（环境工程专业论文）微生物絮凝剂的菌株筛选、培养条件优化与应用研究.pdf

微生物絮凝剂的菌株筛选、培养条件优化与应用研究 捅晏 生物絮凝剂由于其高效、无毒、无二次污染、可自行降解及使用范围广的特点， 其开发与应用研究一直是近年来生物制剂领域的热点。为了从活性污泥中获德低成 本，高效率的絮凝菌株，并初步研究絮凝菌株工业化大规模生产的可行性，本论文做 了从前期菌株分离到后期发酵罐培养的一系列研究工作。首先从三种不同的活性污泥 中通过富集、初筛、复筛，分离出了四种絮凝性能良好的絮凝菌株：b 一0 4 、b - 2 0 、b - 4 7 、 m 0 3 。通过染色实验分别观察了各絮凝菌的形态。用廉价的鱼血培养基对这四株菌进 行了培养，发现此廉价培养基培养的菌株絮凝性能较好，可以作为絮凝菌株培养的替 代培养基。考察了不同絮凝条件下这四株菌的絮凝性能，包括不同的环境p h 、不同 的静沉时间、不同的高温处理、不同的助凝剂投加量及不同的絮凝菌株投加量。结果 表明絮凝菌株在碱性环境下有更高的絮凝率；静沉时间越长，絮凝效果越好：高温处 理发现菌株的絮凝性能并没有减弱，反而加强，这说明这些絮凝菌株中含有糖类絮凝 物质。并测定得到了助凝剂氯化钙及发酵培养上清液的最佳投加量。之后对絮凝菌 b 一2 0 进行了热诱变和紫外诱变实验。比较了热诱变后得到的菌株b - 2 0 2 2 与原菌株的 絮凝性能差异，结果显示絮凝性能确实有所提高；紫外诱变得到的传代稳定菌株 b - 2 0 2 2 2 5 与原菌株相比，絮凝性能提高了2 4 。为了通过改善培养条件提高菌株的 絮凝性，进行了l 9 ( 3 4 ) 正交实验，考察培养液初始p h 、培养温度和摇床转速的改变 对四株菌絮凝性能的影响；并对菌株b - 0 4 进行了单因素实验；测定了四株菌的生长 曲线，及不同培养时间菌株絮凝率和发酵液p h 的变化。为了能将絮凝菌株投向工业 化生产，对絮凝菌b 0 4 进行了发酵罐培养研究，并根据实验数据得到了菌株生长速 率模型、基质消耗速率模型和絮凝产物生成速率模型。为了能够对絮凝菌株的化学性 质做进一步分析，从而对絮凝机理有更深入的认识，对絮凝菌株b - 0 4 进行了提纯研 究，测定了提纯物的糖和蛋白质含量，并对提纯物进行了紫外和红外图谱测定。对这 些化学测试的分析初步表明，菌株b - 0 4 中的絮凝物质主要是糖类物质a 对絮凝菌株 的实际应用效果进行了测试，测试内容包括对染料溶液、活性炭溶液、模拟废水的色 度、浊度和c o d 的去除能力，测得b 一2 0 、b 一4 7 对染料废水色度的去除率为8 0 左右， b - 0 4 为7 0 左右，m 0 3 为6 0 左右；四株菌对染料废水c o d 的去除率都达到8 0 以上；b 0 4 对活性炭溶液的色度、浊度和模拟废水c o d 的去除率都达到9 5 以上。 本论文开发出的絮凝菌株b - 0 4 絮凝能力强，絮凝粘度高，本论文已初步研究了其工 1 1 1 东华大学硕士学位论文 业化生产应用的可能性，b 一0 4 已可通过发酵罐大规模生产，并能应用于工业废水颗粒 悬浮物、色度、浊度、c o d 的去除。其它三株高絮凝率菌株b 一2 0 、b 一4 7 、m 一0 3 所具 有的良好絮凝能力和稳定传代性能也为其工业化生产和应用提供了可靠的保障。 关键词 微生物絮凝剂，筛选，诱变，培养条件优化，速率模型，化学性质分析 i v 微生物絮凝剂的菌株筛选、培养条件优化与应用研究 a b s t r a c t w i t hp r o p e a i e so f h i 曲f l o c c u l a t i n ge f f i c i e n c y , w i t h o u tt o x i c i t ya n ds e c o n dp o l l u t i o n , s e l f - d e g r a d a b i l i t ya n dw i l da p p l i c a t i o n ，t h er e s e a r c ho nd e v e l o p m e n ta n da p p l i c a t i o no f b i o f l o c c u l a n th a sb e e naf o c u so f t h ea r e ao f b i o l o g i c a lp r e p a r a t i o ni nr e c e n ty e a r s f o rt h e p u r p o s eo fo b t a i n i n gm i c r of l o c c u l a n tw i t hl o wc o s ta n dh i 曲e f f i c i e n c ya n de x p l o r i n gt h e p r o b a b i l i t yf o rl a r g es c a l ei n d u s t r i a lm a n u f a c t u r eo f m i c r of l o c e u l a n t ，as e r i e so f r e s e a r c h e s w e r ec a r r i e do u tf r o ms c