水解产品品质及得率都较酸 解法差。从总体上来讲，采用化学法均会在处理过程中破坏部分氨基酸，酸碱的 中和也会产生大量的盐分，而产品若用作饲料或饲料添加剂会抑制动物的生长。 高压加热水解法是目前我国大多采用的生产角蛋白饲料的方法，其工艺流程 一般为：羽毛清杂、投入水解灌，直接或间接通入蒸汽，水解成块状蛋白质凝胶， 烘干粉碎后用作饲料。产品质量取决于时间、温度、压力等工艺参数。该方法工 艺设备落后，工艺参数不易控制，水解效果不佳，产品质量不够稳定，氨基酸消 化率低或蛋白质严重变性，生产过程中需要锅炉、水解罐、烘干箱等设备，生产 成本也比较高。而且持续过度的蒸汽加热处理会破坏一些热敏性的氨基酸，同时 也会降低某些氨基酸的消化率或利用纠r n 。 1 4 2 生物技术法 生物技术法较之上述的传统水解法具有诸多优点，如反应条件相对温和、对 环境污染小、可节省能源等。因此近年来已成为国内外的研究热点，但至今未见 产业化技术和产品。该方法主要包括微生物降解和酶降解两种。 1 。4 2 1 角蛋白的微生物降解 角蛋白具有不溶于水和抗分解的性质，这些性质取决于以下几个方面；胱氨 酸残基所提供的分子间双硫键的高度交叉连接、氢键的作用、分子问相互的疏水 作用。因为其稳定的化学结构，所以角蛋自在一般条件下不溶解，也不能被一般 的蛋白酶( 如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶) 水解。然而在自然界中并未发 现有角蛋白废弃物的积聚，这是由于自然界中能降解角蛋白的微生物的存在。早 在十九世纪初期，人们就已发现有一些高等生物如衣蛾、兀鹰和苍鹰能降解角蛋 白 1 8 1 ，而自1 8 9 9 年w a r d 报道了真菌马爪甲团囊菌( o n y g e n ae q u i n a ) 能分解角 蛋白以来，到目前为止己发现有3 0 多种微生物具有降解角蛋白的能力，即能分 泌出降解角蛋白的酶，其中包括细菌、放线菌和真菌。下面简要介绍一下这方面 的研究进展。 ( 1 ) 细菌 可降解羽毛角蛋白的细菌发现比较晚，1 9 9 0 年w i l l i a m s 等1 1 9 】从家禽养殖废 东华大学硕士学位论文第一章前言 物的高温厌氧消化系统中获得了能够降解羽毛的地衣芽孢杆菌( b a c c i l l u s l i n c h e n i f o r m i sp d w - 1 ) ，其降解羽毛角蛋白产物的可消化性和营养价值与饲用大 豆蛋白相同，但该菌种只能降解高温蒸煮过的羽毛，而从该消化系统中分离出的 弧菌科细菌( f i _ b r i o n a c e a e ) 在2 天内可使未蒸煮过的羽毛完全降解2 0 1 ，包括羽 小枝和羽轴。1 9 9 3 年a m l o 等1 2 1 】分离到一株能降解不同纤维性蛋白的嗜热杆菌 p - 0 0 1 a ( t h e r m o p h i l i cb a c i l l u ss p e c i e sp - 0 0 1 a ) 1 9 9 5 年胡介卿等1 2 2 从鸬鹚 ( p h a l a c r o c o r o xc a r b o s i n e n s i s ) 肠道分离出的f 5 变异株枯草芽孢杆菌 ( b a c c i l l u s s u b t i l i s ) 具极强的分解能力。1 9 9 6 年f f i e d r i e h l 2 3 分离到一株利用羽毛角 蛋白的嗜热厌氧菌闪光杆菌( f e r v i d o b a c t e r i u mp e n n a v o r a n s ) 。2 0 0 1 年m r o z s 等凹1 又从部分降解的羽毛中分离到一株能降解角蛋白的地农芽孢杆菌，在温度 为4 7 c 、p h 为7 0 的发酵条件下，该菌表现出极强的降解能力。同年姚淑敏等 1 2 5 从长期堆积废羽毛的土壤中分离筛选出一株芽孢杆菌，其摇瓶发酵的最佳条 件为：温度为4 2 、d h 为7 5 、转速1 2 5 r p m ，最高酶活力可达2 5 2 0 u m l 。