（化学工程专业论文）高效液相色谱手性流动相添加剂法拆分药物对映体.pdf

脚 c二 共 大 争 砚 士 掩 丈 高效液相色谱手性流动相添加剂法拆分药物对映体 摘 要 许多药物对映体由 于其空间结构的差异， 导致其药理、 药效上有 很大的不同。因此，对这些对映体的拆分分析具有非常重要的意义。 在过去二十多年里， 利用高效液相色谱进行对映体光学拆分已 取得了 巨大的进展，成为测定光学纯度和获得光学纯药物的确实可行的方 法。 本文分别以 高效液相色谱手性流动相添加剂法对麻黄碱， 对经基 苯甘氨酸甲 酷，美托洛尔， 布洛芬对映体的拆分作了 研究。 本论文的第一部分对高效液相色谱拆分对映体进行了评述，介绍 了 两种高效液相色谱手性拆分方法、手性选择剂类型及其最新发展。 本论文的第二部分介绍了高效液相色谱分离的基本原理及手性拆 分对映体的机理。 本论文的第三至第六部分介绍了高效液相色谱手性流动相添加剂 法拆分麻黄碱、 对经基苯甘氨酸甲 醋、 美托洛尔、 布洛芬对映体。 以 3 一 环糊精、轻丙基_ 0 一 环糊精作为手性流动相添加剂在 c 8 柱上， 成 功地拆分了麻黄碱、 对经基苯甘氨酸甲酷、 美托洛尔。 布洛芬对映体。 考察了流动相的组成、 p h值、流速以 及手性流动相添加剂的浓度对 拆分选择性的影响。建立了p 一 环糊精， 轻丙基一 p 一 环糊精手性流动 相添加剂法拆分麻黄碱、 对经基苯甘氨酸甲 酷、 美托洛尔、 布洛芬对 映体的方法。 浙 a 工 鸿 大 争 硕 士 份 文 本论文的第七部分介绍了 美托洛尔片剂含量的高效液相色谱法 测定， 选用a g i l e n t e c l ip s e x d b -c s 柱， 以甲 醇 : 水= 6 0 : 4 0 为流动 相， 建立了测定美托洛尔含量的高效液相色谱法。本法简便、 准确、 快 速。 线 性范围 : 0 .5 一 4 0 0 p g m l - ( r 二 0 .9 9 9 8 ) 。 平 均回 收 率 为 1 0 0 .5 %, r s d=1 .5 6 % ( n = 5 ) 。有利于美托洛尔的质量控制。 关键词: h p l c ， 手性流动相添加剂，0 一 环糊精， 经丙基一 0 一 环糊精 对映体拆分，麻黄碱，对轻基苯甘氨酸甲酷，布洛芬，美托洛尔 浙 a 工 业 大 学 硕 士 份 文 h i g h p e r f o r ma n c e l i q u i d chroma t ograp hi c s e p ara t i on of drug e nant i ome r us i ng chi ral mobi le p has e addi ti ves abs tract ma n y c h i r a l d r u g s m a y d i f f e r in t h e i r p h a r m a c o l o g i c a l a c t i v i t i e s t o t h e d i ff e r e n c e o f s t e r e o c h e m i s t ry . t h e r e f o r e ，r a p i d a n d s e n s d u e i t i v e m e t h o d s f o r t h e r e s o l u t i o n a n d q u a n t i f i c a t i o n o f t h e i n d i v i d u a l o p t i c a l l y p u r e e n a n t i o m e r s a r e o f g r e a t i m p o rt a n c e ; c h r o m a t o g r a p h i c m e t h o d s o n b o t h t h e a n a l y t i c a l a n d p r e p a r a t i v e s c a l e h a v e b e c o m e o f c o n s i d e r a b l e i n t e r e s t i n r e c e n t y e a r s . p a r t i c u l a r l y i n t h e p a s t 2 0 y e a r s , o p t i c a l r e s o l u t i o n b y h i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y( h p l c ) h a s p r o g r e s s e d r a p i d l y , a n d h a s b e c o m e a p r a c t i c a l a n d u s e f u l m e t h o d n o t o n l y f o r d e t e r m i n in g o p t i c a l p u r i ty b u t a l s o f o r o b t a i n i n g o p t i c a l i s o m e r s . i n t h i