（环境工程专业论文）菊酯类农药手性对映体类雌激素活性差异的研究.pdf

菊酯类农药手性对映体类雌激素活性差异的研究 摘要 尽管人们已知手性化合物的生物过程是对映体选择性的，但目前 手性污染物内分泌干扰方面的对映体差异性研究甚少。本研究选取了 功夫菊酯、胺菊酯、氯菊酯、高效氯氰菊酯、联苯菊酯共5 种拟除虫 菊酯农药，通过体外人乳腺癌m c f 7 细胞增殖试验探讨这5 种农药的 类雌激素活性，并对高效氯氰菊酯、联苯菊酯进行手性拆分，研究这 两种手性污染物的内分泌干扰方面的对映体差异性。并以联苯菊酯手 性农药为例，采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应( r t - p c r ) 方法， 探讨其对人乳腺癌m c f 7 细胞p s 2 、e r am r n a 表达的影响。 结果表明功夫菊酯( c y h ) 、胺菊酯( t e t ) 、联苯菊酯( b f ) 、 高效氯氰菊酯( 亨- c y p ) 、氯菊酯( p e r ) 均能引起人乳腺癌m c f 一7 细胞 增殖。对这5 种拟除虫菊酯农药的拟雌激素活性当量进行了比较，刺激 m c f 7 细胞增殖的能力依次为：p e r b f c y h - c y p t e t 。由此可 知观察的5 种拟除虫菊酯农药p e r 、b f 、c y h 、夕- c y p 、t e t 均具有类雌激 素活性。 p c y p 是从普通氯氰菊酯( c y p e r m e t h r i n ) 经差向异构得到的2 对杀 虫活性较高的对映体。通过人乳腺癌m c f 7 细胞增殖试验表明，其内 分泌干扰作用主要来自于其1 r c 函格、i r t r a n s a s 、i s = c i s a r 对映体， 1 s - t r a n s a r 对映体同样具有较高的杀虫活性，但其内分泌干扰作用却较 小，明显低于其它三个对映体，具有显著性差异( p i r c i s b f 。结合细胞增殖分析结 果均表明b f 具有明显的类雌激素的活性，而且其雌激素活性表现出了 显著的对映体选择性差异，雌激素活性为1 s - c i s b f i r c i s b f ，这种类 雌激素效应可能都是通过雌激素受体介导的信号通路实现的。 关键词：手性农药，拟除虫菊酯杀虫剂，内分泌干扰，酶联免疫实验， 雌激素受体，实时荧光定量聚合酶链反应 s t u d yo ne n a n t i o s e l e c t i v i t yi ne s t r o g e n l c a c t i t yf o rp y r e t h r o i dp e s t i c l d e s a b s t r a c t d e s p i t et h ef a c tt h a tt h eb i o l o g i c a lp r o c e s so fe h i r a lc o m p o u n d sa r e e n a n t i o s e l e c t i v e ，t h ee n d o c r i n ed i s r u p t i o na c t i v i t ya n du p t a k eo fe h i r a l c o m p o u n d sw i t hr e s p e c tt oe n a n t i o s e l e c t i v i t yh a ss o f a rr e c e i v e dl i m i t e d r e s e a r c h t os t u d yt h ee s t r o g e n i ce f f e c t so fc o m m o n l y - u s e dp y r e t h r o i d p e s t i c i d e so nt h ep r o l i f e r a t i o no fm c f - 7c e l l s f i v ep y r e t h r o i dp e s t i c i d e s s u c ha sc y h a l o t h r i n ，t e t r a m e t h r i n ，p e r m e t h r i n ，b e t a c y p e r m e t h r i na n d b i f e n t h r i n w e r es e l e c t e dt op e r f o r mh u m a nb r e a s tc a n c e rm c f 一7c e l l p r o l i f e r a t i o na s s a y a n d t h ed i f f e r e n c e so fe n d o c r i n e - d i s r u p t i n gi n e n a n t i o m e r so fb e t a - c y p e r m e t h r i n 、b i f e n t h r i nw e r es t u d i e d t os t u d yt h e e s t r o g e n i c e f f e