（环境工程专业论文）纺织清洁生产用过氧化氢酶的工业化生产条件优化.pdf

中文摘要 中文摘要 过氧化氢酶( c a t a l a s e ，简称c a t ) ，存在于所有好氧微生物和动、植物细胞内，催化 h 2 0 2 分解为h 2 0 和0 2 ，在食品消毒、临床分析、医学诊断以及纺织、造纸、制浆等工业得 到越来越广泛的应用。随着人们环保意识的加强，过氧化氢酶开始用于织物漂白工艺中替 代水洗和化学试剂还原法去除h 2 0 2 ，是一种绿色，清洁、高效的生物催化剂。但是，大多 数商品c a t 不能耐受漂白浴液的苛刻条件，因此需要开发在高温( 6 0 ) 和碱性( p h 9 ) 条件下稳定的酶，而嗜热子囊菌t h e r m o a s c u sa u r a n t i a c u $ w s h0 3 0 1 b c 所产的c a t 与目前 市场上的商品酶相比，其耐热，耐碱性能更能满足纺织漂染工艺的要求。 本论文以一株嗜热子囊菌t h e r m o a s c u sa u r a n t i a c u sw s h0 3 0 1 b c 为出发菌株，研究了 发酵工艺改进和环境因素对菌体合成c a t 的影响，并针对细胞内存在的葡萄糖分解代谢物 阻遏现象，联系其与乙醇代谢的关系，找到了添加乙醇( 7 5 ) 促进c a t 合成有利的规律。 此外还对该菌株所产c a t 粗酶的简单性能，应用进行了研究，并且对活性氧影响细胞生长 以及产酶的机理进行了初探。主要研究内容如下： 1 由于za u r a n t i a c u sw s h0 3 0 1 b c 子囊菌在发酵产酶的不同阶段对溶氧的要求不同的， 分阶段控制溶氧水平有利于提高细胞生长和合成c a t 水平。发酵0 - - 4 8 h 控制d o 浓度为8 0 ( 体 积分数) ，菌体的生长量d c w 达到最大值1 0 5 3 9 l ，比对照( 1 0 0 9 9 l ) 提高了4 4 ；在发酵4 8 h - 7 2 h 控s u d o 水平为5 0 ( v v ) ，菌体合成过氧化氢酶达到最大值2 8 3 7 u m l ，比对照( 1 8 8 7 u m 1 ) 提高了5 0 3 4 。 2 za u r a n t i a c u sw s h0 3 0 1 b c 子囊菌是一种专性嗜热菌，实验表明它的最适生长温度 和最适产酶温度不一致。分阶段控制发酵温度策略使得菌体的生长充分的前提下进一步促 进菌体大量的合成过氧化氢酶。发酵0 h 3 6 h 控制发酵温度为4 6 ，在3 6 h , - - 7 2 h 将温度恒 定在4 9 c ，生长量达到1 0 7 9 9 l ，最大酶活达到了2 8 7 5 u m l ，单位细胞产酶能力达到 2 7 8 ，8 6 u r a g ，与单一控制发酵温度为4 6 c 时的最大的酶活相比，分别提高了2 8 9 和2 9 9 。 3 适量添加乙醇( 7 5 ) 可以促进菌体合成过氧化氢酶，当添加总量超过2 4 时，细胞 的生长及产酶则受到较大的抑制。在发酵3 6 , - - 4 8 h ，恒速流加乙醇比一次性添加等量的乙醇 更有效地促进菌体的产酶。在菌体生长的稳定期前期恒速流加1 6 乙醇以及混合添加o 4 的h 2 0 2 ，过氧化氢酶的产量比对照提高5 0 1 。 4 在前期研究的基础上，将实验结果放大到1m 3 和5m 3 罐的中试规模时，1m 3 和5m 3 罐的酶活和生产强度分别达到2 2 2 4u m l ：9 2 6 7 u l h 和2 3 0 0 u m l ；1 3 9 3 8 u l h ，分别接 江南大学硕士学位论文 近和高于7l 罐水平，表明所采用的放大方法并由此确定的通气量和搅拌转速是合理的，并 且实际试生产结果表明利用za u r a n t i a c u sw s h 0 3 0 1b c 进行工业化产c a t 是完全可行的。 5 za u r a n t i a c u sw s h0 3 o i b c 所产c a t 粗酶液的特性研究表明，此酶的热稳定性较 高，温度适用范围是6 0 ( 2 - 8 0 ( 2 ，p h 的适用范围为9 - 1 1 ，其耐受高温和强碱性环境的特 性在纺织行业中将有广阔的应用前景。 6 提高环境中的溶氧浓度能够促进za u r a n t i a c u sw s h0 3 0 1 b c 生长，但细胞对高氧浓 度引起的0 2 一胁迫应激水平并不高，表现为提高溶氧浓度( 5 0 8 0 ) 时c a t 酶活没有明 显地提高。而在甲萘醌( 流加速度3 “m h 1 ) 存在的情况下，提高溶氧浓度使得细胞对0 2 一 胁迫应激水平提高了，表现为当溶氧浓度提高到5 0 时，s o d 和c a t 酶活分别达到 1 2 1 1 u r a g 和3 2 0 0 u m l ，与2 5 水平相比，分别提高了1 8 6 和1 7 3 ；当d o 继续提高 到8 0 时，最大s o d 酶活高达1 2 u m g ，但是最高c a t 酶活( 2 8 8 9 u m 1 ) 与5 0 水平相 比却降低了1 0 8 。