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糖厂污泥中产氢细菌的筛选及其特性研究 摘要 随着石化能源日趋枯竭及其燃烧对环境的破坏，氢能被认为是最具战 略意义的可替代能源。在众多制氢方法中，生物制氢技术作为一种绿色能 源生产技术，备受关注。发酵微生物制氢技术因产氢效率高，对环境适应 性强等优点越来越受到科学家的青睐。然而，发酵微生物制氢的关键性问 题是高效产氢微生物的获得。 本研究以广西扶南糖厂生化池污泥为研究对象，在厌氧条件下，对生 化池污泥的发酵微生物菌群进行产氢富集。采用三层平板法( 培养基一培养 基一石蜡) 分离纯化出7 0 株微生物，对其中4 株筛选出来的产氢微生物运用 常规形态学观察和分子生物学等方法对菌株进行鉴定。1 6 sr d n a 基因序列 测定表明，5 a 1 、6 a 5 、8 d 7 和6 0 e 均属于梭菌属。运用气相色谱分析方 法对菌株的产氢能力进行分析，并分别对菌株的产氢条件进行优化，同时 将其与废水处理相结合。 c l o s t r i d i u ms p 5 a 1 是一株中高温产氢细菌。在温度4 3 。c ，起始p h 值 7 5 ，起始葡萄糖浓度1 0g l 的条件下，产氢能力最高为18 4 7 m l ( h 2 ) l ( m e d i u m ) 。c l o s t r i d i u ms p 6 a 5 在温度4 3 。c ，起始p h 值8 ，起始 葡萄糖浓度1 6g l 的条件下，产氢能力最高为2 7 2 6m l ( i - 1 2 ) l ( m e d i u m ) 。 c l o s t r i d i u ms p 8 d 一7 是一株中温产氢菌，在温度3 4 。c ，起始p h 值7 ，起始 蔗糖浓度1 0g l 的条件下，产氢能力最高为3 4 6 7m l ( h 2 ) l ( m e d i u m ) ，接种 废水实验时能较好的去除废水中的c o d 。c l o s t r i d i u ms p 6 0 e 是一株耐酸性 中温产氢菌，在温度3 5 。c ，起始p h 值5 的条件下，产氢能力最高为2 0 8 0 m l ( h 2 ) l ( m e d i u m ) 。在与废水有机结合的试验中，6 0 e 能较好的利用糖蜜酒 精废水制氢。 关键词：产氢微生物糖厂污泥梭菌最佳条件有机废液 i s o l a t i o na n ds t u d yo n c h ar a c t e i u s t i c so f b i o h y d r o g e n p r o d u c v gb a c t e r i u mf r o ms u g a r p l a n ts l u d g e a bs t r a c t w i t ht h ei n c r e a s i n ge x h a u s t i o no ff o s s i le n e r g ya n dt h eb u r n i n gd a m a g et o e n v i r o n m e n t ，h y d r o g e ni sc o n s i d e r e dt ob ea na l t e r n a t i v ee n e r g yt h a ti so ft h e g r e a t e s ts t r a t e g i cs i g n i f i c a n c e a sag r e e ne n e r g yp r o d u c t i o n t e c h n o l o g y ， b i o l o g i c a lh y d r o g e ni sb e c o m i n gaf o c o u so fs o c i e t y b e c a u s eo fh i g he f f i c i e n c y p r o d u c t i o no fh y d r o g e na n ds t r o n ga d a p t a b i l i t yt oe n v i r o n m e n t ，f e r m e n t a t i v e h y d r o g e np r o d u c t i o nt e c h n o l o g yh a sg o tt h ef a v o u ro fs c i e n t i s t s h o w e v e r ，t h e k e 、i s s u ei nt h i sm e t h o di st h eo b t a i n i n go fh i g he f f i c i e n c yh y d r o g e np r o d u c t i o n m l c r o o r g a n l s m s i nt h i ss t u d y ，t h es u g a rp l a n ts l u d g ew a sc o n s i d e r e da sas a m p l ef o rt h e i s o l a t i o no fh y