r e e n i n go f m i c r o b e sw i t hf l o c c u l a t i n ga b i l i t yt ob a t c hf e r m e n t a t i o n o fb i o f l o c c u l a n ti nt h i sp a p e r f i r s to fa l l ，f o u rk i n d so ff l o c c u l a t i n gm i c r o b e sw i t hg o o d f o c c u l a t i n ga b i l i t yw h i c hw e r eb 一0 4 、b - 2 0 、b 一4 7a n dm 一0 3w e r eo b t m n e db ye n r i c h m e n t ， f i r s ts e l e c t i o na n dr e s e l e c t i o nf r o mt h r e ek i n d so fa c t i v a t e ds l u d g e s t h em o r p h o l o g yo f t h e s ef o u rm i c r o b e sw a so b s e r v e db yc o l o r a t i o n a n dt h e s ef l o c c u l m i n gm i c r o b e sw e r e c u l t i v a t e dw i t hl o w c o s tf i s h - b l o o dc u l t u r em e d i u m ，g e t t i n gt h er e s u l to fp r e s e n t i n gf a i r l y g o o df l o c c u l a t i n ga b i l i t ya f t e rt h ec u l t i v a t i o n , w h i c hi n d i c a t e dt h a tt h ef i s h - b l o o dc u l t u r e m e d i u mc a l lb eu s e da ss u b s t i t u t ec u l t u r em e d i u mf o rc u l t i v a t i o no ff l o c c u l a t i n gm i c r o b e s t h ef l o c c u l a t i n ga b i l i t yu n d e rd i f f e r e n tf l o c c u l a t i n gc o n d i t i o n sw e r ed e t e r m i n e d ，i n c l u d i n g p ho fs o l u t i o n , l e n g t ho fs e d i m e n t a t i o nt i m e ，d i s p o s a lo fh i g ht e m p e r a t u r e ，v o l u m e so ft h e s o l u t i o no fc o a g u l a n ta i da n dv o l u m e so ft h es u p e r n a t a n to ff l o c c u l a t i n gm i c r o b e s t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ef l o c c u l a t i n gm i c r o b e sp r e s e n t e dh i 曲e rf l o c c u l a t i n ga b i l i t yu n d e r a l k a l i n ee n v i r o n m e n ta n dw i t hl o n g e rs e d i m e n t a t i o nt i m e ；t h e r ew e r es u g a rc o n t a i n e di n t h em i c r o b e s ，a st h ef l o c c u l a t i n ga b i l i t yw e r en o td e c r e a s e da n di n c r e a s e do nt h ec o n t r a r y a f t e rt r e a t m e n tw i t hh i 曲t e m p e r a t u r e m o r e o v e r , t h eo p t i m a lv o l u m e so fs o l u t i o no f c o a g u l a n ta i d a n ds u p e m a t a n to ff l o c c u l a t i n gm i c r o b e sw e r eg o t a f t e rt h a t ，t h e f l o c c u l a t i n gm