c t so fc o m m o n l y u s e d p y r e t h r o i d sp e s t i c i d e s o nt h e e x p r e s s i o no f t h ee s t r o g e nr e c e p t o r ( e r ) g e n ea n dp s 2g e n e b i f e n t h r i nw e r e s e l e c t e dt op e r f o r mt r a n s c r i p t i o na c t i v a t i o na s s a y t h ep r o l i f e r a t i v es t a t u s w a sa s s a y e db ym t ta n dt h em r n al e v e l sd e t e r m i n e db yr e a l t i m e q u a n t i t a t i v ep c r a l lo ft h ep y r e t h r o i dp e s t i c i d e s ( c y h a l o t h r i n ( c y h ) 、t e t r a m e t h r i n ( t e t ) 、 p e r m e t h r i n ( p e r ) 、b e t a - c y p e r m e t h r i n ( f l - c y p ) a n db i f e n t h d n ( b f ) ) w e r e a b l e t os t i m u l a t et h ep r o l i f e r a t i o no fm c f 一7c e l lt ov a r y i n ge x t e n t ，t h eo r d e ro f t h e i ra b i l i t i e st oi n d u c et h e p r o l i f e r a t i o n w e r el i s t e da sf o l l o w ： p e r b f c y h f l - c y p t e t t h er e s u l tm e a n st h a tt h ep y r e t h r o i dp e s t i c i d e s s e l e c t e de x h i b i te s t r o g e n i c i t y f l - c y p w e r e g o t f r o m c y p e r m e t h r i nt h r o u g he p i m e r i z a t i o n t h e d i s r u p t i n ge f f e c t so fe n d o c r i n e d i s r u p t i n g m a i n l yc o m ef r o me n a n t i o m e r i c s ( 1 r c z 叠一a s 、1 r l - c a n s a s 、is - c i s - a r ) t h ee n a n t i o m e r i c s u c ha s 1 s - t r a n s a rh a st h eh i g hi n s e c t i c i d a la c t i v i t y ，b u tt h ed i s r u p t i n ge f f e c t so f e n d o c r i n e d i s r u p t i n gi sv e r yw e a l ( ，s i g n i f i c a n t l yl o w e r t h a nt h eo t h e rt h r e e e n a n t i o m e r sw i t has i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( p o 0 5 , p 0 0 1 ) t h e c e l l p r o l i f e r a t i o ni n d u c e db yt h ef o u rf l - c y pe n a n t i o m e r sm a yb et h r o u g ht h e c l a s s i c a le s t r o g e nr e s p o n s ep a t h w a yv i at h ee s t r o g e nr e c e p t o r ( e r ) ，a st h e p r o l i f e r a t i o ni n d u c e db yt h ee n a n t i o m e r sc o u l db ec o m p l e t e l yb l o c k e d w h e nc o m b i n e dw i t h10 石m o l lo ft h ee ra n t a g o n i s ti c i18 2 7 8 0 i nt h ee s c r e e n a s s a y , t h ed i s r u p t i n g e f f e c t so f e n d o c r i n e - d i s r u p t i n gm a i n l yc o m ef r o me n a n t i o m e r i c1s - c i s b f e n a n t i o m e r i cs u c ha s 1 r c 括b fh a st h eh i g hi n s e c t i c i d a la c t i v i t y ，b u tt h ed i s r u p t i n ge f f e c t so f e n d o c r i n e d i s r u p t i n gi sv e r yw e a k ，s i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a n t h eo t h e r e n a n t i o m e r1 r c s - b fw i t has i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( p i r c i s - b f t h i ss u g g e s t st h a tt h ec e l lp r o l i f e r a t i o ni n d u c e db y b fm a yb et h r o u g ht h ec l a s s i c a le s t r o g e nr e s p o n s ep a t h w a yv i at h e k e y w o r d s ：c h i r a l p e s t i c i d e s ，p y r e t h r o i d s ，e n d o c r i n e d i s r u p t i n g ， e n z y m e l i n k e d i m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) ，e s t r o g e n r e c e p t o r , r e a l t i m eq u a n t i t a t i v ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 菊酯类农药手性对映体类雌激素活性差异的研究 e e d s 叫境内分泌干扰物 d e p 敌百虫 d c h p 邻苯二甲酸二环已酯 p c b s 一氯联苯化合物 d d t 滴滴涕 a h c h 1 六六六 p o p s 持久性有机污染物 n l s 核定位序列 e r e 雌激素反应元件 t c d d 四氯二苯并二嚼英 p b b s 多溴联苯化合物 a l l 芳烃 a p 烷基酚 e l i s a 酶联免疫吸附试验 e r 雌激素受体 a l l 雄激素受体 d h t 雄激素双氢睾酮 e 2 雌二醇 v t g 卵黄蛋白原 z r p 卵壳蛋白 i nv i v ot e s t 体内实验 i nv i t r ot e s t 体外实验 h e r s - 人类雌激素受体 i n s l 3 二胰岛素样生长因子3 r o s 一“性氧族产物 e r 一对映体比率 e 卜对映体过剩 e 卜对映体分数 符号说明 浙江工业大学硕士论文 菊酯类农药手性对映体类雌激素活性差异的研究 e c n 一电子捕获检测器 g c 气相色谱仪 h p l c 一高效液相色谱 r 广_ 分离度 卜容量因子 4 选择因子 k 为气体常数 a h o 手性化合物某异构体在固定相中的焓变 a s o _ _ 手性化合物某异构体在流动相中的熵变 a 铲l 手性化合物相邻两异构体从流动相传递到固定相并与固定相形成缔合物 的焓变之差 铲手性化合物相邻两异构体从流动相传递到固定相并与固定相形成缔合物 的熵变之差。 a a g 。l 相邻两异构体在固定相和流动相间的自由能之差 死一临界温度 一线性相关系数 m t t 一四唑盐 d m s o i 一二甲基亚砜 m e m 培养基 e d t a 一乙二胺四乙酸 c y h 功夫菊酯 t e t _ - 胺菊酯 b 卜联苯菊酯 伊c y r 高效氯氰菊酯 p e 卜一氯菊酯 p k 增殖效应 r p b 一相对增殖效应 r p p _ _ 相对增殖力 e s c r n m c f 7 细胞增殖试验 p c r 一聚合酶链反应 浙江工业大学硕士论文h 菊酯类农药手性对映体类雌激素活性差异的研究 c d n a 一互补脱氧核糖核酸 a n o v a 方差分析 c 仁- 荧光信号有统计意义显著增长( 即穿过阈值线) 时的循环次数 浙江工业大学硕士论文h i 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研 究工作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外，本论文不包 含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得浙江工业大 学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献 的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。 