d r o g e n p r o d u c i n gb a c t e r i u m t h eb a c t e r i a l g r o u po fm u d d y s u b s t r a t e sw a se n r i c h e du n d e rt h ea n a e r o b i cc o n d i t i o n so f h y d r o g e np r o d u c t i o n s e v e n t yf a c u l t a t i v es t r a i n sw i t hh y d r o g e n - p r o d u c i n ga b i l i t yw e r ei s o l a t e db yt h e a n a e r o b i cp l a t e m e t h o d ( m e d i u m m e d i u m p a r a f f i n ) i na d d i t i o n ，f o u rs t r a i n s w e r ei d e n t i f i e da sc l o s t r i d i u ms p u s i n gb i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c st e s ta n d16 s r d n ag e n e s e q u e n c ea n a l y s i s s u b s e q u e n t l y , t h eh y d r o g e np r o d u c t i v i t yo f s t r a i n sw a sd e t e c t e d b yg a sc h r o m a t o g r a p h y f i n a l l y , t h ec o n d i t i o n so n h y d r o g e np r o d u c t i o nw e r eo p t i m i z e df o rf u r t h e rs t u d y t h i sw o r kp r o v i d e st h e 1 1 1 f u n d a m e n t a ld a t at os u p p o r tt h ea p p l i c a t i o no fm o l a s s e sw a s t e w a t e rt r e a t m e n t a c c o r d i n gt ot h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t s ，w ec o n c l u d ea st h ef o l l o w i n g s f i r s t ， c l o s t r i d i u m s p 5 a - 1 i ss u i t a b l ef o r l i v i n g i n m i d - t e m p e r a t u r e o r h i g h - t e m p e r a t u r ec o n d i t i o n s u n d e rb a t c hc o n d i t i o n so ft e m p e r a t u r e4 3 ， i n i t i a lp h 7 5 ，g l u c o s ec o n c e n 仃a t i o n 10g l ，t h eh i g h e rh y d r o g e ne v o l u t i o no f c l o s t r i d i u ms p 5 a - 1w a s18 4 7m l ( h 2 ) l ( m e d i u m ) s e c o n d ，u n d e rc o n d i t i o n s o ft e m p e r a t u r e4 3 ，i n i t i a lp h8 ，g l u c o s ec o n c e n t r a t i o n16g l ，t h eh i g h e r h y d r o g e ne v o l u t i o no fc l o s t r i d i u ms p 6 a 一5 - w a s2 7 2 6m l ( h 2 ) l ( m e d i u m ) t h i r d ，c l o s t r i d i u ms p 8 d 一7w a sam e s o p h i l i cb a c t e r i a ，v a c c i n a t i o nw a s t e w a t e r e x p e r i m e n tc a nb e r e rr e m o v et h e c o di nw a s t ew a t e r a n du n d e rb a t c h c o n d i t i o n so ft e m p e r a t u r e3 4 ，i n i t i a lp h7 ，g l u c