（环境工程专业论文）苯酚、苯胺类对黄河水中藻类的毒性研究.pdf

内蒙古科技大学硕士学位论文 摘要 随着现代工业的迅速发展，越来越多的有毒有害化学品通过生产、使用和排 放进入到环境的各个领域。水体是化学品进入环境后的一个重要的归宿地，造成 了不同程度的水体污染。为了保护水资源，以及科学、合理的制定污染物在水环 境的允许浓度和排放标准，人们采用各种方法对水体进行监测和评价。 本文以黄河水包头段作为藻种来源，参照国际经济合作与发展组织 ( o e c d ) 规定的藻类生长抑制试验的标准方法，分别测定了1 1 种苯酚、苯胺类 化合物对藻类的9 6 h 的急性毒性和8 d 的慢性毒性，得到了急、慢性毒性的浓度 一效应曲线，求得了急性毒性的2 4 9 6 h 半数抑制浓度e c 5 0 值和慢性毒性8 d 最大 允许浓度m a t c 值。结果表明，苯酚、苯胺类化合物对藻类的毒性与取代基的种 类和位置有关。 为进一步探讨苯酚、苯胺类化合物的致毒机理，选取了1 1 种化合物的8 个 量子化学参数分别与试验所得的急性毒性4 8 he c 5 0 和慢性毒性的m a t c 值采用 s p s s l 3 0 统计学软件进行多元逐步回归分析，建立了急、慢性毒性q s a r 模型。 模型表明，化合物的辛醇水分配系数l g p 、化合物的摩尔折射率m r 、化合物的 最高占据轨道能e h o m o 是影响苯酚、苯胺类化合物毒性的主要因子。以l g p 、 m r 、e h o m o 建立的q s a r 模型，通过验证预测能力良好。 分别采用线性回归法和急性慢性比法( a c r ) 对急性毒性和慢性毒性关系 进行了探讨，得到急、慢性毒性之间的关系方程，通过此方程计算的慢性毒性数 据与实测值吻合性良好。本结果为同类化合物采用现有的急性毒性数据预测慢性 毒性提供参考。 关键词：苯酚、苯胺类；黄河水中藻类；急性毒性；慢性毒性；q s a r 模型 内蒙古科技大学硕士学位论文 a b s t r a c t w i t ht h e d e v e l o p m e n to ft h em o d e mi n d u s t r y ，m o r ea n dm o r ep o i s o n o u s s u b s t a n c e sh a v ec o m ei n t oe a c hf i e l do fe n v i r o n m e n tt h r o u g hp r o d u c i n g ，u s i n ga n d e m i s s i o n i n g ，w a t e rb o d yw h i c hi s a l li m p o r t a n tf i n a lp l a c ea f t e rc h e m i c a l sc o m ei n t o e n v i r o n m e n ta n dc a u s e dt h ew a t e rp o l l u t i o n i no r d e rt o p r o t e c tt h ew a t e rr e s o u r c e ， r a t i o n a l l y s e td e n s i t yo fp e r m i s s i o na n dd i s c h a r g es t a n d a r do fp o l l u t a n ti nw a t e r e n v i r o n m e n t ，m a n ym e t h o d sh a v eb e e n u s e dt om o n i t o ra n da p p r a i s et h ew a t e rb o d y t h er i v e rw a t e rg a t h e r e df r o mt h eb a ot o us e c t i o no ft h ey e l l o wr i v e ra sa l g a e s s o u r c e ，9 6 ha c u t et o x i c i t ya n d8 dc h r o n i ct o x i c i t yo f11k i n d so fp h e n o l sa n da n i l i n e st o a l g a ew e r ed e t e r m i n e da c c o r d i n gt ot h ea l g a e sg r o w t hi n h i b i t i o nt e s tw h i c hp r e s c r i b e db y i n t e r n a t i o n a lo r g o n i z a t i o no fe c o n o m i ca n dc o o p e r a t o nd e v e l o p m e n t ( o e c d ) 2 4 - 9 6 h e c 5 0v a l u e ，8 dm a t cv a l u ea n dd o s a l e e f f e c tc u r v ew e r eo b t a i n