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毛细管电泳在苯氧羧酸类除草剂手性分离中的应用 摘要 毛细管电泳( c e ) 技术是近年来发展起来的一种分离分析方法，在 手性分析中显示了分离效率高、分析时间短、适用分析物种类多、进 样体积小、试剂消耗少、操作简便等优点，是非常具有应用前景的手 性分离分析手段之一。苯氧羧酸类除草剂是最早开发成功并广泛应用 于农林业生产的一类除草剂，其大多具有手性，它的对映异构体在除 草剂活性、环境行为、生物毒性等方面有明显差异。因此，本论文对 苯氧羧酸类除草剂的手性毛细管电泳进行了研究。 本实验采用毛细管电泳手性拆分5 种苯氧羧酸类化合物：2 苯氧 基丙酸、2 - ( 4 - 氯苯氧基) 丙酸、2 一( 3 一氯苯氧基) 丙酸、2 ，4 - 滴丙酸、2 ，4 ，5 - 涕丙酸。 使用的手性选择剂是应用最为广泛的环糊精类手性选择剂，包括 丫一环糊精、p 一环糊精、2 - 羟丙基- 1 3 - 环糊精。 y 环糊精为手性选择剂时，2 , 4 滴丙酸、2 ，4 ，5 一涕丙酸、2 一( 3 一氯苯 氧基) 丙酸能完全基线分离( 分离度r s 1 5 ) ，2 - ( 4 一氯苯氧基) 丙酸和 2 苯氧基丙酸部分分离( 分离度r s 分别为0 5 、0 8 9 ) 。 p 一环糊精为手性选择剂时，2 一( 3 一氯苯氧基) 丙酸和2 一苯氧基丙酸 t 能完全基线分离( 分离度r s 1 5 ) ，2 ( 4 - 氯苯氧基) 丙酸部分分离 ( r s = 0 4 1 ) ，其余两种样品无法分离。 2 一羟丙基一1 3 一环糊精为手性选择剂时，2 ( 3 氯苯氧基) 丙酸和2 - 苯 氧基丙酸能完全基线分离( 分离度r s 1 5 ) ，其余三种样品均无法分 离。 综上所述，4 种苯氧羧酸类除草剂能实现基线分离，2 ( ，4 氯苯氧 基) 丙酸在三种手性选择剂中均无法完全分离，在y 环糊精为手性选 择剂，分离度最大，r s 为o 5 。 在上述三种选择剂中，丫。环糊精是最为合适的手性选择剂，在 1 0 0 m m o l l 十二烷基硫酸钠一4 0 m m o l ly 一环糊精一7 5 m m o l l 磷酸 为缓冲溶液的实验条件下，2 ，4 - 滴丙酸、2 ，4 ，5 一涕丙酸、2 一( 3 一氯苯氧基) 丙酸完全基线分离，分离度r s 分别为8 2 7 、3 4 2 、2 8 3 ；2 ( 4 一氯苯 氧基) 丙酸和2 苯氧基丙酸部分分离，分离度r s 分别为o 8 9 、o 5 。 与已有的文献相比，本次实验我们取得了如下进展：在同一种实 验条件下我们分离的样品更多，分离度更高；选用的手性选择剂均为 常用的环糊精，实验有普及性；实验方法简单，可操作性强。 关键词：毛细管电泳，手性，拆分，环糊精，p h e n a n t i o r i cs e p a r a t i o no fc h i r a l p h e n o x ya c i dh e r b i c i d esb yc a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s a b s t r a c t c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) t e c h n o l o g yi saa n a l y s i sm e t h o dt h a t h a sb e e nd e v e l o p e di nr e c e n ty e a r s c es h o w sm a n ym e r i t si nc h i r a l a n a l y s i s ，w h i c hi n c l u d e sh i g hs e p a r a t i o ne f f i c i e n c y , s h o r ta n a l y s i st i m e ， a p p l i c a t i o nt om a n yk i n d so fa n a l y t e s ，t h es m a l li n j e c t i o nv o l u m e ，l e s s r e a g e n tc o n s u m p t i o na n de a s yo p e r a t i o ne t c c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i si sa v e r yp r o m i s i n gc h i r a ls e p a r a t i o na n da n a l y s i sm e t h o d p h e n o x ya c i d h e r b i c i d e si st h ef i r s ts u c c e s s f u l l y d e v e l o p e da n dw i d e l ya p p l i e d i n a g r i c u l t u r ea n df o r e s t r yp r