o s ec o n c e n t r a t i o n10g l ，t h e h i g h e rh y d r o g e n e v o l u t i o no f c l o s t r i d i z f 聊s p 8 d 7 w a s3 嚣7 m l ( h 2 ) l ( m e d i u m ) f o u r t h ，c l o s t r i d i u ms p 6 0 ew a sam e s o p h i l i cb a c t e r i aa n d h a sb e a e rc a p a b i l i t yo fa c i dr e s i s t a n c e u n d e r35 t e m p e r a t u r e ，i n i t i a lp h5 ， h y d r o g e np r o d u c t i o nc a p a c i t yr e a c h e d2 0 8 0m l ( h 2 ) l ( m e d i u m ) i nw a s t ew a t e r a n do r g a n i cc o m b i n a t i o no ft h et r i a l ，6 0 ec a nh a v eag o o de f f e c to nh y d r o g e n p r o d u c t i o nb yu s i n gm o l a s s e sa l c o h o lw a s t e w a t e r k e yw o r d s ：h y d r o g e np r o d u c t i o nm i c r o o r g a n i s m s ；s u g a rp l a n ts l u d g e ； c l o s t r i d i u ms p ；o p t i m a lc o n d i t i o n s ；o r g a n i cw a s t e w a t e r i v 广西大掌硕士掌位论文糖厂污泥中产氢细l h - 的筛选及其特性研究 1 1 氢能 第一章绪论 工业革命以来，传统的化石能源体系正面临两大问题：第一，人类消耗日益增多， 能源储量日益减少，主要能源日益枯竭；第二，化石能源燃烧所引起的一系列环境问题， 如温室效应、土壤酸化、植被破坏、粉尘污染等日益严峻。要解决以上问题并实现可持 续发展目标，寻找可替代的新型能源尤为重要。 许多可再生清洁能源中，生物柴油、乙醇、甲醇、甲烷、氢气等【l 】都可以从自然界 广泛存在的生物质中获取。而氢能源是公认的最清洁的、最具潜力的未来替代能源之一。 1 1 1 氢能特点 作为能源，氢能主要有以下特点：第一，资源丰富。氢是宇宙中最丰富的元素也是 最轻的元素，一升约重0 0 9 9 ，地球上大量的储存水中含氢1 1 ，共计约1 0 2 3 吨。第二， 放热效率高。与同重量物质相比，燃烧1 9 氢可以放出1 4 1 0 4j 的热量，是汽油的2 6 8 倍，煤的3 5 4 倍。第三，转化效率高。与化石能源相比，将其转化为动力，转化效率要 高出3 0 - - - 6 0 。第四，无污染。氢气燃烧时最终产物只有水，因此又被称为“清洁燃料”。 第五，能储藏。与难储存的电相比，具有明显的优越性。第六，用途广。氢既能燃烧生 热，也可以产生化学能，也可作为吸热的介质等。 氢能的研究不仅是科学研究，它还涉及了经济、环境、政治、动植物等多个方面。 每个国家的政府部门作为推动氢能的主要经济力量都积极参与进来，例如美国、欧洲、 日本等为此构建了适合本国发展的的氢能源路线图( r o a d m a p ) ，我国的氢能燃料电池 电动汽车也已成功开发。 1 1 2 制氢方法 目前，工业制氢主要包括化石燃料制氢、电解水制氢、催化热分解碳氢化合物制氢、 生物制氢等。化石燃料制氢法是将天然气、煤、石油与水蒸气反应生成水煤气，再将水 蒸气和水煤气一同通过灼热的氧化铁( 作催化剂) 生成二氧化碳和氢气，最后经过气体分 广西大国昀页士掌位论文 糖厂污泥中产氢细菌的硼i 选及其特性研究 离即可得到h 2 。电解水制氢法是指用电能使水分解制得h 2 ，现多应用于工业生产过程 中要求纯度高、用量不多的企业。催化热分解碳氢化合物制氢，是指在高温条件下对甲 烷进行催化作用，将其分解为碳和氢的过程。在此过程中因为不产生c 0 2 气体，所以该 制氢方法被认为是连接可再生能源和化石燃料的过渡工艺。与其它方法相比，生物制氢 的优越性体现在：( 1 ) 原料易得。包括一切植物、工业有机物、水和微生物材料。( 2 ) 消 耗能量少。反应在生物酶的作用下，常温常压即可进行，且操作费用低廉。( 3 ) 利用大 量可再生能源。生物制氢主要是把太阳能或者生物质能等能量转化成氢能，这样就完全 摆脱了对于石化能源燃料的依赖。 1 2 生物制氢技术 生物制氢简言之就是利用微生物产生氢气。具体来讲是指一些微生物在生长代谢过 程中拥有产生氢气的能力，它们可以分解利用有机工业废水或者存在于自然界中的有机 化合物，同时产生人类需要的清洁能源氢气。 