e d t h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h et o x i c i t yo ft h ep h e n o l sa n da n i l i n e sc o m p o u n d st ot h ea l g a e sw a sc o r r e l a t e dw i t h t h ek i n d sa n dp o s i t i o no fs u b s t i t u e n t si nb e n z e n e r i n g q s a rm o d e lw a sb u i l ti no r d e rt of u r t h e rd i s c u s so nt h em e c h a n i s mo ft o x i c i t yo f p h e n o l sa n da n i l i n e s t h eb u i l d i n gm e t h o do fq s a rm o d e lw a sl i n ku pt h e8q u a n t u m c h e m i s t r yp a r a m e t e r so ft h e11k i n d so fc o m p o u n d sw i n la c u t et o x i c i t y4 8 he c s oa n d c h r o n i ct o x i c i t ym a t cb yt h em u l t i p l el i n e a rs t e pr e g r e s s i o nm e t h o dw i t hs p s s13 0 t h em o d e ls h o w e dt h a t ，o c t a n o l - w a t e rp a r t i t i o nc o e f f i c i e n t sl g p ，m o l a rr e f r a c t i o nm ra n d t h eh i g h e s to c c u p i e dm o l e c u l a ro r b i t a le n e r g ye h o m ow e r em a i nf a c t o rw h i c hi n f l u e n c e t o x i c i t i e so fp h e n o l sa n da n i l i n e s w i t hl g p ，m ra n de h o m oo b t a i n e dq s a rm o d e l s h o w e dt h a tp r e d i c t i n gf u n c t i o ni sv e r yg o o d d i s c u s s i o no ft h er e l a t i o n s h i pb e t w e e na c u t ea n dc h r o n i ct o x i c i t yw a sd e v e l o p e d a c c o r d i n gt ol i n e a rr e g r e s s i o nm e t h o da n da c u t e c h r o n i cr a t i om e t h o d ，a n do b t a i n e dt h e c o r r e l a t i o ns q u a r e t h ei d e n t i c a t i o ni sv e r yg o o db e t w e e nc h r o n i cv a l u e sc o m p u t e db y t h es q u a r ea n dt h ev a l u et e s t e d t h i sr e s u l tc a nm a k ear e f e r e n c et ot h es a l t t ek i n d so f c o m p o u n d sw h e np r e d i c tc h r o n i ct o x i c i t yu s i n ga c u t et o x i c i t yi nb e i n g k e yw o r d s ：p h e n o l sa n da n i l i n e s ；a l g a ei nt h ey e l l o wr i v e r ；a c u t et o x i c i t y ；c h r o n i c t o x i c i t y ；q s a r 2 独创性说明 本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得 内蒙古科技大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明并 表示了谢意。 