o d u c t i o n ，m o s t l yw i t hc h i r a l ，i t se n a n t i o m e rh a s o b v i o u sd i f f e r e n c e si nh e r b i c i d e a c t i v i t y , e n v i r o n m e n t a lb e h a v i o r , b i o l o g i c a lt o x i c i t y t h e r e f o r e ，w es t u d yo ne n a n t i o m e r i cs e p a r a t i o no f c h i r a lp h e n o x ya c i dh e r b i c i d e sb yc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s t h i se x p e r i m e n tu s i n gc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i ss e p a r a t e df i v ek i n d s o f p h e n o x yc a r b o x y l i ca c i dc o m p o u n d s ：2 - p h e n o x y p r o p i o n i ca c i d ( 2 一p p a ) ， 2 一( 4 - c h l o r o p h e n o x y ) p r o p i o n i c a c i d ( 2 ，4 一c p p a ) ，2 一( 3 - c h l o r o p h e n o x y ) p r o p i o n i ca c i d ( 2 ，3 - c p p a ) ，d i c h l o r p r o p ，s i l v e x w eu s e dt h ec y c l o d e x t r i n a sc h i r a ls e l e c t o r s ，i n c l u d i n gn - c y c l o d e x t r i n ( 7 一c d ) ，1 3 - c y c l o d e x t r i n ( 1 3 一c d ) ， 2 - h y d r o x y p r o p y l - 1 3 一c y c l o d e x t r i n ( 2 - li p p c d ) w h e n u s i n g7 - c d a sc h i r a l s e l e c t o r ，d i c h l o r p r o p ，s i l v e x a n d 2 , 3 - c p p ac o u l db es e p a r a t e dw i t hp e r f e c tb a s e l i n e ( r s 1 5 ) ，2 ，4 - c p p a a n d2 - p p aw e r eo n l yp a r t l ys e p a r a t e d ( r s 2 0 5 0 8 9 ) w h e nu s i n g1 3 - c da sc h i r a ls e l e c t o r ，2 , 3 - c p p a a n d2 - p p ac o u l db e c o m p l e t e l ys e p a r a t e d ( r s 1 5 ) ，2 , 4 - c p p aw a sp a r t l ys e p a r a t e d ( r s = 0 4 1 ) t h er e m a i n i n gt w os a m p l e sc o u l dn o tb es e p a r a t e d w h e nu s i n g2 - h p p c da sc h i r a ls e l e c t o r ，2 , 3 - c p p aa n d2 一p p a c o u l db ec o m p l e t e l ys e p a r a t e d ( r s 1 5 ) t h er e m a i n i n gt h r e es a m p l e s c o u l dn o tb es e p a r a t e d i ns u m m a r y ，t h eb a s e l i n e s e p a r a t i o no f4k i n d so fp h e n o x ya c i d h e r b i c i d e sw e r ea c h i e v e d b u t2 , 4 - c p p ac o u l dn o tb ec o m p l e t e l y s e p a r a t e di nt h ea b o v et h r e ec h i r a ls e l e c t o r ，s e p a r a t i o nd e g r e er e a c