（微生物与生化药学专业论文）药用生物催化剂的研究——菌株筛选及所产脂肪酶的应用.pdf

摘要 脂肪酶饵c 3 1 1 3 ) 是类脂化合物分解、合成和酯交环的催化剂，有机相中脂肪酶可以 完成酯化、交换及转酯等反应，具有区域选择性、立体选择性、较高的稳定性：抑制了水 参与的副反应，易于回收和利用；反应完毕后产物的分离纯化也比较容易，可以完成用化 学法难以进行的消旋化合物的拆分、不对称合成等，使这一古老的酶种有着崭新而广阔的 发展前景。由于酶在非水介质中反应具有水溶液介质中酶促反应无法比拟的优点，人们对 非水溶液的酶催化反应研究也就越来越感兴趣。脂肪酶在微生物界分布很广，但要寻求适 于工业化生产的高产菌株却非常困难，目前国内需要的脂肪酶仍依赖进口，为了推动非水 相酶催化在我国的研究与应用，有必要开发出适于非水相作用的脂肪酶品种。 本论文涉及有机溶剂中有活性的脂肪酶产生菌株的选育，产酶条件及其在合成抗坏血 酸脂肪酸酯和生物柴油中的应用，主要结果如下： ( 1 ) 通过添加1 0g l 的甲苯作为唯一碳源进行预培养，然后以透明圈平板筛选法从 土壤样品中成功地筛选到了一株耐有机溶剂的产脂肪酶的酵母菌a 2 1 3 ，初步鉴定为耶 罗威亚酵母( y a r r o w i as p ) 。 ( 2 ) 摇瓶实验表明，a 2 1 3 适宜的产酶培养基为( g l ) ：酵母膏4 0 ，橄榄油1 0 ， m g s 0 4 7 1 - 1 2 0l ，k h 2 p 0 4 5 ，最佳培养条件为温度2 7 、初始p h6 5 。脂肪酶活力最 高可达6 7 8i u m l ；该酶最适作用温度为4 0 ，最适作用p h 为6 5 ，该酶在4 0 ， 4 0m i n 时酶活还可保持5 0 ，p h5 5 - - 8 5 范围内稳定。能直接在叔戊醇溶剂中催化 合成l 一抗坏血酸棕榈酸酯。 ( 3 ) 首次揭示了以油脂为脂肪酸基供体跟l 一抗坏血酸非水相酶促酯交换反应合成l 一 抗坏血酸脂肪酸酯的可行性；并以氢化棕榈油、大豆油和海狗油作为脂肪酸基供体跟l 一 抗坏血酸进行酯交换反应的介质进行了筛选，发现在叔戊醇中用脂肪酶催化此反应所得的 产物浓度最高；同时对影响合成抗坏血酸脂肪酸酯的因素进行了探讨，确定了最适反应条 件：最佳的初始油脂底物浓度为2 0 0 6 0 0m m o l l ，最适反应时间可以定为9h 。最佳反应 条件下产物浓度可达：4 3 5 1g l 。 ( 4 ) 脂肪醇解反应在油脂化工中具有重要的意义。本文建立了用于脂肪醇解反应产 物定性定量分析的薄层层析法和高压液相色谱法，研究了在不添加其他溶剂的前提下脂肪 酶催化氢化棕榈油和无水乙醇的脂肪醇解的过程，当乙醇：棕榈油= 2 0 0 ：1 反应进行1 2 h 时 几乎全部转化为乙酯，此时棕榈油、单甘酯、双甘酯的含量接近0 。 关键词：脂肪酶菌种选育有机溶剂抗坏血酸脂肪酸酯生物柴油 江南大学硕：l 学位论文 a b s t r a c t l i p a s e s ( t r i a c y l g l y c e r o lh y d r o l a s ee c 3 1 1 3 ) a r ee n z y m e sw i d e l yd i s t r i b u t e di nn a t u r e ， w h i c hc a t a l y s et h eh y d r o l y s i s ，s y n t h e s i sa n di n t e r e s t e r i f i c a t i o no fl i p o i d ，a n da l s oc a p a b l et o c a t a l y s e t h ee s t e r i f i c a t i o n ，i n t e r e s t e r i f i c a t i o na n dt r a n s e s t e r i f i c a t i o ni no r g a n i cm e d i a ，w i t h c o n t r o lo ft h ew a t e ra c t i v i t y t h e ys h o wu n i q u ec h e m o 一，r e g i o a n de n a t i o s e l e c t i v i t i e sa sw e l l a st e m p e r a t u r ea n dp hs t a b i l i t i t y t h i sa n c i e n te n z y m eh a sn e wa n db r o a dp r o s p e c t sf o r d e v e l o p m e n t b e c a u s eo fi t si n h i b i t i o no ft h ew a t e rp a r t i c i p a t i o ns i d er e a c t i o n ，t h er e l a t i v ee a s eo f r e c y l i n g ，t h er e l a t i v e e a s eo fr