繇将嘿严 关于论文使用授权的说明 本人完全了解内蒙古科技大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可 以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保 存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵循此规定) 内蒙占科技人学硕+ 学位论文 引言 随着人类社会的进步，高度发展的物质文明给人类带来了丰富的物质享受，同 时也给人类带来了另一个日益严重的社会问题一环境污染。而水体是污染物进入环 境后的一个重要的归宿地，造成了不同程度的水体污染。水体中存在的污染物众 多，然而对人类健康和生物生存影响最大的是那些痕量毒物的长期毒性作用，因此 备受人们关注。为了保护水资源，科学、合理的制定污染物在水环境的允许浓度和 排放标准，人们采用各种方法对水体进行监测和评价。 目前，国内外有关各类污染物对水生生物毒性的报道已有很多。由于急性毒性 试验具有简便、快速、费用省、试验结果变异性小且重现性好等特点，因此，已有 的毒性数据多为急性毒性数据。然而，在水环境中，水生生物因为急性中毒死亡的 情况并不多见，对水生生物的生长、繁殖以及生理功能影响最大的还是低浓度毒物 长时问作用的结果。因此，要想对所有化学品进行全面、合理的评价，必须对其慢 性毒性作用进行研究。但慢性毒性试验的周期长、成本也非常大，并且必须特定受 试生物个体的生活史，使得慢性毒性数据的获得比较困难。己有文献对水生生物的 慢性毒性研究多为测定单个化合物或几个化合物对某一受试生物的慢性影响，得到 无可见效应浓度( n o e c ) 或最低可见效应浓度( l o e c ) ，然后定性分析其作用机 理，而大批量化合物慢性数据的报导和定量研究很少见。 在水生生物的毒性研究中，常用的水体指示生物种类很多，藻类是水体的初级 生产者，且容易获得、个体小、繁殖快、对毒物敏感、并能从水相中吸收有毒物质 通过食物链将其转移到上一级生物体中，进而在较短时间内可得到化学物质对许多 世代及种群水平影响等特点，成为研究水生生态毒理学很好的材料。本文以黄河水 包头段作为藻种来源，采用藻类生长抑制法，分别进行了苯酚、苯胺类化合物对藻 类的急性和慢性毒性试验，通过测定多个苯酚和苯胺类化合物对藻类的急、慢性毒 性数据，采用s p s s 统计学软件，建立化合物结构与活性( 毒性) 之间的相关 ( q s a r ) 模型，分析化合物对生物的致毒机理，用以预测同类其它化合物对水生 生物的毒性，进一步了解有机污染物对人类健康可能造成的影响和危害。分别采用 线性回归法和急性慢性比法( a c r ) 对急性毒性和慢性毒性关系进行了探讨，得到 急、慢性毒性之间的关系，以期能够利用现有的急性毒性数据，不必通过实验，也 可获得较为可靠的慢性毒性数据。 内蒙古科技大学硕十学位论文 1 绪论 随着现代工业的迅速发展，越来越多的有毒有害化学品通过生产、使用和排放 进入到环境的各个领域。目前，进入流通领域的化学品已有1 0 余万种，每年又有上 千种新化学品问世i ，这些化学品对环境的危害十分严重。 水体是化学品进入环境后的一个重要的归宿地，我国大部分水体均不同程度地 受到化学品的污染。化学品进入水体后，对生物生存，生态系统平衡及人类健康等 都构成了影响i z j ，其影响的大小与化学品对水生生物的毒性有关，化学品对水生生 物的毒性数据可以通过水生生物毒性试验而得到。因此，以水生生物为受试对象的 毒性试验在评价化学品的环境效应方面起着重要作用。 包头是黄河沿岸重要的工业城市，其大部分工农业及生活废水通过排污河沟进 入黄河，加之黄河包头段上游的污染，该段黄河水质状况已不容乐观。监测资料显 示i2 1 ，2 0 0 1 年黄河包头段水质污染沿昭君坟、画厅营子、瞪口三个断面呈逐渐加重 趋势，其污染指数分别为8 6 5 、9 6 7 、l o 9 5 ，污染负荷比依次为2 9 6 、3 3 0 、 3 7 4 。2 0 0 1 年黄河包头段三断面枯水期和丰水期因受上游有机物污染影响均属v 类 水质。平水期昭君坟断面属i i i 类水质，画匠营子和瞪口断面属i i 类水质，全年平均 三断面均属类水质。 根据刘昕宇【3 】等对黄河重点河段水环境有毒有机物污染现状识别工作，得出1 3 个黄河地表水断面不但有毒有机物的种类繁多，包括了酞酸酯类、酚类、氯苯类、 多环芳烃类等多种类型的有毒有机物，而且有毒有机污染状况较严重。薛爱娣1 4 j 等 通过对1 9 8 2 2 0 0 1 年之间黄河包头段画匠营子断面水质分析，指出黄河画匠营子断面 有机污染物浓度呈逐年增加趋势，且1 9 9 8 年以来污染明显加重，其原因主要是四道 沙河向黄河排放废水量在逐年增加。 姜福欣【5 】等对2 0 0 4 年采集于黄河河1 2 2 区域的水样进行了检测分析，共鉴定出有 机污染物8 类1 9 2 种，包括挥发性有机物( v o c s ) 3 3 种、半挥发性有机物( s v o c s ) 1 5 9 种；其中属美国列出的1 2 9 种优先控制污染物的有6 2 种，属我国列出的5 8 种优先 控制污染物的有3 3 种，属地表水环境质量标准( g b 3 8 3 8 2 0 0 2 ) 控制的有31 种。