h e d t h e h i g h e s tp o i n t ( r s = o 5 ) w i t h1 , - c da sc h i r a ls e l e c t o r i nt h ea b o v et h r e ec h i r a ls e l e c t o r s ，y c di st h em o s ts u i t a b l ec h i r a l s e l e c t o r i nl o o m m o l l s d s - - - 4 0 m m o l l y - c d - - 7 5 m m o l lh 3 p 0 4 ，w e a c h i e v e dt h eb a s e l i n es e p a r a t i o no fd i c h l o r p r o p ，s i l v e xa n d2 , 3 c p p a ，r s w a s8 2 7 ，3 4 2a n d2 8 3 2 ，4 一c p p aa n d2 一p p aw e r ep a r t l ys e p a r a t e d ，r s w a s0 8 9a n d0 5 t h i se x p e r i m e n td e v e l o p e dt h es t u d yo fc h i r a ls e p a r a t i o no f p h e n o x y a c i d b yc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s t h e r e s u l tc a nb e a p p l i e d t ot h e d e t e r m i n a t i o no fs o l i ds a m p l e s ，a n dl a i dt h ef o u n d a t i o nf o rt h es t u d yo f t h i sp e s t i c i d e se n v i r o n m e n t a lb e h a v i o r k e y w o r d s ：c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c h i r a l i t y ，s e p a r a t i o n , c y c l o d e x t r i n ，p h i v 符号说明 b g s 一背景电解质溶液c e 一毛细管电泳 c e c 一毛细管电色谱c g e 一毛细管凝胶电泳 c i e f _ 一毛细管等电聚焦c z e 一毛细管区带电泳 c f _ 一连续流动接口e o f _ 一电渗流 d a d 一二极管阵列检测器f a s s 一场放大样品堆积 g c 一气相色谱吼c 一高效液相色谱 皿c e 一高效毛细管电泳法h s c c c 一高速逆流色谱法 l v s s 一大体积样品堆积m s 一质谱 m e k c 一胶束毛细管电色谱 n 一理论塔板数 r s d s 一相对标准偏差s e f 一灵敏度促进因子 s d s 一十二烷基硫酸钠s m b 一模拟移动床色谱法 s f c 一超临界流体色谱法 t - i t 卜瞬间等速电泳 u v 一紫外光谱u 一电流淌度 d d i - 1 2 0 一双蒸水 1 1 选题背景与意义： 第一章前言帚一早刖苗 手性化合物尤其是手性农药的分离在农药的研究和农药工业发展方面具有 意义。据统计，在目前6 5 0 多种已经商品化的农药品种中，手性农药已占到1 7 0 余种【l 】。含有手性中心的农药，其异构体通常具有极为相近的理化性质，但生 物活性往往存在差异。欧美一些发达国家已经立法，限制外消旋农药的使用，对 于具有手性的农药一定要使用其具有生物活性的单一异构体，以此达到保护环境 的目的 2 1 。手性农药的研究已成为国际农药研究的新方向之一，手性农药的分离 分析是手性农药研究中的关键环节。但是由于缺乏有效且使用范围广的手性分离 分析方法，制约了手性农药的研究与开发。 由于结构及理化性质的极其相似，对映体的拆分一直是化学分离的难点和热 剧【3 】。目前，色谱方法在手性分离中发挥着极其重要的作用，用于手性农药拆分 的色谱方法主要有高效液相色谱 法( i - i p l c ) t 4 巧】、气相色谱法( g o t 6 7 】、高效毛细 管电泳 法( h p c e ) t8 。1 0 】、模拟移动床色谱法( s m b ) 、超临界流体色谱法 ( s u p e r c r i t i c a lf l u i dc h r o m a t o g r a p h y ，s f c ) 、高速逆流色谱法( h i g h - s p e e dc o u n t e r - c u r r e n tc h r o m a t o g r a p h y ，h s c c c ) 等。手性固定相液相色谱法是目前手性分离中应 用最多的一种，通常几种不同类型的手性液相柱来满足某一特定的分析要求。