s p a p e r t h e s e p a r a t i o n o f s o m e e n a n t i o m e r i c b a s i c d u r g s , i n s e c t i c i d e s ( s u c h a s f e n v a l e r a t e ，t r i a d i m e n o l )a n d s e c - p h e n e t h y l a l c o h o l h a s b e e n i n v e s t i g a t e d b y m e a n s o f c h i r a l m o b i l e p h a s e a d d i t iv e ( c mp a ) o r b y t h e 浙 江 工 店 大 攀 项 士 冷 文 u s e o f c h i r a l s t a t i o n a ry p h a s e s ( c s p ) r e s p e c t i v e l y . i n p a r t i ， a r e v i e w o n c h i r a l r e s o l u t i o n b y h i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o gr a p h y ( h p l c ) i s p r e s e n t e d . b a s i c a l l y , t w o d i f f e r e n t a p p r o a c h e s f o r t h e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y r e s o l u t i o n o f e n a n t i o m e r s a n d t h e t y p e s o f c h i r a l s e l e c t o r a r e i n t r o d u c e d . t h i s r e v i e w a l s o d e a l s w i t h t h e d e v e l o p m e n t a n d p r e s e n t s t a t e o f c h i r a l s e l e c t o r s . i n p a r t 1 1 , t h e b a s i c t h e o ry o f s e p a r a t i o n b y h i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o gr a p 坤 ( h p l c)a n d c h i r a l r e c o g n i t i o n m e c h a n i s m s f o r e n a n t i o me r s a r e d e s c r i b e d . i n p a r t ii i t o v i , e p h e d r in e , t y r o s i n e m e t h y l e s t e r , m e t o p r o l o l , i b u p r o f e n e n a n t i o m e r i c s e p a r a t i o n w i t h c h i r a l a d d i t i v e a s m o b i l e p h a s e b y h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o gr a p h y a r e p r e s e n t e d . e n a n t i o m e r s o f e p h e d r in e , t y r o s i n e m e th y l e s t e r , m e t o p r o l o l , i b u p r o f e n w e r e c o m p l e t e l y r e s o l o v e d w i t h 13 - c y c l o d e x t r i n o r h y d r o x y p r o p y l - 0 一 c y c l o d e x t r i n a s t h e c h i r a l m o b i l e p h a s e a d d i t i v e o n c 8 c o l u m n . i n a d d i t i o n a l t h e i n fl u e n c e o f t h e m o b i l e p h a s e c o m p o s i t i o n , p h , t h e m o b i l e fl o w - r a t e , t h e c o n c e n t r a t i o n o f c h ir a l m o b i l e p h a s e a d d i t iv e o n t h e