定 量出的v o c s 有1 9 种，主要包括卤代烃类和单环芳香族类，其质量浓度平均值分别为 0 6 8 3 5 u 0 6 0 9 9 9 l ，定量出的s v o c s 有6 9 种，主要包括多环芳烃类、酯类、单环芳香 族类、卤代烃类、酚类和农药类，其质量浓度平均值分别为0 4 5 8 ，1 0 11 ，0 3 6 7 ， 0 1 2 1 ，0 2 2 0 和0 0 4 5 9 9 l ，其中多环芳烃类、酯类和单环芳香族类的污染程度相对 较高，分别超标2 8 5 7 ，0 2 8 8 和0 0 0 1 1 5 4 3 倍。 内蒙古科技人学硕士学位论文 1 1 水生生物毒性试验 毒性试验在预测和评价化学品的环境效应方面起着重要作用，水生生物毒性试 验可探索污染物对水生生物的作用规律以及为科学的制定污染物在水环境的允许浓度和 排放标准提供可靠的理论依据。 1 1 1 水生生物毒性试验分类 1 1 1 1 按致毒时间不同划分 水生生物毒性试验按照致毒时间的长短划分，分为急性毒性试验( a c u t et o x i c i t y t e s t ) 又称短期试验( s h o r t t e r mt e s t ) 、亚慢性毒性试验( s u b c h r o n i ct e s t ) 、慢性试验 ( c h r o n i ct e s t ) 又称长期试验( 1 0 n g t e r mt e s t ) 【7j 。 ( 1 ) 急性毒性试验，是指在短时间内接触高浓度毒物时，被测试化学物质能引起 试验生物群体产生某一特定百分数有害影响的试验。由于死亡容易观察，而且是最明显 而又最严重的有害影响，因此进行水生生物试验时，常用半数效应浓度( i c 5 0 ) 来表征 毒物对水生生物的毒性，当试验不以死亡作为受试生物对毒物的反应指标，而是观察测 定毒物对生物的某一影响时，常用半数有效浓度( e c 5 0 ) 来表征毒物的毒性。对于藻类 常以半数有效浓度( e c 5 0 ) 作为毒物毒性大小的度量。 ( 2 ) 亚慢性毒性试验，是指试验生物在较长的时问里，因连续接触较大剂量的毒 物而出现中毒效应的试验。亚慢性毒性试验并没有明确的致毒时间期限，它介于急性毒 性试验和慢性毒性试验之间。 ( 3 ) 慢性毒性试验，通常将在低浓度下致毒时间接近或超过整个生活周期，有的 甚至连续几代的毒性试验称为慢性毒性试验。慢性毒性试验主要用以测定毒物对试验生 物的生长、发育、繁殖等方面的影响。慢性毒性的反应终点很多【8 】：存活率、生长速 度、产卵量、孵化率、畸形率、卵壳脆性；还可以测试生理、生化和行为等指标。慢性 毒性试验在环境毒理学中占有重要地位，对评价环境化学污染物对机体的慢性毒性危害 具有重要意义，同时慢性毒性试验结果也是制定环境中有毒有害物质卫生标准的重要依 据。急性和亚慢性试验是慢性毒性试验的基础，能为慢性试验的展开提供重要资料【9 j 。 以存活率为反应终点( e n d p o i n t ) 的慢性毒性试验最终可以得至i j n o e c ( n oo b s e r v a b l e e f f e c t i v e c o n c e n t r a t i o n ，无可见效应浓度) 、l o e c ( l o w e s to b s e r v a b l ee f f e c t i v e c o n c e n t r a t i o n ，最低可见效应浓度) 和m a t c ( m a x i m u ma c c e p t a b l et o x i c a n t c o n c e n t r a t i o n ，毒物最大允许浓度，是n o e c 和l o e c 的几何平均值) t o 】等毒性指标。 内蒙古科技人学硕十学位论文 1 1 1 2 按受试对象不同划分 水生生物毒性试验按照受试对象的不同分为：藻类毒性试验、细菌类毒性试 验、鱼类毒性试验等。 ( 1 ) 藻类是水体的初级生产者，对环境中的许多毒物比水生动物更为敏感，是最 常使用的环境监测指示物种之一。它对生态系统的平衡和稳定起着十分重要的作用， 其种类的多样性和生产量直接影响水生生态系统的结构和功能。在水生毒理学研究 中，藻类容易获得、个体小、繁殖快【l 、对毒物敏感、并能从水相中吸收有毒物质 通过食物链将其转移到上一级生物体中【l2 1 ，进而在较短时问内可得到化学物质对许 多世代及种群水平影响等特点，成为研究水生生态毒理学很好的材料，而受到人们 的重视，并得到广泛的应用l l 引。国际经合组织( o e c d ) 标准方法将斜生栅藻 ( s c e n e d e s mu so b l i q u u s ) 列为环境监测的试验藻种l i4 。，我国环保部门也将蛋白核 小球藻( c h l o r e l l a p y r e n o i d o s a ) 推荐为环境监测的试验藻种i ”j 。 ( 2 ) 细菌因具有生长周期短，对环境变化敏感，同高等生物有相似的物理化学特 性和酶作用过程等特剧1 6 1 ，受到人们的重视，细菌类毒性试验在国内外得到了广泛应 用。常用的细菌毒性监测方法有：细菌发光监测及细菌生长抑制监测1 17 1 。 江敏等【1 8 】研究了6 种典型含氮杂环化合物对发光细菌等水生生物的急性毒性，发现6 种物质对发光细菌、大型蚤、斑马鱼的毒性与其价分子连接性指数、辛醇水分配系数 显著相关。