（环境工程专业论文）新型水环境微生物检测方法研究.pdf

摘要 摘要 水环境中微生物多种多样，其中可能包含肠道细菌、寄生虫卵以及病毒之 类的致病性微生物，如果人们不慎饮用，将会给人体健康带来极大影响，所以 加强水环境微生物检测方面的研究就显得很有必要。传统的水环境微生物检测 方法包括平皿计数法、滤膜法、多管发酵法等方法，这些方法在水环境微生物 检测中应用已久，并且也得到了很多研究人员的认可。但是这些检测方法往往 耗时较长，无法及时反映出水环境微生物现状。相对于新型的水环境微生物检 测方法而言，上述水环境微生物检测方法就显得不够高效，不够准确。 目前，流式细胞术、a t p 检测法、p c r 和变性梯度凝胶电泳( d g g e ) 技术等 新型水环境微生物检测方法已经被广泛的应用于实验室微生物检测及其生理生 态研究。通过使用这些新型的分析手段，我们可以更好的检测和了解水环境的 微生物状况。 本研究主要从饮用水以及城市污水两个角度来探索研究新型水环境微生物 检测方法的效果。通过使用流式细胞术、a t p 检测法、p c r d g g e 技术等手段来 分析研究水环境微生物质量。研究内容主要包括水环境活性非活性细胞含量测 定、水环境微生物再生长能力、微生物a t p 含量与微生物数量之间的关系、水 环境微生物群落结构及其优势菌落分析等。 相比于传统水环境微生物检测方法，流式细胞术、a t p 检测法、p c r d g g e 等技术不仅可以缩短检测时间，而且可以更准确地区分水中活性细菌和非活性 细菌，估算这些微生物的再生能力，并了解水质微生物群落结构。通过这些技 术手段，我们可以更好的帮助饮用水供应企业及时掌握各水处理工艺流程的即 时微生物质量，更有效地保障饮用水的安全；而在污水处理领域，我们也可以 借助上述技术更好的了解污水处理过程中的微生物生长繁殖变化规律，结合分 子生物学手段，我们更可以进一步分离其优势菌株，从而提高污水处理效率。 关键词：饮用水，城市污水，流式细胞术，a t p ，p c r d g g e a b s t r a c t a b s t r a c t a v a r i e t yo fm i c r o o r g a n i s m sh a v eb e e nf o u n di na q u a t i ce n v i r o n m e n t , w h i c h m a y c o n t a i np a t h o g e n ss u c ha sp a t h o g e n i ci n t e s t i n a lb a c t e r i a , p a r a s i t ee g g s ，a n dv i r u s i fp e o p l ed r i n k si ta c c i d e n t a l l y , i tw i l lb r i n gg r e a tt h r e a tt oh u m a nh e a l t h t h e r e f o r ei t i so fg r e a tn e c e s s i t yt os t u d yt h ea c c u r a t ea n df a s tm i c r o b i a ld e t e c t i o nm e t h o d sf o r a q u a t i cm i c r o b i a lq u a l i t yc o n t r 0 1 t r a d i t i o n a la q u a t i cm i c r o b i a ld e t e c t i o nm e t h o d s i n c l u d et h ep l a t ec o u n tm e t h o d ，f i l t e rm e t h o d ，a n dm u l t i p l et u b ef e r m e n t a t i o nm e t h o d e t c t h o s em e t h o d sh a v eb e e nu s e di na q u a t i ce n v i r o n m e n tf o ra l o n gt i m e ，a n dh a s a l s ob e e na c c e p t e db ym o s tr e s e a r c h e r s h o w e v e r , t h e s ed e t e c t i o nm e t h o d sa r eo r e n t i m e c o n s u m i n ga n dn o tb ea b l et or e f l e c tt h ew a t e re n v i r o n m e n tm i c r o b i a ls t a t l l s w i t h i nr e q u i r e d t i m e c o m p a r e dt ot h en e wm i c r o b i a ld e t e c t i o nm e m o d s m e t r a d i t i o n a lm e t h o d sw a sn o tv e r ye f f i c i e n