与 这些传统方法相比，2 0 世纪8 0 年代兴起并且迅速发展起来的毛细管电泳 ( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 分析技术，在手性分离分析提供了新的途径，成为 一个极其活跃的领域 1 1 - 1 2 l 。与g c 、h p l c 相比，c e 用于手性分离具有分离效率 高、分析时间短、适用分析物种类多、进样体积小、试剂消耗少、操作简便等特 点 1 3 - 1 5 】。对于液相色谱而言，手性选择剂一般情况下是固定在固定相上，它的 种类与浓度是无法改变的。而c e 手性分离在这方面显示出了众多的优势：在优 化分离时可以方便地改变手性选择剂种类以及浓度，或者可以同时选用多种手性 选择剂，利用它们的协同效应产生更好的手性分离效果：大多c e 采用无机缓冲 液代替有机溶剂，不仅对环境友好而且费用降低了。近几年来，毛细管电泳在手 性分离分析方面显示了出强大优势，被越来越广泛地应用于分析分离环境中的有 机污染物。 苯氧羧酸是最早开发成功并广泛应用于农林业生产的一类选择剂性除草剂， 其具有价格低廉、除草速度较快、除草谱宽等优点【1 6 】，在生产中一直发挥重要 作用，广泛应用于小麦、玉米和水稻田防除阔叶杂草。在我国，从1 9 5 6 年在黑 龙江稻田试用至今，苯氧羧酸类除草剂一直是年产量较大，使用面积最广的一类 除草剂 1 7 】。苯氧羧酸类除草剂是单一异构体具有高效的典型代表，其中r ( ) 异 构体能有效地抑制靶酶活性，阻断杂草体内生长素和赤霉素的形成，表现出很高 的除草活性，而s ( + ) 异构体则基本无效，两者除草活性相差8 ，- 1 2 倍，且降解 速率也存在较大的差异性1 8 】。对于没有活性的一半而言，用于农田，既：大量消 耗了资源，增加了企业的生产成本，又对环境造成了污染 1 9 - 2 0 】。使用单一1 高活性 手性体可以以较低的剂量达到高效的药效，在避免环境受药害的同时节约了原料， 满足社会可持续发展的要求。近年来，采用毛细管电泳技术对苯氧羧酸类除草剂 进行手性分离的研究逐渐完善。2 3 1 。p o l c a r o 等采用万古霉素( v a n c o m y c i n ) 着e i y - c d 作为手性识别剂分离2 , 4 ，5 涕丙酸( s i l v e x ) 、2 ( 2 甲基，4 氯苯氧基) 一丙酸 ( 2 - ( 4 - c h l o r o p h e n o x y ) - 2 - m e t h y l p r o p i o n i ca c i d ) 、毗氟氯禾灵( h a l o x y f o p ) $ t ：l l l l ：氟禾草 灵( f l u a z i f o p ) 的对映体2 4 】。m i u r a 等采用一系列甲基化环糊精衍生物2 5 1 作! 为手性 手性选择剂考察其对苯氧羧酸类除草剂的手性分离效果，得到结果：在以：二甲基 a 环糊精作为手性选择剂时，实现了7 种苯氧羧酸类的基线分离，包括：2 ，4 ， 5 - 涕丙酸( s i l v e x ) 、2 , 4 一滴丙酸( d i c h l o r p r o p ) 、2 - ( 3 氯苯氧基) 一丙酸 ( 2 一( 3 - c h l o r o p h e n o x y ) p r o p i o n i ca c i d ) 、2 - ( 2 - 甲基- 4 氯苯氧基) 丙酸 ( 2 - ( 4 - c h l o r o p h e n o x y ) - 2 - m e t h y l p r o p i o n i ca c i d ) 、2 一( 2 - 氯苯氧基) 丙酸 ( 2 一( 2 - c h l o r o p h e n o x y ) p r o p i o n i ca c i d ) 、2 ( 4 氯苯氧基) 丙酸 ( 2 - ( 4 - c h l o r o p h e n o x y ) p r o p i o n i ca c i d ) 、2 一苯氧基丙酸( 2 一p h e n o x y p r o p i o n i c ) 。l e w i s 等使用t m - 3 c d 为手性选择剂基线分离了2 , 4 滴丙酸( d i c h l o r p r o p ) 2 6 1 ，致力 于研究因环境变化而产生其对映体在土壤中降解速度的差异性，深刻地揭示了在 探索手性污染物的环境行为影响，与此同时，也要考虑到因微生物转化过程中的 给环境变化带来的影响以及对映体的选择性，这问题已成为当前研究的热点。 毛细管电泳在苯氧羧酸类除草剂手性分离分析中的研究虽然在逐步完善，但 仍旧存在很多明显的问题。苯氧羧酸类化合物种类繁多，现已有的文献中，能够 拆分一系列化合物的分离条件的相关报道并不多；或者有些实验中选择的手性选 择剂过于昂贵，实验缺乏普及意义；或者在有些实验条件比较复杂，实验可操作 性不强；或者在有些实验条件中能够分离，但分离时间过长等等一系列缺点。因 此，我们深入开展苯氧羧酸类的毛细管电泳分离分析是一项有意义、富有挑战性 的工作。 1 2 本实验技术路线 环糊精及其衍生物是应用最为广泛的手性选择剂2 7 1 ，可以分离多种手性物 质，近年来有关环糊精作为手性选择剂的报道很多 2 8 - 2 9 】，已经成为分离科学领域 的热门和研究重点之一。