吴伟等【l9 】研究壬基酚聚氧乙烯醚及其降解产物毒性时，发现其对微生物要比 对其它水生生物的毒性低的多，认为是由于与细胞表面接触面积小及化合物分子链长难 以透过细胞膜，而延缓了毒性发作。b o y d 等 2 0 测定了氯苯的毒性作用，发现物质被卤 代越多，对细菌的毒性也就越大。 ( 3 ) 鱼类与人们的关系远比其它水生生物密切，对化学物质比较敏感，因此鱼类 毒性试验的应用比其它水生生物更为普遍。鱼类毒性试验不仅可以测定、评价化学物质 和工业废水的毒性，也可为制定渔业水质标准和工业废水排放标准提供重要依据。 袁星等【2 l 】测定了16 种取代苯胺、苯酚类化合物对鲤鱼9 6 h 急性毒性，观察了中毒症 状，并根据受体学说进行了定量构效关系研究，发现分配过程及有机物分子与细胞内分 子问的电子相互作用是影响化合物毒性的主要因素。卜艳珍等【2 2 】则在常温静水条件下， 通过测定4 种重金属对金鱼的急性毒性，得出毒性强弱顺序为h g c d z n c r 。h a v a t 2 3 j 综合一些拟除虫菊酯对鱼类的毒性，认为含0 【一氰基比不含0 【一氰基的拟除虫菊酯毒性大， 有卤原子取代则毒性增加，且毒性随卤原子相对分子质量的加大而增加。 1 1 1 3 按试验溶液状况不同划分 按试验容器内试验溶液的状况不同，水生生物毒性试验可以分为静水式试验、 内蒙占科技大学硕十学位论文 半静水式试验和流水式试验等1 2 4 。 ( 1 ) 静水式试验( s t a t i ct e s t ) ，生物所在容器内的试验溶液处于不流动或静 态，试验期间不更换试验溶液的毒性试验称为静水式试验。该方法简单，无需特 置，但只适用于那些在试验期间稳定而又耗氧不高的化学物质。 ( 2 ) 半静水式试验( s e m i - s t a t i ct e s t ) ，如果每隔一段时间将容器内的试验溶液 吸出，而后加入新配制的试验溶液，或者将试验动物转入另一盛有刚配制的、浓度 相同的试验溶液的容器内，这种毒性试验方法就是半静水式试验。这种方法除了用 以提供试验生物所需要的溶解氧外，还能保持被测物质浓度的大致稳定和防止水质 恶化，但是对于易挥发、不稳定的化学物质或生化需氧量( b o d ) 较高的工业废水 难以维持被测物质浓度的相对稳定和生物所需的溶解氧，更不能及时的将试验生物 的代谢产物排除容器。若解决上述问题，需采用流水式试验。 ( 3 ) 流水式试验( f l o w t h r o u g ht e s t ) ，流水式试验是指试验溶液连续地、或间 歇地流经试验容器的毒性试验方式。该方法除了解决了半静水式试验无法解决的问 题外，还为试验生物提供了更接近自然环境的试验条件。但该方法用水量和废水量 都很大，所需要的设备也比前面两种方法复杂，因而，目前在测定相对稳定而又耗 氧量不大的化学物质毒性时，仍然视具体情况而选用前两种方法。 1 1 2 国内外水生生物毒性试验现状 目前，国内外有关各类污染物对水生生物毒性的报道已有很多。由于急性毒性试验 具有简便、快速、费用省、试验结果变异性小且重现性好等特点，因此，已有的毒性数 扼多为急性毒性数据。b l u m1 2 5 ，2 6 j 比较深入的研究了1 0 0 多种有机有毒污染物对甲烷菌等 四种环境细菌的毒性，并研究了其与鱼类并1 m i c r o m x 毒性数据的相关性；陆光华【z7 j 研究 了苯酚、苯胺及其衍生物对斜生栅列藻的急性毒性，并建立- j q s a r 模型：赵元剥2 8 j 也 研究过涵盖取代苯酚、取代苯胺、卤代苯、甲苯、烷基酚和硝基类化合物等多类化合物 对斜生栅列藻、绿藻、小球藻等不同藻种的急性毒性数据，并建、_ - j q s a r 模型。 然而，在水环境中，水生生物因为急性中毒死亡的情况并不多见，对水生生物的生 长、繁殖以及生理功能影响最大的还是低浓度毒物长时间作用的结果。因此，要想对所 有化学品进行全面、合理的评价，必须对其慢性毒性作用进行研究。但慢性毒性试验的 周期长、成本也非常大，并且必须特定受试生物个体的生活史，使得慢性毒性数据的获 得比较困难。己有文献对水生生物的慢性毒性研究多为测定单个化合物或几个化合物对 某一受试生物的慢性毒性影响，得到无可见效应浓度( n o e c ) 或最低可见效应浓度 ( l o e c ) ，然后定性分析其作用机理，而大批量化合物慢性毒性数据的报导和定量研 究很少见。而且，多为测定某种化合物对大型蚤、细菌或其它水生生物的慢性影响，如 内蒙古科技大学硕士学位论文 丁中海等【2 9 】测定了丙烯酰胺对大型蚤( d a p h n i am a g n a ) 的急性毒性和慢性毒性，还 测定了联苯胺对大型蚤( d a p h n i am a g n a ) 的慢性毒性【3 0 】；王玉芬等【3 l 】测定了氯苯对 球形红细菌的毒性效应等，而对藻类的慢性毒性报道很少见。 1 1 3 毒性试验的发展方向 生物组建水平可分为亚细胞一细胞一组织一器官一个体一群落一生态系统一生物圈。就 保护水环境的一致性来说，生态系统级的毒性试验最为理想f 3 2 1 。但是，模拟生态系 统耗资巨大，而群落级毒性试验能在一定程度上反映出化学物质对环境生物的真实 影响。