ta n dn o ta c c u r a t ee n o u g h n o w d a y sf l o wc y t o m e t r y , a t pa s s a y , p c ra n dd e n a t u r i n g g r a d i e n tg e l e l e c t r o p h o r e s i s ( d g g e ) t e c h n o l o g y e t ch a v e b e e nu s e d w i d e l yi nl a b o r a t o r y m i c r o b i o l o g i c a ld e t e c t i o n b yu s i n gt h e s en e wa n a l y t i c a lt o o l s ，w ec a na c h i e v eb e t t e r d e t e c t i o na n du n d e r s t a n d i n gt h em i c r o b i o l o g i c a ls t a t u so ft h ew a t e re n v i r o n m e n t t h i st h e s i ss t u d i e dt h em i c r o b i a lq u a l i t yo ft w o r e p r e s e n t a t i v et y p e so fw a t e ri n t h ec i t y ：d r i n k i n gw a t e ra n du r b a ns e w a g e ，u s i n gt h e n e wm i c r o b i a la n a l y z i n g m e t h o d s w ea n a l y z e dt h el i v e d e a dc e l lc o u n t s ，m i c r o b i a lr e g r o w t hc a p a c i t y , t h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h em i c r o b i a la t pc o n t e n ta n dt h em i c r o o r g a n i s mc e l lc o u n t s ， a n dt h em i c r o b i a l c o m m u n i t ys t r u c t u r eu s i n gf l o wc y t o m e t r y , a t pa s s a ya n d p c r d g g e c o m p a r e dt ot h et r a d i t i o n a lw a t e re n v i r o n m e n t a lm i c r o b i a ld e t e c t i o nm e t h o d s f l o wc y t o m e t r y , t h ea t p a s s a ya n dp c r d g g et e c h n o l o g yc a r ls h o r t e nt h ed e t e c t i o n t i m e ，m o r ea c c u r a t e l yd i s t i n g u i s ht h el i v e d e a db a c t e r i a ，e s t i m a t et h er e g r o w t h c a p a c i t yo ft h e s em i c r o o r g a n i s m s ，a n dr e v e a lm i c r o b i a lc o m m u n i t yc o m p o s i t i o n t h r o u g ht h ea b o v ea n a l y s i s ，w ec a nh e l pt h ed r i n k i n gw a t e rs u p p l ye n t e r p r i s et og r a s p t h er e a l - t i m e m i c r o b i o l o g i c a lq u a l i t yo ft h ew a t e rt r e a t m e n tp r o c e s s ，a n dt om o r e 工i a b s t r a c t e f f e c t i v e l ye n s u r et h es a f e t yo fd r i n k i n gw a t e r r e g a r d i n gs e w a g et r e a t m e n t ，w ec a n u s et h e s et e c h n o l o g i e st oa c h i e v eb e t t e ru n d e r s t a n d i n go ft h em i c r o b i a lg r o w t ha n d r e p r o d u c t i o