i c r o b eb 2 0w a si n d u c e du n d e rh i ta n du v r a d i a t i o nc o n s e c u t i v e l y b 一2 0 2 2 o b t a i n e da f t e rh i ti n d u c i n ga n db - 2 0 2 2 2 5g o ta f t e ru vr a d i a t i o nb o t hs h o w e dh i g h e r f l o c c u l a t i n ga b i l i t yc o m p a r e dw i t hb 一2 0 l 9 ( 3 4 ) o r t h o g o n a le x p e r i m e n t sw e r ec a r r i e do u tt o r e s e a r c ht h ei n f l u e n c eo ft h ec h a n g ei ni n i t i a lp ho fc u l t u r em e d i u m ，c u l t u r et e m p e r a t u r e a n dr o t a t i n gs p e e do fs h a k e ro nt h ef l o c c u l a t i n ga b i l i t yo ft h ef o u rm i c r o b e si no r d e rt o i m p r o v et h ef l o c c u l a t i n ga c t i v i t yb yt h ei m p r o v e m e n to fg r o w t hc o n d i t i o n s f u r t h e rm o r e ， s i n g l ef a c t o re x p e r i m e n tw a sc a r r i e do u to nb 一0 4 t h eg r o w t hc u r v e so fc e l l so ft h e s e m i c r o b e sa sw e l la st h ef l o c c u l a t i n ga b i l i t ya n dp ho fc u l t u r em e d i u mi nd i f f e r e n tc u l t u r e t i m ew e r ed e t e r m i n e d b a t c hc u l t i v a t i o no fb 一0 4w a sc a r r i e do u tf o ra p p l y i n gt h e f l o c c u l a t i n gb a c t e r i ai n t oi n d u s t r y , a n dt h r e er a t em o d e l so ft h ed e v e l o p m e n to fb a c t e r i a , t h ec o n s u m p t i o no fc a r b o na n dt h ep r o d u c t i o no ff l o c c u l a t i n ga g e n tw e r eg o ta c c o r d i n gt o t h ee x p e r i m e n t a ld a t a f o rt h ep u r p o s eo fad e e p e ru n d e r s t a n d i n go ft h ec h e m i c a l v 东华大学硕士学位论文 c h a r a c t e r i s t i c sa n dt h ef l o c c u l a t i n gm e c h a n i s mo fb 一0 4 ，s o m ec h e m i c a le x p e r i m e n t sw e r e c a r r i e do n tb ye x t r a c t i n gt h ef l o c c u l a t i n ga g e n tb e f 一14f r o mb - 0 4 ，d e t e r m i n i n gt h ec o n t e n t o fs u g a ra n dp r o t e i ni nb e f 一1 4a n dt h eu va n di n f r a r e ds p e c t r u mm a po fb e f 一1 4 t h e a n a l y s i st ot h e s ec h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c si n d i c a t e dp r i m a r i l yt h a ts u g a ri s t h em a i n f l o c c u l a t i n gs u b s t a n c ei nb 一0 4 t h ep r a c t i c a la p p l i c