因此，应大力发展群落级毒性试验；另一方面也要重视细胞水平的研究( 除 微核外，如自由基、生物发光、细胞膜通道、电生理乃至d n a 突变等) 。在现实环 境中，污染物常是多来源、多种类的复合污染，他们之间可能存在拮抗、叠加或协 同作用。同时也可能受到自然条件、理化性质的影响。因此，众多污染物的联合毒 性及野外监测正有待展开。 随着环境污染出现新的特点以及人类对环境毒物认识的不断深入，生态毒理学 的发展方向是： ( 1 ) 深入探讨多种环境毒物作用于机体或生态系统的复合污染生态毒理效应及 其机理，发展联合效应广义理论。 ( 2 ) 深入研究环境次生毒物的产生过程，包括污染物在环境中的降解和转化产 物以及各种环境污染物在环境因素影响下相互反应形成的各种转化产物，以及所导 致的次生生态毒理效应及其机理，以及新、老污染联合胁迫的生物学变化与反应。 ( 3 ) 深入揭示环境毒物的化学结构、不同浓度组合同它们的生态毒性之间的关 系，探索环境毒物的多水平、长时间暴露的生态毒理过程规律，强化环境毒物长时 f s j , f 氐水平暴露的生态毒理效应的研究。 ( 4 ) 开展种群或群落水平的生态毒理学研究，建立环境毒物与新型疾病之间的 确切关系，进一步完善致突变作用的试验方法，把环境毒物对动物神经功能、行为 表现以及免疫机能的影响作为一种早期观察的敏感生态指标进行深入研究。 ( 5 ) 充分吸收分子生物学的最新成就，加强分子生态毒理学的研究，提高生态 毒理效应的微观认识水平。 生态毒理学作为一门独立的学科，在我国起步晚，是门处于形成和发展中的 新学科。我国环境污染形势仍在恶化，生态系统由于污染物的毒害作用在许多地区 处于亚健康状态，这从客观上要求对生态毒理学进行了深入研究，尤其要结合我国 国情和我国生态环境现状开展相应的研究【咒】。 内蒙古科技大学硕士学位论文 1 2 分子致毒机理 1 2 1 剂量一反应关系 试验生物对毒物的反应( 即毒物的毒性) ，除与受试生物和毒物二者本身的特性有 关外，主要取决于毒物浓度和致毒时间两个因素，当然环境因子、特别是水质条件对毒 物的毒性也有一定影响f 3 习。前面已经提到根据致毒时间的不同，水生生物毒性试验可以 分为急性毒性试验、亚慢性毒性试验和慢性毒性试验三种类型，下面讨论毒物浓度对水 生生物的影响如何表示。 毒物浓度对试验生物的影响可用剂量一反应关系束描述。具体的讲，剂量一反应关 系是反映外来化合物剂量与在群体中呈现某种效应( 计数指标或转变成计数指标的剂量 指标) 的个体在群体中所占比例关系。这种关系用曲线表示就是剂量一反应关系曲线。 大量研究表明，在剂量一反应关系中，无反应和最大反应之间，随剂量增加，反应逐步 增加，有明显程度变化。剂量一反应曲线有三种类型1 7 j ，见图1 1 。 ( 1 ) 直线关系，在这种剂量一反应关系中，剂量改变与效应强度或反应率成正比 ( 曲线a ) 。这种类型在生物效应中是很少见的。只是简单的离体试验中，在一定剂量 范围内，才可能显示这种线形关系。 ( 2 ) 对数曲线关系，该曲线是一条先锐后钝的曲线，类似数学上的对数曲线( 曲 线b ) 。当剂量换算成对数剂量时，可转成一条直线。 ( 3 ) s 状曲线，当群体中的全体对某一化合物的敏感性变异呈对称正态频数分布 时，剂量与反应率成“s ”状曲线( 曲线c ) 。此类易出现在一些物质效应( 这些效应 常在剂量增大到一定阈值时方出现) 中，但生物效应中乃属少见现象。 效 应 强 度 或 发 生 室 剂量 图1 1 剂量反应关系曲线 内蒙古科技大学硕十学位论文 1 2 2 致毒机理 分子是组成物质的基本结构单位，分子中原子的种类和化学键的性质决定了分子的 性质。在物质结构与性质之间存在着一定的函数关系 3 4 】，物质的生物活性和化学性质都 依赖于结构，是在分子水平上分子间作用的外在表现。 目自，j 认为，分子水平上的毒性机理有两种，非反应性毒性和反应性毒性【3 5 j 。非反应 性毒性也称为麻醉性毒性，主要是对细胞或者动物的中枢神经产生抑制作用。此类毒性 只与毒物作用于生物细胞的量有关，化合物在生物体内的浓度达到一定程度即呈现毒 性。麻醉性的毒性一般是可逆的，非专一性，主要是由化合物跨越细胞膜的传质过程， 或者是由其脂溶性所决定的。因此，麻醉性的毒性效应往往与污染物的辛醇水分配系 数( 1 9 p ) 具有良好的相关性。常见的产生此类毒性的污染物质包括脂肪烃、芳香烃、 氯代烃、醇、醚、酮、醛、弱酸和弱碱等。许多研究发现，一些能够形成氢键的污染物 质经常引起比较严重的麻醉性毒性效应。b l u m 和a l t e r 等认为非反应性物质首先积累在 细胞某一部位上，如细胞的类脂蛋白上，而使细胞发生膨胀，从而破坏了细胞的正常的 代谢过程，这种膨胀也可以阻塞交换的入口，也导致酶与底物机械分离，因而使细胞呈 现中毒症状，一旦毒物浓度降低至理论允许值，则细胞又恢复正常卯j 。 反应性毒性往往是由污染物质与生物体反应引起的，与污染物质的电子结构以及类 脂亲和性有很大关系。因此，这类污染物质的毒性与l 妒的相关性不是很强。污染物对 生物体产生毒性效应是因为它与生物体内的受体发生了相互作用，这种作用通常包括电 子迁移、氧化还原和自由基反应等。