ni n t h es e w a g et r e a t m e n tp r o c e s s c o m b i n e dw i t hm o l e c u l a rb i o l o g y m e t h o d s ，w ec o u l df u r t h e ri s o l a t et h ep r e d o m i n a n ts t r a i n si no r d e rt oi m p r o v et h e s e w a g et r e a t m e n te f f i c i e n c y k e yw o r d s ：d r i n k i n gw a t e r ；s e w a g e ；f l o wc y t o m e t r y ；a t p ；p c r - d g g e i i i 第一章绪论 第一章绪论 第一节研究背景 1 1 1饮用水分类及其安全现状 水是生命之源。人体中水占体重的7 0 ；它对于维持人体各项生理机能 的正常运转具有重要作用，如果水中缺少人体必需的微量元素，或被某些 有害物质污染，达不到饮用要求，就会影响人体健康。 随着人类生存环境的日益恶化，人们对饮用水安全的关注度也越来越高， 日常饮用水主要包括自来水、纯净水、矿泉水、山泉水、矿物质水、管道直饮 水。其中自来水是直接采自水源地，并经过初步加工过滤，达到国家饮用水标 准后被输入输水管道。尽管对其进行了过滤，但其中的杂质和污染物不可能全 部过滤掉，残留的杂质和污染物仍存在潜在的威胁。纯净水是指以符合生活饮 用水标准的水为原料，通过离子交换、电渗析、蒸馏、反渗透及其他适当加工 方法制得的，密封于容器中且不含任何添加物可直接饮用的水，纯净水在加工 过程中，不仅滤去了有害细菌和杂质，也滤去了有益微生物和微量元素钙、镁、 氟、硒等，长期饮用会使人体内的矿物质供求失去平衡。矿泉水是一种天然苏 打水，它是从地下深处自然涌出的或经人工发掘的、未受污染的地下矿泉水， 它含有一定量的矿物质盐、微量元素和二氧化碳气体，在通常情况下，其化学 成分、水温、流量等参数相对稳定。山泉水是由取自环境清幽、无任何污染， 具有稳定的p h 值、水温，以及对人有益的矿物质和微量元素的地表水、泉水、 自然井水经深度过滤、消毒加工而成。矿物质水是在纯净水的基础上，添加少 量矿物质元素制成。管道直饮水是现有自来水或达到生活饮用水标准的水源水 经过深度处理后，再通过优质管材送至用户，成为可直接饮用的优质水，它在 去除有害物质的同时，又保留了人体所需的微量元素，可供各年龄段人士长期 饮用。 根据世界卫生组织2 0 0 8 年的数据，安全饮用水每年可防止：1 4 0 万儿童死 于腹泻病；5 0 万人死于疟疾；8 6 万儿童死于营养不良；2 8 万人死于溺水。此外， 有5 0 0 万人可免于因淋巴丝虫病儿严重致残，还有5 0 0 万人可免于因沙眼而致 残。一个安全的饮用水环境对于能保障人们的身体健康非常重要，供水安全的 第一章绪论 破坏可引起大规模污染，并可能导致可以检测到的疾病爆发。由致病性细菌、 病毒和寄生虫( 如原虫和蠕虫) 引起的传染病是与饮用水有关的对健康最常见、 最普遍的威胁。这些传染病对公众健康的危害程度取决于病原体致病的严重程 度、传染性及受累及的人群。目前我国的饮用水安全问题也不容忽视，很多原 本作为水源地的水库，河流，地下水均受到不同程度的污染，这些原本的水源 地被污染后在很大程度上减少了人们的饮用水来源，并且一些可以作为饮用水 水源的水体也存在很多的有害微生物，不对它们进行适当的处理就会危害人们 的身体健康，这其中包括一些能对人类造成重大危害的病原微生物，如大肠杆 菌0 1 5 7 ：h 7 、军团菌、幽门螺杆菌等。同时，那些经过处理的饮用水的微生物含 量是否符合目前的饮用水标准也是一个值得探讨的问题。 1 1 2 污水来源及分类 污水通常是指受一定污染的、来自生活和生产的废弃水。污水主要包括生 活污水，工业废水和初期雨水。污水中的主要污染物有病原体污染物，耗氧污 染物，植物营养物，有毒污染物等。 生活污水是人类在日常生活中使用过的，并被生活废料所污染的水。 其水质、水量随季节而变化，一般夏季用水相对较多，浓度低；冬季相应 量少，浓度高。生活污水一般不含有毒物质，但是它拥有适合微生物繁殖 的条件，并含有大量的病原体，从卫生学角度来看有一定的危害性。 工业废水是在工矿生产活动中产生的废水。工业废水可分为生产污水 与生产废水。生产污水是指在生产过程中形成、并被生产原料、半成品或 成品等原料所污染，也包括热污染( 指生产过程中产生的、水温超过6 0 的水) ；生产废水是指在生产过程中形成，但未直接参与生产工艺、未被生 产原料、半成品或成品等原料所污染或只是温度少有上升的水。生产污水 需要进行净化处理；生产废水不需要净化处理或仅需做简单的处理，如冷 却处理。生活污水与生产污水的混合污水称为城市污水。 初期雨水主要是指被污染的雨水。由于初期雨水冲刷了地表的各种污 染物，污染程度很高，故宜作净化处理。 污水中的微生物主要是细菌和病菌，它们以水中的有机物为食料。生 活污水、食品工业污水、制革污水、医院污水等含有寄生虫卵( 钩虫卵、 蛔虫、饶虫等) ，肠道病原菌( 伤寒、痢疾、霍乱菌等) ，炭蛆杆菌与病毒 2 第一章绪论 ( 狂犬、脊髓灰质炎、腮腺炎、肝炎、麻疹等) 。