e c o v e r yo fp r o d u c t si no r g a n i cp h a s ea n ds e p a r a t i o na n d a s s y m e t r c a l l ys y n t h e s i so fr a c e m i cc o m p o u n dw h i c hi sd i f f i c u l tw i t ht h ec h e m i c a lp r o c e s st o c a r r yo n t h en o n a q u e o u sp h a s ee n z y m a t i cc a t a l y t i cr e a c t i o n sh a v er e c e i v e di n c r e a s e da t t e n t i o n d u et ot h ee n z y m ei nt h en o n a q u e o u sm e d i u mh a sm a n ya d v a n t a g e sw h i c hi su n a b l et oc o m p a r e i nt h ew a t e r l i p a s e si nm i c r o o r g a n i s md i s t r i b u t ev e r yb r o a d ，b u ti ti sd i f f i c u l tt os e e kas u i t a b l e h j g hp r o d u c t i o ns t r a i nf o rt h ei n d u s t r i a l i z a t i o np r o d u c t i o n a tp r e s e n tt h ed o m e s t i cn e e dl i p a s e s t i l lr e l i e do nt h ei m p o r t ，i no r d e rt oi m p e lt h en o n a q u e o u sp h a s ee n z y m a t i cc a t a l y s i si no u r c o u n t r y sr e s e a r c ha n dt h ea p p l i c a t i o n ，i ti sn e c e s s a r yt od e v e l o pt h el i p a s es u i t a b l ef o rn o n a q u e o u sp h a s ef u n c t i o n i nt h i st h e s i s ，t h es c r e e n i n go fl i p a s e p r o d u c i n gs t r a i nf o rc a t a l y t i cs y n t h e s i so fe s t e ri n o r g a n i cm e d i aw a sc o n d u c t e d t h el i p a s e p r o d u c i n gc o n d i t i o n sa n di t sa p p l i c a t i o ni ns y n t h e s i s o fl a s c o r b y lp a l m i t a t ea n db i o d i e s e lw e r ea l s oi n v e s t i g a t e dc o n s e q u e n t l y t h em a i nr e s u l t sa r e a sf o l 】o w s ； ( 1 ) a no r g a n i cs o l v e n tt o l e r a n ti s o l a t ea 2 1 3o r i g i n a t i n gf r o ms o i ls a m p l e sw e r es u c c e s s f u l l y i s o l a t e dv i ad i r e c tp l a t i n gm e t h o du s i n g1 0g lo ft o l u e n ea st h es o l ec a r b o ns o u r c ea n d t r a n s p a r e n tc y c l ep l a t ea s s a ym e t h o d i t w a si d e n t i f i e da sy a r r o w i ab a s e do ni t s c h a r a c t e r i s t i c s ( 2 ) t h er e s u l t si ns h a k ef l a s kc u l t i v a t i o ns h o w e dt h a tt h es u i t a b l el i p a s ep r o d u c i n gm e d i a w e r e ( g l ) ：y e a s te x t r a c t4 0 ，v e g e t a b l eo i l1 0 ，m g s 0 4 7 h 2 0 1 ，k h 2 p 0 4 5 u n d e ro p t i m a l c u l t u r ec o n d i t i o n s ( 2 7 a n dp h6 5 ) ，t h em a x i m a ll i p a s ea c t i v i t yc o u l dr e a c h6 7 8i u m l t h eo p t i m a lp ha n dt e m p e r a t u r ef o rt h eh y d r o l y s i so fp - n i t r o p h e n 。