尤其是含有亲电子取代基( 如 c h o ， n h 2 ， o h ， s h ) 的污染物质，很容易受到电子诱导和共扼效应的影响，与生物大分子例 如蛋白质和d n a 等发生反应。其它机理包括碳氧键加成和碳碳双键加成等反应。具体 的毒性机理随着污染物质分子、生物物种、具体反应部位的变化而变化。因此，这类毒 性机理，毒物的毒性特别依赖于毒物分子的大小、空间构型及活性基团的性质等因素。 13 定量结构活性关系( q s a r ) 研究 1 3 1q s a r 概述 定量结构活性关系( q s a r ，即q u a n t i t a t i v es t r u c t u r e - - - a c t i v i t yr e l a t i o n s h i p s ) 是 根据统计学性质，建立一系列化学物质的生物活性与它们的理化性质、结构参数的相关 性，以达到预测和研究化合物的生物活性等目的1 3 8 1 。研究定量结构一活性关系，不仅可 以快速、准确预测化合物对生物的毒性，而且能够合理解释毒性机理，近年来在环境化 学等领域得到了广泛应用【3 9 , 4 0 1 。 定量结构话性关系( q s a r ) 除可以定量计算相关性外，还能得到以下信息【4 i 】： 内蒙古科技大学硕十学位论文 ( 1 ) 相关分析可以帮助判断毒物的作用机理。 ( 2 ) 相关性可以内推和外推，内推可以预测结构类型非常相似的化合物的活性， 外推可以预测化合物对人体的活性。 ( 3 ) 可以预测改变被分析化合物的结构是否可行。 目前，q s a r 法在国际上己发展成为一个相当活跃的研究领域，是环境化学、药物 化学、计算机化学中的一个前沿课题【4 2 1 。q s a r 从定量描述有机物的分子结构与其活性 之j 日j 的关系，不仅可以预测有机物的化学行为，而且使计算机辅助设计合成具有特定生 物活性的有机分子成为可能。有机污染物在环境中的行为，尤其是在生物体内的富集和 致毒是环境化学和环境毒理学的主要研究方向之一。q s a r 方法可以从已有的情报中最 大量的提取有关环境污染物结构活性之间的信息，用于预测、预报中。而且，对有机 污染物与其环境活性关系的深入研究，可望构成有机污染物理论环境化学的基础幽j 。 1 3 2q s a r 概念模式 由q s a r 的概念模式图1 2 t 3 8 】可见，其研究程序包括以下5 个主要步骤： ( 1 ) 选择合适的待试数据资料，要求准确、可信； ( 2 ) 从中选择合适的结构参数及欲研究的活性参数； ( 3 ) 选择合适的方法建立活性参数与结构参数的定量关系模型； ( 4 ) 模型检验，选择更优的分子结构参数或更佳建模方法，优化模型，给出模型 的适用约束和误差范围； ( 5 ) 实际应用，预测、预报新化合物的活性。 图1 2q s a r 概念模式图 内蒙古科技大学硕士学位论文 1 3 3q s a r 模型参数介绍与选择 有机污染物分子对水生生物的毒性作用包括两个过程：先是有机物分子通过扩散作 用透过细胞膜到达生物体内的靶分子( 外源性物质进入生物体后进攻并与之结合的生物 大分子，如蛋白质、脱氧核糖核酸) ，并在水相与生物相达到分配平衡的过程，这一过 程用辛醇水分配系数l g p 来描述；其次是毒物分子与靶分子发生作用而使生物呈现毒 性效应的过程。毒物分子与靶分子的相互作用实际上是分子间的作用力，这种分子间的 作用力包括定向力、诱导力、色散力、氢键力和电荷转移作用力等。 ( 1 ) 疏水性参数 “疏水 概念最早是由k a m a n a n n 提出的，有机物首先必须溶解在生物的脂组织中 才能致毒。疏水性越强，有机物越倾向于溶解在脂中( 即亲脂性越好) 4 3 1 。早在上世纪 末，m e y e r 和o v e r t o n 就发现醇类等的油水分配系数会影响其生物麻醉性能。h a n s e h 和l e o 等更认为在所有可能的因素中，化合物的分配行为最能影响其生物活性晔1 。 辛醇水分配系数l g p 定义为： 平衡时化合物在正辛醇中的浓度 ( 式1 1 ) l g p = = 化合物在水相中的浓度 生物活性与l g p 之间具有良好的相关性，但并不简单地呈线性关系。若l g p 过低或 过高的有机物，化合物分子则难以进入或离开脂组织，其生物活性均不高。 ( 2 ) 电性参数 分子( 或离子) 间的相互作用会影响化合物与生物组织作用的强度和范围。这些相 互作用力包括取向力、诱导力和色散力等，其强度可用电性参数来描述。q s a r 中常用 的电性参数有取代基参数、全分子参数和量子化学参数等3 类。 ( 3 ) 量子化学参数 随着计算机技术和量子化学方法的不断发展，量化计算也越来越受到人们的关注。 在许多近来的q s a r 研究中己经越来越多地或独自应用量化参数或将量化参数与其他常 规的参数联合使用。量子化学方法和分子模拟技术通常可以从空间因素及电学性质方面 为q s a r 研究提供一些很有用的信息。q s a r 中的量子化学参数包括：与电荷有关的参 数有原子电荷密度、原子静电荷q 1 、原子电荷q 、前线轨道电子密度h o m o 、自由价 等：与能量有关的参数有最高占据轨道能e f _ i o m o 、最低占据轨道能e l u m o 、分子轨道的 特征值差异、总反应能、库反应能；与电荷、能量均有关的参数有亲核极化度、亲电极 化度、前线极化度、发展静电场势等。 