a t i o ne f f e c to f t h e s ef o u rm i c r o b e sw e r e a l s od e t e r m i n e di nt h i sp a p e r , i n c l u d i n gt h er e m o v a la b i l i t yt oc h r o m a ，t u r b i d i t ya n dc o d o fd y es o l u t i o n ，a c t i v ec a r b o ns o l u t i o na n ds i m u l a t e dw a s t e w a t e rs o l u t i o n t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h ef l o c c u l a t i n gr a t e so ft h e s ef o u rm i c r o b e st oc o do fd y es o l u t i o nw e r ea l l m o r et h a n8 0 ，a n dt h a to fb 一0 4t oc h r o m aa n dt u r b i d i t yo fa c t i v ec a r b o ns o l u t i o na n d c o do fs i m u l a t e dw a s t e w a t e rs o l u t i o nw e r ea l lm o r et h a n9 5 t h ew h o l ee x p e r i m e n t d e v e l o p e dt h ef l o c c u l a t i n gm i c r o b eb 一0 4w i t hh i g hf l o c c u l a t i n ga b i l 时a n dv i s c i d i t y , r e s e a r c h e dt h ep r o b a b i l i t yo fi n d u s t r i a l p r o d u c t i o na n da p p l i c a t i o no fb 一0 4p r i m a r i l y , p r o d u c e db 0 4c o s m i c a l l yb yb a t c hc u l t i v a t i o na n da p p l i e db 0 4i nt h er e m o v a lo fg r a i n s u s p e n d ，c h r o m a ，t u r b i d i t ya n dc o do fi n d u s t r i a lw a s t e w a t e r t h eg o o df l o c c u l a t i n g a b i l i t ya n ds t a b l ep r o p a g a t i n gc a p a b i l i t yo fb 一2 0 ，b 一4 7a n dm 一0 3a l s op r o v i d e dr e l i a b l e a s s u r a n c ef o rt h e i ri n d u s t r i a lp r o d u c t i o na n d a p p l i c a t i o n k e yw o r d s l i uj i a ( e n v i r o n m e n t a le n g i n e e r i n g ) s u p e r v i s e db y ：z h a ox i a o x i a n g b i o f l o c c u l a n t ，s c r e e n i n g ，i n d u c i n g ，o p t i m i z a t i o no fg r o w t hc o n d i t i o n s ，v e l o c i t ym o d e l ， c h e m i c a lp r o p e r t ya n a l y s i s v l 微生物絮凝剂的菌株筛选、培养条件优化与应用研究 符号说明 d d 原悬液吸光度； f 不同的静置沉淀时间； o 腰。试剂加入后上清液吸光度； 置培养液中活性细胞浓度k g 埘4 ； 活性细胞生长速率培m - 3 ，= 鲁； 叫胞比生长速率，= 要； s 培养液中碳源浓度k g 聊一。 基质消耗速率堙m - 3 , 一，= 警； ，培养液中絮凝性产物浓度堙r 用一； d o 溶解氧百分数； ，。菌体对基质的得率因子堙堙一5 m j 维持常数堙k g ； 儿最大比生长速率 ； 屯吨质半饱和常数姆m 。3 ； 非生长偶联的产物形成系数堙k g 一h 一。 