y la c e t a t eb yc r u d el i p a s e w e r ep h 6 5a n d4 0 a f t e r4 0m i n t h ee n z y m eh a d5 0 a c t i v i t ya t4 0 a n dw a ss t a b l e b e t w e e np h5 5 8 5 t h e ni s o l a t ea 2 1 3w a sf o u n dt op r o d u c et h el i p a s ew h i c hc a n s y n t h e s i z el - a s c o r b y lp a l m i t a t ei nt e r t a m y l a l c o h o lv a l i d a t e d b y t h e t h i n l a y e r c h r o m a t o 铲a p hy ( 3 ) an o v e lr o u t ef o rs y n t h e s i so fl a s c o r b y lf a t t ya c i de s t e r s ( a f a e ) h a sb e e nr e v e a l e di n i i t h i sp a p e r f o rt h ef i r s tt i m e ，t h ei n v e s t i g a t i o ns h o w st h a te d i b l eo i lc a nb eu s e da st h ed o n o r o ff a t t ya c i dg r o u pt os y n t h e s i z et h ea f a ev i at r a n s t e r i f i c a t i o nw i t hl - a s c o r b i ca c i di n o r g a n i cm e d i ac a t a l y z e db yc r u d el i p a s e t h ei n f l u e n c eo fs u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n ，r e a c t i o n t i m ee t c o nt h es y n t h e s i so fl - a s c o r b i ca c i de s t e r sa r ea l s oi n v e s t i g a t e d t h er e a c t i o n c o n d i t i o n sh a v eb e e no p t i m i z e d f o rh a r d e n e dp a l mo i l ，t h ec o n d i t i o n sw e r e2 0 0 6 0 0 m m o l la f t e r9hi nt e r t - a r n y la l c o h o l 。a tt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n st h ep r o d u c tc o n c e n t r a t i o n c a nb ea c h i e v e da sh i g ha s4 3 5 1g l ( 4 ) t h ee n z y m a t i ci n t e r e s t e r i f i c a t i o nr e a c t i o ni si m p o r t a n ti nl i p i dc h e m i c a l s t h et h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h ya n dr e v e r s e d p h a s eh i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yw e r eb u i l tt o q u a l i t a t i v e l y a n d q u a n t i f i c a t i o n a l l ya n a l y z e t h e p r o d u c t i n t h