本实验用环糊精及其衍生物作为手性选择剂分离苯氧羧 酸类除草剂，从而丰富其在毛细管电泳中手性分离的方法和理论。 本实验选取化学结构相似且市场需求量大的5 种苯氧羧酸类除草剂作为样 品，分别为：2 一苯氧基丙酸( 2 p h e n o x y p r o p i o n i ca c i d ) 、2 - ( 4 一氯苯氧基) 丙酸 ( 2 ( 4 c h l o r o p h e n o x y ) p r o p i o n i c a c i d ) 、2 - ( 3 一氯苯氧基) 丙酸 ( 2 - ( 3 - c h l o r o p h e n o x y ) p r o p i o n i ca c i d ) 、2 ，4 - 滴丙酸( d i c h l o r p r o p ) 、2 , 4 ，5 一涕丙酸( s i l v e x ) 。 这些农药在我们环境中扮演着非常重要的角色，能够将其手性分离，对生产具有 经济与环保的双重意义。 影响手性c e 分离效果决定性因素是手性选择剂，在我们现有的理论知识基 础上，还不能直接判断一种手性选择剂是否适合对某一对映体，因为手性选择剂 和不同样品相互作用的机理还尚未研究清楚；换句话说，对某种手性样品而言， 也不能判断到底哪一种手性选择剂是最为合适的。一般情况下，我们选择手性选 择剂，先是参照文献，其次进行反复的试验，直到获得理想的试验结果。本实验 采用常用的丫环糊精( 丫c d ) 、3 - 环糊精( i b - c d ) 以及改性后溶解性好的2 一羟 丙基p 环糊精( 2 h p d c d ) 作为手性选择剂，进行苯氧羧酸类除草剂农药的毛 细管电泳手性拆分。通过考察不同环糊精( c d ) 对手性分离的影响，确定最为 有效适用的手性选择剂。同时优化其毛细管电泳分离的非手性因素，如表面活性 剂浓度、背景电解质的浓度以及p h 值的影响等等，从而实现5 种苯氧羧酸类样 品的毛细管电泳手性分离。 1 3 实验创新点 本实验采取毛细管电泳对5 种苯氧羧酸类除草剂的对映体进行拆分，其中4 种基线分离，这对于准确评价苯氧羧酸类除草剂对映体在环境和农产品的残留有 着十分重要的意义。与已有的文献相比，本实验取得了多种优化的实验结果，拓 宽了毛细管电泳在手性农药中的应用范围。并对分离机理进行了初步的探讨，丰 富了手性毛细管电泳的理论知识。 4 2 1 引言 第二章手性毛细管电泳的研究进展 手性是自然界的本质属性之一。“手性”( c h i r a 】i t y ) 一词源自希腊语“c h e i r ”， 意思即为“手”。1 8 4 8 年，法国科学家路易斯巴斯德( p a s t e u r , l o u i s ) 从外消旋 混合物中分离了( + ) 、( ) 酒石酸钠铵盐得晶体【3 们，指出“分子不对称是旋光 的本质”，首次提出分子手性的概念。1 9 0 4 年，k e l v i n 首次对手性进行了定义。 在立体化学中镜像对称但不能完全重合的分子定义为手性分子( c h i r a lm o l e c u l e ) ， 如图2 1 ，我们称这一对化合物为对映异构体( e n a n t i o m e r ) ，它们在组成和分子 式上完全相同，仅在空间结构上存在差异性，互为镜像。除了对偏振光表现出不 同的性质之外，对映异构体在物理化学性质方面完全相同，这样一来，给我们的 分离分析研究造成了困扰。 图2 - 1 手性分子 f i g 2 - 1c h i r a lm o l e c u l e 含有手性中心的农药物是为手性农药，它的一对对映体在生物活性方面一般 都存在着差异。往往存在这样的情况，一种立体异构体具有生物活性，而与它互 为镜像的分子的生物活性却很小，也可能完全没有。就我们此次实验的样品苯氧 羧酸类除草剂而言，其r ( ) 异构体能有效地抑制靶酶活性阻断杂草体内生长 素和赤霉素的形成，表现出很高的除草活性，而s ( + ) 异构体则基本无效，两者 除草活性相差8 1 2 倍。欧美一些发达国家已经立法，限制外消旋农药的使用， 对于具有手性的农药一定要使用其具有生物活性的单一异构体，以此达到保护环 境的目的阱】。比如，荷兰与瑞士的行政管理当局不允许手性苯氧羧酸类除草剂 外消旋混合物注册，只认可单一光活性异构体注册3 2 1 。单一高活性手性体以较 低的剂量达到高效的药效，在避免环境受药害的同时节约了原料，满足社会可持 续发展的要求。目前使用的农药中2 5 是手性农药，在我国其中绝大部分手性农 药以外消旋体形式作用使用，所以国内的发展趋势是生产和使用光学纯农药物。 毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 作为一种经典电泳技术与现代微 柱分离有机结合的新兴分离技术，兴起于上个世纪8 0 年代，在9 0 年代得到蓬勃发 展。毛细管电泳是一种高效的手性分离分析新方法，与液相色谱( 皿) l c ) 和气 相色谱( g c ) 这些传统分离手性分离技术相比，毛细管电泳具有分析效率高，样品 进样体积小、试剂消耗量小，手性选择剂的可选择余地多等优势。最近几年，手 性芯片电泳和手性毛细管电色谱也越来越广泛的得到应用。