作者签名：刁易豹莨 日期：h a l 年石月厂e l 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅。本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本 学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密酊 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名： 导师签名： 榀f 葭 影李 日期：潲年 日期：参萨 ) 只gb 舌月，日 菊酯类农药手性对映体类雌激素活性差异的研究 1 1 选题背景及意义 第一章前言 越来越多的研究表明，近几十年来野生动物与人类生殖功能的下降可能与某 些环境化学物有关，由于这些化学物能干扰内分泌功能，故也称为环境内分泌干 扰物( e n v i r o n m e n t a le n d o c r i n ed i s r u p t o r s ，e e d s ) 。e e d s 的作用机制很复杂，类 雌激素活性是可能机制之一。由于近几年来陆续有研究报道某些农药具有内分泌 干扰作用，目前普遍观点认为农药在e e d s 中占有很大的比重。 拟除虫菊酯类农药是上世纪7 0 年代后发展起来的新型农药，随着有机氯农药 大多已被禁用及有机磷农药的限制使用，拟除虫菊酯类农药因具有选择性毒性， 对哺乳动物急性毒性低、代谢和排泄快的特点，现在已经成为世界范围内广泛使 用的一类杀虫剂【1 5 】，在国际农药市场中占2 0 的份额网，用于农作物害虫和卫生 害虫的防治。但同时也带来了环境污染和食品安全等问题。研究显示拟除虫菊酯 类农药不仅具有致癌性、致突变性，而且在长期低剂量暴露下能够刺激乳腺癌 m c f 7 细胞增殖一存在着对非靶标生物内分泌干扰的可能，而且通过食物链的 富集作用，拟除虫菊酯类农药的浓度大大地提高，对人体健康造成了潜在的威胁。 拟除虫菊酯一般含有一至三个手性中心，有一对或多对对映体，这些对映体 的物理化学性质几乎完全一样，但其潜在的生物效应如毒性、致癌性、致突变性 和内分泌干扰性等大都具有对映体选择性嗍。尽管预知不同对映体可能具有完全不 同的生物活性，但目前生产和使用的大部分手性农药仍为外消旋体。手性物质进 入生态环境被生物摄取后，其各个对映体在生物体内的活性、代谢和毒性存在着 很大差异，它们在环境中的持久性通常也存在着差异。长期以来，在研究手性农 药的环境行为、生态效应、潜在毒性、副作用时，都把外消旋体农药视为单一化 合物。在对映体水平上研究手性污染物( 如手性农药) 是科学发展到今天的必然， 同时它也将促进环境科学向更微观和纵深发展。 然而，近年来对手性杀虫剂( 包括拟除虫菊酯) 的研究主要集中在水生生物 的急性毒性【9 1 4 l 和环境行为 s , 1 5 - t 9 】。到目前为止很少有人关注手性杀虫剂慢性生态 毒性( 如内分泌干扰) 的对映体选择性 2 0 - 2 2 1 。因此，在手性层面上研究环境污染 物各对映体的慢性生态毒性( 如内分泌干扰) 具有极大的现实意义。 浙江工业大学硕士论文 菊酯类农药手性对映体类雌激素活性差异的研究 1 2 研究内容 尽管人们已知手性化合物的生物过程是对映体选择性的，但目前手性污染物 的内分泌干扰方面的对映体差异性研究甚少。本研究选取了功夫菊酯、胺菊酯、 氯菊酯、高效氯氰菊酯、联苯菊酯共5 种拟除虫菊酯农药，通过体外人乳腺癌m c f 7 细胞增殖试验探讨这5 种农药的类雌激素活性，并对高效氯氰菊酯、联苯菊酯进 行手性拆分，研究这两种手性污染物的内分泌干扰方面的对映体差异性。并以手 性农药联苯菊酯为例，从分子水平对其作用机理进行初步研究，采用实时荧光定 量逆转录聚合酶链反应( r t p c r ) 方法，观察联苯菊酯及其对映体对人乳腺癌 m c f 7 细胞p s 2 、e r am r n a 表达的影响。 浙江工业大学硕士论文 2 菊酯类农药手性对映体类雌激素活性差异的研究 2 1 内分泌干扰 第二章文献综述 随着工农业化的发展，环境污染在进一步扩大。大量化学物质在环境中不合 理的释放、现代农业对农药的过分依赖都对环境造成了极大的污染幽】。这些环境 污染物质不仅能致癌，还能与人和动物体内的雌激素受体结合，影响甚至破坏内 分泌系统的功能，引起发育障碍和生殖系统疾病，甚至性变态。 2 1 1 环境内分泌干扰物的定义 环境内分泌干扰物质( e n v i r o n m e n t a le n d o c r i n ed i s r u p t o r s ，e e d s ) 很早以前就 已经出现，2 0 世纪3 0 年代在英国自然杂志上发表过两篇有关合成雌激素的论 文 2 4 , 2 了1 。9 0 年代以来，环境化合物的内分泌干扰效应引起了学术界和各国政府的 高度重视嘲，美国已于1 9 9 1 、1 9 9 3 、1 9 9 5 年召开了3 次环境雌激素的研讨会。