i s p a p e r t h e nt h e i n t e r e s t e r i f i c a t i o np r o c e s so ft h ep a l mo i lw i t hh p a s ei nt h en o n s o l v e n tw a ss t u d i e d t h e y i e l do fp a l ma c i de s t e r sw a sa l m o s t1 0 0 w h e nt h er a t i oo fp a l mo i la n de t h a n o lw a s2 0 0 ：1 a f t e r1 2h ，a tt h es a m et i m et h ec o n t e n to fp a l mo i l ，m o n o g l y c e r i d e sa n d d i g j 【y c e f i d e sc l o s e d t 0 0 k e y w o r d s ：l i p a s e ，s c r e e n i n g ，o r g a n i cs o l v e n t s ，l a s c o r b y lf a t t ya c i de s t e r s ，b i o d i e s e l 独创性声明 奉人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文巾f i 包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名：童红途 日期：z 0 d 6 年易月s 同 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：袁缸硷导师签名：幽 ! j 日期：d 一易年；唇沩每，e t 赫稚珏絮 第一章绪论 第一章绪论 脂肪酶( e c 3 1 1 3 ) ，全称为三酰基甘油水解酶( t r i a c y l g l y c e r o la c y l h y d r o l a s e ) ，是能 在油水界面上水解甘油三酯的特殊酯酶【1 】。脂肪酶由于在自然界中存在的广泛性和催化功 能的广谱性，而备受研究者的青睐。脂肪酶及其改性制剂在食品与营养、日用化学工业、 油脂化学品工业、农业化学工业、造纸工业、洗涤和生物表面活性剂的合成以及药物合成 等许多领域得到广泛应用1 2 j 。脂肪酶的天然底物是甘油酯类，研究表明，脂肪酶除了能够 催化甘油酯类化合物的水解和合成之外，还可以用于催化酯交换反应、生物表面活性剂的 合成、多肽合成、聚合物的合成和药物的合成等，尤其是利用某些脂肪酶的立体专一性， 催化旋光异构体的拆分p i 和手性药物的合成1 4 j ，成为脂肪酶研究领域的新热点。近2 0 年来， 深入研究和应用于工业生产的微生物脂肪酶种类不断增加。目前已遍及细菌酵母及霉菌各 大类中，并借助于遗传工程提高了脂肪酶的产量。人们已经逐渐认识i i i i 肪酶作为实用催 化剂的巨大潜力，特别是对光学纯手性药物的市场需求不断增长，刺激了脂肪酶在不对称 生物转化中的应用开发。假如脂肪酶的应用今天还局限在其天然的水相介质中的话，那么 其工业应用的范围( 特别在生产精细化学品和高分子等领域) 必然会大打折扣，近来发现脂 肪酶催化反应可以在非常规介质( n o n c o n v e n t i o n a lm e d i a ) 中进行，即那些以有机物质( 溶 剂、底物、产物等) 为主的介质( 有机介质) 、气态反应介质、超临界流体和离子液体等，以 区别于那些以水为主的常规介质。z a k s 和k i l i b a n o v 的发现【5 】打破了人们有关酶作为生物 进化的产物，只有在水相中才具有催化活性的传统观念，为酶工程开辟了一个崭新的领域 非水酶学( n o n a q u e o u se n z y m o l o g y ) 。目前，不论出于学术还是工业考虑，由于其在 食品、医药及油脂化学品方面的巨大的应用潜力，有机介质中的生物催化研究都是值得关 注的焦点嘲。 1 。1 非水介质中脂肪酶催化研究进展 1 1 1 产脂肪酶菌株的筛选 通过几十年的研究，已经发现许多种微生物具有产脂肪酶的能力。根据看到的文献资 料所作的初步估计，细菌有2 8 个属，放线菌有4 个属，酵母菌有1 0 个属，其他真菌有2 3 个属，共计达6 5 个属的微生物能产脂肪酶。目前就国内研究和开发而言，虽然在产酶菌 株选育、培养条件、酶的性质及工业应用方面已有几十年的研究历史，但由于脂肪酶的结 构及性质的多样性、酶的不稳定性、底物的水不溶性酶的来源不足、提取困难以及应用范 围不广泛等问题，脂肪酶的研究进展及工业应用与蛋白酶、淀粉酶相比要慢的多，窄的多。 尤其是近年来不断派生的新型化学工业，对生物催化剂的高要求，一些原有的传统的老酶 种因不具备耐温、耐碱、有机溶剂稳定性等特点，越来越不能适应工业生产的要求。因此 江南大学硕士学位论文 一些科研工作者将目光放在老酶种的改造如化学修饰、蛋白质工程等，另一些则致力于新 酶种的开发。 