对比细胞生长的情况，这可能是由于细胞受到过高的氧化损伤造成的。 关键词：过氧化氢酶，溶氧阶段控制，混合添加，乙醇，工业化生产，活性氧胁迫。 a b s t r a c t a b s t r a c t c a t a l a s ei sw i d e l yd i s t r i b u t e di nn a t u r ea n df o u n di na 1 1a e r o b i cm i c r o o r g a n i s m s p l a n t sa n d a n i m a l s ，i tc a nd e c o m p o s eh 2 0 2i n t oh 2 0a n d0 2e f f e c t i v e l y c a t a l a s ef r o mv a r i o u ss o u r c e si s u t i l i z e di n l o t so ff i e l d ss u c h 弱d i s e a s e sd i a g n o s i s ，f o o ds t e r i l i z a t i o na n dt e x t i l ei n d u s t r i a l r e c e n t l y , 丛t h ep e o p l e sm i n do fe n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o n gb e c o m es t r o n g e r , c a t a l a s ei s p l e n t i f u l l ya p p l i c a t e di nr e m o v i n gh 2 0 2i nt e x t i l eb l e a c hc l e a n u pi n s t e a do fc h e m i c a lr e d u c i n g a g e n t sa n dh o tw a t e rw a s h i n g ，w h i c hi sp r o v e da sae n v i r o n m e n t - f r i e n d l y , p o l l u t i o n - l e s sa n dh i g h e f f e c t i v eb i o a c t i v a t o r , b u tm o s tc o m m e r c i a lc a t a l a s ea r eu n a b l et ow i t h s t a n dt h e r i g o r o u s c o n d i t i o n so ft e t i l eb l e a c hc l e a n - u pp r o c e s s t h e r e f o r e ，i ti sn e c e s s a r yt of m dae n z y m ew o r k i n g w e l li nt h ec o n d i t i o no fh i i g ht e m p e r a t u r e ( 6 0 ) a n da l k a l e s c e n t ( p h 9 ) c o m p a r ew i t ht h e c o m m e r c i a lc a t a l a s ci nt h em a r k e t , 恤e r m o - a l k a l i s t a b l ec a t a l a s ep r o d u c e db yt h e r m o a s c u s a u r a n t i a c u sw s h0 3 - 0 1 b ci sm o r es u i tf o rt h et e c h n o l o g yo f t e x t i l eb l e a c hc l e a n u p i nt h i s p a p e r , f e r m e n t a t i o nt e c h n o l o g ya n dc u l t u r ec o n d i t i o n so fza u r a n h a c u sw e r e i n v e s t i g a t e ds oa st oi n c r e a s ec a ta c t i v i t y i na d d i t i o n ，t h r o u g ht h er e s e a r c ho nza u r a n t i a c u s w s h0 3 01b c ，a p r i n c i p l e ，w h i c hh e l pt oe n h a n c ec a ty i e l d ，w a sf o u n da m o n gc a ts y n t h e s i s ， c r a b t r e ee f f e c t ( c a t a b o l i s mr e p r e s s i o n ) a n de t h a n o l ( 7 5 ) m e t a b l i s m f u r t h e r m o r e ，t h ec h a r a c t e r s a n dp o t e n t i a la p p l i c a t i o no ft h i sn o v e lc a t a l a s ew a ss t u d i e d ，a l s oi ti si m p o r t a n tt oq u e s tf o rt h e m e c h a n i s mo fb i o s y n t h e s i so fc a t b yt h e r m o a s c u sa u r a n t i a c u sw s h0 3 01b cu n d e rt h ee f f e c t o fr o s t h em a i nr e s e a r c h so ft h i sd i s s e r t a t i o nf o l l o w ： 1 d i f f e r e n tl e v e l so fd ow e r er e q u i r e di nd i f f e r e n ts t a g ep r o d u c i n gc a t a l a s eb yza u r a n t i a c u s w s h0 3 一o1b c ，i tw a sag r e a tb e n e f i tt oi m p r o v et h eg r o w t ho fc e l la n di n c r e a s et h ec a t a l a s e a c t i v i t yw i t hb i s t a g e dd oc o n t r o l l i n gs t r a t e g y m l e nt h ec o n c e n t r a t i o no fd ow a s8 0 ( v 0 1 p e r c e n t ) d u r i n g0 0 8 kt h eb i o m a s sr e a c h e dt h em a x i m a lv a l u e10 5 3 9 l ，w h i c hw a si n c r e a s e db y4 4 b y c o m p a r i s o n 、析t l lt h a to fi n i t i a lc o n d i t i o n s ( c o n = 10 0 9 9 l ) ；w h i l et h ed ol e v e lw a sc o n t r o l l e dw i t h c o n s t a n tv a l u e5 0 d u r i n g4 8 7 2 h ，t h ec a t a l a s ea c t i v i t yf r o mw s h0 3 0 1 b cr e a c h e d2 8 3 7 u m l 5 0 3 4 l l i g ht h a nt h a to fc o n t r o l ( c o n = 18 8 7 u m l ) 2 n er e s u l to fe x p e r i m e n ti n d i c a t e dt h a tt h e b e s tt e m p e r a t u r ef o rl i v i n ga n dp r o d u c i n g c a t a l a s eo fza u r a n t i a c u sw s h0 3 01b cw a sd i f f e r e n t 。t h e r e f o r e i tw a sp o s s i b l et oh a v eag r e a t i m p r o v e m e n to nt h ec a t a l a s ea c t i v i t yo nt h eb a s eo fe n o u g hg r o w t ho fc e l lw i t hb i s t a g e d t e m p e r a t u r ec o n t r o l l i n gs t r a t e g y w h e nt h ef e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r ew a sc o n t r o l l e d4 6 ，4 9 。c d u r i n go h , - 3 6 h ，3 6 h 7 2 hr e s p e c t i v e l y , t h eb i o m a s sr e a c h e d1 0 7 9 9 l ，t h em a x i m a lc a t a l a s ea c t i v i t y w a s2 8 7 5 u r n la n dt h ep r o d u c t i v ea b i l i t yw a s2 7 8 8 6 u r a g ，2 8 9 a n d2 9 9 h i g ht h a nt h a to f t h ec o n d i t i o n so f k e e p i n gt h ec o n s t a n tt e m p e r a t u r e4 6 m 江南大学硕士学位论文 3 。