x i 微生物絮凝剂的菌株筛选、培养条件优化与应用研究 学位论文原创陛声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本入在 导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已明确注明和引用的内容外， 本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本 人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：i l 仡 日期：_ “年；月0 e t 东华大学硕士学位论文 学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权 可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在年解密后适用本版权书。 本学位论文属于 不保密 。 学位论文作者签名：l 纯 日期；知口年明l 阳 指导教师签名：赵柑埠 日期：动刀6 年多月争日 微生物絮凝剂的菌株筛选、培养条件优化与应用研究 第一章绪论 1 1 微生物絮凝剂的概念与分类 微生物絮凝剂( m i c r o b i a lf l o c c u l a n t 或b i o f l o c c u l a n t ) 是高效、无毒、无二次污染、 能自行降解，使用范围广的新一代絮凝剂心1 。使用微生物絮凝剂进行絮凝，易于实 现固液分离，形成沉淀物少【。由于微生物絮凝剂的优点非常突出，其研制和应用近 年来一直是水处理领域的热点。 微生物絮凝剂的絮凝性是由产絮微生物本身或其在培养后期产生的次级代谢产 物所引起的。这种次级代谢产物结构特殊，分子量大，能够吸附一些悬浮物质，主要 包括蛋白质1 3 “、多糖1 5 用、脂类、纤维素1 8 】、d n a l 9 培物质。根据来源不同，微生物絮 凝剂可分为三类i l 】： ( 1 ) 直接利用微生物细胞的絮凝剂：如某些细菌、霉菌、放线菌和酵母，它们大 量存在于土壤、活性污泥和沉积物中。 ( 2 ) 利用微生物细胞提取物的絮凝剂；如酵母细胞壁的葡萄糖、甘露聚糖、蛋白 质和n 一乙酰葡萄糖胺等成分均可作为絮凝剂。 ( 3 ) 利用微生物细胞代谢产物的絮凝剂：微生物细胞分泌到细胞外的代谢产物， 主要是细菌的荚膜和黏液质，除水分外，其余主要成分为多糖及少量的多肽、蛋白质、 脂类及其复合物。 传统的絮凝剂有无机絮凝剂、有机絮凝剂，它们虽然絮凝效果良好，但是价格昂 贵，使用量大，且会造成二次污染，对环境甚至人体产生危害。而与传统的絮凝剂相 比，微生物絮凝剂具有絮凝效率高、成本低、无污染、易生物降解等优点。这在实际 应用中可用低投资换来更好的水处理效果和零环境污染，为生态环保、可持续发展作 出贡献。1 9 8 1 年，欧洲生物技术联盟( e f l 3 ) 将控制污染的微生物絮凝剂定为环境生物 技术的一种，我国也在生物技术中长期发展纲要中将开发微生物絮凝剂作为明确 的方向之一。 东华大学硕士学位论文 1 2 微生物絮凝剂产生菌 目前已报道的可产生絮凝性的微生物有很多，包括细菌o o - n 】、霉菌 z 2 - z s l 、放线菌 协 】、酵母菌 1 8 - 2 0 】等。至今发现的具有絮凝性的微生物达3 2 个种。广泛分布于各种 土壤、污水之中，其中细菌1 8 种，分别为粪产碱菌属( a l c a l i g e n e sf a e e a l i s ) 、协腹产 碱杆菌( a l c a l i g e n e sl m u s ) 、渴望德莱氏菌( a l c a l i g e n e sc u p i d u s ) 、芽孢杆菌属( b a c i l l u s s p ) 、棒状杆菌( c o r y n e b a c t e r i u mb r e v i c a l e ) 、暗色孢属( d e m a f i u ms p ) 、草分枝杆 菌属( m y c o b a c t e r i u r np h l e i ) 、红平红球菌( r e r y t h r o p o l i s ) 、铜绿假单胞菌属 ( p s e u d o m o n a sa e r u g i n s a ) 、荧光假单胞菌属( p s e u d o m o n a sf l u o r e s c e n s ) 、粪便假单胞 菌属( p s e u d o m o n a sf a e c a h c ) 、发酵乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sf e r m e n t u m ) 、嗜虫短杆菌 ( b r e v i b a c t e r i u mi n s e c t i p h i l u m ) 、金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ) 、土壤杆菌 属( a g r o b a c t e r i u ms p ) 、环圈项圈蓝细菌( a c i n e t o b a c t e r s p ) 、厄氏菌属( o e r s k w v i a s p ) 和不动细胞属( a c i n e t o b a e t e r s p ) 。