美 国、欧共体及日本都己拨出巨款，对e e d s 问题进行了专项研究。1 9 9 5 年美国由 1 4 个政府部门组成了内分泌干扰工作组( w o r k i n gg r o u po ne n d o c r i n ed i s r u p t o r s ) 制定了e e d s 的合作研究计划。1 9 9 6 年美国科学家c o l b o m 等合作发表的我们失 落的未来( o u rs t o l e nf u t u r e ) 一书网，在很大程度上促进了美、欧、日等发达国 家对环境中内分泌干扰问题的研究。包括欧盟、经济合作与发展组织和美国国家 环保局等在内的政府和组织机构都已经发表了相关的专题报告，就环境中内分泌 干扰物质的暴露、对野生动物和人类内分泌系统及身体健康的不利影响和风险评 价等问题作了整体上的论述1 2 s 】。 环境内分泌干扰物质是指进入机体后，具有干扰体内正常内分泌物质的合成、 释放、转运、代谢和结合等过程，激活或抑制内分泌系统的功能，从而破坏内分 泌系统维持机体稳定性和调控作用，并影响生物体或其后代的发育、繁殖和( 或) 行为的外源性化合物【2 9 , 3 0 l 。对于这类化合物，另外还有些称法如环境雌激素 ( e n v i r o n m e n t a le s 臼o g e n s ) 3 1 1 、内分泌调节物质( e n d o c r i n em o d u l a t o r s ) 【3 2 1 、内分 泌干扰剂( e n d o c r i n ed i s r u p t e r s ) 、内分泌活性化合物( e n d o c r i n ea c t i v ec o m p o u n d s ) 熊f 2 3 】 可 o 2 1 2 环境内分泌干扰物的分类 内分泌干扰物按其生物活性可分为类雌激素及抗雌激素、类雄激素及抗雄激 浙江工业大学硕士论文3 菊酯类农药手性对映体类雌激素活性差异的研究 素、类甲状腺素及抗甲状腺素等。目前研究最多的是类雌激素【3 0 1 。迄今已发现1 0 0 多种具有内分泌干扰作用的化学物质，大致可分为农药、防腐剂( 如五氯酚、三 丁基锡等) 、增塑剂( 如邻苯二甲酸二乙酯、d e p 和邻苯二甲酸二环己酯、d c h p 等) 、洗涤剂( 如壬基苯酚、n p 和4 辛基苯酚等) 、副产物( 如二嚼英类、苯并 ( a ) 芘等) 、某些重金属( 如铅、汞等) 、其它化合物( 如双酚a 和多氯联苯类、 p c b s 等) 等几类。其中农药又包括除草剂( 如阿特拉津、除草醚等) 、杀虫剂( 如 六六六、马拉硫磷等) 、杀菌剂( 如苯菌灵、六氯苯等) 等【3 3 1 。 2 1 3 环境内分泌干扰物的危害 环境内分泌干扰物质大多数是脂溶性的，且化学性质稳定，可通过食物链富 集，进入机体以后半衰期较长，可在机体内长期蓄积，难以生物降解，不易排出 甚至不排出。目前认为环境内分泌干扰物质具有毒物的一切性质，即使微量也可 对正常的激素作用产生影响，干扰内分泌机能【3 4 】。主要体现在生殖器官的成熟和 功能，对其它腺体也有不同程度的影响。无论动物还是人类都会受到这一类物质 的干扰。环境内分泌干扰物质除了生殖毒性外，还可引起哺乳动物的病理性损伤， 如肾上腺皮质增生、骨质疏松、胃肠溃疡、爪畸形、动脉硬化、子宫肌瘤和子宫 内皮厚度减低等。环境内分泌干扰物质的种类繁多，且分布范围广，加之对物种 性别平衡的影响，势必会造成物种减少，生态失衡，甚至影响人类和动物的繁衍网。 现有资料表明，内分泌干扰物已在全球范围内对野生生物种群造成明显影响， 导致鸟类、两栖类、鱼类、贝类和哺乳类动物的繁殖能力下降、出生缺陷增加、 代谢行为异常以及动物的性畸变现象等。动物实验也表明外来雌激素可引起各种 形式的雄性生殖系统发育障碍、性周期失调、诱发生殖器官肿瘤等。大量报道显 示，环境内分泌干扰物质不仅使许多野生动物的繁殖能力显著下降，而且对人类 的生殖健康也产生了潜在的威胁【3 5 1 。许多研究认为内分泌干扰物质能引起人类精 子计数减少，精子活力下降，导致男性生育能力下降。环境内分泌干扰物还能干 扰内源性性激素正常水平的维持而影响生殖系统发育。对男性的影响尤为突出， 表现为性腺发育不良、生殖道肿瘤和先天畸形增多。此外，内分泌干扰物还能直 接作用于神经系统，引起行为、精神等的改变。内分泌干扰物对人类健康及生物 种群的影响，已引起各国政府、科研机构及公众的广泛关注，成为当前公共卫生 和环境保护研究工作的一个热点 3 0 l 。 浙江工业大学硕士论文4 菊酯类农药手性对映体类雌激素活性差异的研究 2 1 4 环境内分泌干扰物的作用机制 内分泌系统包括大脑、肾上腺皮质、甲状腺、卵巢、精囊及内分泌腺等。e e d s 对人体及野生生物影响是复杂的，目前的发现主要集中在与性激素有关的反应系 统【3 6 如。性激素是胆固醇的衍生物，通过胞内受体介导的途径进行信息传递 3 9 l 。 性激素受体位于细胞核内，当性激素与细胞核内的受体结合后，可使受体的构象 发生变化，暴露出d n a 结合区，激素受体复合物作为转录因子与d n a 特异基因 的激素反应元件结合，从而使特异基因易于( 或难于) 转录。