s e p a r a t i o n f a c t o r a r e s t u d i e d . t h e m e t h o d w i t h a - c y c l o d e x t r i n ，h y d r o x y p r o p y l - p- c y c l o d e x t r i n a s t h e c h i r a l p h as e a d d i t i v e f o r t h e s e p a r a t i o n o f e p h e d r in e , t y r o s i n e m e t h y l e s t e r , m e t o p r o l o l , i b u p ro f e n e n a n t i o m e r s h a v e b e e n e s t a b l i s h . i n p a r t v ii , t h e d e t e r m i n a t i o n o f m e t o p r o l o l t a b l e t s a r e i n t r o d u c e d b y 街 ( 3 ) 两 个对映体具有完全不同的生物活性; ( 4 两个对映体中一个有活性， 另一个不 但没有活性， 反而有毒副作用; ( 5 ) 对映体中两个都有相近的活性， 但从全面平 衡 仍 宜 选 用 单 一 异 构 体: ( 6 ) 对映 体中 ， 一 个 有 活 性 而 另 一 不 不 但 没 有 活 性 而 且 发生拮抗作用。 例如， 它们可能有不同的味道， 不同的 气味， 最重要的是， 各对 映体可能表现出极不相同的生理行为， 如 ( r ) 一 天冬酸胺有甜味，而天然 ( s ) - 天冬酞胺则是苦的;( s ) 一 ( + ) 一 香芹酮有芫茎的香味，而其 ( r ) 一 异构体则有 留兰香的香味。 生物体的酶和细胞表面受体是手性的， 外消旋药物的两个对映体 断 仁 二 业 李 硕 士 铸 大 在体内以 不同的途径被吸收、 活化或降 解。 这两种对映体可能 有相等的药理活性; 或者一种可能是活性的， 另一种可能是无活性的甚至有毒的; 或者两者可能有不 同 程 度或 不同 种类的活性13 - 5 1 。 例如临 床广泛 使 用的 0 - 阻 滞剂如普蔡洛 尔， 其s - 对 映 体的 生 物效 价 是r 一 对映 体的9 8 倍， 而r 型 代 谢 速率比s 型 快 6 1 ; 又 如 氯 霉 素是一种广谱抗生素， 但只有其中的d - ( ) 光学异构体具有杀菌作用， 而l( - ) 光学异构体则没有药效;再如外消旋的沙利度胺 ( t h a l i d o m i d e )曾 是有力的镇 静剂和止吐药， 尤其适合在早期妊娠反 应中使用。 不幸的是， 有些曾 服用过该药 的孕妇产下了畸形的婴儿。因此， 很快就发现它是极强烈的致畸剂。 进一步的研 究表明，其致畸是由该药的 s 一 异构体所引起的，它在机体中的代谢产物既有胎 毒性又有致畸性，而 r - 异构体被认为即使在高剂量时在动物体中也不引起畸变 7 1 ， 类似的 例子很多p 。 据统计现有药物中有6 0 % 具有一个或多个手性中心， 鉴 于有机分子的立体结构与其生物活性有特殊关系，1 9 9 2年美国国家医药管理局 规 定， 今后 凡发 展具有不 对称中 心的 药物， 必须给出 手性拆分结果 18 1 ， 使 之能 生 产出 光学纯药物， 欧共体也采取了相应的措施。 因此， 药物对映体的手性拆分显 得十分重要， 有关手性化合物对映体的 研究成为国际上分离科学的 研究热点 1 9 1 因此手性化合物对映体的拆分在药物化学、 生物化学、 高效农用化学品开发及有 机立体化学等领域中有着非常重要的理论价值和现实意义。 对映体的拆分和测定在分离科学上曾被认为是最困难的工作之一。 经典的方 法， 如分级结晶、 旋光法、 酶催化法等的 重现性或灵敏度欠佳。 高效液相色谱法 在7 0 年代后期开始了 此项研究， 短短的二十年时间已 取得突破性进展，发展了 多 种 方 法， 由 于 它的 快 速、 操作 方 便、 成 本不 高 等 优点 而 受到 广 泛重 视11 0 1 . 1 9 8 8 年6 月在巴 黎召开的第一届国际手性分子分离会上， 9 0 % 的文章是涉及到色谱的 1 1 1 1 . 1 9 8 8 年9 月 在维也 纳召开的 第十七 届国 际 色谱会上， 有关 对映 体的 报告竟 占 大 会 报 告 的巧 %川 .由 此可 见， 高 效 液 相色 谱 ( h p l c 】 进 行 对映 体的 光 学 拆 分 己 成为现代合成化学、生物医药学及农业化学等领域中 必不可少的工具. h p l c 拆分 对映体的方法可分为两类: 直接法和间接法。 对映体不加处理， 直接采用手 性选择器 ( 手性固定相c s p和手性流动相添加剂c a m ) 拆分的方法称为直接 法。 间接法又称手性衍生化法 ( c d r ) 是让手性衍生化试剂与被分析组分反应， 使对映体转变成非对映体后， 利用其物化性质的不同， 在非手性固定相上进行拆 浙 妞 工 该 大 李 硕 士 婚 大 分。 