近 年来对降解羽毛的地衣芽孢杆菌的研究还在不断深入1 2 眦7 i 。 ( 2 ) 放线菌 许多放线菌也能降解角蛋白，但多为链霉菌属。1 9 5 8 年n o v a l 等【2 8 】首先发 现弗氏链霉菌( s t r e p t o m y c e sf r a d i a e ) 能降解角蛋白，并对产生的角蛋白酶进行 了详尽的研究，提出了角蛋白复合酶学说。1 9 9 3 年丁正民等1 2 9 1 分离纯化到一株 分解羽毛的放线菌s s 1 ，发酵5 天就不见成形鸡毛。1 9 9 4 年涂国全等 3 0 - 3 1 1 分离 到具极强分解能力的s - 2 2 1 菌株，定名为弗氏链霉菌s - 2 2 1 变种( s t r e p t o m y c e s f r a d i a e 删s 2 2 1t u ) 。1 9 9 5 年b r i g i t t eb o c k l e 掣珥发现密旋链霉菌( s t r e p t o m y c e s p a c t u m ) 可降解羽毛，并提纯到一种丝氨酸型蛋白酶。1 9 9 9 年p h i l i p p e b r e s s o l l i e r 3 3 】 又分离到一株微白黄链霉菌( s t r e p t o m y c e sa l b i d o f l a v u s ) 。2 0 0 0 年s z a b o 等 3 4 1 分 离到一株嗜热的禾生链霉菌( t h e r m o t o l e r a n ts t r e p t o m y c e sg r a m i n o f a c i e n t s ) ，该菌 在4 0 时可有效地降解角蛋白。 ( 3 ) 真菌 在众多微生物中，最早发现能降解角蛋白地就是真菌。早在1 8 9 9 年w a r d 就发现马爪甲团囊菌。1 9 2 6 年n a n n i z z i 提出环癣真菌可水解角蛋白。在许多能 降解角蛋白的丝状真菌中最典型的是发藓菌属。1 9 8 0 年j a i n 等【3 5 1 研究发现马发 6 东华大学硕士学位论文第一章前言 藓菌( t r i c h o p y t o ne q u i n u m ) 和轮枝孢菌( v e r t i c i l l i u mt e n u i p e s ) 具有较高的羽毛 降解能力。1 9 9 5 年s i n g h 等f 3 6 】从2 1 种真菌的研究中发现猴发藓菌( t r i c h o p y t o n s i m i ) 降解羽毛角蛋白的能力最强。2 0 0 0 年t a w f i k 等1 3 7 】从患有骨藓的病人皮肤 中分离到发藓菌t r i c h o p y t o nm e n t a g r o p h y t e s 。此外，1 9 9 3 年罗文等【3 8 】从土壤中分 离到一株霉菌，初步鉴定为串孢属菌( c a t e n u l a r i as p ) 。1 9 9 6 年s a n t o s l 3 9 】报道分 离到一株烟曲霉( a s p e r g i l l u s f u m i g a t u s ) 。2 0 0 1 年中国科学院的曹军等 4 0 l 也从土 壤中分离到一株有效降解角蛋白的栖土曲霉( a s p e r g i l l u s t e r t e r r i c o l a ) ，对其进行 了u v 射线的处理后研究了发酵条件的优化。g r a d i s a r 等【4 h 2 1 分离到一株微孢长 囊头孢霉菌( d o r o t o m y c e sm i c r o s p o r u s ) ，它能降解人体角质层，不产生毒素，还 能降解指甲和蹄角。m u h s i n 等4 3 】也从污泥中分离到两种d e r m a t o p h y t e s 和两种 s a p r o p h y t e s ，能降解人发、鸡毛和羊毛。