手性芯片电泳在快速 ( 毫秒级) 手性分离中显示出了巨大优势。毛细管电色谱结合了毛细管区带电泳 ( c z e ) 和高效液相色谱( 卸? l c ) 的特征，为改善手性分离提供了强有力的工 具。 2 2 手性毛细管电泳的基本原理 在毛细管电泳中，对映体必须呈现不同的电泳淌度才能手性分离。有两种基 本策略可以实现手性分离，一是构建手性分离环境，二是手性消除。 手性消除一般采用的方式是柱前反应方法，让对映体与一种手性试剂进行化 学反应，可以使之转变成非对映异构体，若其淌度存在差异性就可能实现c e 分 6 离。1 9 8 9 年，l e o p o l d 等利用m a r f e y 氏试剂与氨基酸对映体反应【3 引，然后在 o 2 m o l ls d s 的硼酸盐( p h 8 5 ) 缓冲体系中进行毛细管电泳，成功的将样品实 现了基线分离。该方法的优势在于可直接采用非手性背景进行分离，而且能与检 测衍生反应合并考虑。但是此类衍生试剂很难搜寻到，同时还应该注意，体积过 大的衍生试剂会减弱样品组分之间的差异，这样就给分离造成了困难。另外，消 除反应并不适合所有样品，许多样品尚未能承受得了所需的反应条件。理论上， 消除样品的手性还能利用氧化还原或者其他破坏性化学反应，但是从目前来看， 尚未有相关报道。 构建手性分离环境可以通过三种方法来构建：运用手性添加剂；运用手 性涂层毛细管；运用手性填充毛细管。其中手性填充和手性涂层毛细管这两种 方法都需要特别的制作技术，并没有大力推广。添加法因为简单实用，而被广泛 运用，其只需在背景电解质中添加手性选择剂，经过优化一定的分离条件就能实 现手性分离。它的原理是对映体与手性选择剂的结合常数不同，从而导致对映体 的表观淌度的不同，这样就可以进行c e 分离。在淌度差异可以忽略不计的前提 下，倘若选择剂和对映体形成结合物，那么对映体的有效淌度差舡可表示成如 下 3 4 1 4 l = c ( ： e ) ( k 2 - k g ( 1 + k jc ) ( 1 + k 2 c ) ( 2 1 、) 式中，肝为对映体游离时的淌度，u 。为对映体结合时的淌度，c 表示为手性 选择剂的浓度，局和局则表示为两对映异构体的包合平衡常数，从式( 2 1 ) 我们可以看出，必须满足这3 个条件，才能拆分对映体： 1 ) c o ，说明如果没有手性选择剂存在，对映体是无法分离的。 2 ) 萨化，要求对映体和结合物在淌度上必须有差别 3 ) 厨k 2 ，要求两个对映体与手性选择剂的结合常数必须有差别；但是例 外的情况也有过报道m 】3 5 。当结合常数相同时，两个结合物存在淌度差别也能 拆分对映体。 2 - 3 影响手性毛细管电泳分离的因素 分离条件选择通常情况下要考虑到分离选择性和分析速度这两个问题。在手 性分离中，我们着重考虑分离选择性。c e 手性分离应该关注的关键因素有：手 性选择剂种类的选择及其浓度的优化；样品的性质及特殊要求；缓冲试剂种类的 选择及其电解质浓度和p h 的优化；有机溶剂的选用与优化。一般使用的优化方 法是进行单变量搜寻或多变量搜寻。单变量搜寻只优化单一参数，实验虽然简单 化了但容易错过最优条件。我们通常同时对多个参数进行优化，即多变量搜寻， 这样既能考察参数之间的相互依赖关系同时减少了优化试验的次数。关于如何设 计多变量搜寻的实验参阅综述( 36 1 。 影响手性c e 分离效果决定性因素是手性选择剂，一般情况下，适用于c e 手 性分离的手性选择剂需要满足以下要求 3 7 - 3 8 】：1 ) 高效和可调的选择性识别对映 异构体；2 ) 被分离的化合物与手性选择剂发生作用前后应当具有不同的淌度；3 ) 有足够的基团、原子、凹槽或空腔能与被分析物形成包合物或发生作用：4 ) 紫 外光区吸收较弱；5 ) 能较好的溶于背景电解液中。在我们现有的理论知识基础 上，还不能直接判断一种手性选择剂是否适合对某一对映体，因为手性选择剂和 不同样品相互作用的机理还尚未研究清楚。换句话说，对某种手性样品而言，也 不能判断到底哪一种手性选择剂是最为合适的。一般情况下，我们选择手性选择 剂，先是参照文献，其次进行反复的试验，直到获得理想的试验结果。 如公式2 1 所示，手性选择剂的浓度很大程度上影响了分离效果，当其浓 度很高时有效淌度亦趋向于零，即存在最佳值( c 卿) 。由公式( 2 1 ) 推得p 9 】： c o p = 觚j 。廖( 2 2 ) 另外一个影响分离效果的重要的参数是缓冲溶液的p h 。p h 能够决定性影响 弱电解质的解离程度、表观淌度和中间结合物的稳定性等，从而影响了c e 的分 离效果。曲等人对这个问题做了系统深入的研究，推导出了手性分离度方程 4 0 4 2 ，其适合应用于多重酸碱平衡。除此之外，p h 也可能通过改变电渗流来影 响到分离的选择性。p h 还可能影响手性选择剂例如白蛋白的构象，从而影响分 r 离的选择性 4 3 - 4 4 1 。 温度对c e 分离效果造成一定的影响。在手性选择剂的浓度低于最佳值 ( 【c 】印，) 这种情况下，有可能通过降低温度提高其分离能力。 非手性添加剂比如表面活性剂、有机溶剂等对粘度、电渗流、溶解度一系列 因素产生影响等，从而改变中间结合物的淌度和稳定性等，因此也可能对手性分 离产生影响。 