然后经化学转化， 再生出原对映体。 两者的共同点是:均以现代h p l c技术 为基础， 并引入不对称中心 ( 或光活性分子) ， 不同的是c d r法中是将其引入于 齐质分子内，而c mp a和c s p则引入分子间。引入手性环境使对映异构体呈现 物理特征的差异是手性h p l c作光学异构体拆分的基础。 下面分别介绍这两种方 法: 1 . 2手性衍生化法 1 . 2 . 1 手性衍生化的反应条件 为了有效地拆分和准确地测定对映体，手性衍生化试剂法需要满足以下条 件 1 2 - t 6 . ( 1 ) 手性试剂和反应产物在化学上和手性上都很稳定。 手性试剂应是光学 纯且在贮存中不发生改变。 在衍生化反应中， 试剂、 手性药物和反应产物不应发 生消旋化反应。 若有光学纯对映体， 试剂中对映体杂质量或消旋化率可通过检测 其非对映体杂质的相对峰面积来确定，一般应少于1 %。若用于测定痕量对映体 杂质， 则试剂光学纯度要求更高。 各对映体应有相同的衍生化速率。 另外， 从对 映体杂 质的 最小检出量考虑， 杂质峰最好在主峰之前洗脱， 通过换用两种不同 构 型的手性试剂可容易地达到这一目的。 ( 2 ) 手性试剂和反应产物在衍生化反应和色谱条件下应是稳定的。 为了防 止消旋化， 反应条件应尽可能温和简便。 为了保证分析方法的准确性， 衍生化反 应需要定量完成。 ( 3 ) 衍生化反应生成的非对映体对在色谱分离时应能显示高柱效。 这在生 物药物分析中尤为重要， 因痕量的非对映体衍生物需要在大量内源性化合物存在 下测定 添加剂 为了 达到高 柱效， 应选择最佳 色谱条 件， 如r p 或n p 、 流 动相组 成、 p h和柱温等。 ( 4 )手性试剂应具有u v或荧光等敏感结构。 尽管手性衍生化的目 的是将 对映体转变成能良 好分离的非对映体衍生物， 但是真正优良的试剂同时还应使生 成物具有良 好的可检测性。 例如具有蔡结构的手性试剂与胺类反应， 最低u v检 测限 约l o n g ， 若 衍生 物 具 有荧 光， 检 测限 则 可 达i n g 以 下. 这 在对 映 体 浓 度 低 的生 物药物分析和相对纯的 对映体中痕盆光学杂质的测定时显得特别重要。 浙 4 t二 泣 大 矛 硕 士 论 文 ( 5 ) 手性化合物对映体的化学结构中应具有衍生化的基团， 如氨荃i 放堪 i 轻基和琉基等。 1 . 2 . 2手性衍生试剂的种类和应用 手性衍生试剂的种类较多，主要有以下几类: ( 1 ) 酞化试剂1 7 - 2 2 7 ,酞化试剂是按酸的衍生物， 一般手性碳原子位于竣基 的 a位，主要用于分离胺和醇类。主 要应用形式有: 酞氧、 酸配. 酷。 其中 酞氯的反应性最强， 即使是仲胺、 仲轻 基也能反应， 但性质欠稳定. 如市售的 n 一 三氟乙 酞- s - 脯氨酞氯，在存放过程 中可能发生消旋化生成百分之几到十 几的r对映体。 酸醉的反应性次之， 可由 狡酸与光气制备. 游离狡酸的酞化 反应， 需要缩合剂存在。 如二环已 基碳 二亚胺 ( d d c ) 和 1 , 1 一梭基二咪 哇( c d i ) 等。 有时 还加催化剂。 常用 的反应溶剂是c h 2 c 1 2 ，甲 苯和苯。 ( 2 ) 胺类试剂2 3 - 2 7 1 : 手性胺类试 剂主要用于衍生化狡酸类、n - 保护氨 基酸、 醇类药物，如芳基丙酸类非ig st r 卜 r - c- ci 出甲 吸 c( 洲 洲r d c cw s cc n 汉 勺砂加叼 _ 08 rf rwe 仁 h,c 1 4 r吞刊 、 图1 - 1 政胺非对映体衍生物的反应类型 体抗炎药、 烃基丙三醇、 类菇酸等。 梭基可于反应前用s o c 12 转变成相应的酸氯 或用c d i 作为缩合剂， 后者反应条件温和。 若用1 - ( 3 一 二甲 胺基丙基) - 3 一 乙基- 碳酞亚胺 ( ws c ) 和1 轻基苯并三哇 ( h o b t )可以 获得高产率的酞胺衍生物。 广泛应用的 手性胺试剂都具有苯环、 蔡或葱结构， 以 提高检测灵敏度。 如1 取代 苯乙 胺、蔡乙胺、葱乙胺、二甲基禁乙胺 ( d a n e ) 、对硝基一苯乙胺等。图 1 - 1 是形成酞胺非对映体对的反应类型。 ( 3 ) 异 ( 硫) 佩酸醋 类2 8 - 3 5 1 : 异 佩酸酣主要 用于 分离 胺和醉 类对映 体， 常 用的试剂有苯乙 基异佩酸醋 ( p e i c ) .蔡乙基异佩酸酩 ( n e i c ) ，脱氢橄酸基异 氰酸醋等。 这类试剂与胺反应生成脉， 与醉反应生成氨基甲 酸酷类， 反应通常在 浙 江 工 鸿 大 李 硕 士 格 丈 c h 2 c 1 2 、甲 苯、 c h c 1 3 中进行。 而异硫氰酸酷主要用于肤类顺序、 氮推酸及胺类 异构体的分离。常用的试剂有:2 , 3 , 4 , 6 一 四 一 o 一 乙酞基书一 毗喃葡萄糖异硫 氰酸酷( g i t c ) . 2 , 3 , 4 ， 一 三一 o 一 乙酞基一 a - d - 毗喃阿拉伯糖异硫氰酸醋( a t t c ) 等。 