t h ee f f e c t so fa d d i n gt h em i x t u r eo fe t h a n o l ( 7 5 呦c o u l de n h a n c et h ep r o d u c t i o no f c a t a l a s e w h e nt h et o t a le t h a n o li nt h ef e r m e n t a t i o nl i q u o re x c e e d s2 4 ( v v ) ，t h ep r o d u c t i o no f c a ta n dt h eg r o w t ho ft a u r a n t i a c u sw s h 0 3 - 0 1w e r ei n h i b i t e ds i g n i f i c a n t l y e t h a n o l ( 7 5 ) w a s a d d e dt ot h eb r o t hb yf e d - b a t c hw i t hc o n s t a n tr a t ef r o m3 6 ht 06 0 hw a sm o r ei m p r o v e do nt h e c a t a l a s ea c t i v i t yt h a nt h a to fe q u a le t h a n o la d d e do n et i m e 骱e n1 6 e t h a n o lw a sa d d e dw i t h c o n s t a n tr a t ef r o m3 6 ht o6 0 ha n d0 4 h 2 0 2 ( v v ) w a sa d d e da t4 8 h ，t h ec a t a c t i v i t yr e a c h e d 2 7 8 6 u m lw h i c hw a s5 0 1 h i g h e rt h a nt h a to f i n i t i a lc o n d i t i o n 4 b a s e do nt h ep r e v i o u sr e s u l t so nc a t a l a s ef e r m e n t a t i o ni nf l a s ka n d7 lf e r m e n t o r , t h es c a l e u do fc a tp r o d u c t i o nf r o m7 lt olm a n d5 m 5f e r m e n t o r sw a si n v e s t i g a t e dw i t hza u r a n t i a c u s w s h0 3 - 01b c t h ea e r a t i o nr a t ew a ss c a l e du pb yt h ep r i n c i p l e so ft h ee q u a la e r a t i o nr a t ea n d k l a ，a n dt h ea g i t a t i o ns p e e db yt h ee q u a lp w i mt h ea b o v es c a l i n gu pp r i n c i p l e s ，c a ta c t i v i t y r e a c h e d2 2 2 4 u m i ，2 3 0 0 u m la n dp r o d u c t i v ei n t e n s i t yr e a c h e d9 2 6 7u l h 。1 3 9 3 8 u l hi n1 m j a n d5 m jf e r m e n t o r sr e s p e c t i v e l y , w h i c hw e r en e a rt oo rh i g h e rt h a nt h o s ei n7 lf e r m e n t o r i t s h o w e dt h a t 也ea d o p t e dp r i n c i p l e sw e r er a t i o n a l a n dt h ep r a c t i c ei n d i c a t e dt 1 1 ep o s s i b i l i t yi nc ：a t i n d u s t r i a lp r o d u c t i o nb yu t i l i z i n gza u r a n t i a c u $ w s h0 3 0 1b c 5 t h er e s e a r c ho nc a t a l a s ec h a r a c t e rs h o w e dt h a tt h i st h e r m o - a l k a l i s t a b l ee n z y m ec o u l dw o k w e l li nt h er a n g e s ：t e m p e r a t u r ef r o m6 0 ct o8 0 ca n d p hf r o m9t ol1 ，t h e s ea d v a n t a g e sw o u l d m a k et h ec a taw i d ea p p l i c a t i o ni nt h et e x t i l ei n d u s t r i a l 。 