值得注意的是，雌 激素受体的特异性相比较其他类固醇激素受体而言是较低的，它可以和许多结构 类似雌二醇的物质结合，因此，许多类固醇物质和其他物质都可以表现出雌激素 样活性 3 9 1 。在细胞水平上，e e d s 对机体的影响是多方面的，其主要作用机制有以 下三方面。 ( 1 ) 通过与受体的结合介导 一些e e d s 的形态与内源性雌激素结构相似，与内源性雌激素竞争结合细胞中 的雌激素受体，通过c a m p 依赖的信息传导通路，受体的构型发生改变，并暴露 核定位序列( n u c l e u sl o c a t i o ns i g n a l s ，n l s ) ，从而使配体受体复合物转移到细胞核 内，与靶基因启动区的雌激素反应元件( e s t r o g e nr e s p o n s ee l e m e n t , e r e ) 结合， 通过参与转录，调节靶基因表达1 4 0 。 此外，e e d s 还可以与其他固醇类激素受体结合，比如p ，p - d d e 是杀虫剂滴 滴涕( d d t ) 的代谢产物，可以与雄激素受体竞争性结合，从而抑制雄激素的活 性：e e d s 还可作用于甲状腺受体，如p c b s 可以与甲状腺受体结合，通过于扰神 经内分泌系统而影响发育。靶器官将这些e e d s 误认为是内源性激素后，还可以通 过反馈机制向下丘脑和垂体等中枢输送信号，或抑制激素的过度分泌，或促进激 素的分泌，从而进一步影响到整个机体的内分泌系统【4 1 1 。 ( 2 ) 激素代谢及其自身代谢 甾体激素是胆固醇经过脂解酶和细胞色素p 4 5 0 酶系合成的，而特异性的细胞 色素p 4 5 0 酶系很容易受到环境化学品的影响【4 2 】。如e e d s 中的d d t 、林丹、p c b s 、 二嗯英( t c d d ) 等对肝脏的细胞色素p 4 5 0 、p 4 4 8 等酶的活性有诱导作用，t c d d 在肝脏或生殖细胞核内与芳烃( a h ) 受体结合后，作用于基因识别部位，启动 c y p l a l m r n a 的表达，使得内源性激素的代谢加速，间接干扰内分泌系统 4 3 1 。 ( 3 ) 作用于细胞信号传导通路 浙江工k 大学硕士论文 5 菊酯类农药手性对映体类雌激素活性差异的研究 e e d s 通过影响与激素受体无关的细胞信号传递途径发挥作用。一些生长因子 的反应可以证明其过程与激素受体无关，而可能与蛋白激酶的活性有关。比如高 水平的d d t 可以增a n d , 鼠子宫平滑肌细胞中游离钙的浓度；某些p c b s 可以影响 钙的体内平衡和蛋白激酶c 的活化 2 3 1 。据推测，一些e e d s 因其脂溶性质能嵌入 细胞膜并在其中蓄积，降低细胞膜上的c a 寸泵活性，通过干扰生殖细胞内钙稳态 而影响生殖功能1 4 4 。有些e e d s 可能通过第二信号途径的细胞机制产生作用。有 研究表明，一些e e d s 导致隐睾与胰岛素样生长因子3 ( i n s l 3 ) 及其受体lg r 8 g r e a t 基因突变有关【4 5 1 。i n s l 3 以雌激素依赖方式促进睾丸引带始基的生长和分 化，对小鼠睾丸引带的膨胀反应有直接作用，影响睾丸的第二期下降，血i n s l 3 水 平下降及lg r 8 g r e a t 基因突变，均系鼠类动物隐睾的关键原因。至于人类隐睾 是否与之有关有待进一步证实 4 6 1 。 分子水平的研究显示，e e d s 可干扰胚胎发育过程中多种基因的表达，导致某 些组织器官异常。e e d s 能与e r 结合形成复合体，再与d n a 的激素反应元件结 合，从基因水平调控生理生化过程。暴露于e e d s 还引起细胞数量、结构、功能的 变化，造成d n a 损伤、端粒融合、染色体畸变【4 7 , 4 8 1 。 2 1 5 环境内分泌干扰物检测技术 环境内分泌干扰物种类多、数量大、含量较小( n g l 叩g l 级) ，并且大部分 类雌激素的内分泌干扰物虽然能与天然17 p - 雌二醇( e 2 ) 竞争雌激素受体( e s t r o g e n r e c e p t o r , e r ) ，产生雌激素样效应，但在结构上与1 7 伊雌二醇( e 2 ) 没有相似性， 这些都给环境内分泌干扰物的检测带来困难。随着研究的深入，愈来愈多的环境 内分泌干扰物被认定。目前国际上对环境内分泌干扰物中具有雌激素活性的物质 的检测更为注重，方法较多。现有的检测技术可分为物理检测技术和生物检测技 术两大类f 2 9 4 9 】。为了全面而深入的研究内分泌干扰物并评价其对人类和动物界的 危害，在检测时选择多种方法以便综合分析是很有必要的【5 0 1 。 ( 1 ) 物理检测技术 物理检测一般是用色谱仪器( 如液相色谱和气相色谱) 进行分析。色谱分析 技术对样品的前处理过程要求非常高，需要从复杂的基质样品中将低浓度的目标 化合物高效提取、纯化和浓缩。随着色谱技术与质谱技术的结合，检测分析的选 择性和灵敏度得到很大提高，检测范围有所扩大。一般来说，做为色谱分析前处 理的萃取只能提取一类或几类物理性质相似的环境内分泌干扰物，因此要完全分 浙江工业大学硕士论文 6 菊酯类农药手性对映体类雌激素活性差异的研究 析样品，必须采用不同的萃取、纯化方法分别提取与分析，这样耗时较长，费用 也较大陋，5 。 ( 2 ) 生物检测技术 生物检测是建立在环境内分泌干扰物在体内的作用机制及产生的生物效应的 基础之上的。生物检测包括体内实验( i nv i v ot e s t ) 与体外实验( 1 nv i t r ot e s t ) 网。 体内实验是指以活体动物为对象，进行e e d s 对内分泌系统干扰作用的研究。 利用该方法可开展e e d s 对生物体及生殖器官影响的研究。包括：子宫增重、阴 道细胞角质化、阴道开放、动情期、生殖器、性腺组织学等试验。对卵生脊椎动 物、爬行动物和两栖动物还可测定卵黄蛋白素，确定内分泌作用。体内试验的优 点是代表一种活体状态，综合了血浆结合和毒物代谢动力学等多种因素。能进行 世代观察，并比较物种间的差异，可研究到实验终点。同时能检测需经体内代谢 活化的化合物和中间代谢产物的内分泌干扰活性，因此可检测出潜在内分泌干扰 效应。缺点是试验时间长、费用高，有时结果易受实验动物体内其它干扰物的影 响，使反应不明显。 体外实验的设计主要是基于大部分环境内分泌干扰物在体内的作用机制，如 类雌激素在体内与 7 ，- 雌二醇( e 2 ) 竞争结合雌激素受体。体外实验主要有受体 结合实验、激素受体激活试验、体外芳香酶活性抑制实验、细胞培养实验、分子 生物学检测技术等几种 2 9 , 3 0 。受体结合实验包括雌激素受体结合实验和雄激素受 体结合实验，是从受体水平上判断某物质是否具有类激素活性及其活性强度【3 0 , 5 2 。 受体结合实验可以了解药物的作用是否经过受体所介导，但尚不能区分被测物是 激素的激动剂还是拮抗剂【5 3 】。受体结合实验主要是选用组织匀浆。细胞培养实验 是利用细胞对雌激素或具有雌激素样作用的物质可产生特异性反应，通过观察细 胞生长曲线或测定特异性蛋白含量，来判断受试物的雌激素活性和强度。所用的 细胞系有m c f - 7 细胞、t 4 7 d 细胞、z r - 7 5 1 细胞( 此三者皆为人乳腺癌细胞系) 、 h e l a 细胞( 人宫颈鳞癌上皮细胞系) 、大鼠子宫原代细胞、大鼠垂体原代细胞、鼠 淋巴细胞经基因转染的l e c 9 细胞等。其中细胞增殖常用的是m c f 7 细胞 5 4 , 5 5 - 5 7 1 ， 它的优点在于能反映对人体的作用，并且操作简单、灵敏度较高。而细胞特异性 产物测定常用的是卵黄蛋白原( v i t e l l o g e n i n , v t g ) 。由于卵黄蛋白原具有高度的特 异性、高度的灵敏性及标本的取材灵活广泛等特点，所以在内分泌干扰物筛选中， 可以作为很好的生物标志物( b i o m a r k e r ) 2 9 , 3 0 4 9 】。激素受体激活试验主要是激素可 浙江工业大学硕士论文7 菊酯类农药手性对映体类雌激素活性差异的研究 通过受体机制影响基因表达。根据e r 信号转导的模式，配体与e r 结合，可导致 受体蛋白构型的变化。雌激素通过调节雌激素反应基因转录显示其生物活性【5 8 1 。 利用分子生物学技术深入分析药物在基因转录和基因表达水平的作用对于环境污 染物的研究具有很重要的意义【5 9 1 。分子生物学检测技术包括l e c 9 转染细胞系统、 雌激素和雄激素受体报告基因筛选试验、荧光偏振试验等。其中雌激素受体重组 酵母系统方法是雌激素和雄激素受体报告基因筛选试验的一种，是由何世华等人 建立的【5 5 1 ，它与l e c 9 转染细胞系统相似，但不同的是该方法将人类雌激素受体 ( h e r s ) 基因、雌激素应答表达因子质粒和编码伊半乳糖苷酶的l a c z 基因转染入 酵母细胞中，获得雌激素应答单位，该单位可调控l a c z 的基因表达。环境内分泌 干扰物质能够与酵母中的雌激素受体结合，结合复合体激活雌激素应答单位，进 而使l a c z 基因表达，生成伊半乳糖苷酶，此酶与伊d 吡喃半乳糖苷氯酚或其它物 质有变色反应，通过扫描仪分析吸光值来评价受试物的雌激素样活性。 2 2 农药内分泌干扰研究现状 2 2 1 我国农药类环境内分泌干扰物使用现状 2 0 世纪9 0 年代中期以来我国每年农药的生产量已达5 0 万t 以上，使用量也 达到了4 0 万t 以上，并继续上升，其中约8 0 的农药直接进入环境。2 0 0 1 年全国 农药产量达6 4 7 7 万t ，其中除草剂1 1 6 6 万t 。我国虽然先后停止六六六、d d t 、 氯丹、七氯、除草醚等农药在农业的使用，但3 0 年来累积使用六六六约4 9 0 万t ， 比同期国际上多3 倍以上；d d t 约4 0 万t ，占国际用量的2 0 。由于环境内分泌 干扰物具有低剂量效应，一些用量并不多的农药也可能因为低剂量效应，危害具 有相加作用，应予以重视。 农药的大量使用，在陆地和水域都造成了严重污染。我国水环境中的环境内 分泌干扰物污染调查结果表明，某些近海海域中有机氯农药的残留很严重，主要 污染物六六六的浓度总和在1 0 0n g l 左右，五氯酚等烷基酚类物质在所调查的各 种海域和内陆江河中都存在。在官厅水库( 北京主要地面水源之一) 也检出莠去 津，残留浓度为0 6 7 - 3 9 腭l 。1 9 9 0 年对江苏省环境质量调查，一些大用量除草 剂在环境中残留较为突出，主要是除草醚和绿草隆。