k a u l i 删等人也从一百种鸟类的羽毛上分 离到1 4 种( 分别属于1 0 个属) 能够利用角蛋白的真菌( c h r y s o p o r i u m 、 m a l b r a n c h e a 、c h a e t o m i u m ，s e p e d o n i u m ，m i c r o a s c u s 等1 。 1 4 2 2 微生物产角蛋白酶的影响因素及发酵条件的研究 ( 1 ) 影响因素 微生物发酵产酶的量及酶活性的大小不仅因菌种的不同而不同，它还与适合 的发酵培养基、发酵过程中合理的条件控制以及其它条件有关，这些因素都对酶 的形成产生极大的影响，因此应针对不同的菌种研究其最佳的发酵条件。 发酵培养基 培养基是指人工配制的适合于微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养物质， 也是微生物生长、繁殖和分泌代谢产物的基地。培养基成分一般包括碳源、氮源、 无机盐类和生长因子等几方面，其组成不仅影响微生物的生长发育和酶的产量， 而且与生产成本密切相关。 碳源碳源是微生物营养物质的重要成分，是提供微生物生命活动与构成微 生物酶的主要原料。可作为微生物碳源的物质很多，如葡萄糖、蔗糖、麦芽 糖及各种含淀粉的农副产品( 玉米粉、米糠等) 。目前各种淀粉和其水解物如 糊精、葡萄糖等都是发酵工业最常用的碳源。不同的微生物对不同碳源物质 的利用率不同，因此应通过科学的实验选择适合该微生物适合的碳源。 氮源氮源对微生物发酵产酶尤为重要，氮素是组成微生物细胞蛋白质( 包括 7 东华大学硕士学位论文 第一章前言 各种酶) 和核酸的主要元素之一。氮源分为无机氮源和有机氮源两类，其中有 机氮源包括各种蛋白质、蛋白胨、多肽和氨基酸以及天然原料如酵母膏、酪 蛋白、鱼粉、豆饼粉中的蛋白质物质：无机氮源是指含氮素的无机化合物， 如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等。 碳氮比( c m ) 除碳源和氮源本身影响产酶微生物的生长繁殖和酶的产量 外，碳与氮的比例对产酶的影响也十分显著。碳氮l l ( c n ) 是指培养基中碳元 素的总量与氮元素的总量之比。不同的菌种或酶对培养基的碳氮比要求不 同，而且不同生长阶段所需的碳氮比耶不一样。 无机盐类无机盐类也是微生物生长所不可缺少的营养物质，它包括硫酸 盐、磷酸盐、氯化物，以及含钾、镁、钠等化合物，此外还有锌、铜等微量 元素。这些无机元素在微生物细胞中的作用各不相同，有的参与组成细胞成 分，有的参与酶的组成、有的参与细胞的能量代谢，有的则对培养基的p h 或渗透压起调节作用。无机盐类对产酶的影响往往因浓度而异，一般在低浓 度时有利提高酶的产量，而高浓度则容易产生抑制作用。 培养基的p h 值培养基的p h 即指培养基溶液的酸碱度。各类物质生长繁 殖所需的最适p h 是不同的，所以配制培养基时应根据微生物的需要调节p h 值。一般细菌、放线菌生长的最适p h 为中性至微碱性，而真菌则喜爱偏酸 性。 发酵过程的条件控制 温度温度对产酶量的影响很大。每种微生物生长、繁殖、产酶过程都有最 适温度范围，温度过低过高都会使微生物生长繁殖速度极度下降甚至死亡， 而在这个最适温度范围内有一个最适温度，此温度下微生物生长最好、繁殖 最快、产酶量最大、酶活力最高。因此在发酵产酶过程中应对温度严格控制。 酸碱度( p n 值) 同温度一样，酸碱度也是影响菌种生长繁殖和发酵产物生成 的重要条件。不同微生物对p i - i 值的要求各不相同。为保证产酶量，发酵液 的p h 值必须控制在一定范围内，p h 值过低过高都会影响菌种的代谢活动。 而在发酵过程中p h 值也会因产物的形成及培养基营养物的消耗而发生变 化，所以应选择缓冲能力较强、灭菌后p h 值改变不太大的培养基、保证通 气量，从而维持p h 值的稳定。 东华大学硕士学位论文 第一章前言 通气量( 溶解氧1 根据微生物对氧气的要求，有厌氧、兼氧和好氧三种不同 发酵类型。本研究拟分离纯化好氧菌种，因此在发酵过程中必须供给微生物 足够的氧气，氧气供应不足将直接影响微生物的生长发育和酶的产生，尤其 在培养液中的微生物不能从空气中直接吸收氧，只能利用溶解于水中的氧气 进行呼吸。