因此了解污水的生物性质 以及对城市污水以及初期雨水进行生物处理就显得十分必要。污水的生物 处理主要是以污水中的混合微生物群体作为工作主体，对污水中的各种有 机污染物进行吸收、转化，同时通过扩散、吸附、凝聚、氧化分解、沉淀 等作用，以去除水中污染物。如果我们能实时监测污水生物处理过程中的 微生物含量，那我们就能更好地了解污水生物处理过程以及污水生物处理 过程中的污染物降解状况【l 】 第二节水处理方法 1 2 1生活饮用水处理方法 生活饮用水处理方法通常需要根据水源水质和用水对象对水质的要求而确 定，其去除的对象主要包括水中的悬浮物质、胶体和致病性微生物。对于未被 污染的水源水，经过混凝一沉淀一过滤一消毒四步工艺即可达到处理目的。但 是对于已经被污染的水源，常规处理方法已经无法达到处理目标，通常还需要 在常规处理的基础上增加预处理和深度处理，预处理和深度处理主要是靠吸附、 氧化、生物降解、膜处理等4 种作用来完成，其去除对象主要的水中有机污染 物 舶。 1 2 2 污水生物处理方法 污水生物处理主要是利用污水中微生物的代谢作用，来降解污水中呈溶解、 胶体状态的有机污染物。它主要包括好氧生物处理和厌氧生物处理两大类。 好氧生物处理也叫好氧氧化法，它是在水中有溶解氧存在的条件下，利用 好氧及兼性厌氧微生物来降解水中污染物的方法。在处理过程中，绝大多数的 有机污染物都能被相应的好氧微生物氧化分解。好氧生物处理法被广泛应用于 城市污水及有机性生产污水处理中，它对污水b o d 5 的去除率一般在8 0 9 0 以 上。 厌氧生物处理又叫厌氧还原法，它是指在无氧条件下，利用污水中存在的 厌氧和兼性厌氧微生物来分解污水中有机污染物的方法。厌氧生物处理主要应 用于高浓度有机污水和有机污泥的处理。由于是密闭发酵，所以在处理过程中 不影响周围环境；同时隔绝空气又加上高温发酵，可以有效杀死寄生虫卵和致 3 第一章绪论 病菌口1 。 第三节水质微生物检测方法 1 3 1 传统水质微生物检测指标 根据g b t 5 7 5 0 1 2 2 0 0 6 生活饮用水标准检验方法微生物指标规定，目 前我国的饮用水微生物标准包括定量微生物指标一菌落总数；指示性微生物指标 一总大肠菌群；致病微生物指标一肠道致病菌和致病性球菌、原生动物。 定量微生物指标：主要是指饮用水中所包含菌落总数。菌落总数主要是通过 平皿计数法得到，测定的是一些加工人员和环境带来的体温型寄生菌。通过这 种方法测得的微生物都是一些可在传统培养基上生长的微生物。 指示性微生物指标：主要是指饮用水中所包含的总大肠菌群，它们是一群在 3 7 培养2 4 h 能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆 菌。 致病微生物指标：主要是指饮用水中所包含的肠道致病菌、致病性球菌、原 生动物。如肠道致病菌0 1 5 7 ：h 7 能致人死亡；而易于在铜管、塑料管和镀锌管 的壁面聚集成菌落的鸟分枝杆菌复合群则可感染肺部并扩散至全身；贾第鞭毛 虫和隐孢子虫会导致严重的腹泻甚至死亡：除此之外，在饮用水中还可能含有 病毒、以及藻类毒素等，如柯萨奇病毒和艾柯病毒能感染婴儿的中枢神经系统， 导致神经后遗症和智力障碍，肝炎病毒会导致死亡，轮状病毒会引发腹泻；而 饮用水中的一些微蓝藻毒素则可能会导致肝癌【4 j 。 1 3 2 传统水质微生物检测方法 饮用水直接关系到人们的身体健康，所以必须对其中的微生物进行检测， 其检测手段也越来越多样化，快速化，精确化。本节主要讨论其中的一些传统 的，目前仍广泛使用的方法。其中针对菌落总数，主要采用的是平板计数法， 这种方法已经使用超过1 0 0 年了，主要是依靠异养菌平板计数( h e t e r o t r o p h i c p l a t ec o u n t ，h p c ) ，分析那种具有一定细胞分裂速率并在琼脂营养培养基上形 成可见菌落的微生物，但事实上，水样中绝大多数的细菌无法在平板上生长繁 殖，这样便会形成“大平板计数异常”【5 1 。这样我们便会阻碍我们了解水样中的 实际微生物情况。同时传统的平板计数法耗时很长，般需要2 4 4 8 h 才能得 4 第一章绪论 到结果，这样就不利于检测人员迅速了解当天的出水微生物状况，因此平板计 数带有一定的滞后性，当水样中可培养微生物含量达到一定水平后，通常还需 要进行梯度稀释，其检测范围也比较有限。在评价饮用水是否安全时，人们通 常会使用大肠菌群和耐热大肠杆菌作为指示性生物，在研究水样中的大肠菌群 和耐热大肠杆菌时，传统的方法包括多管发酵法、滤膜法，这些方法都需要较 长的孵化时间，并且特异性不强，对生长速率缓慢或进行“活的不可培养状态 的细菌”检出率很低。也有研究者通过使用基于特异性酶活性的方法来检测饮 用水中的大肠菌群，如用b - d 半乳糖苷酶和b d 葡萄糖醛酸酶来分别检测总 大肠菌数和大肠杆菌数，这种方法的灵敏度比多管发酵法( m t f ) 和膜过滤技术 ( m f ) 要强，但它还是需要耗费较长时削6 1 。在检测生活饮用水及水源水中是否 存在贾第鞭毛虫和隐孢子虫卵囊时使用的是免疫磁分离荧光抗体法。 1 3 3 新型水质微生物研究方法 1 3 3 ，1 流式细胞术原理 流式细胞术( f lo wc y t o m e t r y ，f c m ) 就是对处在快速直线流动状态中的细 胞或生物颗粒同时进行多参数、快速定量分析和细胞分选的高新技术。