真菌9 种，分别为酱油曲霉( a s p e r g i l l u ss o j a e ) 、 棕曲霉( a s p e r g i l l u so c h r a c e u s ) 、寄生曲霉( a s p e r g i l l u sp a r a s i t i c u s ) 、赤红曲霉( m o n a c u s a n k a ) 、拟青霉属( p a e c i l o m y e e ss p ) 、棕腐真菌( b r o w nr o tf u n g i ) 、白腐真菌( w h i t e r o tf u n 百) 、白地霉( g e o r r i c h u me a n d i d u m ) 和栗酒裂殖酵母( s c h i z o s a c c h a r o m y c e s p o m b e ) 。放线菌5 种，分别为椿象虫诺卡氏菌( n o c a r d i ar e s t f i e a ) 、红平诺卡氏菌 ( n o c a r d i ar h o d n i i ) 、石灰壤诺卡氏菌( n o c a r d i ac a l c a r c a ) 、灰色链霉菌( s t r e p t o m y c e s g n s e u s ) 和酒红链霉菌( s t r e p t o m y c e sv i n a c e u s ) 。 表1 - 1 为较常见的絮凝剂产生茵： 表卜1 较常见的絮凝剂产生菌 苗种类别菌种名称 r e r y t h r o p o l i s ( 红平红球菌) n o c a r d i ar e s t r i e a ( 椿象虫诺卡氏菌) 革兰氏阳性菌n o c a r d i ar h o d n i i ( 红平诺卡氏菌) n o c a r d i ac a l e a r c a ( 石灰壤诺卡氏菌) c o r y n e b a c t e r i u mb r e v i c a l c ( 棒状杆菌) a l c a l i g e n e sl a t u s ( 协腹产碱杆菌) 革兰氏阴性菌 a l c a l i g e n e sc u p i d u s ( 渴望德莱氏菌) 2 微生物絮凝剂的菌株筛选、培养条件优化与应用研究 a s p e r g i l | u ss o j a e ( 酱油曲霉) 真菌 p a e c l l o m y c e ss p ( 拟青霉属) w h i t er o tf u n g l ( 白腐真菌) a g r o b a c t e r i u ms p ( 土壤杆菌属) o e r s k w v i as p ( 厄氏菌属) 其他p s e u d o m o n a ss p ( 假单胞菌属) a c m e t o b a c t e rs p ( 不动细胞属) d e m a u u m s p ( 暗色孢属) 1 3 微生物絮凝剂的基础研究 1 3 1 微生物絮凝剂产生菌的培养条件 微生物絮凝剂产生菌分布广泛，因此，不同微生物絮凝菌的最适培养条件存在很 大差异，主要影响因素有：发酵培养基组成、初始p h 值、培养温度、溶解氧以及培 养时间等。因为微生物絮凝剂的产量和分布都与培养条件密切相关，所以这些因素的 确定及最优化是非常重要的。 ( 1 ) 发酵培养基的组成： a 碳源：对于细菌来说，富含单糖的营养丰富的培养基有利于絮凝剂的产生，而 一些霉菌利用淀粉作为碳源生长和产絮的情况良好。对生长最合适的碳源并不一定就 是对絮凝剂分泌最有利的碳源，并且加入过量的碳源有时会抑止絮凝物质的合成。 b 氮源：有机氮源、无机氮源单独使用或联合使用均能成为微生物絮凝剂产生的 最适氮源。一般而言，有机氮源比无机氮源更有利于产生絮凝物质。 c 碳氮比：对某些微生物产生有絮凝性的成分有决定性的影响。 d 金属离子：因菌株差异，不同金属离子对絮凝活性物质起到不同甚至相反的作 用。 e 生长因子：微量生长因子可以促进絮凝剂的产生。 ( 2 ) 培养温度：微生物的培养温度在2 5 3 0 c 之间。某些菌絮凝剂合成的最佳 东华大学硕士学位论文 温度和菌体生长的最佳温度不同。 ( 3 ) 初始p h 值：一般在6 0 9 0 之间。 ( 4 ) 溶解氧：已发现的生物絮凝剂产生菌均为好氧微生物。实验室通常采用摇床 振荡培养。培养过程中，摇床转速和装瓶量都影响培养过程中的溶解氧量。其中，培 养液的体积虽然不影响培养液中微生物细胞的总量，却会影响絮凝物质的产生。 ( 5 ) 培养时间：最好在细菌对数生长期后期或静止期早期收获微生物絮凝剂，此 后，絮凝活性即使不下降也不会再增加。 1 3 2 微生物絮凝剂的分离提纯与成分分析 ( 1 ) 絮凝活性成分在发酵液中的分布：主要存在于培养液中和微生物细胞表面。 有关研究表明，絮凝物质在细胞表面和培养液中的分布受到培养液p h 值的影响。 ( 2 ) 生物絮凝剂的分离提纯：絮凝剂的化学成分主要是多聚糖、蛋白质及一些金 属离子。提取方法因絮凝剂的具体结构而异，也与最终要求达到的程度和使用要求有 关，可分粗提和精提两步。 ( 3 ) 化学本质：其研究大致有以下几种方法： a 因子破坏法：测定纤维素酶、蛋白酶( 如链酶蛋白酶) 、金属阳离子鳌合剂( 如 e d t a ) 和加热等处理对微生物絮凝剂絮凝能力的破坏，以判断絮凝剂的化学组成。 