传统的筛选分离脂肪酶产生菌常用的方法是用含有甘油三酯的琼脂平板，酶催化水解 产生清晰的环带或浑浊的脂肪沉淀，也可利用生色底物或产脂肪酶微生物的某些特性。国 内外脂肪酶筛选的成功实例主要有：( 1 ) 油同化平板法( 7 】( g r a v e r i r 等) ；( 2 ) 耐尔蓝显 色法( j e n s e n c h 等1 9 7 8 年) ；( 3 ) 维多利亚蓝透明圈法( 施巧琴( 8 j 1 9 8 1 ，1 9 8 0 年：吴松 刚1 9 9 1 ，1 9 9 2 年) ；( 4 ) 牛脂法( 松树亲1 9 报道，适用于霉菌筛选) ；( 5 ) 琼脂平板检测法 ( 李祖义【1 0 l 等) ；( 6 ) 沉淀法( s a t y a n a r a y a t a i l l j ) 。 脂肪酶产生菌主要从自然界中寻找，其筛选方法一般是：样品一富集培养一平板分离一 平板初筛( 观察透明圈大小) 一摇瓶复筛( 测酶活力大小) 。从自然界中筛选的产脂肪酶菌种 再经化学诱变和物理诱变可得高产菌。如任丽虹等【12 】1 9 9 6 年报道了从土样、烟叶、牛奶的 5 2 0 株真菌中分离得到1 9 4 株产脂肪酶菌，并复筛得到1 株产酶活力较高的黑曲霉l 1 。又如 无锡轻工大学的f r e d e r i cm a r i et a v e a l l 3 1 于2 0 0 0 年报道了从非洲的3 3 个土样中分离得到产生 用于催化合成低分子量酯类脂肪酶的细菌h 一1 ，初步鉴定为假单胞菌属，又以菌株h 一1 为出 发菌株，经紫外线照射和亚硝基胍处理，得诱变菌株h 一5 8 ，其脂肪酶产生能力达4 0u m l 。 此外，从保藏菌株中也可筛选到脂肪酶产生菌，如冯青等口4 】1 9 9 0 年报道用保藏菌种中筛选 到产脂肪酶较高的2 株假单胞菌、1 株地霉、1 株假丝酵母、l 株根霉、l 株黑曲霉。近年来 随着生物工程的发展，脂肪酶产生菌的诱变、育种和基因克隆等方面也取得了很大进展。 如黄建忠等【l5 j 1 9 9 5 年报道以扩展青霉n 一5 0 3 作为出发菌株，经紫外线、硫酸二乙酯、亚硝 基胍多代诱变，选育成功产酶水平高达1 2 0 0u m l 的优良菌株扩展青霉p f 8 6 8 ，其酶 活力较出发菌株提高了1 1 1 。宋欣等【16 】1 9 9 9 年报道了从2 2 份不同来源的土样中得到l 株耐 碱性脂肪酶产生菌丝孢酵母y l ，该菌株经紫外线和亚硝酸复合诱变，再以制霉菌素和琥珀 酸钠筛选高渗透性和抗阻遏性突变株，使酶活力提高了1 5 5 。周延等【i7 j 2 0 0 1 年报道了用 快中子法选育细菌脂肪酶高产菌株，结果从出发菌酶活较低的l 株得到了酶活为3 9 6 2 2u m l 的诱变株，此菌比出发菌酶活高9 2 倍。徐岩等人改变传统的产脂肪酶菌株的筛选方法， 以有机物中合成能力为终指标进行筛选，分离到一株在有机相中合成乙酸乙酯率较高的根 霉【18 1 。 1 1 2 非水介质中酶的结构和特性 1 1 2 1 非水介质中酶的结构 按照热力学预测，球状蛋白的结构在水溶液中是稳定的，在疏水环境中是不稳定的。 但在有机环境中还能表现出催化活性这一事实说明：酶的结构至少是酶的活性部位的结构 与水溶液中的结构相同，这是研究有机相中酶催化的最基本问题。总所周知，酶作为蛋白 质，它在水溶液中以具有一定构象的三级结构状态存在。这种结构和构象是酶发挥催化功 能所必需的“紧密”而又“柔性”的状态【1 。紧密状态主要取决于蛋白质分子内的氢键，溶液 第一章绪论 中水分子与蛋白质分子之问所形成的氢键使蛋白质分子内氢键受到一定程度的破坏，蛋白 质结构变得松散，呈一种呵f 启”状态。这种“紧密”和“开启”两种状态处于一种可动的平衡 中，表现出一定的柔性。 酶分子在水溶液中以其紧密的空间结构和一定的柔性发挥催化功能。z a k s 2 0 l 认为，酶 悬浮于含微水( 小于1 ) 的体系中，与蛋白质分子形成分子间氢键的水分子极少。蛋白 质分子内氢键起主导作用，导致蛋白质结构变得“刚硬”，活动的自由度变小，限制了疏水 环境下的蛋白质构象向热力学稳定状态转化，能维持着和水溶液中同样的结构与构象，不 变性还能表现出催化活性。 米赫毛霉( m u c o rm i e h e i ) 脂肪酶是目前对其结构研究比较多和较清楚的真菌脂肪酶 之一。作为一个典型脂肪酶的代表，x 一衍射结晶学的研究表明：m u c o rm i e h e i 脂肪酶的二 级结构主链是由九股的p 一中心折叠系统和五股a 一螺旋所组成。所有的a 一6 连接都是右手螺 旋。这就产生了由在一边b 一中心折叠和一系列a 一螺旋以及片断形成的一个复杂的蛋白质结 构。总的来说，a 一螺旋由于受到自身与p 一折叠的连接，结果也平行于d 一折叠股的方向。它 的催化活性是以s e r 为主与a s p 、h i s 组成的三分子催化中心进行的。但是这个中心却埋在 一段螺旋结构的“盖子”下面。“盖子”的疏水基团与这个三分子的疏水区域相结合。这个带 有t r p 的盖子是具有两亲性的，t r p 疏水表面与催化中心的疏水区域相结合，暴露出的另 一亲水端则面向外，与水分子以氢键作用连接【2 ”。 ； 脂肪酶的催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，这早在1 9 5 8 年被s a r d a 和 d e s n n e l v 【2 训发现。所谓的界面被认为是两个彼此分离的完全不同的相差，在分子水平上相 当于两个邻接的有序分子层，一个比较亲水，一个比较疏水。界面形成可提高脂肪酶活性 的理论解释为所有脂肪酶的一级结构都相似，包括重要区域h i s g l y z s e r - g l y 和 y - g l y - h i s s e r - w - g l y ( 这里x 、y 、z 、w 表示基因氨基酸残基) ；活性部位的丝氨基酸残基 被a 一螺旋掩盖，当脂肪酶与界面接触时a 一螺旋打开，这导致脂肪酶通过在丝氨基酸周围创 造一亲电区域，暴露疏水残基，增加与脂类底物的亲和力并保持催化过程中过渡中间产物 稳定。 1 1 2 2 非水介质中酶学性质 与水相反应相比，在有机介质中的反应具有以下优点：有机底物在有机溶剂中有较大 的溶解度；在有机溶剂中，酶的热稳定性和储存稳定性比在水中有明显提高i 在有机溶剂 中某些反应过程的热力学平衡可以向期望的方向移动，可以发生水溶液中不可能进行的反 应，如脂肪酶催化酯交换和酯合成反应等；在有机溶剂中，酶分子构象表现出比在水溶液 中更有刚性的特点，因而可以通过选择不同性质的溶剂来调控酶的某些选择性；产物的分 离与纯化比在水中容易；另外，酶不溶于有机溶剂因此有利于酶的回收与再利用等。有机 溶剂中生物转化除了上述一般的优点之外，还具有以下几个方面的独特且有用的优势，需 要进一步加以阐述。 1 酶的活性 江南大学硕士学位论文 有机相中酶的活性与溶剂极性及水分子存在与否密切相关。有机溶剂会使酶失活这一 传统观念的产生可能是由于酶在水有机混合溶剂及完全无水的有机溶剂中活性很低或活 力完全丧失之缘故。由于酶活力取决于酶构象，因此，研究上述体系中酶构象意义重大。 g r i e b e n o w 等研究发现，与水混溶的有机溶剂( 如乙腈、四氢呋喃、丙二醇) 和水的混合物能 使酶的二级结构发生明显变化； 1 百f i t z p a t r i c k l 2 3 和s c h m i t k e 【2 4 j 发现酶在各种无水有机溶剂 ( 如正辛烷、乙腈、环己烷) 中酶的二级结构与天然酶相比几乎不变。由此可见，决定酶催 化活性的是酶蛋白的动态结构即由静电力、疏水力、范德华力和氢键等共同参与维持的瞬 态构象。水分子作为一种分子润滑剂，能直接或间接地参与这些非共价作用，使酶活性中 心结构显现一定的柔性，从而起到对酶分子构象的调节作用。因此，对酶活性来说，有机 溶剂中存在一最适水量。当水含量远低于最适水量时，由于有机溶剂缺乏提供形成多种氢 键的能力，加之介电常数较低，导致酶蛋白分子内强烈的静电作用1 2 5 1 , 此时氢键作用主要 体现在酶分子内部，氨基酸残基处于一种紧密堆积状态，这种过于刚性的结构虽然可以使 酶在无水有机溶剂中保持二级结构不变，但已无法表现出催化活力；反之，当水含量远高 于最适水量时，大量的水分子与酶分子形成分子间氢键，此时酶处于一种十分松散的状态， 柔性过大使酶的构象易于改变，这就解释了为什么在水有机混合溶剂中酶的二级结构会变 化，并最终导致酶的变性失活。只有在最适水量附近时酶才处于一种刚柔适度的状态，表 现高的催化活性。对于不同的酶，最适水量也不同，每个蛋白分子的结合水从几十至几百 不等，这些水必须以某种形式局限并保持在酶表面，因此又被称为“必需水”。 2 热力学稳定性 对于酶的( 热) 不稳定性来说，有两种情况需要加以区分：一是当酶暴露于高温时发生 的随时间逐渐失去活性的不可逆失活；另一种是由热诱导的瞬间和可逆的协同性去折叠。 但无论是哪一种失活方式，水均起着非常关键的作用，包括促进蛋白质分子的构象变化、 天氡酰胺俗氨酰胺的脱氨以及肽键的水解等有害的反应。所以，在有机溶剂中酶的热稳定 性和储存稳定性都有明显提高。如猪胰脂肪酶( p p l ) 在苯中催化酯交换反应时，酶的活 性随温度升高( 2 0 7 0 ) 而增加，而且在7 0 连续反应7 次( 每次9 6h ) 后酶活力仍保持 6 0 ：p p l 在有机溶剂中1 0 0 时的半衰期可达数十小时，而在水中1 0 0 几乎马上失活； 而且p p l 的稳定性取决于有机溶剂中水的浓度，1 的水浓度会使p p l 的稳定性降低到和水 溶液中相同的水平【2 。这是由于水介质中酶蛋白过于柔性，活性构象易于改变，同时水的 存在会促进天冬酰胺谷氨酰j 按( a s n g l n ) 残基的脱酰基作用和肽键的水解等不利反应。此 外，有机溶剂中不存在由于微生物污染而使酶失活的问题，这也是酶在有机溶剂中稳定性 好的原因之一。 3 底物特异性 和水溶液中酶的催化一样，酶在有机溶剂中对底物的化学结构和立体结构均有严格的 选择性。在有机介质中，由于介质疏水性口7 1 、极性网、介电常数例等性质的差异，酶的选 择性( 包括化学选择性、区域选择性和立体选择性) 会发生明显的改变。其原因是酶在水溶 4 第一章绪论 液中，酶与底物的结合主要是疏水作用，而在有机溶液中，底物与酶之间的疏水作用已不 重要。