1 2 1 生物制氢技术的发展 s t e p h e n s o n 等【2 j 在1 9 3 1 年发现了细菌中的氢酶能催化氢气和氢离子的可逆反应。 g a f f r o n 和r u b i n 3 1 在1 9 4 2 年观察到海藻栅藻能通过光合作用放出氢气。g e s t 和k a m e n 4 1 在1 9 4 9 年研究证明了深红红螺藻在有机碳的存在下可以放出氢气。2 0 世纪7 0 年代，石 油危机使生物制氢第一次被认为具有实用性。8 0 年代石油价格回落，制氢技术的研究一 度减慢甚至消失。9 0 年代，世界环境与能源双重问题出现时，生物制氢技术再度兴起。 2 1 世纪，能源与环境问题日益严峻，生物制氢符合可持续发展战略的目标，又一次得到 了广泛重视。许多国家例如美、英、日、意、以等都将大量的资金和人力投入到了对生 物制氢的研究技术中。 1 2 2 我国生物制氢技术的研究 我国生物制氢的研究起始于2 0 世纪9 0 年代，但发展较快。任南琪等5 1 于19 9 4 年提出 了以有机废水为培养液，将厌氧污泥作为氢气释放体的发酵法生物制氢技术。这种技术 【6 1 打破了一定要采用纯菌株或者采用细胞固定化的方法制取氢气的局面，第一次试验成 功了连续流持续产氢的中试规模生产研究。樊耀亭等 刀以牲畜粪尿堆肥、秸秆堆肥和消 2 广西大学硕士掌位论文糖j - - 污泥中产氢细菌的筛选及其特性研究 化污泥作为天然混合产氢微生物来源，在批式培养实验中以不同有机废弃物为底物，通 过厌氧氢发酵制备生物氢气，取得了一定的成果，也拥有了很高的国际地位。目前，在 国际上已经有了一定的影响。 1 2 3 生物制氢技术的应用前景 虽然从发现微生物能产氢直到今天已经有5 0 多年了，但是将生物制氢运用到实践生 产中还存在很多难题，其中备受关注的问题是生物制氢技术的成本。从经济研究的严格 层面上来讲，在近期内，采用微生物制取氢气的技术和传统的采用化学方法生产氢气的 技术是不能相提并论的。然而从废物资源化的环保层面来讲，生物制氢使有机废弃物得 到了处置，其发展及应用的潜力是不可估量的。 目前，不管是厌氧发酵制氢体系，还是光解制氢体系，在提高氢气总产量与氢气产 生速率等方面都还留有很多科研任务。从自然环境中筛选野生高效产氢细菌可以使蓝细 菌间接光解制氢系统的产氢速率进一步提高【8 j 。优化不同的影响因素，例如温度、p h 值、 营养物浓度、光照强度等培养条件，使二氧化碳和氢气的分压保持在较低状态下，也可 以将细菌的产氢量提高。采用基因改造的方法也可以使细菌的产氢能力极大提高，主要 依靠吸氢酶的去除、氢化酶活性的提高来进行。同样存在着许多限制条件的还有光发酵 制氢体系，与e l 标菌种存在竞争关系的细菌就会影响氢气产生量的提高，b a g a i 等【9 1 车t x - 寸 每种异养菌对光谱的不同吸收这一特点共同培养细菌，k a t a o k a 等【lo j 采用光发酵厌氧发 酵结合的两相系统，以相应的废水为培养液同时优化反应器的设计。 与其他发酵制氢系统相比，厌氧发酵作为最有潜力成为可供实际应用的制氢系统倍 受科学家的青睐。对反应器的设计进行优化、应用基因工程技术或者从氢气分压下降等 方面着手，都可以使系统氢气产量大幅度提高。抽空顶空为真空、氩气或氮气的喷射， 都可以加快分离和排出气体的速率，使氢气分压降低。但是与此同时，过度喷射会稀释 氢气，这对分离与纯化氢气带来阻碍。已经证明解决此问题的有效方法之一便是膜技术。 l i a n g 等t 1 1 】研究发现中空纤维硅橡胶膜能够降低氢气分压，提高氢气总产量1 5 ，提高 氢气产率1 0 。t e p l y a k o v - 等t 1 2 】研究发现聚乙烯三甲基硅烷膜( p v t m s ) 无论是在厌氧 还是好氧系统中，都能够生产高纯度氢气，且效果良好。采用细胞固定化技术和膜过滤 技术都可以把氢分压维持在较低状态，使产氢量得到提高，从而使反应器进一步被优化。 广西大掌硕士掌位论文 糖厂污泥中产氢细菌的筛选及其特性研究 1 3 厌氧发酵制氢 厌氧发酵制氢简言之就是把小分子有机物转换成氢气。该过程起主要作用的是厌氧 微生物，主要基质原料是农业、工业废弃物。发酵制引1 3 】又分为光发酵制氢和暗发酵制 氢：光发酵制氢是通过光发酵把有机物转换成氢气，光合细菌起主要作用；暗发酵制氢 是通过暗发酵把碳水化合物转换成氢气，异养厌氧菌其主要作用。厌氧发酵产氢细菌分 为梭菌属( c l o s t r i d i u m ) 、肠杆菌属( e n t e r o b a c t e r ) 、埃希氏肠杆菌属( e s c h e r i c h i a ) 和杆菌属( b a c i l l u s ) 四种类型。厌氧发酵产氢细菌中，梭菌属和肠杆菌属研究得最多。 目前，获得产氢菌株的方法主要包括从自然环境特别是淡水中直接筛选菌株和通过 基因工程等技术手段改良目标菌株【6 4 1 。后者操作复杂、设备昂贵、成功率低；相比而言， 直接从自然界广泛筛选高效产氢菌株是一种更具可行性、更有效的筛选方法。目前国内 外在生物制氢方面研究的难点和重点就是广泛筛选既能适应特殊生活条件同时氢气产 量又高的细菌。不同菌株对环境的要求各不相同，而不同行业产生的废水性质差异大， 因此直接从特定废水中筛选菌株是一种有效的方法，由此筛选出来的菌株对于废水环境 的适应性更强，代谢活动更稳定。 