b 化学分析法：能有效地证明其具体化学组成，包括多糖的单位成分、蛋白质和 氨基酸的构成等。糖类：用传统的显色、沉淀分析，如苯酚一硫酸法、蒽酮法，色谱 法、层析法，涉及构型用核磁共振等。蛋白质：凯氏定氮、双缩脲、气相色谱法、液 相色谱法、紫外光谱、电泳、过滤层析等。核酸：色谱、电泳、纸层析、红外光谱、 紫外光谱等。由于实际需要及具体条件的不同，操作方法可灵活多变。 c 再形成法：将与絮凝有关的成分分别提取出来，再把它们添加进去，如果可以 恢复絮凝能力，絮凝剂的组成便得到证实。 跟据多年研究可初步确定，从化学本质讲，微生物絮凝剂主要是微生物代谢产生 的各种多聚糖类，这类多聚糖中有些是由单一单体组成，有些是由多种糖单体构成的 杂多聚糖，有些微生物絮凝剂是蛋白质( 或多肽) ，或者有其参与。脂类、d n a 等其 4 微生物絮凝剂的菌株筛选、培养条件优化与应用研究 它类型的微生物絮凝剂较为少见。另外，一些絮凝剂中还含有无机金属离子，如c a 2 + 、 m f + 、a 1 3 + 和f 一+ 等。但并非细菌合成的所有多糖均具有絮凝活性。而且某些絮凝剂 的分子结构还会随培养条件的改变而相应变化。 1 3 3 微生物诱变方法 诱变育种是常用的微生物驯化方法，是利用物理，化学等基本因素诱发基因突变， 并从中筛选出具有某一性状的突变体的方法。其基本原则为：选择简便有效的诱变剂； 挑选优良的出发菌株；处理单细胞悬液( 均匀态) ：选用最适剂量；充分利用协同效 应( 同一种诱变剂的重复使用，两种或多种诱变剂的先后使用，两种诱变剂的同时使 用) ；设计或采用高效筛选方案或方法。 诱变育种一般包括以下主要步骤： ( 1 ) 出发菌株的选择：根据经验，选择己经经过多次诱变并且每次诱变都有较好 效果的菌株作为出发菌株。 ( 2 ) 诱变剂的选择：目前在育种实验中应用的较多的诱变剂是紫外线、x 射线、 亚硝酸盐、乙基磺酸乙酯、偶氮氨基氧化嘌呤或其它诱变荆。 ( 3 ) 诱变剂量的选择：一般来说，随着剂量的增加诱变率也增加，但超过一定的 限度，随着剂量的增加诱变率反而下降。过去常采用杀菌率为9 9 或9 0 的紫外线 进行育种，而现在倾向于采用杀菌率为7 0 一7 5 ，甚至更低的紫外线进行育种。筛 选是在单一碳源培养基上连续进行，诱变剂量递增以强化菌株特性。也可人为地提供 特殊的强化环境来加速筛选过程。 ( 4 ) 突变体的筛选：因为存活下来的突变体的性状并不相同，基因的改变是随机 的、非定向的，因而必须进行多次筛选，才能选出具有优良性状的突变体。一旦筛选 出变异株，即可在实验室或废水处理厂进行实验。测试项目包括安全性、稳定性及菌 株繁殖能力。 东华大学硕士学位论文 1 4 微生物絮凝剂的应用研究 1 4 1 絮凝效果影响因素 影响微生物絮凝剂絮凝能力的因素有很多，包括絮凝剂本身的性质，并与外界 环境密切相关。一般来说，主要的影响因素有温度、p h 值、微生物絮凝剂浓度、微 生物絮凝剂分子量、结构和金属离子投加量等。 ( 1 ) 微生物絮凝剂本身特性的影响：微生物絮凝剂的主要成分中含有亲水的活性 基团，如氨基、羟基、羧基等，故其絮凝机理与有机高分子絮凝剂( 利用其线性分子 的特点起到一种粘接架桥作用而使颗粒絮凝) 相同。其絮凝效果会受分子形状、分子 量等因素影响。一般说来，线形结构有利于絮凝，如果分子结构是交联的或支链结构， 其絮凝效果就差；分子量越大，絮凝剂活性就越高。 ( 2 ) p h 值：在不同的使用环境中，可通过调节p h 值改善絮凝剂的试剂使用效 果。 ( 3 ) 温度：以蛋白质或肽链为主的絮凝剂一般都是热不稳定的，高温导致这些高 分子物质变性，使絮凝活性下降，甚至丧失。但以糖类为主的絮凝剂则是热稳定的， 对环境温度的抗冲击能力较强，絮凝活性不随温度改变而变化或改变很小。 ( 4 ) 金属离子：通过中和稳定残余的带负电荷的官能团，同时在悬浮颗粒之间发 生桥联作用，形成易沉降的大颗粒，进一步激发絮凝活性。 1 4 2 发酵罐培养研究 一个确定的发酵过程由6 部分组成【2 1 】：确定的种子培养基和发酵培养基的组成： 培养基、发酵罐和辅助设备的灭菌；大规模有活性、纯种的种子培养物的生产；发酵 罐中微生物最优生长条件下产物的大规模生产；产物的提取、纯化；发酵废液的处理。 6 部分之间的相互关系如图卜l 所示。 实验室中常用的发酵罐为不锈钢小型搅拌式发酵罐，是一种具有顶部或底部驱动 的中空的钢柱，可进行原位清洗和灭菌。这些搅拌罐容积为i 1 0 0 l ，其强度大，可 靠，使用寿命长。发酵过程中经常需采集大量的试样进行分析。 将发酵罐应用于微生物絮凝剂的培养是大规模生产生物絮凝剂的必然要求。国内 6 微生物絮凝剂的菌株筛选、培养条件优化与应用研究 已见报道的有何宁等人通过发酵罐培养絮凝剂r e a l l ，并研究了发酵过程中p h 2 2 l 和溶氧2 习的控制模型，国外有不少生物絮凝剂用发酵罐培养后进行研究，如c g a n c s h k u m a r 等人用发酵罐培养了絮凝微生物b a c i l l u ss p ，并进一步提纯出了絮凝剂 e p s 4 5 0 【2 4 1 。 