酶能利用它与底物结合的自由能来加速反应，总的结合能的变化是酶与底物之间的 结合能和酶分子与水分子之间的结合能的差值。因此介质改变时，酶的底物专一性 ( k c 址k 。) 和催化效率会发生改变。另一方面，底物在反应介质与酶活性中心之间分配的 变化也是影响酶的底物专一性及其催化效率的因素之一，而底物和介质的疏水性直接影响 底物在两者之间的分配。据报道，脂肪酶在异辛烷中呈现出高的立体选择性，这一性质已 经被用来拆分外消旋醇和酸【2 w 。 4 对映体选择性 酶的对映体选择性是指酶识别消旋化合物中某种构象对映体的能力，这种选择性是由 两种对映体的非对映异构体的自由能差别造成的。有机溶剂中酶对底物的对映体选择性由 于介质的亲( 疏) 水性的变化而改变，许多实验表明，疏水性强的有机溶剂中酶的立体选 择性差，因此某些蛋白水解酶在有机溶剂中可以合成d 一氨基酸的肽，而在水溶液中酶只选 择l 一氨基酸。一些学者认为有机溶剂中酶的立体选择性降低原因是由于底物的两种对映异 构体把水分子从酶分子的疏水结合位点置换出来的能力不同。反应介质的疏水性增大时， l 型底物置换水的过程在热力学上变得不利，使其反应活性降低很多；而d 型异构体以不同 的方式与酶活性中心结合，这种结合方式只置换出少量的水分子，当介质的疏水性增加时， 其反应活性降低的不多，因此总的结果使酶的立体选择性随介质的疏水性增加而降低。i ： 5p h 记忆和p h 忘记： 有机溶剂中的酶能够“记忆”它冷冻干燥或丙酮沉淀前所在缓冲溶液中的p h 。z a k s 等称 这种现象为p h 记忆。他们在研究脂肪酶催化三丁酸甘油酯与正庚醇的转酯反应中发现，酶 的反应速度与其冷却干燥前水溶液的p h 密切相关，反应的最适p h 接近于水溶液的最适p h 。 他们认为在缓冲液中酶的解离状态取决于环境因素，而在有机溶液中不存在发生质子化的 条件，当酶分子从水溶液转移到有机溶液中时，它保持了原有的离子化状态，环境因素不 能改变酶的这种解离状态，或者说酶在缓冲液中所处的p h 状态仍被保持在有机溶剂中。利 用酶的p h 记忆特性可以控制有机相中酶催化的最适p h 。许多研究表明，有机溶剂中的酶活 力与酶冷冻干燥或有机溶剂沉淀前所在的缓冲液的p h 和离子强度相关，其最适p h 与水相中 酶催化的最适p h 是一致的。因为在有机溶剂中酶分子表面的必需水只有在特定的p h 和离子 强度下，酶分子活性中心周围的基团才能处于最佳的离子化状态，有利于酶活性的表现。 根据缓冲液中磷原子的核磁共振谱的变化和利用分子探针技术，可以检测酶从缓冲液中冷 冻干燥或有机溶剂沉淀后，转入微水有机溶剂中的p h p o i 。 1 1 3 水活度的控制 大量文献报道表明，在有机相酶催化反应中，适量水的存在是维持酶的催化活性及稳 定性的关键因素。系统含水量包括酶粉水合的结合水，溶于有机溶剂中的自由水以及固定 载体和其他杂质的结合水，与酶结合的水量是影响酶的活力、稳定性以及专一性的决定因 江南大学硕士学位论文 素。要成功应用非水介质中的酶催化反应，控制酶结合的水量和水在在酶分子中的位置是 关键。在基本无水的有机溶剂中，水对酶催化活性构象的获得与保持是必须的，但水也与 许多酶的失活过程有关。因此，有机溶剂中的微量水调控有十分重要的意义。 这里所说的有机溶剂并不是绝对无水的，只是体系中含水量较少而已。事实上，水在 酶催化反应中发挥着双重作用【3 l 】：水分子直接或问接地通过氢键、疏水键及范德华力等非 共价键相互作用，来维持酶的催化活性所必需的构象。与酶分子紧密结合的一层左右的水 分子对酶的催化活性是至关重要的，称之为“必需水”。不同酶与必需水结合的紧密程度及 所结合的必需水数量是不同的。另一方面，水是导致酶的热失活的重要因素。有水存在时， 随着温度的升高，酶分子会发生以下变化而失活：( 1 ) 形成不规则结构；( 2 ) - - 硫键受到破坏： ( 3 ) 天冬酰胺和谷氨酰胺水解变为相应的天冬氨酸和谷氨酸；( 4 ) 天冬氨酸肽键发生水解。因 此，在非水相酶反应体系中存在着“最佳含水量”。该“最佳含水量”不仅取决于酶的种类， 也与所选用的有机溶剂有关。 在有机介质酶促反应体系中，水起着至关重要的作用。研究中常用水活度表征酶 表面的水含量大小。4 。被定义为在一定温度和压力下反应体系中水的蒸气压和同样状态 下纯水的蒸气压之比。当体系达到平衡态时，体系中各部分的n 。值相等。由于有机介质 酶促反应体系中水的重要作用，可以通过体系中含水量的不同使反应向所期望的方向发 展。一方面可以通过调节含水量影响酶的水化程度及物理状态，使酶根据需要表现出不同 的催化活性。另外，还可以通过改变体系中水的活度而改变反应的平衡点。例如，随着水 活度的降低脂肪酶催化反应难易程度有如下顺序：水解，醇解，酯交换，酯化 3 2 1 。在反应介 质中可能同时存在不同反应，但通过控制水的活度，可使所期望的反应占主导地位。 1 1 4 有机溶剂中酶选择性的调控 反应体系中的有机溶剂对酶的各种选择性( 包括底物选择性、区域选择性、化学选择性、 对映选择性和潜手性选择性等) 都会发生深刻的变化。它主要通过以下三种途径发生作用： 一是有机溶剂与酶直接发生作用，通过于扰氢键和疏水键等改变酶的构象，从而导致酶的 活性被抑制或酶的失活；二是有机溶剂和能扩散的底物或反应产物相互作用，影响正常反 应的进行；三是有机溶剂还可以直接和酶分子周围的水相互作用。