2 4 手性选择剂 理想的手性选择剂首先应对尽可能多的对映体具有高的分离选择性；其次， 无紫外线吸收，不干扰对映体的检测；最后，它应该是廉价并且对环境友善的。 实际上现有的手性选择剂并不能完全满足上述要求，但不少手性选择剂还是能符 合大部分的要求，在毛细管电泳中得到很好的应用，比如环糊精、大环抗生素、 线性多糖、手性冠醚、亲和手性选择剂、配体交换手性选择剂和手性表面活性剂 等。在手性c e 中，环糊精的应用最为广泛，所占比例逐年上升，已从1 9 9 7 年 的6 7 增加到2 0 0 9 年的8 0 4 5 1 。 2 4 1 环糊精 环糊精( c d ) 及其衍生物，最早应用于气相色谱，逐渐引入应用于高效 液相色谱，在上个世纪九十年代蓬勃发展，并迅速商品化，成为在c e 中应用最 广泛的手性选择剂 4 6 - 4 7 l 。常见的环糊精是由淀粉通过酶解而形成的，由六元环椅 式构象的d ( + ) 吡喃葡萄糖以1 ，4 糖苷键连结形成的环状葡聚糖聚合物，由于 每个葡萄糖基都无法绕糖苷键自由旋转，因此呈锥体圆桶形。以糖苷氧原子连接 的c h 组成的环形成了圆筒的内侧，呈疏水性，可以容纳不同类型的客体化合 物，特别是那些非极性基团。一级和二级羟基组成了环糊精空穴的外环，使其外 部呈现相对的亲水性，总体而言，整个分子内腔疏水而外沿亲水。环糊精的空腔 直径与种类有关，天然的的伍- c d 、1 3 - c d 和y - c d 中，1 3 - c d 是最为常用的手性选 9 择剂。虽然1 3 - c d 溶解度( 2 5 时可溶约1 6 m m o l l ) 比q c d 或丫c d 低，但它 却被广泛使用，主要原因其空腔与大部分对映体相匹配。 为了提高水溶性和对映体选择性，越来越多的环糊精衍生物被研究开发出。 不带电的环糊精衍生物包括甲基化、乙基化、乙酰基化、羟丙基化等环糊精。带 正电的环糊精衍生物包括各种胺修饰的环糊精，例如聚乙烯毗咯烷酮【和组胺引 入到1 3 - c d 后形成的环糊精衍生物。带负电的环糊精衍生物包括羧甲基化、磺酸 化、羧基化、磷酸化、烷基硫酸化环糊精。可离子化基团( 如羧基、磷酸根、硫 酸根、烷基硫酸盐、甲氨基等) 。 环糊精及其衍生物能与大量的对映体形成包合化合物，在p h 范围较广的情 况下依旧具有极好的稳定性，因此被广泛应用于手性毛细管电泳中。由于环糊精 衍生物大部分是有不同取代度的产物构成的混合物，导致不同批号的产品对拆分 效果的影响也不尽相同。v i g h 小组经过不懈努力开发研究，合成了一系列单一 异构体的磺酸化环糊精，改善了这种状况【4 8 。65 1 。在非水性毛细管电泳中，采用 磺酸化环糊精作为手性选择剂，能够拆分碱性手性化合物。七取代( 2 ，3 二甲基6 磺酸基1 1 3 - c d 作为手性选择剂时，成功分离了4 0 对碱性对映体5 2 1 。 2 4 2 大环抗生素 大环抗生素是一种药物，近些年来的研究比较热门。目前有四类抗生素已 经被引入到手性分离中，分别是：糖肽类( 万古霉素、替考拉丁、瑞斯西丁素、 阿福霉素) 、安莎霉素类( 利福霉素s v 、利福霉素b ) 、氨基甙类( 硫酸新霉素、 硫酸链霉素、硫酸卡那霉素) 和多肽。其中，万古霉素易得到纯的药品，价格公 道，因此它在手性c e 中有广泛的应用 6 6 - 6 9 】。正电荷的万古霉素容易在裸毛细管 内壁吸附，因此在实际运用时，为了抑制吸附提高效率，常需使用聚丙烯酰胺涂 层毛细管 6 6 , 6 9 。杜红英等以氨基糖苷类抗生素阿米卡星作为手性选择剂，在毛 细管电泳中成功将后马托品进行了手性拆分7 们。王柱命等以新霉素为手性选择 剂，分离了两种联苯双脂类酸性手性药物m 】。2 0 0 3 年，红霉素也被实验证明可 作为手性选择剂【7 2 l 。 1 0 2 4 3 手性冠醚 冠醚在结构上位王冠状的聚醚环，环的外沿是亲脂性的乙烷基，环的内沿 是富电子的氧原子。通过离子偶极、疏水、氢键等作用，手性冠醚可与碱金属 或碱土金属阳离子( 例如钠离子、铵离子) 以及质子化的烷基胺( 例如伯胺) 形 成稳定的主客体配位络合物 7 3 - 7 4 】。 1 9 6 7 年，p e d e r s e n 首次合成了冠醚7 5 1 。随后，越来越多的冠醚被研究开发， 现在冠醚类物质在很多化学领域都有广泛的运用。z h o u 等用( + ) ( 1 9 c r o v ，i q 6 ) 2 ，3 ，1 1 ，1 2 t e t r a c a r b o x y l i ca c i d 作为手性选择剂，成功分离了2 0 种常用手性药物， 并从理论上探索了分离机理【7 6 1 。2 0 0 4 年，i v a n y i 等人合成了不同取代的四嗯二 吖冠醚衍生物，并与不同的c d 组成二元手性剂体系用来分离氨基酸衍生物7 7 1 。 手性冠醚的缺点就是它对伯胺类药物起作用，能够分离的药物数量有限，因此并 没有能够得到广泛应用。 2 4 4 多糖类化合物 天然糖类( 如淀粉、纤维素等) 富含手性中心，几乎没有紫外吸收，是理 想的手性选择剂，此类物质在糖类单体的手性分离中占有优势。