流式细 胞仪的基本结构主要包括三部分：( 1 ) 光学系统：包括激发光源和光束成形系 统：( 2 ) 液流系统：包括流动室和液流驱动系统；( 3 ) 电子系统：包括光电转 换器和数据处理系统( 信号检测、存储、显示、分析等) 。另外具有细胞分选功 能的流式细胞仪还具有细胞分选系统，借助于细胞分选系统，科研人员可以将 带有某种特性的目的细胞专门从混杂特性的细胞群体中分离出来，再进行后续 的分析研究。 5 第一章绪论 巾哭投蘩酝 图1 1 流式细胞仪基本结构图 流式细胞仪工作原理：将待测细胞制成单细胞悬浮液后，对待测细胞进行 特异性荧光染色，等到染色结束后进样，此时待测样品在恒定的气体压力下被 注入流动室。同时不含细胞或微粒的缓冲液在高压下从鞘液管喷入，鞘液管的 入口方向与待测细胞或微粒流形成一定角度，根据流体力学的层流原理使鞘液 包绕着细胞或微粒作高速流动，而样本流则处于稳流状态，从而形成一个圆柱 形的液流束。待测细胞在鞘液的包裹下呈单行排列，并依次通过流式细胞仪的 检测区，此时样品流被入射激光束垂直照射，细胞或微粒上的荧光染料被激发， 产生不同的荧光和散射光。在与入射激光平行的方向和与入射激光和液流形成 平面相垂直的方向上分别放置光测量系统，主要包括透镜、光阑、滤片、检测 器等以收集荧光信号和散射光信号。散射光信号主要分为前向散射光( f o r w a r d s c a t t e r , f s c ) 和侧向散射光( s i d es c a t t e r , s s c ) 。f s c 主要反映被测细胞或微粒 的体积大小，s s c 则是反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化。荧光信号主要 分为白发荧光和特异荧光，前者是细胞自身发出的微弱荧光，后者则是从细胞 上携带的特殊荧光色素分子发射出来的。随后f s c 、s s c 以及荧光信号被电子 系统接收并转化为电信号。电子系统包括光电转换器、前置放大电路、模数转 换电路和数据处理系统。( a ) 光电转换器将光信号转换为电流信号，其中f s c 信号较强，可以用光电二极管接收，而s s c 和荧光信号则用光电倍增管( p m t ) 来接收。( b ) 前置放大电路被用来决定整个流式细胞仪电子系统输出信号的强 度，它输出的电压信号即为被测细胞通过光束中心位置时所产生的最强信号。( c ) 6 第一章绪论 模数转换电路被用来将模拟的电压峰值转换为数字化信号。( d ) 通过计算机上 的f c m 应用软件分析得到的数字化信号【7 1 。 i ：t e c e r g h i l 髓n tl ：i l t 4 咐q 阿景。 飞制麓曛岛成誉。 b e e t l ei t j c i t 镤i n o 瓣融融| 沁 图1 2 萤光素酶反应 a t p 是生命活动所必需的能源物质，在细胞中，它与a d p 的相互转化实现 贮能和放能，从而保证细胞各项生命活动的能量供应。在m 9 2 + 和分子氧存在 时，萤光素酶能利用微生物所含的a t p 来催化萤光素进行单氧合反应。当萤光 素完成单氧合反应之后，会释放出与a t p 的物质的量相等的光子。通过a t p 检 测仪测定萤光素酶反应所释放的光子数之后，我们便可以依据a t p 标准曲线确 定微生物所含a t p 的含量，再根据a t p 含量推算出水中的活细胞数目。 1 3 3 3 分子生物学方法 1 3 3 3 1 p c r 法 p c r 基本原理是以单链d n a 为模板，4 种d n t p 为底物，在模板3 末端有 引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板 d n a 得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与待扩增的d n a 片段两端 己知序列分别互补的两个引物、微量的d n a 膜板、适量的缓冲液、耐热t a qd n a 聚合酶、四种d n t p 溶液、m 9 2 + 等。反应时先将上述溶液加热，使模板d n a 在 高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下 与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在t a qd n a 聚合酶的催化下，以d n t p 为原料，引物沿5 _ 3 方向进行延伸，并形成新的 d n a 片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变 性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。 因此p c r 循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定d n a 聚合酶 在适当温度下催化d n a 链延伸合成。 7 第一章绪论 p c r 法通常是与m f 法结合在一起使用的，首先是将膜上截留的细菌用化 学方法裂解，释放出d n a ，再在相应的引物引导下用t a q 酶扩增出产物【8 1 ，通 过电泳条带染色或再与相应探针杂交判定结果。