6 t oe n h a n c et h ec o n c e n t r a t i o no fd oc a r li n c r e a s et h eg r o w t ho fc e l l ，b u tt h er e s p o n s eo fz a u r a n t i a c u sw s h0 3 0 1 b ct o0 2 一s t r e s sp r o d u c e db yh i g hd ow a sm i n o r , c a t a c t i v i t yw a sn o t e n v i d e n t l yi m p r o v e dw h e nd ow a se n h a n c e df r o m5 0 t o8 0 l e v e l o nt h ec o n t r a r y , i nt h e p r e s e n c eo fm e n a d i o n e ( a d d i t i v es p e e d = 3i _ t m h 1 ) ，e n h a n c e m e n to fd oc o n c e n t r a t i o nc o u l d a m p l i f yt h eo x i d a t i v es t r e s sr e s p o n s eo fza u r a n t i a c u sw s h0 3 - 01b ct o0 2 ，w h i c hw a s c h a r a c t e r i z e db yt h es o da n dc a ta c t i v 时o f5 0 l e v e la r e1 2 11 u m ga n d3 2 0 0 u m l ，18 6 a n d17 3 h i g ht h a nt h o s eo f2 5 l e v e l ；w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fd oi n c r e a s e dt o8 0 ，s o d a c t i v i t yr e a c h e d12 u m g ，w h i l et h ec a ta c t i v i t y ( 2 8 8 9 u m l ) w a sd e c r e a s e db y10 8 ，c o m p a r e d w i t ht h eg r o w t ho fc e l l ，t h er e a s o nm a yb et h es e r i o u so x i d a t i v ed a m a g et oc e l l s t h e r e f o r e ，i tw a s p o s s i b l et ot r yh a v i n gas i g h ti n t ot h em e c h a n i s mo fc a tp r o d u c e dd u et ot h er e s p o n s eo fw s h 0 3 01b ct o0 2 一t h r o u g ht h ee f f e c to fe x t r a c e l l u l a ra n di n t r a c e l l u l a r0 2 - - o nt h eg r o w t ha n dc a t p r o d u c t i o no fc e l l k e y w o r d s ：c a t a l a s e ，b i - s t a g e dd oc o n t r o l l i n gs t r a t e g y , m i x e da d d i t i o n ，e t h a n o l ，i n d u s t r i a l p r o d u c t i o n , o x i d a t i v es t r e s s i v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我- - n 工作的同志 一对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签 名：筌因主 日 期： 为二：z ：趔 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签 名：笸应垂 导师签名： 竺坐望 第一章绪论 1 1 研究背景 第一章绪论 1 1 1 过氧化氢酶概述 c a t ( h y d r o g e np e r o x i d eo x i d o r e d u c t a s e ，c a t a l a s ee c1 11 1 6 ) 以h 2 0 2 为专一底物，通 过催化一对电子的转移而最终将其降解为水和氧气( 如下式) 。 