1 3 1 厌氧发酵制氢的发展 1 9 4 9 年，g e s t 和k 锄e i l 【4 】首先发现了深红红螺菌的光合产氢现象。1 9 6 6 年，h u n g a t e 1 4 1 研究发现纯培养瘤胃细菌有产生氢气的现象，在其内混合发酵过程中氢气产生，不过氢 气纯度比较低。到了1 9 6 7 年，b 巧a i l t 等【”】研究分离出菌株m e t h a n o b a c t e r i u mo m e l i a n s k i i o ， 得到产甲烷杆菌m o h 以及“s ”有机体，这是通过改良的h u n g a t e 厌氧技术得到的，同时通 过菌株对乙醇的代谢实验证实这两种菌之间有良好的互营联合作用。1 9 7 9 年，产甲烷杆 菌m o h 被b a l c h 等【1 6 】定名为布氏甲烷杆菌( m e t h a n o b a t e r i u mb r y a n t i i ) 。19 7 9 年，刘克鑫、 徐洁泉等【1 7 】将薯芋粉加在沼气发酵的污泥富集液中，发现产甲烷现象完全被抑制，同时 全部转为产氢气，他们将2 4 株产氢菌从中分离。1 9 8 7 年，k i s a a l i t a 掣1 8 】研究发现以乳糖 为碳源厌氧发酵产酸时，随着起始p h 值的改变发酵产物随之改变，其中p h 为4 5 是个分 界线。低于这个值，乙酸盐、丁酸盐及乙醇大量出现；高于这个值气体产生现象消失。 在1 9 9 3 年和1 9 9 4 年这两年间，王宝贞和任南琪等【5 】，发表了新的理论乙醇型发酵产 氢。他们研究用废糖蜜为基质制取氢气的现象，主要采用自制的发酵反应器( c s t r ) ，最 4 广西大学硕士掌位论文糖厂污泥中产氢细菌的鲥i 选及其特性研究 后使反应器中丁酸和丙酸的部分累积得到了消除，氢气产生速率达到1 0 4m 3 ( h 2 ) m 3 d ， 2 0 0 1 年的中试研究中，实验获得t 3 0m o l k g v s s d 的持续产生氢气能力。2 0 0 0 年，日本 的m i z u n o 等1 9 1 以豆腐厂废水为基质，以豆腐窑富集的产氢细菌为接种物，进行产生氢气 实验，用氮气吹脱，在温度为3 5 ，p h = 5 0 的条件下，产氢持续1 2h ，产氢速率达最高 时碳水化合物浓度是3 7 2 0m g l ，氢气产量达到2 5 4m o l ( h 2 ) m o l ( 己糖) ，氢含量为6 3 。 1 3 2 厌氧发酵产氢途径 发酵产氢的机理一般认为有四种可能的途径即：辅酶i 的氧化与还原平衡条件产 氢、硫氢化酶催化产氢、产氢产乙酸菌的产氢和丙酮酸脱羧产氢2 0 1 。在厌氧发酵产氢 过程中，由于最终发酵产物组成的不同，发酵类型可以被分为四种，分别是：混合酸发 酵、丁酸型发酵、丙酸型发酵和乙醇型发酵。前面三种发酵类型与生物化学中经典的丙 酸发酵、丁酸发酵、混合酸发酵比较相似，但是并不是完全相同的，主要原因是其生长 环境和生物种群是不同的。另外，乙醇型发酵与经典的乙醇型发酵不同，其是哈尔滨工 业大学任南琪教授课题组发现的新型发酵类型，该发酵类型的主要末端发酵产物是乙醇 和乙酸。 ( 1 ) 乙醇型发酵 经典的乙醇型发酵是产成丙酮酸和乙醇的过程，其主要是酵母菌属细菌经过e d 途 径或者糖酵解e m p 途径。在整个过程中，末端无氢气产生，只有二氧化碳和乙醇。李建 政等2 1 1 以碳水化合物为供氢体，提出了一种新的乙醇型发酵，主要末端产物为乙醇、乙 酸、c 0 2 、h 2 、少量丁酸和丙酸。发酵气体中含h 2 ( 4 0 - 4 9 ) 和c 0 2 ( 5 1 6 0 ) 。 其发酵途径如图1 1 所示，典型微生物有梭菌属( c l o s t r i d i u m ) 和瘤胃球菌属 ( r u r n i n o c o e c u s ) 。 ( 2 ) 丙酸型发酵 丙酸型发酵主要发生在纤维素等不容易降解的碳水化合物的厌氧发酵过程中，以及 牛肉膏、明胶、酵母膏等有机含氮化合物的酸性发酵过程中。丙酸型发酵的末端发酵产 物主要包括乙酸和丙酸，在发酵过程中气体的产量很少，甚至都没有气体产生，这也是 该发酵类型的特点之一。发酵途径如图1 2 所示，典型微生物有丙酸杆菌属 ( p r o p i o n i b a c t e r i u m ) 。 糖厂污泥中产氢细菌的筛选及其特性研究 甲酸 ( i - i ) 萆醢乙敞虹琥建酸 图1 - 1 乙醇型发酵途径 f i g 1 1f e r m e n t a t i v eh y d r o g e nm e t a b o l i t e so f e t h a n o lt y p e ( 3 ) 丁酸型发酵 丁酸型发酵主要是指淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖等可溶性碳水化合物的发酵过程。 该发酵类型的末端产物主要有乙酸、丁酸及少量的丙酸，发酵气体中含有c 0 2 和h 2 。发 酵途径如图1 3 所示。 ( 4 ) 混合型发酵 乙醇、乙酸、乳酸、甲酸、氢气和二氧化碳等都是混合型发酵的主要末端产物。