p c r 法原来一般应用于土壤中 的微生物检测，其在饮用水检测中的应用历史还比较短暂。在p c r 法中最重要 的就是设计出合适的引物，因为水中微生物种类众多，如果不能设计出针对靶 细胞的高特异性的引物，就很容易出现假阳性的现象。尽管p c r 法具有很高的 敏感性，但p c r 也存在着一些不足，一是p c r 法无法给我们提供细菌状态的信 息，二是p c r 体系影响因素多，水样中可能存在t a q 酶的抑制剂等，从而影响 p c r 的检出率。 1 3 3 3 2 d g g e 技术 d g g e 对水环境微生态的分析一般包括4 个步骤：细菌核酸提取、细菌1 6 s r r n a 基因序列的p c r 扩增、d g g e 以及d g g e 指纹图谱分析。通过基因克隆、测 序建立微生物区系的1 6 sr r n a d n a 文库，我们可以分析系统发育状况，建立进化 树，从而获得水体微生物多样性信息。 细菌核酸提取：污水微生物群落总d n a 的提取是使用d g g e 技术研究污水微 生物群落结构的基础。一般认为微生物提取总d n a 的方法分为细胞裂解和核酸 抽提两个步骤。细胞裂解法主要包括机械法、化学法和酶法。机械法包括玻璃 珠法、超声波法、冻融法等：化学法包括加入s d s 、苯酚等：酶法包括加入裂解酶、 溶解酶和蛋白酶k 等。而许多研究者用其中两种或三种方法进行组合，发现组合 后提取总d n a 的效果较好。核酸抽提则一般用酚一氯仿一异戊醇抽提，这种方法 对去除杂蛋白有良好的效果。 细菌1 6 sr r n a 基因序列的p c r 扩增：细菌按沉降系数分为5 s 、1 6 s 和2 3 s 三种，1 6 sr r n a 基因是细菌染色体上编码该r r n a 的相应d n a 系列。1 6 sr r n a 基因序列全长1 5 4 0b p ，可分为保守区和可变区，每种细菌的保守区都是相同的，它 能反映细菌种类的亲缘关系，为系统发育重建提供线索；可变区根据细菌种类而 变化，通过设计细菌保守区的引物，扩增出其可变区，我们就可以得到细菌多样性 信息。大多数情况下，我们都是根据细菌1 6 sr r n a 基因的v 3 区和v 6 v 8 区设 计细菌特异性引物进行p c r 扩增，有时为了更加准确得获得细菌群落多样性信息， 可先通过细菌1 6 sr r n a 序列全长通用引物进行p c r 扩增，再针对v 3 或v 6 v 8 区进行扩增。 8 第一章绪论 d g g e ：如果对d n a 双链分子不断加温或对其用化学变性剂处理，d n a 分 子的两条链就会开始解链。首先解链的区域由解链温度较低的碱基组成。g - c 碱基对要比a t 碱基对更加牢固，因此g c 碱基对含量高的区域通常具有较高 的解链温度。此外影响解链温度的因素还包括相邻碱基间的吸引力( 称作“堆 积，) 。解链温度低的区域，通常位于d n a 双链的端部，它们被称作低温解链区 ( 1 0 w e rm e l t i n gd o m a i n ) 。如果端部分开，那么双螺旋就由未解链部分柬在一起， 这一区域便称作高温解链( h i g hm e l t i n gd o m a i n ) 。如果温度或变性剂浓度继续升 高，两条链就会继续解链直至完全分开。d g g e 主要依据两点：( 1 ) d n a 双链 末端一旦解链，d n a 分子在凝胶中的电泳速度将会极剧下降；( 2 ) 如果d n a 双链某一区域首先解链，而与其仅有一个碱基之差的另一条链就会有不同的解 链温度，因此，将d n a 样品加入含有梯度变性剂的凝胶中进行电泳就可将二者 分离。最终，如果一d n a 双链在其低温解链区出现碱基错配( 异源双链) ，并 且其与另一等同的d n a 双链相比差别仅在于此，那么，含有错配碱基的双链将 在浓度低得多的变性剂下解链。事实上，样品通常含有突变、正常的同源双链 以及配对的异源双链，后者是在p c r 扩增加时产行的。而含有错配的双链通常 可以远远地与两个同源双链分开，这种分离效果使该方法灵敏度很高。为使仅 有一个碱基之差的不同分子取得最好的分离效果，必须先选择所要研究的d n a 范围以及电泳样品时变性剂浓度梯度。这可以通过正交变性梯度实验来解决。 变性剂梯度应选在曲线斜率大的部分，因为这时多数分子处于部分变性状态， 这就使得落入低温解链区的不同分子达到最佳分离。 现在多数分析都是采用所谓的“g c 夹板”( c l a m p ) 技术进行的。它是将 一段长度为3 0 5 0 碱基，富含g c 碱基对的d n a 附加到目标d n a 双链的一端 以形成一个人工高温解链区。这样，片段的其他部分就处在低温解链区，这样 我们就可以对其进分析。这一技术可大大增加该方法可检测的突变比例。 d g g e 指纹图谱分析：目前，d g g e 电泳图谱分析最常用的方法是相似性聚 类分析法。d g g e 图谱通过扫描仪输入计算机，通过m o l e c u l a ra n a l y s i s 软件进行 相似性分析。d g g e 图谱中的每一个条带都代表一个微生物优势菌群，通过测序 和序列比对，研究人员就可以鉴定出该优势菌群的种类。 