一般认为，在非水相反 应体系中，极性强的有机溶剂对酶的催化活性不利，因为它们会剥夺酶表面微环境中的必 需水而使酶失活。所以在多数情况下，酶在疏水性强的有机溶剂中保持较高的活性【3 。研 究表明在非水介质中加入某些添加剂1 3 3 】如乙二醇、多元醇聚合物，大环有机物如硫冠醚 及非缓冲体系的盐类均可起到稳定酶或增强其活性及选择性的作用。 底物选择性是指酶辨别两种结构相似底物的能力。这常常是基于两种底物之间疏水性 的差别。例如，许多蛋白酶( 如枯草杆菌蛋白酶和铲凝乳蛋白酶) 于底物结合的主要驱动力 来自于氨基酸底物的侧链与酶活性中心之间的疏水作用。因此，疏水性的底物比亲水性的 底物反应性更强，因为疏水性底物的驱动力更大。但当水被一种有机溶剂( 顾名思义，疏水 6 第一章绪论 作用不再存在) 代替时，上述情形将发生显著的变化。实验表明，疏水性底物n 一乙酰一l 一苯 丙氨酸乙酯( n a c l - p h e o e 0 在水中对驴凝乳蛋白酶的反应性比亲水性底物n 一乙酰一l 一丝氨 酸乙酯( n a c l s e r - o e t ) 高5 万倍，而在辛烷中苯丙氨酸底物反而比丝氨酸底物反应性低3 倍。 酶的区域选择性和化学选择性也受到溶剂的控制。区域选择性是指酶对底物分子中几 个相同官能中的一个具有优先反应能力，化学选择性是指酶对底物分子中几个不同官能团 之一的偏爱程度。例如，洋葱假单胞菌脂肪酶( p c l ) 对一种芳香族化合物中两个不同位置的 酯基，或者对糖分子中不同位置羟基的选择性受到溶剂的深刻影响。 从合成化学的观点来看，酶的几种选择性的类型中应用价值最大的是立体选择性，尤 其是对映选择性和潜手性选择性。不幸的是，酶在一些非天然的、但却有实用价值的重要 转化反应中常常表现出立体选择性不够理想，使得人们不得不进行费力费时的筛选工作。 因此，当发现溶剂可以显著影响以至逆转酶的对映选择性和潜手性选择性后，便为酶的筛 选找到一种有前途的替代方法。yh i r o s e 等人的研究发现，假单胞菌脂肪酶( p s e u d o m o n a s s p l i p a s e ，p s l ) 催化潜手性二氢吡啶二羧基酯类衍生物选择性水解产生二羧酸单酯。在 不同的有机溶剂中，酶具有不同的对映体选择性，在环己烷中产生一型对映体，在异丙 醚中产生( 研一型对映体，相同酶在不同有机溶剂体系反应所得产物的构型相反，见图l f _ 1 。 底物分子中的r 取代基不同，其对映体过量率不同，见表1 - 1 。这种拆分己在钙秸抗剂尼群 地平( n i 廿e n d i p i n e ) 合成中得到应用。 9 ”2 “：焱_ 桫 单胞茁脂肪彰 图1 - 1 溶剂对假单胞脂肪酶水解反应选择性的影响 表1 - 1 溶剂对酶水解二氢吡啶羧酸酯衍生物选择性的影响 r 溶剂构型 e e r 溶剂构型e e t - b u c 0 2 c h 2 一环己烷 r8 8 8 e t c 0 2 c h 2 -环己烷 r9 1 。4 t - b u c 0 2 c h 2 一异丙醚 s 9 9 e t c 0 2 c h 2 一异丙醚 s6 8 1 1 2 有机相中脂肪酶催化的应用 脂肪酶在非水溶剂中反应的研究，在国外已取得突破性进展。在国内，脂肪酶在非水 江南大学硕士学位论文 介质中的应用也成为近年来研究热点，并取得可喜成果。如用酶催化转酯反应拆分外消旋 体，已获得高光学纯度的对映体1 3 5 1 ：在酶促反应体系中添加b 一环糊精可提高对映体的纯度 口6 】；枯草溶菌素有效地催化合成氨基酸及肽的酯【3 ”。这一领域在国内也受到了大家的重 视。如杨波等【j 驯提出了有机溶剂中在假丝酵母( c a n d i d a a n t r a r c t i c a ) 脂肪酶( c a l ) 的催化作 用下，含手性中心碳原子的胺类化合物酰胺化的异构选择性规则；韦丽红等【3 圳用胰脂酶在 有机介质中催化反应，得到高光学纯度的2 一氨基丙醇( r ) ( 一) 和( 回( + ) 对映体；宗敏华等1 4 0 探 讨了超声辐射对有机相中脂肪酶催化有机硅醇与脂肪酸酯化反应的促进作用。刘平等【4 l 】 研究了有机溶剂中酶催化合成五肽前体的反应。此外，最近又有研究成果表明，有机溶剂 体系也可使用混合有机溶剂体系 4 2 1 ，如在乙醇中加入疏水有机溶剂等。其催化作用广泛 性和巨大的工业潜力，及它不需要辅酶等优势使它在生物合成和生物转化中具有诱人的前 景。随着酶学研究的进展，脂肪酶催化特性必将得到进一步阐明，在各行各业中作用也必 将得到最大发挥。 1 2 1 在医药工业中的应用 对手性药物而言，通常并非两种都异构体具有相同的活性，惨痛的教训使人们认识到 对手性的立体异构体必须分别进行考察，慎重对待，也促进与手性技术有关的研究的蓬勃 发展。制备光学纯药物的潜在优点在于扩大用药安全范围，提高治疗指数，改进制剂质 量，减少并发症以及寻求新的适应症。其中研究最多的一类手性药物是2 一芳基丙酸类药物。 2 一芳基丙酸类药物( 2 一a p a ) 属于非甾体抗炎药( n s a i d ) ，主要有布洛芬和