图卜1 典型发酵过程示意图 f i g 1 - 1s k e t c hm a po f ar e p r e s e n t a t i v ef e r m e n t a t i o np r o c e s s 1 4 3 应用现状 微生物絮凝剂作为一类新型絮凝剂，其广谱的絮凝活性、可生物降解性及应用安 全性显示了它在水处理，食品加工和发酵工业方面的良好应用前景。但到目前为止， 所有研究都还处于实验室阶段，并未投入实际的生产应用。已研究的应用领域有：废 水悬浮颗粒的去除、废水脱色、乳化液的油水分离、污泥沉降性能的改善、畜牧场废 水的处理、污泥脱水等。微生物絮凝剂也可作为发酵工业和食品工业中安全有效的絮 凝剂。对纺织废水的处理也有不少报道，最多的是对废水脱色及处理高c o d 废水的 报道。 1 ，5 微生物絮凝剂的国内外研究状况 1 5 1 单一菌株的微生物絮凝剂 ( 1 ) 国外研究状况 7 东华大学硕士学位论文 对产絮凝性物质微生物的研究，最早见诸报道的是1 9 5 3 年，b u t t e r f i e l d 从活性污 泥中分离出1 株细菌，该菌的培养液具有一定絮凝能力。2 0 世纪7 0 年代，美国学者对 活性污泥中的絮凝微生物进行研究时发现其中包含多种絮凝性微生物。1 9 7 1 年z a j i c 和k n i f i n g 从煤油中分离出1 株棒状杆菌，该菌可分泌对泥水具有絮凝作用的多聚物 2 5 1 。1 9 7 5 年，j u n j in a k a m u r a 等对2 1 4 株微生物进行了分离筛选，最终得到1 9 株产絮凝 剂的微生物，包括细菌5 株、放线菌5 株、霉菌8 株、酵母菌1 株【2 6 - 2 9 。日本学者率先研 究和开发了微生物絮凝剂。它克服了传统絮凝剂的缺陷，更加高效、安全。上世纪7 0 年代，日本学者在研究酚酸脂生物降解的过程中发现了具有絮凝剂作用的微生物培养 液。1 9 8 5 年，h t a k a g i 等人发现拟青霉属【3 0 1 微生物产生的絮凝剂，采用乙酸沉淀和凝 胶色谱法精制得到了称为p f l 0 1 的絮凝剂，对啤酒酵母、血红细胞、活性污泥、纤维 素粉、活性炭、硅藻土和氧化铝等有良好的絮凝效果。1 9 8 6 年，日本的仓根隆一郎等 人从日本的旱田土壤中分离出红平红球菌s - 1 ，并将菌种产生的微生物絮凝剂命名为 n o c 1 ，絮凝剂n o c ，1 对大肠杆菌、酵母、泥浆水、河水、粉煤灰水、活性炭粉水、 膨胀污泥和纸浆废水等均有极好的絮凝和脱色效果1 8 , 3 1 1 ，是目前发现的絮凝效果最好 的微生物絮凝剂。1 9 9 1 年，k t o c d a 和k u r a n e 从土壤中分离出一株革兰氏阴性菌，产 碱杆菌。y b a r 和m s h i l o 发现一些海底蓝细菌( 海藻) ，如a n a b e n o p s i sc i r c u l a r i sp e c 6 7 2 0 和p h o r m i d i u ms p 能产生数量可观的胞外絮凝剂。韩国的c g a n e s hk u m a r 等人从严重 污染的潮汐泥中分离得到了絮凝菌株b a c i l l u ss p ，并提纯得到絮凝剂e p s 4 5 0 ，用作药 物糖衣t 2 4 1 。 ( 2 ) 国内研究状况 我国对微生物絮凝剂的研究起步较晚，开始于2 0 世纪9 0 年代中期。中科院成都 生物研究所张本兰从活性污泥中分离到e a l c a l i g e n e s 8 7 2 4 菌株产生的絮凝剂。武汉城 市建设学院康健雄、陶涛由黑酵母以淀粉水解或葡萄糖为原料发酵产生了普鲁兰絮凝 剂。陆茂林等所在的江苏微生物研究所在土壤和污泥中筛选出两株絮凝活性较高，并 且絮凝活性稳定的诺卡氏菌，并对其适宜培养基，培养时间和培养液p h 变化与絮凝 活性之间的关系进行了研究。李智良等所在的中国科学院成都生物研究所用常规的细 菌分离纯化方法从废水、土壤、活性污泥中通过分离筛选初步获得6 株微生物絮凝剂 产生菌，用其发酵离心上清液对造纸黑液，皮革废水，偶氮染料废水，硫化染料废水， 电镀废水，彩印制板废水，石油化工废水，造币废水及蓝黑水，碳素墨水等进行的絮 8 微生物絮凝剂的菌株筛选、培养条件优化与应用研究 凝试验表明，废水固液分离效果良好，c o d 去除率5 5 - - - 9 8 ，悬浮物、色度、浊度 去除率9 0 以上。南开大学环境科学系从天津市区和郊区土壤中分离的多种菌中筛选 出6 株对水中染料有较好的絮凝脱色作用的菌株，利用其培养液对染料水溶液进行了 探索性的絮凝实验，发现所筛菌种培养液对直接深棕染料脱色率可达9 0 以上，对直 接黑染料生产废水稀释液的脱色率为6 0 左右，而对其它染料脱色效果不显著。宫小 燕等所在的大连理工大学环境科学与工程学院从污水处理厂活性污泥中分离筛选获 得l 株具有稳定絮凝性状的菌株，经初步鉴定为假单胞菌属，p s c u d o m o n a s s p g x 4 一l ， 并对影响该菌的絮凝活性条件进行了初步研究。上海大学环境科学系从污水处理厂的 回流污泥及俞经浦底泥中分离、筛选出3 株絮凝剂产生菌，其中一株所产培养液可使 土壤悬液浊度去除率达9 9 以上，使碱性染料废水c o d 去除率达7 0 左右，色度去除 达9 2 左右。另外，台湾省的邓德丰等人从废水处理厂的废水处理液中分离得到c 一6 2 ， 细菌菌株