1 3 3 3 3 荧光原位杂交( fls h ) 技术 使用荧光原位杂交( f i s h ) 技术检测大肠菌群和大肠埃希菌时，通过设计 9 第一章绪论 出针对它们1 6 sr r n a 特定区域的寡核苷酸探针，研究人员也可以快速判断饮用 水中是否存在这些细菌。这种方法与定量p c r 技术相比具有一定的优势，因为 针对1 6 sr r n a 基因片段的原位杂交可以减少样品提取中的损失，特别是针对那 些环境中含量很少的细菌，这样可以最大限度的保留细菌的多样性和丰度。而 通过荧光原位杂交技术并结合d n a 染色和f c m ，研究人员也可以定量分析混 合细菌样品 9 1 。然而这种方法也会出现一些假阳性，通过设计针对特定大肠杆菌 菌株的探针来评价杂交效率，j o a c h i m s t h a l 等发现f i s h 杂交的效率最高也只能 达到7 0 【1 0 】。f r a h m 等结合p c r 技术并使用了一种基于5 3 核酸外切酶活性 的t a q d n a 聚合酶来检测饮用水中的指示性微生物。其中，基于2 3 sr r n a 序列 来对肠球菌属进行检测；基于u i d a 基因序列来对大肠杆菌进行分析【l l 】。但是这 种方法的精确度也不太好。r e v e t t a v 等通过1 6 sr r n a 基因库来鉴别了饮用水中 的细菌种群，并研究了环境中的活性微生物片段。因为细胞在遭遇外压时，其 r n a 会迅速的降解，所以死细胞自然的被排除在研究范围之外【l 引，这样就可以 使得研究人员能快速的定量水中的微生物含量和活性。 1 3 3 3 4 免疫学方法 依赖于抗原抗体反应，我们也可以检测饮用水中的肠道细菌。这种方法主 要分为酶联免疫吸附试验( e l i s a ) 和免疫荧光( i f a ) 两大类。e l i s a 法是基 于肠道细菌表面的一种由脂多糖构成的抗原e c a 。e l i s a 法敏感性不是很高，1 m l 水中必须含有1 0 6 个以上的细菌才能检出，所以必须预先扩增培养水样中的 细菌。但一些革兰氏阴性的气单胞菌和假单胞菌属表面也具有e c a 抗原，因此 使用这种方法检测水样大肠菌群时会造成假阳性，所以e l i s a 法的特异性并不 是很强。 i f a 法可以检出水样中的单个菌体，它可以和m f 法结合起来应用。i f a 的 敏感性可以达到m f 集落计数法的1 0 0 倍。但这种方法无法区分死菌和活菌。还 有研究者通过大肠杆菌不同生长周期胞浆中合成的特异性蛋白来判定大肠杆菌 的生理状态。这些大肠杆菌特异性蛋白包括代谢稳定蛋白d n a k 、静止期蛋白 d p s 和协调r r n a 合成与生长的蛋白f i s 。通过设计出针对这些蛋白的单克隆抗 体，并用荧光物质对其进行标记，就可以判断水样中大肠杆菌的生理状态【l3 1 。 1 3 3 3 5 生物化学方法 1 0 第一章绪论 磷脂脂肪酸法( p l f a ) ：磷脂是细胞膜的重要组成部分，在微生物所处的外 界环境发生变化时，磷脂也会发生变化。当细胞死亡时，细胞膜中的磷脂会马 上降解【1 4 】。通过研究这些磷脂的变化，我们可以了解微生物群落的结构以及特 定微生物的生理状态。通常使用气相色谱质谱来定量检测萃取出的脂肪酸，再 将其与数据库中脂肪酸数据进行对照，我们便可以确定磷脂脂肪酸的种类【l 川。 也有研究指出磷脂脂肪酸与1 6 sr r n a 在系统进化分析中具有同样类似的作用 【1 6 】，但磷脂脂肪酸还不能鉴定到特定的种属，因为不同的微生物可能含有相同 的脂肪酸，并且不同环境条件、营养条件下脂肪酸也会发生变化【l7 | 。 第四节水质微生物检测方法研究进展 1 4 1 国内外研究进展 1 4 1 1 流式细胞术在水环境微生物检测中的发展应用 2 0 世纪8 0 年代末，f c m 开始应用于水环境微生物研究领域，其研究内容 包括浮游植物、细菌和病毒的分类鉴定、计数以及生理生化研究，这项技术的 应用极大的推动了水生生态学和水生实验生物学的发展。 浮游植物研究：海洋浮游植物种类繁多且数量巨大，要想全面的掌握浮游植 物的生理生态状况，就必须对其进行分类和计数，f c m 由于其快速高效而逐渐 成为浮游植物分类鉴定的重要工具。使用f c m 可以对单细胞浮游植物进行同步、 快速、多参数分析。根据所分析微粒的荧光特性可以了解浮游藻类的大小、形 状，结构或者色素类型。带分选装置的流式细胞仪还可以分选单个浮游植物细 胞，从而能方便不同种浮游植物的分离。在定量检测海洋浮游植物细胞内d n a 时，添加p i c og r e e n 和s y t o xg r e e n 染料可以对所研究的物种进行分类【l8 1 。在 由叶绿素产生自身荧光的真核浮游植物中，通过使用荧光d n a 染料y o y o 1 ， 通过蓝光激发，可以区别细胞循环周期的g 1 ，s ，g 2 + m 期【l9 1 。使用f c m ，我们可 以研究重金属对海洋藻类的影响。当水体中的c u 浓度为0 1 m g l 时便可减少 5 0 的三角褐指藻生长，而c u 浓度达到1 m l 时便可完全抑制这种藻类的生长。 c u 会影响三角褐指藻的光合作用和a t p 合成，其主要的作用位点是光系统i i 中 的氧化阶段【2 0 1 。 