余露山 等3 6 利 用c h ir a lc e l o d 和c h ir a lp a k a d两 种 手性固 定 相及2 , 3 , 4 , 6 一 四一 o 一 乙酞基一 h - d - 毗喃葡萄糖异硫氛酸醋 ( g r f c )衍生化试剂，对 i 1 种药物 进行手性拆分研究， 结果， 普蔡洛尔、阿替洛尔、比索洛尔、 美托洛尔、 塞利洛 尔、 卡维地洛、 索他洛尔、 普罗帕酮、 麻黄碱和佐米曲普坦都在一种或几种色谱 条 件 下 得 到了 分离. 近 年 来， 对异 硫氰 酸 类荧 光c d r 的 研究比 较活 跃。 k l e id e r n i g g 等 (3 7 1合 成( 1 s , 2 s ) - n - ( 2 一 异 硫氰 酸) 一 环已 基 新 戊 基甲 酞 胺 ( p d i t c ) 新的 荧光 c d r ， 用于拆分胺、氨基酸和唾吩等对映体。对许多胺类药物如苯丙胺和 脱氧麻黄碱， 氨基醇类药物如普蔡洛尔、 卡维地洛和美托洛尔等以及脯氨酸等消 旋体拆分的研究表明， 其分离效果比 用2 , 3 , 4 , 6 一 四一 o 一 乙酞基币 - d - 毗喃葡萄 糖 异 硫氰 酸 酷 ( g i t c ) 为c d r的 要 好。 他 们 又 试验 用 ( 1 r , 2 r ) - n - ( 2 一 异 氰 酸) 一 环已 基卜 6 一 甲 基 氨基一 4 - 哇啦甲 酸酞 胺( c d r f c ) 拆分了1 9 种氨基 酸 对映体 ( 3 8 1 。 实验结果表明该试剂是拆分氨基酸很好的c d r ，它与含伯、 仲氨基的。 、 0 、丫 一 氨基酸进行选择性的 衍生化反应， 且无消旋现象。 对氨基酸对映体拆分， 其结果优于用2 , 3 , 4 , 6 一 四苯甲酞基一 1i - d - 毗喃葡萄糖异硫氰酸醋 ( b g r r ) 或 o 一 苯二醛和d - 3 - 疏基甲 基丙酸等c d r 衍生后所得的结果。 此外， 用( r , r ) - c d i t c 为c d r与用 ( s , s ) - c d i t c为c d r所得的色谱流出 顺序相反， 这对某一对映 体大量存在下分离测定痕量的另一对映体是十分有用的。 s ( + ) - 1 - 蔡基乙基异 氰酸醋与 抗心律失常药物盐酸普罗帕酮衍生反应后， 被用于测定血浆中 普罗帕酮 对映 异 构体和药 代动力学曲 线的 研究 ( 3 9 1 。由 于 一 s 和r - 普罗帕酮的 毒副 作用差别 很大， 曾 苏等4 0 1用g i t c为c d r ， 在反相色谱柱上才分了r / s - 普罗帕酮对映体， 得到r s = 1 .9 ， 并应用于两对映体代谢中立体选择性研究. g i t c还被用于一些不 常见的 仲芳香基氨基酸， 如含1 , 2 , 3 , 4 - 四 氢异哇琳结构的 氨基酸对映体的 研 究14 1 1 。以 半乳糖为母体的新 c d r - 2 , 3 , 5 , 四 0 - 苯甲 酞基- 13 - d - 吹喃半乳糖 异 硫 氰 酩， 最近由m a r i n o 等 (a 2 】合 成， 对 拆 分 伯、 仲 氨 荃 化 合 物 ( 胺， 氨 基 醇， 氨基酸) 对映体，实验证明该c d r具有高选择性和稳定性，既可用于分析级分 离， 又可用于制备级分离。 最近， p e t e r 等提出一种新的c d r , ( i s , 2 s ) 一 或( i r , 断 江 二 此 大 争 确 士 奋 文 2 r ) - 1 , 3 一 二乙酞氧基一 1 - ( 4 - 硝基苯)- 2 - 丙华异硫氰酸 ( d a n i ) 。用c d r衍生 后的非对映体用反相色谱分离。 该试剂仅用两步即可合成。 他们用该衍生化试剂 拆分氨基酸14 3 1 、 不常见的氨基酸 ( p 一 甲基一 。 一 氨基酸和带环烷烃骨架的is - 氨基 酸) (4 4 1 和0 一 阻断剂等的对映体进行了一系列应用研究。 例如用于分离有关0 - 阻断剂对映体时均得到了 基线分离 ( r s 值为 1 .5 8 - 2 . 7 2 ) ，为这些0 一 阻断剂对映 体的分离提供了有效和简单易行的方法。 ( 4 ) 氯甲 酸 酷 类4 5 - 4 8 : 主 要用 于 分离 轻 基酸、 胺 和 氨基酸 等， 这 类 试 剂与 伯、 仲、 胺在中等碱性的水溶液中反应生成氨基甲 酸醋， 与硫醇和酚反应则生成 疏基碳酸醋和碳酸酷， 试剂同时水解产生母体醇、 c o z 和盐酸。 醇和叔胺需在合 适的 氢受体存在下， 于有机溶剂如甲 苯或c h 2 c 1 : 中与 氯甲 酸酷类反应. ( 5 ) 邻苯二醛 ( o p a ) 和手性硫醇4 9 - 5 1 1 , o p a在硫醇存在下， 可将胺类衍 生化生成异叫噪类. 这类衍生物通常都具有强烈荧光和良 好的分离度。 这类试剂 是由o p a与各种手性硫醇组成。如n - 乙酞基一 l - 半胧氨酸、叔丁氧基- l 一 半肤氨 酸和n 一 乙酞基一 青霉胺等， 广泛用于拆分氨基酸、 氨基醇、胺和硫醇。反应式 女 口 下: s - - c h i c h - - n h c o r 闭 目. ， . 2 . 3分离机理 非 对映体对衍生物是否具有良 好的分离度， 衍生化反应是否具有较高的 选择 性， 都取决于手性试剂的选择、 反应产物手性基团的结构和反应生成的化学键类 型。 