h 2 0 2 - - 9h 2 0 + 0 2 过氧化氢酶是红细胞的衍生物，它可催化过氧化氢分解为水和氧气，使过氧化氢不至 于与超氧化物自由基反应生成有害的0 h ；并对血红蛋白及其它的含巯基蛋白质起到保护 作用，使它们不被氧化，因此对减轻活性氧损伤有定意义。大多数从不同机体分离出的 过氧化氢酶由4 个相同的亚单位组成，分子量在2 4 0 k d a 左右，在亚基的活性部位各含一个 血红素基团【l 】。来自哺乳动物以及某些真菌和细菌的过氧化氢酶还含4 个紧密结合的 n a d p h 分子。过氧化氢酶可被氰化合物、苯酚类、叠氮化物、过氧化氢、尿素及碱等物质 所阻抑。研究表明几乎所有的需氧微生物中都存在c a t 1 1 ，但也有少数好氧菌如过氧化醋 杆菌( a c e t o b a c t e r p e r o x y d a s ) 不存在c a t 。除了少数外f 2 】，如谢氏丙酸杆菌( p r o p i o n i b a c t e r i u m s h e r m a n j o 和巨大脱硫弧菌( d e s u l f 0 1 ，汤，- 面舀g a s ) ，绝大多数厌氧微生物体内不存在c a t 。c a t 主要集中存在于细胞的过氧化物酶体中，另外线粒体和细胞质中也含有少量的c a = r 。c a ：r 能及时分解细胞内产生( 主要为s o d 歧化产物) 或由胞外进入细胞的h 2 0 2 。避免了h 2 0 2 通过f e n t o n 和h a r b e r - w e i s s 反应产生o h 。同时c a t 还能对血红蛋白及其它的含巯基蛋白 质起到保护作用，使它们不被氧化【3 】。 人们研究过氧化氢酶的历史可追溯到1 0 0 多年前，早在1 8 1 1 年就已发现动植物组织可 以分解h 2 0 2 产生0 2 ，到1 8 9 2 年j a c o b s o n 证明了在动植物组织内有专一分解过氧化氢的酶， 即过氧化氢酶的存在。1 9 0 1 年l o e w 4 第一次报道了过氧化氢酶的生物化学特性。到1 9 3 7 年，s u m n e r 和d o u n c e 5 】首次从牛的肝脏中分离得到过氧化氢酶的结晶，这是最早分离得到 的高纯度酶之一。这一事件也标志着生物化学学科早期发展的胜利。随后相继报道了哺乳 动物的肝脏、红细胞及大多数微生物体内均含有此酶。 1 1 2 过氧化氢酶的应用领域 过氧化氢酶是一种催化效率非常高的生化酶，在食品、医药、临床等行业有着广泛的用途。 ( 1 ) 临床 在临床分析中，c a t 对研究自由基代谢失衡，抗衰老和肿瘤发病机理具有一定价值， 对某些疾病的诊断，鉴别诊断亦具有重要意义。c a t 可消除h 2 0 2 ，对超氧化物歧化酶起保 护作用，因而具有抗衰老作用。 江南大学硕士学位论文 ( 2 ) 医药 由于h 2 0 2 具杀菌、清洁、漂白及消毒的功效，常用于器械消毒。如在隐形眼镜消毒过 程中添加c a t 可分解消毒液中残留的h 2 0 2 。国内、外均有研究的专利发表。 ( 3 ) 食品加工 c a t 可使食品保鲜，并作为消除啤酒、饮料中分子氧、活性氧和自由基的抗氧化剂。 与葡萄糖氧化酶并用作氧的去除剂，牛乳杀菌及干酪原料乳的杀菌【6 】。 ( 3 ) 其它工业 与h 2 0 2 同时使用，用于橡胶成型，塑料及多泡性粘合剂。纸浆、纤维、毛漂白工艺中 除残留的h 2 0 2 。加入化妆品中可防止皮肤衰老，还可处理半导体废水。近年来随着h 2 0 2 在纺织、造纸、制浆等行业的普遍应用，市场对c a t 的需求也呈大幅增长趋势。 1 1 3 国内外研究概况简介 目前，国内对微生物过氧化氢酶的研究主要停留在不同来源过氧化氢酶的性质上，真 正将其进行工业化生产并用于纺织行业的不多。江南大学确定研究所用菌株为一株嗜热丝 状真菌嗜热子囊菌( t h e r m o a s c u sa u r a n t i a c u s ，编号w s h0 3 01b c ，环境生物技术研究 室保藏) 。因为应用于纺织染整工艺的过氧化氢酶，需耐高温和碱性。因此在选取生产用菌 种时可优先考虑耐热菌，这不仅能满足应用的需要，还因为选用高温菌发酵生产有很大的 优势，如：能有效防止染菌，在工艺上可节省大量发酵降温用水，节省能源，降低成本等。 在本实验室前期的研究中，主要对该菌的培养方法，营养条件以及摇瓶发酵条件的优化进 行了研究，并且对添加诱导剂促进细胞产酶，粗酶的性能评价以及应用方面也做了充分的 研究。