细菌总数计算：传统的饮用水微生物指标鉴定主要是依靠h p c ，但这种方 法越来越受到人们的质疑，因为它所反映出来的只是那些可培养的细菌数，这 第一章绪论 与饮用水中实际存在的细菌总数存在着很大的差距，且在实际的饮用水给水管 网中会存在更多的不确定因素，如压力、温度、氧化剂等，这些条件会使得许 多细菌进入到活的但不可培养状态。而且传统的h p c 方法耗时耗力，无法快速 直接的反映饮用水中的实际微生物数量。所以很多研究者将目光投向了f c m 。 虽然f c m 已经出现了3 0 年，但它以前主要应用于海洋环境微生物和医学微生 物，并且在这些方面都取得了很好的效果【2 1 。而f c m 在饮用水研究这个领域才 刚刚起步。使用f c m 可以帮助我们快速的了解饮用水中的实际微生物数量，通 过使用一些特异性的荧光染料，我们可以对水样中的微生物进行计数，分类。 相对于传统的平板计数方法，f c m 就显得相当快捷和方便了。在实际饮用水处 理过程中，人们并没有将饮用水细菌总数作为微生物检验指标，同时也没有一 个对于饮用水处理过程中细菌总数的国家标准，这是因为传统的方法无法完成 这点。而有通过使用核酸荧光染料s y b rg r e e ni 并结合f c m ，我们可以快速 分析饮用水处理厂各处理工序后的细菌总数【5 1 ，这样就可以快速的判断各工序的 处理效果并能及时的做出调整。而使用s y b rg r e e ni 并结合f c m 对饮用水进 行疑似病毒粒子和细菌进行总量计算的另一个优点就是饮用水的背景荧光比较 低，这样就使得s y b rg r e e ni 在对饮用水进行荧光染色后能方便的将背景荧光 与细胞或疑似病毒粒子区分开，这种方法可以用于研究大体积的饮用水净化过 程【2 2 1 。也有研究者使用b a c l i g h t 试剂盒来评估饮用水中的活菌和细菌总数，其 中所使用的两种染料分别为s y t o9 和p i ，s y t o9 能够穿透所有细菌的细胞膜， 而p 1 只能穿透那些死细胞，被前者染色后细胞会产生绿色荧光，而p i 在激发后 会产生红色荧光。将s y t o9 和p i 相结合对细胞进行染色，会使细胞产生红色 荧光。通过绿色荧光和红色荧光( s y t o 与p i 一起对细胞染色后产生) 的值， 我们可以计算出细菌总数和活细菌数 2 3 1 。将p i 和s y b r 按一定比例混合后对饮 用水中微生物进行染色也可以用于评价饮用水中细菌总数和活菌数【2 4 1 。与使用 了1 0 0 多年的h p c 相比，这些方法能更客观，公正的显示出饮用水中的微生物 含量，特别是能够让我们了解那些不能通过传统培养方法发现的活的但不可培 养细菌( v b n c ) 。但是在目前的情况下，h p c 法还是被广泛的运用于饮用水微 生物指标检测中，这主要是缺乏相应的饮用水细菌总量标准与相应的与之配套 的检测设备，检测方法。 细菌活性分析：使用s y b rg r e e ni 并结合f c m 对水样细菌总数进行计算 方便快捷，但它也存在一些缺陷，例如它无法将那些具有活性的细胞，处于休 1 2 第一章绪论 眠状态的细胞以及死细胞区分开来。通过使用不依赖培养的荧光染色方法，如 膜完整性，膜电位，酯酶活性来区分饮用水中的活细菌。将p i 和s y b rg r e e n i 按一定比例混合后对细胞进行染色，我们可以清楚的发现那些细胞膜破裂的细 菌。还可以使用菁二聚体染料b o b o 3 并结合多色荧光原位杂交技术来检测细 菌活性【2 5 1 。而使用d i b a c 4 ( 3 ) 和c f d a 对细胞进行染色，研究人员可以快速的 分析细菌膜电位和细菌酯酶活性【2 4 1 。还有研究者通过使用c t c 来进行直接活菌 计数，c t c 是一种无色细胞膜可渗透成分，可以被具有呼吸活性的细菌细胞通 过电子传递链还原，在细胞内形成红色荧光沉淀物质c t f ( c t c f o r m a z a n ) ，因 此c t c 被用于指示细菌活性。m e z u l e 等利用c t c 测定呼吸活性加上直接活菌 计数测定细菌繁殖率来对饮用水消毒效率进行分析，他们发现c t c 能用于研究 “活的但不可培养”细菌的呼吸作用【26 1 。r i c c i a r d i 等通过使用i n t 来分析在不同 压力环境下的细胞新陈代谢活性，他们发现无色的i n t 在与具有新陈代谢活性 的细胞进行反应后会产生红色的晶体，通过检测其发射的荧光，便可研究细胞 的新陈代谢活性【2 。 病毒检测：病毒在水环境生态系统中占有重要的地位，它们在整个水环境 微生物食物链以及微生物基因交换中都发挥了很大的作用【2 引，水环境中的肠道 病毒等还会对人体健康造成很大影响，所以加强对水环境病毒检测方面的研究 具有很重要的意义。目前我们在水环境病毒直接计数，病毒分类以及毒性测定 等方面的技术还不是很完善。在2 0 世纪9 0 年代之前，使用最广泛的病毒检测 方法是宿主细胞培养法，通过宿主细胞来鉴定分离相应的病毒颗料2 9 】，但这种 方法耗时过长并且容易出现假阳性。随后，f c m 、分子生物学方法迅速发展， 并且被很多研究者应用于水环境病毒检测上，例如，d o m i n i q u e 等人将f c m 应 用于海洋病毒检测并取得较好的效果，其检测的结果与荧光显微镜和穿透电镜