本文将选择苯酚、苯胺类化合物的 g v 、h o f 、t e 、e l e e 、e h o m o 、e l u m o 、 t o r s i o n e 、m r 4 5 】等8 个参数进行q s a r 模型的研究，各参数特性列于表1 1 。 内蒙古科技大学硕士学位论文 表1 1q s a r 研究中所选参数 参数名称符号单位特性 化合物的辛醇水分配系数l 妒表征化合物的亲脂性【删 摩尔折射率 m r 关，爰躲嚣篓黎篓撬荔子体椭 化合物的分子生成热 h o f k c a l m 。l 性。怒酱麓黼捣，靛 化合物的总能t e e v 反映化合物的活跃程度 化合物的总电子能 e 1 e ee v 反映化合物的活跃程度 化合物的扭转能t o r s i o n e k c a l m o l 反映化合物的活跃程度 表征化合物提供电子的能力，即该化 化合物的最高占据轨道能e h o m 0 e v 合物的亲核能力或还原能力。e 删m o 的绝 对值越大，则该化合物的还原能力越强【4 9 j 表征化合物接受电子的能力，即该化 化合物捌氐占据轨道能 e v 篡鬣毒端，龌警瞿 随之增加，化合物的毒性也变人【刊 1 3 4 藻类毒性的q s a r 研究进展 张育红等剐测定了氯代苯和烷基苯对绿藻的毒性，并将毒性数据与辛醇水分配系 数l 妒作线性回归，建立了预测模型： 1 9 l c 5 0 = o 8 4 1 1 9 p + 0 8 7 n = 1 7 ，r 2 = 0 8 4 , s = 0 2 2( 式1 2 ) 作者认为：氯代苯和烷基苯类与绿藻受体主要发生脂溶作用，这种作用可以用辛醇 水分配系数来表示。 g r a t h 等【5 2 】以麻醉致毒机理为依据，假设毒物和生物体在特定脂质部位发反应，辛 醇与特定脂质部位的物理化学特性相同，是良好的脂质替代品，在此基础上建立了化合 物对藻类的麻醉靶位脂质模型( t h en a r c o s i st a r g e tl i pm o d e l ) ，发现l 妒与e c 5 0 间有 良好的线性关系，所得目标脂质机体负荷c t l b b 值与以前研究报道相符，表明藻类与 其它水生生物的敏感性相似。 d j o m o 掣5 3 】通过研究多环芳香烃对藻类的毒性，发现化合物毒性与其理化性质( 溶 解性，挥发系数等) 及藻类的情况相关，l g p 、挥发系数较小时化合物的毒性较小。 m a t t h i a s 等【5 4 1 的研究表明：e h o m o ( 分子最高占有轨道能) 与e l u m o ( 分子最低占 据轨道h t - 匕f - , ) 的差值大小是影响多环芳香烃毒性的主要因素。 n e n d z a m 5 5 】测定了芳香胺对小球藻的毒性，并结合辛醇水分配系数与量子化学参 数，建立了q s a r 模型： - l g e c 5 0 = 0 7 4 0 ( o 0 7 0 ) l g p 一0 4 0 6 ( o 0 7 2 ) e l u m o 一1 8 5 2 ( o 1 7 6 ) ( 式1 3 ) 内蒙古科技大学硕士学位论文 n = 1 4 ，r 2 = o 9 3 9 ，s = 0 2 3 3 ，f = 8 4 9 0 所得模型相关性良好，说明芳香胺对小球藻的毒性与其在两相问的分配及其与生物 体分子发生反应有关。 陆光华等【5 6 】用量子化学法研究取代芳烃对藻类的毒性，发现所研究化合物对绿藻的 毒性主要与化合物分子轨道能和空间参数有关。 1 4 本研究的主要内容和意义 1 4 1 内容 本研究拟采用黄河水包头段作为藻种来源。包头市环境监测站对黄河水包头段的长 期监测【2 1 结果表明，酚类含量超过国家标准限值阳，故本研究中受试毒物选用11 种苯 酚、苯胺类化合物，其中大多数已列为美国【5 8 】或我国环境优先控制的有机污染物瞪9 1 。论 文研究的技术路线见图1 3 。 图1 3 论文研究的技术路线 ( 1 ) 预试验 每个化合物根据经验和文献报道，选择高、中、低三个浓度进行预试验，以期得到 接近1 0 0 和o 相对抑制率的毒物浓度，用以确定化合物对藻类的急性毒性范围。 ( 2 ) 急性毒性正式试验 急性毒性试验的过程包括化合物储备液的配置、试验液的设置( 包括不加黄河水的 种子对照与不加毒物的空白对照，另设两组平行样) 、各化合物不同浓度下吸光率的计 算。最终通过对每个化合物浓度及吸光率值作图，在图上读出相应的2 4 9 6 he c 5 0 值。 ( 3 ) 慢性毒性试验 内蒙古科技人学硕士学位论文 在急性毒性试验基础上进行慢性毒性试验，培养阶段，每个化合物的最高浓度组按 相应化合物2 4 he c 5 0 的l 2 设定，然后按摩尔浓度等对数间距0 0 5 配置8 个浓度梯度。 培养7 d ，期间每天定时振荡试验瓶3 0 m i n 。7 d 后，测定各试验瓶的吸光度，通过各化 合物浓度和吸光率值作图，求得各化合物无可见效应浓度( n o e c ) 、最低可见效应浓 度( l o e c ) 和毒物最大允许浓度( m a t c ，为n