实验结果表明在7 升罐上，发酵7 2 小时过氧化氢酶产量高达2 9 8 0 u m l ，并且在1 吨和5 吨罐上进行了中试规模的实验性生产，结果表明利用t h e r m o a s c u sa u r a n t i a c u sw s h 0 3 0 1 b c 进行工业化生产c a t ，在经济性上，应用前景以及环境保护方面上都是可行的。 国外巴西研究者开发了从人胎盘中提取医用过氧化氢酶的技术。植物方面，主要集中 在过氧化氢酶保护植物抗氧化机理方面的研究。微生物过氧化氢酶是目前研究的热点。除 生理机理研究外，工业开发方面也进行了更深入的研究，国外继黑曲霉和微溶壁球菌产c a t 分别实现工业化生之后，又开发了产酶性能更佳的嗜热子囊菌、芽孢杆菌、重组大肠杆菌 等微生物菌种。现在市售商品过氧化氢酶基本为牛肝过氧化氢酶和微生物产过氧化氢酶共 存，微生物产过氧化氢酶基本由诺维信、有田酵素、杰能科等大公司控制。 目前已用于生产过氧化氢酶的菌株及合成水平见表1 2 ： 2 第一章绪论 袁1 1 过氧化氢酶主要生产用菌株及合成水平 t a b l el ls t r a h nf o rc a t a l a s cp r o d u c t i o na n di t sa c t i v i t yi nm e d i u m 1 2 立题依据 1 2 1 过氧化氢酶在纺织染整工艺中的应用 过氧化氢酶用于去除氧漂后残留的过氧化氢是已建立的生物技术在棉、纺织行业应用的 一个最好例子。过氧化氢是对现今所有来自植物或动物的天然纤维使用最为普遍的漂白剂， 其工艺在生态上可接受，在经济上可行。因此过氧化氢漂白或精练的“无氯漂白一工艺正 得到越来越广泛的应用。但是在染浴中若存在过氧化氢，会造成对氧化敏感的活性染料褪 色。已经证明，即使染料分子较小的改变都会导致色泽的消失。因此漂白过程一旦结束， 为保证后道染色的安全性，必须将氧漂后残留的过氧化氢去除干净，以避免在其后的染色 过程发生问题。 表1 2实际生产中使用酶法工艺节约的成本 t a b l e l - 2 s a v i n g si np r a t i c a lp r o d u c t i o nw i t he n z y m e - b a s e dm e t h o d 3 江南大学硕士学位论文 图1 - 1 是染整工艺中除过氧化氢的传统工艺与酶法工艺的流程比较： f i g 1 1c o m p a r i t i o nb e t w e e nc o n v e n t i o n a la n de n z y m e b a s e db l e a c hc l e a n u pp r o c e s s 通过比较传统与酶法工艺流程，我们发现：传统工艺有不尽人意之处：如需多次升温、 洗涤，并可能带入有毒和难降解的物质。过氧化氢酶反应速率非常快：在最适条件下，每 摩尔过氧化氢酶在一分钟内可分解5 百万摩尔过氧化氢。因此，在染整工艺中使用过氧化 氢酶替代多次清洗及化学还原剂去除漂白液中残留的h 2 0 2 ，具有很大的经济优势( 表1 1 ) 和环保优势：a 无残留的有毒物质：b 漂白剂去除率高( 漂白剂能完全被去除) c 由于减少 了洗涤步骤，废水排放量减少；d 废水的总可溶物浓度降低；e 大多数去除漂白剂的化学药 品有毒且难以降解，而酶使用安全并可完全被生物降解。 1 2 2 不同来源的过氧化氢酶的性质对比 由于纺织工艺的特殊性，对纺织用过氧化氢酶的最适p h 及热稳定性提出了耐强碱耐高 温的严格要求，而目前市场上商品过氧化氢酶还不能很好的满足这一要求。 表1 3 目前市场上主要商品过氧化氢酶与枯草芽孢杆菌产过氧化氢酶的性质比较 t a b l e1 2c h a r a c t e r i s t i c so fm a i nc a tp r o d u c t sa tp r e s e n tm a r k e t 4 第一章绪论 1 2 3 菌株的选择 不同来源的过氧化氢酶在细胞中的位置有所不同。动物红细胞、肝脏，以及细菌的过 氧化氢酶存在于细胞质中，必须将细胞破碎才能提取到过氧化氢酶，因此酶的分离、提纯 较为复杂。细菌过氧化氢酶的热、碱稳定性虽然可随来源不同而不同，但因为是胞内酶， 实现高产和提取均不方便。国内用工程茵合成的过氧化氢酶，则仅限于性质研究，没有开 展生产性的研究【s 】。酵母的c a t 主要积累于胞内，而一些丝状真菌的过氧化氢酶则主要分 泌于胞外，胞内也含有一定量的过氧化氢酶。因此选用嗜热丝状真菌来生产c a t 在应用和 产品提取方面具有较大优势。 1 3 研究内容 在实验室的前期研刭钆1 0 】中，发现za u r a n t i a c u sw s h 0 3 0 1 合成的过氧化氢酶具有耐热 耐碱的特性，在纺织生产中的实际应用潜力很大。通过发酵工艺改进以及环境，营养等因 素的优化确定了提高za u r a n t i a c u sw s h0 3 0 1 的合成c a t 水平的方法，初步考察了z a u r a n t i a c u sw s h 0 3 0 1 合成的c a t 粗酶的耐热，耐碱性能以及应用，并通过外源性以及内 源性0 2 对za u r a n t i a c u sw s h0 3 0 1 b c 生长及产酶的影响，探讨了za u r a n t i a c u sw s h 0 3 0 1 b c 细胞在活性氧胁迫下合成c a t 的机理。 