本实验采用三角瓶摇瓶发酵培养，因此通过对振荡条件和三角瓶 装液量的控制保证通气量。 其它物质的影响 添加表面活性剂常用来促进发酵生产，其中非离子型的表面活性剂用得较 多。一般认为其产生的促进作用在于改善细胞的通透性，增大细胞膜的透过能力， 有利于提高细胞外酶的产量。同时，表面活性剂也可能改善通气的效果，有些可 能具有增强酶的稳定性和催化能力，从而提高酶的活力。 ( 2 ) 发酵条件的研究 要使微生物角蛋白酶真正产生经济效益，就必须实现工业化生产，因而研究 其发酵条件是十分必要的。 张道海【4 5 】等报道了曲霉f 2 3 产角蛋白酶的发酵最适条件：n 源以玉米浆最 好，其次为硫酸铵和豆粉：碳源以玉米粉为最佳：玉米浆和玉米粉以l ：l 配比为 最佳；p h 在6 5 0 5 之间，温度在2 8 c 3 2 之间，转速为1 8 0 r r a i n ，发酵1 0 2 h 酶活性达2 3 8 k u m l 。张道海、李楠m 报道曲霉a 2 8 8 最适发酵产酶条件：起始 p h 为7 5 8 0 ，温度为2 8 c 3 2 c ，时间为6 0 7 0 h ，酶活高达2 5 0 0 k u g 曲。姚 淑敏等阎从长期堆积废羽毛的土壤中分离筛选出一株芽孢杆菌，其摇瓶发酵的 最佳条件为：温度为4 2 。c 、p h 为7 5 、转速1 2 5 r p m ，最高酶活力可达2 5 2 0 u m l 。 1 4 2 3 角蛋白的酶降解 ( 1 ) 角蛋白酶的理化性质 1 9 6 3 年n i e k e r s o n 等 4 7 1 首次提出将具有分解角蛋白活性的酶称为角蛋白酶 ( k e r a t i n a s e ) 。角蛋白酶属于诱导型酶，需外源诱导物诱导而生，具有专一降解 天然角蛋白的功能。不同的菌种所产生的角蛋白酶存在一定的差异，这表现在酶 的分泌方式、酶的结构、组成、稳定性、反应最适温度、最适p h 值等方面。有 些菌以产生胞内酶为主，有些则以分泌胞外酶为主，霉菌般既分泌胞内酶又分 9 东华大学硕士学位论文 第一章前言 泌胞外酶。目前主要集中在胞外酶的研究，对胞内酶研究很少。根据最适p h 值 的不同可将角蛋白酶分为酸性酶( 最适p h c a 氨基酸含量 b a c 由极差分析结果，可确定各因素水平的最佳组合为： 对蛋白质含量来说：a 4 8 4 c 2 对氨基酸含量来说：a 2 8 4 c 2 由于上述三个指标的实验结果并不能达成一致，所以以下进行综合平衡以确 定最佳方案。 因素a ：对氨基酸含量来说是第二位的次要因素，取a 2 最好；对蛋白质含 量取最好，但由于a 对这个指标是最次要的因素，所以综合来看，因素a 可 取a 2 。 因素b ：对两个指标来说，均以b 4 为最佳水平，故取b 4 。 因素c ：对蛋白质含量和氨基酸含量均取c 2 最好，故取c 2 。 综上所述可得菌株d 舢与蛋白酶配伍降解羽毛初步最佳方案为a 。b 4 c 2 ， 即菌株d h h j 在最佳发酵条件下降解羽毛角蛋白4 8 h 后，再加入1 0 0m g m l 木 瓜蛋白酶p s i 继续降解反应1 2 h 。由于正交实验中没有该种组合，所以对上述方 案做验证实验，结果表明在该种配伍条件下羽毛角蛋白降解更加彻底，蛋白质含 5 8 东华大学硕士学位论文第四章角蛋白降解菌株发酵条件的优化研究 量达7 0 6 2 m g m l ，氨基酸含量达o 8 5 4 m g m l 。这说明通过菌株d h h j 与蛋自酶 配伍降解羽毛来提高产物得率的方法是可行的，但由于本实验研究时间有限，只 针对上述三种影响因素进行了初步的研究，今后需对其最佳配伍条件做进一步的 研究。 4 3 本章小结 本章对本实验室分离所得的黄单胞菌d h i - i j 进行了发酵条件的优化研究，并 对该菌株与蛋白酶配伍降解羽毛的条件进行了初步的研究。得到以下结论： 1 、经优化实验后得到黄单胞菌d h h j 的最佳发酵培养基( r d l o o m l ) 为：葡萄 糖1 9 、羽毛粉2 5 9 、干酪素o 2 9 、k c io 0 3 7