图1 - 2 列举了常见官能团的衍生化方法。 非对映体对在色谱系统中的差速迁 移与 下述因素有关: 非对映体分子的手性结构; 手性中 心所连接的基团; 色谱系 统的分离效率包括溶质分子与固定相和溶剂之间的结合力， 如氢键、 偶极一 偶极、 电 荷转移和疏水性等。 反应产物间的构型差异越大。 拆分就越容易。 通常认为: 两个手性中心间的最佳距离是2 - - 4 个原子， 具有能形成氢键的极性荃团， 发生能 稳定构型的分子内 反应， 手性中心区域有环系统或刚性结构， 这些均可增加非对 映体对衍生物的分离度。 渐 a 二 店 人 争 碗 士 奋 大 . r n h c n h r t 异月吸 了 / 砚胭 r n 洲 c 牙 派胶典 ! :!、 .c o o r映.一 侧刀叮 . 奋 - 刁 旧日，共一曰沉 刀r . 砚.只 图1 - 2胺、酸和醉类手性衍生化的主要类型 1 . 3手性固定相法和手性流动相添加试剂法 ( 直接法) 对映体的拆分既可以在装有手性固定相 ( c s p ) 的色谱柱上直接进行，也可 以 在流动相中添加手性试剂 ( c m p a ) 达到同样的结果，两者统称直接法，下面 逐一介绍。 1 . 3 . 1 手性固定相法 ( c s p法) 具有不对称中心或手性识别能力的手性固定相 ( c s p )的研制， 是手性色谱 发展的前沿领域， 也是手性色谱发展的 关键和核心(5 2 1 c s p的研制始于2 0 世纪7 0 年代后期， 发展异常迅速。 各种类型的c s p( 如 p i r k l e 型、 蛋白 质型、 环糊 精型、 纤维素的多 糖型、 手性冠醚 及电 荷转移 型等) 相继研制成功，并开展了 手性识别作用机理的 研究。部分类型的c s p已 作为商 品出售，在手性分离领域得到广泛的应用。最近几年每年都有大量用直接法 ( c s p ) 成功拆分对映体的论文发表。 尤其是在色谱技术、 c s p合成方法和拆分 过程的手性识别机理等方面研究工作中 取得的巨 大进展，使 c s p拆分技术更加 迅猛地发展起来， 并越来越成为立体化学问题的重要而有效的工具。 下面就几类 主要的c s p 做一介绍。 1 . 3 . 1 . 1环糊精类手性键合固定相 环 糊 精 ( c y c lo d e x t r i n 简 称c d ) 是多 个 葡 萄 糖 分 子以1 , .4 - 试 键 相 连的 环 状 低聚糖化合物， 至今己分离出六聚、 七聚、 八聚和九聚体， 他们分别称为+ - , s - , r - 和s - c d o ( 图1 - 3 ) 每个葡萄糖取椅式构象。 整个分子具有中空并呈 “ v ”型 的圆筒状构造。( 图1 - 4 )筒内呈疏水性，筒外呈亲水性。组成c d的每个葡萄 糖单元有5 个手性碳原子， 有m个葡萄糖单元构成的c d分子将有5 m个手性中 心，因而作为主体分子能够提供给客体分子一个良 好的不可多得的不对称环境， 街 江 二 业 大 矛 硕 士 份 文 而且c d衍生物在高 达3 0 0 时仍不消旋. c d具有模拟酶的功能 1 5 3 1 。 由于c d 独特的结构， 能够选择性地包结多种客体分子， 形成具有不同自由能的包结配合 物 “ n c l u s i o n c o m p l e x e s ) 作为固定相， 其保留 行为将呈现差别。 若客体分子是 对 映 异 构 体 ， 则 将 形 成 非 对 卜 的 包 结 配 合 物 ( d is te r e o m e r ic in c lu s io n c o m p le x s ) ， 呈 现 对 映 体 选 择 性， 这 是c 扫固 定 相 分 离 手 性 化 合 物 的 主 要 依 据。 不 同 的c d , 其 腔 尺 寸 大 小 不 同 ， 因 而 54 - 其 形 成 包 结 配 合 物 的 客 体 分 子 大 小 有 选 择 性 。 原 则 上 讲 ， 较 大 的 腔 尺 寸 适 合 于 胶 大 的 客 体 分 子. 目 前， fl - c d固 定 相 用 得 最 多， 是 由 于 价 格 便 宜， 而 且 适 用 于 件 多 中 等 大 小 的 分 子 ， 特 别 是芳 香 族 化 合 物 对 映 体 的 拆分。 c h, o 日 才、，。之 图 : - 3 际 糊 精 的 结 构( a . 。 -c d , b . 。 -c d ) a r m s t ro n g 5 4 ,5 5 1和i s s a q 5 6 1 曾 评 述了c d键 合 相在 h p l c中的应用.f uji mura5 7 ,5 8 1f u j i m u r a和 k a w a g u c h i 5 9 1 首 先 通过 不同 的乙 二 胺 链节 把 c d 键合在硅胶上，用于芳香族化合物的拆 s tr o n g 6 0 , 6 1 成 功地制 备了 不 含 氮原 子 键合固定相 ，此种键合相抗水 浏)定 ancd翻 分的解 图1 - 4环糊精结构示惫图，可用于反相系统， 用 于 光 学 异 构 体 、 几 何 异 种 体 和 结 构 异 构 体 的 拆 分 . 