目前，该酶在工业化生产上的主要问题是如何在工业化条件下保证细胞产酶的稳定性。 本论文的研究思路为，以过氧化氢酶的工业化生产为目标，确定适合工业发酵生产的培养 基配方，进一步改进其发酵工艺，并对获得的酶的性能及应用潜力进行初步验证；另一方 面，通过考察外源性、内源性0 2 一对za u r a n t i a c u sw s h0 3 0 1 b c 生长及产酶的影响，探讨 za u r a n t i a c u sw s h0 3 0 1 b c 细胞在活性氧胁迫下合成c a t 的机理。 一主要研究内容如下： ( 一) 通过对影响za u r a n t i a c u sw s h0 3 0 1 b c 合成过氧化氢酶关键因素的研究，进一步优 化发酵工艺以及发酵条件以促进细胞合成过氧化氢酶。 ( 二) 将发酵法生产过氧化氢酶从小试规模放大到实际生产规模，并确定其生产工艺，并 且对粗酶的性能和应用做初步评价。 ( 三) 通过考察外源性、内源性0 2 一对za u r a n t i a c u sw s h0 3 0 1 b c 生长及产酶的影响，探 讨za u r a n t i a c u sw s h0 3 0 1b c 细胞在活性氧胁迫下合成c a t 的机理。 江南大学硕士学位论文 第二章za u r a n t i a c u s w s h 0 3 0 1 b c 合成过氧化氢酶的关键因素研究 2 1 引言 微生物有着高效、灵敏的代谢调控机制，因此它在整个代谢过程中合成的各类物质是 保持在一定水平的。生产中要实现某一物质产量的提高，可以通过育种或改进生产工艺条 件 1 l 】的方法来实现。本章通过对发酵过程的搅拌速度、温度、p h 等关键因素的的控制来研 究对za u r a n t i a c u sw s h0 3 0 1 生产c a t 的影响，从而找到对菌体生长产酶最有利的工艺条 件。 2 2 材料与方法 2 2 1 菌种 金黄色嗜热子囊菌( t h e r m o a s c u sa u r a n t i a c u sw s h0 3 o m o ，江南大学生物工程学院环境 生物技术研究室保藏。 2 2 2 培养基 斜面培养基( 每支茄式瓶) ：4 度麦汁5 0 m l ，琼脂1 9 ，p h 6 0 。 种子培养基( g l ) ：玉米淀粉1 5 ，蛋白胨4 ，酵母膏4 ，k 2 h p 0 41 ，n a 2 h p 0 4l ，m g s 0 4 7 h 2 0 5 ，p h6 8 。 基础发酵培养基( g l ) - 玉米淀粉2 6 ，蛋白胨1 0 ，( n h 4 ) 2 s 0 42 ，k 2 i - l r p 0 45 ，k h 2 p 0 4 3 h 2 0 3 ，m g s 0 4 7 h 2 02 ，微量元素液2m l ，p h8 0 a 微量元素液( g l ) ：f e c c j - 1 5 0 7 n h 2 06 ，c a c l 2 2 h 2 04 ，z n s 0 4 7 h 2 02 ，m n c l 2 4 h 2 00 1 ，k 10 1 ， ( n h 4 ) 6 m o t 0 2 4 4 h 2 00 1 ，c o c l 2 6 h 2 00 1 ，h 3 8 0 30 1 ，n a c l5 。 2 2 3 培养方法 1 ) 摇瓶培养：将成熟的孢子接种到斜面上，4 5 下培养1 3 1 6 d 。待孢子成熟后，刮取斜面上 的孢子，4 5 c 摇床培养5 2 h 。吸取种子培养液，按1 0 的接种量接种于基础发酵培养基中( 装 液量为5 0 0m l 摇瓶中装1 0 0m l 培养基) ，4 5 c 摇床培养8 4h 。每项实验均设三个平行样。 2 ) 发酵罐培养：将成熟的孢子接种至i j p d a 斜面上，4 5 下培养1 3 1 6 d 。待孢子成熟后，刮取 斜面上的孢子，4 5 培养4 4 h ，再以1 0 的接种量接入发酵罐，从4 8 h 开始流加乙醇直至发酵 结束，通气量1 ：1 ，2 0 0 r m ，4 8 h 后调整为3 5 0 r m 。 2 2 4 分析方法 2 2 4 1 发酵液挥发量的校正 发酵过程在高温下进行且周期较长，培养基中水分的挥发对实验结果的准确性会有较大 6 第二章2 7 a u r a n t i a c u sw s h 0 3 0 1 b c 合过c a t 的关键因素研究 影响，因此在发酵结束后采用称重补水法进行校正。将接种后的摇瓶用电子天平( o o lg ) 记录 初始质量，发酵结束后，分别将去离子水补入相应摇瓶至初始值。恢复质量后的发酵液再用 于发酵液各项参数的分析测定。 由于发酵罐发酵体积较大，故发酵结束后未对发酵液挥发量进行校正。 2 2 4 2 生物量测定 取5 0m l 发酵液进行真空抽滤，收集湿菌体，用蒸馏水洗涤2 次后，置1 0 5 下恒温干