多糖类物质容易 与极性分子形成氢键作用，通过配体交换、分子间氢键以及空间配合等方式与手 性分子形成具有不同稳定性的中间结合物，由此影响样品的迁移速度从而实现手 性分离。它们与对映体的结合常数一般小于对映体与c d 之间的结合常数，天然 糖类虽然与对映体的结合常数不如对映体与c d 之间的大，但有价格低廉的优点。 中性和离子化两大类多糖在已经在c e 得到广泛应用。普遍使用的中性多糖有右 旋糖和苷糊精( 它水解后生成更短链的麦芽糖) 等。中性多糖糊精具螺旋结构邢】， 是应用比较广泛的一类手性选择剂，已经成功利用麦芽糖糊精分离了多种手性药 物p 9 8 0 1 。离子型多糖有硫酸右旋糖苷( d e x t r a ns u l f a t e ) 、硫酸软骨素( c h o n d r o i t i n s u l f a t e ) 矛n 肝素( h e p a r i n ) 等。早在1 9 9 4 年，s t a l c u p 等人就使用带负电荷的肝素手 性分离了7 对药物【8 1 】。 2 4 5 表面活性剂 表面活性剂自身是两亲性分子，同时具有一个极性的头部和一个疏水的尾 部，手性分离主要依靠分析物在两相中的分配系数的不同而实现的。手性表面活 性剂应用于c e 的可以分为天然和人工合成两类。天然的表面活性剂包括洋地黄 皂苷【8 2 1 、胆酸盐、和皂角苷8 3 1 等，最为常用的是胆酸盐。胆酸盐包括胆酸钠( s c ) 、 脱氧牛磺胆酸钠( s t d c ) 、脱氧胆酸钠( s d c ) 、牛磺胆酸钠( s t c ) 和脱氧胆酸钠 ( s d c ) 等。早在1 9 8 9 年，t e r a b e 等人首次使用胆酸盐为手性选择剂，分离了丹酰 化氨基酸8 4 1 。田衍等采用胆酸钠作为手性选择剂，成功地拆分了盐酸帕罗诺斯 琼。分离含多环结构的化合物，一般采用脱氧牛磺胆酸钠【8 5 堪6 1 。 人工合成的手性表面活性剂包括糖类的衍生物 8 7 - 8 9 1 、酒石酸的衍生物凹】， 聚二肽表面活性剂9 1 1 、氨基酸的烷酰基衍生物1 9 2 - 9 5 1 等。对于某些氨基酸来说， 它的一对对映体的烷酰基衍生物均可制得9 6 1 。1 9 9 4 年，w a n g 使用聚l 缬氨酸n - 十一烯酯钠( p o l y ( s o d i u mn - u n d e c y l e n y l l v a l i n a t e ) ) 作为手性选择剂，成功分离 了萘酚和劳丹素9 7 1 。手性拆分能力与表面活性剂结构的关系也有深入广泛的研 究1 1 8 】9 8 。 2 4 6 配体交换手性选择剂 配体交换( l i g a n d - - e x c h a n g e ，l e ) 的分离机理是基于手性配体选择剂与被分 析物以及金属络合物三者之间形成三元混合的非对映异构体，从而实现手性拆分， 手性分离的决定性因素是分析物的两个单体与配体形成的络合物的稳定性存在 差异。 配体交换的原理来自于高效液相色谱，z a r e 研究小组首次将这一概念移植 到毛细管电泳中【9 9 1 。配体交换手性选择剂一般由过渡金属阳离子( - - 价的铜、 锌、镍和钴等) 和一个手性化合物组成。1 9 8 5 年，g a s s m a n 等人用铜一l 组氨 酸络合物拆分了丹酰化氨基酸1 0 0 1 。1 9 9 6 年，s c h m i d 首次使用这类选择剂拆分 了未衍生的氨基酸【10 1 1 。k o i d l 利用铜与l 羟( 基) 脯氨酸( 或组氨酸) 的络合物拆 分了卤化的氨基酸1 02 1 。一些氮一烷基化的氨基酸也可用做配体，其效果有时比天 然氨基酸还好1 0 3 1 。配体交换手性选择剂拆分的化合物主要是氨基酸、氨基醇、 1 ， 羟基酸等。 2 4 7 二元手性选择剂体系 毛细管电泳由于其高效、快速、灵敏度高等特点，已经成为手性药物分离检 测中破具吸引力的分析方法。但是仍然存在不少问题，有些手性物质使用单一手 性选择剂根本达不到理想的分离效果。在此基础上，我们构建二元手性添加剂体 系，有效弥补了单一选择剂的缺陷。 目前，应用最为广泛的二元选择剂体系是环糊精之间的两两组合【1 0 4 d 0 7 1 。l 抽 研究小组使用p c d 和磺化环糊精为二元手性选择剂，负高压体系下基线分离了 黄酮类药物2 ，3 和4 羟基黄烷酮1 0 8 1 。 环糊精和其它类型的手性选择剂的组合也逐渐引入研究开发中，也取得了 较为理想的效果，例如，v a l l e 等人用中性c d 和聚表面活性剂混合物为二元手 性选择剂，拆分了联萘衍生物1 0 9 1 。研究组用s t c 和 3 - c d 为二元手性选择剂， 成功拆分了常见的异硫氰酸酯荧光素( f i t c ) 衍生氨基酸1 1 0 1 。 2 5 手性毛细管电泳的发展 2 5 1 毛细管电色谱 毛细管电色谱( c a p i l l a r ye l e c t r o c h r o m a t o g r a p h y ，c e c ) 在手性分离中有着 广泛的应用卜1 12 1 。c e c 是利用电渗流或电渗流结合压力从而推动相运行的一种 液相色谱分离法，它除了具备色谱的高选择性外，还有其它优势：克服了毛细管 电泳中电中性物质难分离的缺点；高效液相色谱