旷 昌 渝 6 2 1 以 不 同 的 合 成路 线 制备了 不 含 氮的 高 固 载 量的c d 键合固 定 相， 具有高选择性， 黄天宝6 3 . 6 4 1 等 并用它分离了位 置 异 构 体 和 对映 体。 t a n a 矛 5 - 6 s 1等 制 备了 酞 基 化 和甲 基 化的c d 键 合固 定 相， 实 浙 江 二 从 大 李 硕 士 份 文 现了 对映体和 芳香族化合 物的 分离. h a t t o ri 6 4 7 4 1 合成了 氨基改性c d 键 合固 定相。 f u j im u r a 7 1 1合 成了 两 种 新 型 的 带 氨 基甲 酸 醋 链节的c d 键合固 定 相， 光学 分离了 苯乙 醇 酸 衍生 物。 a r m s t r o n g 7 2 ) 制 备了 一 系 列酸 基 和异 氰酸 醋改 性的庄c d键 合 相， 不 仅用于反 相系统 7 3 1 ， 而且 用于正 相系统 拆分对映体7 2 . 7 4 1 ，由 于引 入新的 可成二 二 、 氢键和偶极相互作用的 基团，显示出 广泛的对映体选择性。并且认为 在这些新的键合固定相上，对映体分离机理与包结作用无关。此外， 还评价了 2 - 轻 丙 基 - (3 - c d键 合 相7 5 1 o n a k a m u r a 7 6 1等 苯 基 氨 基甲 酞 化尽 c d键合 相， 用 于 分 离少阻 断 剂 类药 物 对映 体。 y o s h in a g a 7 7 1等 通 过新的 空间 臂将,6 - c d固 定 在 硅 胶上， 这种新的空间臂为【 3 - ( 2 - 轻乙氧基) 丙基 硅烷三氧键， 比 通常使用的【 3 - ( 2 - 轻- 3 - 羚丙氧基)丙基 硅烷三氧键的选择性高，作者用它拆分了1 2 种二甲 氨 基 蔡 磺 酸 氨基 酸。 c iu c a n u 等7 8 】将 全甲 基 化庄c d 键合 至 硅胶上， 以 抗 胆 碱 药 溟化奥芬钱作测试物全面评估了 流动相性质、 缓冲剂浓度及柱温等参数对分离的 影 响。 r y u 等(7 9 )分别 采 用r - c d 与t - ( 3 - 。 一 甲 基 卜o - c d 键合 相拆 分了 苯丙 氨 酸 和 色氨酸的2 , 4 一 二硝基苯衍生物， 表明甲 基化令c d的 选择性更好。 蒋艳杰等18 0 1 研 究了3 9 种 仲醇 类 化合 物 在 全甲 基户c d上的 拆分. 冯 钮铸 等 19 1 研究 发 现 在8 - 经基喳琳衍生化价c d链合硅胶液相色谱固定相上， 4 种苯丙酸类药物布洛芬、 f l u r b i p ro f e n .酮洛芬和非诺洛芬均能得到较好的分离。冯钮铸等8 2 . 9 3 1还合成了 单氮杂1 8 - 冠- 6 与0 - c d混合功能基键合硅胶固定相， 发现它能部分拆分通常在 庄c d键合 硅胶固定相上无法拆分的 三种手性化合物: 苯甲 酸疏丙酞甘氨酸、 澳 丙酞甘氨酸、 疏丙酞甘氨酸及合成了2 , 4 , 6 一 三硝基苯酚衍生化0 一 环糊精键合 硅胶固定相， 考察了固定相对稠环芳烃、 位置异构体、 丹磺酞化氨基酸等物质的 分 离 性 能， 并 对 其 分 离 机理 进 行了 初 步 探讨。 张 健 等8 4 1应用接 枝聚 硅 氧 烷少 c d 成 功 地分 离了 乳 酸 烷基 酷。 何 建 峰等 s 5 用3 , 5 一 二 硝 基苯甲 酞 化的户c d 硅 胶固 定相拆分了1 1 对生物碱类手性药物对映体， 取得了良 好的分离效果。 最近， 周 爱 玲等 8 6 合 成了 苯基 氨基甲 酸 酷全衍生 化0 一 环糊精键合硅胶固定相， 在正 相色 谱条件下，对系列 l -( 唾哇基)一 a 一 氮荃麟酸酩化合物进行了有效的手性拆分 研究。 综上所述， c d固定相在手性化合物的色谱拆分中 选择性高、 应用范围 广。 可以 预料，新型的c d衍生物固定相的研究会成为最热门的研究课题之一。 1 . 3 . 1 . 2氢键的电 荷转移键合相 街 a 工 改 大 争 硕 士 婚 火 这 类固 定 相的 研究， 主要贡 献 应归 功于美国i l l i n o i s 大学的p i r k l e w h研究 组， 因 此 称 为p ir k l e 型 或 多 种 作 用 手 性 固 定 相 8 7 ， 其 商品 以b r u s h - t y p e ( 刷 型 ) 著 称. 而且， p i r k l e 还运用非对映异构化合物作用的分子模型和对同一系列的各种 外消旋物质的研究，阐明了这类 c s p的手性识别机理， 其立体识别基于三点作 用原理。在 p i r k l e 型 c s p上的对映体分离通常通过以下几种作用而发生:( d 被分离溶质与c s p芳环的n 一 受体和二 一 授体之间的二 一 二 作用;( 2 ) c s p上的 仲 胺、 拨基基团与溶质的酸性质子、 轻基、 氨基之间的氢键作用; ( 3 ) 偶极偶极作 用;( 4 )大体积非极性基团靠近 c s p手性中心而产生的空间立体效应。图 1 - 5 给出 了3 , 5 - 二 硝基苯 酞基苯甘 氨酸离 子 ( a ) 或 共价( b ) 键合到氨丙 基硅胶上的p i r k l e 型c s p的结构。 