我国当前几种主要除草剂中 乙草胺、莠去津、甲草胺、草克净、杀草强等均是环境内分泌干扰物，其中乙草 胺更是我国第一大用量除草剂。就世界范围而言，除草剂在农药中所占比重最大， 浙江工jk大学硕士论文8 菊酯类农药手性对映体类雌激素活性差异的研究 2 0 0 3 年销售额占农药销售总额的4 7 左右，而我国只占约1 5 。随着经济的发 展，除草剂在我国的使用将会越来越广泛，我们应该在重视农药危害的同时，侧 重关注除草剂的影响，做到防患于未然。据全国3 0 个省级植保植检站预测【6 l 】，2 0 0 4 年乙草胺使用量略有下降，但仍达1 4 3 0 0t ，莠去津使用量增长了3 2 7 7 。随着全 国农药总产量的持续增加，截止2 0 0 6 年9 月份，农药总产量已达到9 7 5 3 万t ( 按 有效成分计) ，同比增长2 4 3 。其中杀虫剂增长1 7 9 、杀菌剂增长1 3 9 、除 草剂增长3 0 7 。2 0 0 7 年1 月1 日，我国全面禁止对硫磷、甲胺磷、甲基对硫磷、 久效磷、磷胺5 种高毒农药在农业生产中使用。2 0 0 7 年1 1 0 月，全国化学农药 原药( 折1 0 0 ) 累计产量为1 4 0 3 万t ，同比增长2 1 2 8 ，增速较上年同期减缓 o 8 8 个百分点。其中，除草剂的累积产量增速持续加快，而杀虫剂和杀菌剂累计 产量增速继续回落。2 0 0 7 年1 1 0 月全国累计生产杀菌剂1 1 2 3 万t ，同比增长 1 0 6 9 ，增速比上年同期略慢3 5 1 个百分点。除草剂累计产量为4 5 2 万t ，同比 增长3 6 3 3 ，增速较上年同期上升6 9 8 个百分点；杀虫剂累计产量为5 1 1 5 万t ， 同比仅增长了1 0 6 6 ，较上年同期下降5 0 6 个百分点。 2 2 2 环境雌激素类农药 使用农药是现代农业提高作物产量的重要手段之一，但它却是一把双刃剑。 由于长期和大量使用，尤其是农药发展早期人们对它们在自然界中迁移转化规律 以及在生物体中的代谢途径、降解方式、残留蓄积等方面的知识掌握不够，对农 药毒性的认识仅局限于急性毒性方面，而忽视农药慢性毒性的严重性，致使一些 化学性质稳定、难降解的农药如大多数的有机氯农药进入环境，并通过生物富集 和食物链造成了在动植物体内、甚至在人体内的积聚，出现了严重的农药残留问 题。这类农药对环境的污染十分严重，特别是目前大量证据显示它们当中有些具 有雌激素活性，并可能影响实验动物、野生动物甚至人的内分泌功能。 ( 1 ) 已知的具有环境雌激素活性的农药 在已知的内分泌干扰物中，农药占了绝大部分。1 9 9 9 年世界自然基金会的环 境中被报告具有生殖和内分泌干扰作用的化学物质清单报告中，共包含1 2 5 种 内分泌干扰物，其中农药就有8 6 种，占6 8 8 1 6 2 j 。具有环境雌激素活性的农药有 4 0 余种，其中杀虫剂占有较大比例，部分杀菌剂、除草剂也有此作用。 杀虫剂 在杀虫剂中，研究较多的当属滴滴涕( d d t ) ，s h e l b y 等【5 0 运用体内、体外的 浙江工业大学硕士论文9 菊酯类农药手性对映体类雌激素活性差异的研究 联合方法，验证了作为持久性有机污染物( p o p s ) 的d d t 具有雌激素活性。赵炳 顺等【5 3 】用小鼠子宫增重法，检测到国产三氯杀螨醇也具有雌激素活性，竞争结合 雌激素受体所需浓度约为雌二醇的几千倍，这与v o n i e r 等【5 刁的研究结果基本一致。 杀螟硫磷( f e n i t r o t h i o n ) 系有机磷类杀虫剂，化学名称为o ，o 二甲基o ( 4 硝基 间甲苯基) 硫逐磷酸酯。目前对杀螟硫磷的环境雌激素活性的研究较多，b o w a n 等 【6 3 1 的体内实验结果表明杀螟硫磷有抗雄激素作用，单晓英等1 6 4 通过大鼠子宫增重 试验证明农药杀螟硫磷具有环境雌激素活性。此外，陈海燕等【7 1 选用5 种有机磷农 药和4 种拟除虫菊酯农药进行大鼠子宫雌激素受体竞争结合实验和m c f 7 细胞增 殖实验，结果显示氰戊菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯及苄氰菊酯4 种拟除虫菊酯类 农药可以通过激活雌激素受体显示出拟雌激素活性。除了上述，具有环境雌激素 活性证据的杀虫剂还有甲氧滴滴涕、六六六、涕灭威、呋喃丹、西维因、艾氏剂、 狄氏剂、氯丹、林丹、异狄氏剂、硫丹、三氯杀螨醇、七氯、开蓬、灭蚊灵、毒 杀酚、氯杀螨、苯醚菊酯、对硫磷和马拉硫磷【6 5 】。 杀菌剂 在杀菌剂中，对乙烯菌核利的研究较多，b i m b a u m l 6 6 1 通过试验阐述了乙烯菌 核利的环境雌激素活性。农药咪鲜安( p r o e h l o r a z ) ，系咪唑类广谱杀菌剂，单晓英 等 6 7 1 ，李百祥等【删分别通过体内试验及体外实验证明咪鲜安具有雌激素样作用。 具有环境雌激素活性证据的杀菌剂还有苯茵灵、多茵灵、嗪氨灵、邻苯基苯酚和 代森锌【朗。 除草剂 在除草剂中，对利谷隆的研究较多，c o o l 等【7 0 】通过试验阐述了利谷隆的环境 雌激素活性。具有环境雌激素活性证据的除草剂还有阿特拉津、除草醚、杀草强、 甲草胺、比氟禾草灵、氟乐灵、西玛津和嗪草酮1 6 9