发 酵途径如图1 4 所示，典型微生物有埃希氏杆菌属( e s c h e r i c h i a ) 、变形杆菌属( p r o t e u s ) 、 沙门氏菌属( s a l m o n e l l a ) 等。 6 披且秘爿嘏 一 一 广西大掌硕士掌位论文 糖j - 污泥中产氢细菌的筛选及其特性国f 究 n a d h + l - i n a d 产 图i - 2 丙酸型发酵途径 f i g 1 - 2f e r m e n t a t i v eh y d r o g e nm e t a b o l i t e so f p r o p i o n i ca c i dt y p e 丁跤 5 图卜3 丁酸型发酵途径 f i g 1 3f e r m e n t a t i v eh y d r o g e nm e t a b o l i t e so f b u t y r i ca c i dt y p e 7 广西大学硕士掌位论文 糖厂污泥中产氢细菌的筛选及其特性研究 复合碳水化合物争c 。h ，：o 。 葡萄糖 圆t 上 2 c h ，c h ：o h i a 9 2 c 0 2 c a h , z m + 。 、2 n a d h + h 2 n a d h2 n a d + 艺i i ”。一 ，、二。， + h + 、矗 2 c h ，c o o h i 乙酸i 、 厂、厂、黼i 2 c h 3 c h o h c o o h 乳酸 谚、 2 a t p2 a d p 2 f d h ， 尸 4 n a d h + h + k 2 n a d h + h + ，a d p 2 a d p ，4 n a d 2 n a d p 一譬_ 作 2 町p c h 3 c h 2 c h 2 c o o h圆2 c h ，c h 2 c o o h 丁酸 丙酸 图1 - 4 混合酸性发酵途径 f i g 1 - 4f e r m e n t a t i v eh y d r o g e n m e t a b o l i t e so f m i x e da c i dt y p e 从上述四种发酵类型可以看出，乙醇型发酵、丁酸型发酵和混合酸型发酵这三种代 谢途径均产生氢气，而丙酸型发酵不产生氢气。所以，从产氢菌种的筛选方面而言，应 着重研究乙醇型代谢、丁酸型代谢和混合酸型代谢。 1 3 3 影响产氢菌产氢的因素 厌氧产氢的影响因素较多，常见的如温度、p h 、底物。 ( 1 ) 温度 温度影响微生物的生长和繁殖，影响微生物的代谢物分泌和营养吸收。对于不同的 菌种，发酵反应可操作的温度不同。例如，低温厌氧微生物生长的温度范围为1 0 3 0 ， 最佳温度范围为1 0 2 0 ；中温厌氧微生物生长的温度范围为3 0 4 0 ，最佳温度范围为 3 5 3 8 ；高温厌氧微生物生长的温度范围为5 0 6 0 ，最佳温度范围为5 1 5 3 。由于 3 7 符合大多数产氢菌的生长特性，所以一般将3 7 视为大多数产氢发酵的控制温度。 有研究者对2 0 、3 0 、3 5 、5 5 不同温度下的细菌产氢量进行比较，结果发现： 随着温度的升高，产氢量越来越大【2 2 1 。一些学者发现，在1 5 3 4 范围内，平均产氢量 为1 1 5m o l ( h ：) m o l ( g l u e o s e ) ，而在较高温度3 7 条件下，产氢量为1 4 2 9m o l ( h 2 ) m o l ( g l u c o s e ) 【2 3 1 。当用食物废物作底物时，5 5o c 的产氢量较之3 5 时高出9 倍2 4 1 。表1 1 糖r - 污泥中产氢细菌的筛选及其特憎，开究 为不同菌株的最适温度。 表1 - 1 温度对产氢菌产氢的影响 t a b l e1 - 1t h ee f f e c to f t e m p e r a t u r eo nf e r m e n t a t i v eh y d r o g e np r o d u c t i o n ( 2 ) p h p h 能够影响微生物的产氢代谢活性和发酵产物的分布和组成。另外，p h 也影响着 细胞质膜结构的稳定性、细胞质膜的渗透性和营养物质的电离性或溶解性。发酵培养过 程中，p h 值的变化会产生一系列的连锁反应，比如合适的p h 值会使微生物顺利生长和 产氢，但是有机酸的累积会导致介质缓冲能力的大大降低，从而导致最终p h 值降低【2 9 】， 脱氢酶的离子活性又受到p h 值的影响，p h 值降低影响脱氢酶活性进而限制了氢气的生 产【3 0 1 。所以想要获得菌株的最大产氢量，研究产氢茵的最适p h i , 不可少。表1 2 为不同 菌株的最适p h 。 ( 3 ) 底物 不同微生物对底物的利用具有选择性。通常用于厌氧发酵产氢的底物为碳水化合 物，主要包括：葡萄糖、蔗糖、纤维二糖、半乳糖、乳糖、果糖、阿拉伯糖和糖蜜等， 也包括生产淀粉或蔗糖的有机废水或固体有机废弃物。一般情况下，分子量大的、比较 复杂的化合物不能直接被微生物利用，他们先被分解为小分子才能被利用产氢；而小分 子化合物如结构简单、分子量又小的直接能被利用产氢。