n(2 . 一o - s i _ _ _曰h n f g 0 2 c .- c n 1 c n 浇 n 02 一o - s i2 、 、 .碑 沪 声 、 臼 云 弓 no z 曰n 沙h 1-0:p 。人 口 图 1 - 5 p ir k le 9 7 1等以2 ,2 ,2 一 三 氟 ( - 1 - ( 9 - 1 ) 乙 醇 ( t f a e ) 作 为 手 性 溶 剂， 研 究2 一二 硝 苯 基甲 基亚 矾( : 一 酸 ) 外消 旋体n m r ， 发 现t f a e 作用下，由 于两对映 体的 立体 构 型不同， 导致其化学位移不同。 将t f a e 键合到硅胶上形成的 手性固定相被称为 第一代p i r k l e型c s p 。这种含葱基氟醉的c s p可用于分离芳基亚讽，各种氨基 酸 、 胺 、 醉 、 经 基 酸 对 映 体 的3 ,5 一 二 硝 基 苯甲 酞 ( d n b 商生 物 8 8 . 8 9 根据交互作用原理，由 上述被分离对映体d n b衍生物制备的c s p ，可分离 手性 芳香醇。 p i r k l e 等制备了d n b氨 基酸、 醉、 胺 衍生物 键合c s p 9 0 1 ， 此类固 定相不仅有共价键合型， 还有离子键合型。 这些以氨基酸d n b衍生物为主的c s p 街 侣 工 蕊 大 争 硕 士 玲 丈 构成了 第二代 p i r k l e型 c s p ， 可有效分离含芳基的 胺、醇、 氨基酸、 亚矾、 氨 基麟 酸等多 种类型手 性化合 物及其衍生 物9 1- 9 3 。 从 大量第二代p i r k l e 型c s p 分 离的各类手性溶质中， 选择分离最好的几类手性化合物作为手性配基， 在深入揭 示 手 性识别 机理的 指导 下， p i r k l e 等人发展了 第三代p i r k l e 型 c s p 9 1 . 这类c s p 一般 具有富电 子( : 一 碱或卜给体 ) 的 蔡基 和较长的 键合 烷基链，除酞胺结构 外， 还有服型结构，提高了立体识别能力和适用范围。此后，还合成出既含二 一 酸 ( d n b ) ， 又 含二 一 碱( 蔡基 ) ， 含有多 个手性中 心， 如不 对称磷、 联蔡等 不对 称中 心 的p i r k l e 型 c s p 。 近几年来， 又相继合成出 氨基磷酸醋及一系列含蔡、杂环的 氨基酸衍生物、二氨和由联蔡梭酸衍生物的多种作用c s p . 在手性液相色谱领域， p i r k l e 型c s p 是目 前使用量大、 适用面广、 对手性识 别机理揭示较深的一类重要c s p 。 它们具有确定的化学结构， 其共同结构特征是 在手性中心附近至少含有下列基团之一: n 一 酸或二 一 碱芳基， 具有给体一 受体相互 作用能力 ( 电子转移络合) ; 极性氢键给体一 受体; 形成偶极相互作用的极性基团; 大体积非极性基团，提供立体位阻、范 德华氏 作用或构型控制作用。 图1 - 6 描述了 其立体选择性作用点. i .i 。 一 飞 c r h ，一、_ 1 界一 万扣月 图1 - 6 p i r k l e 型c s p立体作用点 p i r k l e型 c s p的优点是柱效和柱容量高，不仅用于对映体分析，也可用于 对映体制备分离。 它可以 拆分很多外消旋光学异构体， 例如烷基和芳基醇、 芳基 取 代乙 内 酞 脉、 内 酞胺、 丁二酞 胺、 四 抓苯酞、 亚 砚、 硫化物、 酞肢、 酞亚胺等。 对于含有极性基团 ( 氨基、 拨荃、 径基) 的外消旋物质， 为避免与固定相的作用 过强， 需要先进行衍生化， 衍生化包括将氮荃转变成酞胺， 轻基转化成醋、 氨基 甲 酸醋。 基于立体识别机理， 它还可以 预测对映体洗脱顺序; 确定其构型; 测定 光学纯度。 其不足是被分离的 溶质大部分需衍生化以引入芳基等手性识别所需基 团: 多使用非极性溶剂作流动相， 如正己 烷和异丙醉， 溶解度可能限制对某些溶 质的应用。 3 . 1 . 3配体交换 c s p 浙 a 二 该 大 矛 硕 士 奋 丈 该类c s p以苯乙 烯一 二乙 烯苯聚合物为载体， 在上面接一个手性氨基酸如1 r 颇 氨酸， 经吸附c u 2 , n i z + 或z n z 十 。 可 拆分 氨基酸对映体。 是当 前 分离衍生 氨 基酸对映体的最有效方法之一。 另外也可拆分一些药物如a - 甲基多巴、 甲 状腺激 素等， 其a 值为1 . 18 .0 。此类c s p已商品化。所用的流动相多为水或磷酸、乙 酸氨缓冲溶液。并酌情加入适量的金属离子或配基化合物，以防固定相流失。 1 . 3 . 1 . 4高聚物类c s p 该类 c s p主要包括蛋白 质键合相和纤维素等. 蛋白 质是一类复杂的高分子 聚合物， 所含手性亚单位一 l 氨基酸往往具有手性特异性。 许多蛋白 质分子能 手性特异性地反向键合小分子， 因而对手性分子具有很强的识别能力。 蛋白 质类 手性固定相按其来源可分为: ( 1 ) 血蛋白( a l b u m i n ) 类: 包括人血清蛋白( h s a) 和牛 血 清蛋白( b s a ) ; ( 2 ) 糖蛋白 ( g l y c o p r o t e i