大部分研究都以纯净底物为主， 葡萄糖和蔗糖是最常用的纯化学材料，这些底物因为结构简单适合基础实验研究。表1 3 为不同菌株所用的底物。 9 糖厂污泥中产氢细菌的翻选及其特性研究 表1 - 2p h 对产氢茵产氢的影响 t a b l e1 - 2t h ee f f e c to f p ho i lf e r m e n h a f i v eh y d r o g e np r o d u c t i o n 现今，生物发酵制氢所利用的碳源种类繁多，大致包括三类：第一类是各种糖类，常 见的有蔗糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、乳糖以及麦芽糖等；第二类是有机固体废弃物， 例如豆腐厂残渣、城市固体废弃物、活性污泥等；第三类是有机废液，例如淀粉废水、 甘蔗糖厂生产废水、酿酒废液、糖蜜酒精废液等。 糖厂污泥中产氢细菌的筛选及其特性浔f 究 表1 - 3 厌氧发酵产氢菌 t a b l e1 - 3t h eb a c t e r i a lc u l t u r e sf o rf e m e n t a t i v eh y d r o g e np r o d u c t i o n 1 4 糖蜜酒精废液 甘蔗制糖是广西的支柱性传统行业。广西现在有糖厂约一百多家，产糖量约达7 0 8 6 万吨( 2 0 0 6 0 7 榨季) ，产糖量占全国的5 8 以上。是全国生产规模最大的食糖主产区， 产量超过了世界产糖国古巴、澳大利亚的总产糖量。糖业在广西国民经济中有着举足轻 重的作用。但在生产过程中所产生的高浓度有机废水同时也使得甘蔗制糖业成为我区的 糖r - 污泥中产氯细菌的剜i 选及其特性研究 重污染行业。一般来说，生产1 吨酒精就能够产生7 1 5 吨酒精废液。在通常情况下，将 甘蔗糖蜜发酵，产生醪液后蒸馏，蒸馏时就会有酒精产生，而同时从塔底排出的废液就 是糖蜜酒精废液。糖蜜酒精废液具有p h 值低( 4 0 左右) 、温度高( 9 5 9 8 ) 、c o d 浓度 高( 达1 0 万m g l ) 、色度高等特点。以目前的生产能力，我区每年制糖产生的酒精废液约 为7 0 8 万吨以上，糖蜜酒精废液若得不到妥善处理，将对环境造成较大的污染。 1 4 1 糖蜜酒精废液的特点 糖蜜酒精废液主要包括以下特点：第一，污染物浓度高。第二，日排放量大。第三， 废液一般呈酸性，p h 值在3 5 至1 j 4 5 之间，废液对碳钢等设备具有严重腐蚀性，原因是液 体中有有机酸、氮根、硫酸根等物质。第四，废液中的固状物( 即除水后的干物质) 7 0 为含有维生素、氨基酸、蛋白质、糖类等的有机物质。另外的3 0 是含有镁、钙、钾、 磷、氮等无机盐的灰分，其中钾的含量有0 5 1 1 3 1 5m g l 2 高 5 7 - 6 0 】。以上物质属于可利 用资源，是动植物生存需要的营养物质。第五，废液色度高，由于废液本身含有棕色素 和黑色素，所以颜色多呈棕黑色。这些色素通常很难被细菌利用降解，其耐光照、耐高 温等特点使得即使放置时间很长，其颜色也不会减弱。 1 4 2 糖蜜酒精废液的处理与综合利用现状 ( 1 ) 农田灌溉法 农田灌溉法是指先对废液进行预处理，然后进入氧化塘，在氧化塘主要进行厌氧发 酵，厌氧发酵会使水中的钾、磷、氮等营养元素富集，进而完成了将糖蜜酒精废液转化 为熟液肥料的过程，用于灌溉农田。废液中含有农作物生长所需要的营养元素和丰富的 有机物质，这种方法就使得这些营养资源被重复利用。但是一次建设成本较高，需要辅 设灌溉管网：另外，对酒精产量高、附近农田少的厂家不适宜。 ( 2 ) 浓缩利用法 浓缩法分为浓缩焚烧法和浓缩后综合利用法。浓缩燃烧法主要是采用蒸发的方法使 水分散失，同时使废水中的固体物质增加，6 0 锤度后，进入焚烧炉燃烧。在欧美一些经 济发展快的国家，通常也是使用这种方法处理糖蜜酒精废液。我国广西南宁有些工厂也 是用蒸发浓缩的方法处理废液。但是该方法也存在一些弊端比如仪器事故多、烟尘排放 量浓度大、处理过程仪器易被腐蚀、各种能量消耗大等。 1 2 糖j - - 污泥中产氢细i r a 的硼t 选及其特性研究 ( 3 ) 发酵单细胞蛋白质 发酵单细胞蛋白以酒精废液为培养基，第一步除灰，第二步用种母液接种清液进行 发酵，第三步对成熟后的菌体进行分离，最后将茵体进行干燥就获得了蛋白质菌体饲料。 相关报道显示，前苏联用于生产饲料酵母的酒精废液多达8 5 。 ( 4 ) e m 技术 e m 技术就是有效微生物群技术，它是氧化塘自然氧化技术的改进，是将废液与培养 的有效微生物菌液按一定比例混合后才流入氧化塘。采用日本e m 技术处理糖厂废水( 包 括酒精废液) ，目前正在个别糖厂进行试运行，由于需要极大的处理容积，一般糖厂无法 采用【6 。 ( 5 ) 厌氧一好氧法 对于糖蜜酒精废液，一般使用厌氧一好氧二级处理的方法。这是因为糖蜜酒精废液 中硫酸盐的浓度含量较高，其还原为一硫化物时会毒害产甲烷菌( m p b ) ，同时硫酸盐 还原菌( s r b ) 的还原作用会严重抑制厌氧消化过程。因此目前通常把曝气吹脱或者吸收 的方式引用n - - 段厌氧，目的是为了将其中的硫化物去除。这种方法的弊端是构筑物需 求量增多，成本增高，排出的气体中含有硫化氢，污染环境。 ( 6 ) 糖蜜酒精废液作肥料 糖蜜酒精废液包含多种植物生长的必需元素和微量元素，其内还有动植物生长所需 要的有机化合物等营养物质，把废液当作肥料施撒到土壤中，是废物资源化的有效途径 之一。现今，治理酒精废液广泛应用的方法就是合理、充分利用这些肥料资源。 ( 7 ) 糖蜜酒精废液回收色素 糖蜜酒精废液中的色素主要来源于两方面，一方面是焦糖色素，生产过程中产生的； 另一方面是甘蔗本身的色素，甘蔗生长所具备的。汤兴俊等【6 2 1 研究了用甘蔗糖蜜酒精废 液生产焦糖色素的可行性，也提出了优化的焦糖色素生产工艺及如何消除糖蜜废液中胶 体和灰分的预处理方案。 ( 8 ) 糖蜜废水做生物能源 用糖蜜废水为底物生产氢气的技术，我国在国际上已处于领先地位，不仅小试取得 了前所未有的进展，中试也得以成功运行。综合考虑治理效果、工程投资、运行成本， 糖蜜废水的资源化利用是治理糖蜜废水的一个重要方向。这种利用方法不但使污染环境 的废水、废蜜得到了一定程度的治理，还将这些废物加以利用，实现了可持续发展目标。 广西大掌硕士掌位论文 糖厂污泥中产氢细菌的剜诂龟及其特性研究 1 5 本课题研究的目的和意义 1 5 1 课题来源 本课题来源于广西自然科学基金( 桂科自：0 9 9 1 1 9 1 ) ，项目名称为利用甘蔗糖蜜 废水生物制氢技术的研究。 1 5 2 课题研究意义和目的 生物发酵制氢过程中需要的基质种类通常包括有：( 1 ) 碳水化合物的含量比较高； ( 2 ) 资源丰富且廉价；( 3 ) 具有较高的能量转化率等【6 3 】。有机废水、农业工业废弃物中 都还有大量碳水化合物，将微生物直接接种到这些固体和液体废物中进行发酵制氢，在 将来的生物制氢领域拥有广大的前景。碳水化合物是厌氧产氢茵的营养来源，厌氧菌利 用碳水化合物产生氢气。因此，以有机废物为原料生产氢气，不仅可以保护环境，还可 以减少能源损耗，同时降低制氢成本，是一项同时包涵环境效益、经济效益和社会效益 的新型环保产业，在生物制能和环境保护领域展现了巨大前景，成为了符合可持续发展 战略的课题。生物技术产业是广西今后重点发展的产业，其中利用生物技术对广西的传 统工业进行改造是今后重点研究的领域之一。通过生物技术改造，可以提高传统工业的 产值和效益，改善生产条件，减少环境污染。 ( 1 ) 课题通过对产氢细菌的筛选，分离纯化出高效产氢菌，为产氢菌株遗传育种 和生理生化的研究提供重要的微生物资源。 ( 2 ) 通过对产氢细菌产氢特性的研究，优化其产氢条件，以期得到最优产氢量。 ( 3 ) 将细菌与废水处理相结合，为应用到处理实际废水、降低产氢经济成本提供 参考数据。 1 6 研究内容和技术路线 本实验研究内容： ( 1 ) 本研究以广西扶南糖厂生化池污泥为研究对象，对产氢微生物进行分离，经 多次重复，最终获得纯菌株。通过生理生化方法和分子生物学方法对菌株进行鉴定。运 用气相色谱分析方法对纯菌株的产氢能力进行初步的筛选，对发酵产氢气体的氢气含量 1 4 糖厂污泥中产氢细1 1 的筛选及其特性研究 较高的菌株进行深入研究。 ( 2 ) 考察培养温度、起始p h 值、葡萄糖浓度及碳源种类等因素对产氢菌产氢特性 的影响。 ( 3 ) 以广西糖蜜酒精废液为基质培养菌株，观察其产氢情况，研究产氢菌利用酒 精废液产氢的能力，同时监测糖蜜酒精废液中c o d 浓度的变化。 技术路线： 取泥 分离及纯化卜k初筛菌株夕l 复筛菌株) l 菌种保存 鉴定卜- “生理生化法) l 分子生物学) l 系统发育树 生长与产氢卜一叫 生长情况 人产氢情况 产氢特性研究| _ 火培养温度人起始p h 夕l 葡萄糖浓度人碳源种类 糖蜜酒精废液作基质卜_ 一产氢量人末端p h 夕0 c o d 去除率 糖, r - - 5 5 - 泥中产氢细r - 的筛选及其特性研究 2 1 前言 第二章发酵产氢微生物的分离、纯化与鉴定 本章以广西甘蔗糖厂污泥为研究对象，采用三层平板划线厌氧培养技术对产氢微生 物进行分离与纯化，运用气象色谱分析方法对纯菌株的产氢能力进行筛选，以期获得高 效发酵产氢微生物菌株。 2 2 材料与方法 2 2 1 样品来源 实验用的污泥采自广西扶南糖厂污泥池中。样品1 0 c 密封保存，以维持细菌菌种的 多样性。 2 2 2 产氢培养基 液体培养基( g l ) ：葡萄糖2 0 0 ；胰蛋白胨4 0 ；牛肉膏2 0 ； 酵母粉1 0 ；n a c l 4 o ；k 2 h p 0 41 5 ；m g c l 2o 1 ：f e s 0 4 7 h 200 1 ；l - 半胱氨酸0 5 ； 维生素液( 抗坏血酸0 0 2 5g l 核黄素0 0 2 5g l 柠檬酸0 0 2g l 吡多醛0 0 5 g l ；叶酸0 0 1g l ) 1 0m l l ； 微量元素液( m n s 0 4 7 h 2 00 0 1g l ；z n s 0 4 7 h 2 00 0 5g l ；h 3 8 0 30 0 1g l , c a c l 2 2 h 2 0o 0 1g l , n a 2 m 0 0 40 0 1g l ；c o c l 2 。6h 2 00 0 2g l ；a 1 k ( s 0 4 ) 20 0 1g l