（环境工程专业论文）超累积植物龙葵内生菌的分离纯化及其去除Cdlt2gt的实验研究.pdf

超累积 七物龙葵内生菌的分离纯化及l e 上除c d 2 的实验研究 摘要 重金属是一类典型的环境污染物，其对水体环境的污染是近年的公害之一， 且形式十分严峻。在众多治理重金属污染的方法中，生物吸附法是近期研究的最 有效的方法之一。龙葵( s o l a n u mn i g , r u ml ) 为报导的重金属镉超累积植物，它 生长周期短，生物量大；具有较强的抗逆境能力，较强的争光、争水和争肥的能 力；营养生长迅速、繁殖能力强以及在环境条件适宜情况下生物量能够急剧提高 等特点。若对这些特点加利充分利用，有利于弥补现有修复植物生长周期长以及 生物量较小等缺点，因而是较理想的植物修复资源。植物内生菌是指在植物体内 完成其生活史的部分或全部，但又不引起任何病症，并与宿主建立互惠共生关系 的一类微生物。内生菌普遍存在于目前已研究过的各种高等植物中，它们在植物 体内进行生命活动时，能产生多种活性物质，这些物质能对宿主植物的产生巨大 的影响。研究发现，内生菌能促进宿主生长，提高宿主抗逆性，增强宿主竞争力。 内生菌作为生物防治资源、外源基因的载体和新药的来源，在农业、医药、卫生 领域有着巨大的应用潜力。 植物内生菌广泛存在于各种植物中，对宿主的生命活动产生了各种影响。本 研究通过对重金属镉( c a ) 超累积植物龙葵( s o l a r i u mn i g r u ml ) 内生菌优势种进行 分离纯化，并用含c d 2 + 培养基初步筛选，得到7 株有抗性的菌株，分别命名为 s d e 0 1 0 7 ，其中s d e 0 6 在c d 2 + 浓度为8 0m g l 的条件下仍能生长。经鉴定此株 菌属芽孢杆菌属( b a c i l l u ss p ) 。对s d e 0 6 在不同条件下去除c d 2 + 的情况进行研究， 结果表明：正交实验得最佳实验条件为培养时间3 6h ，p h6 0 ，温度3 7 0 c ，初 始c d 2 + 浓度为2 0m g l ，此条件下c d 2 + 的去除率达8 0 5 。优化分离纯化方法后， 共在龙葵体内提取到内生菌5 4 株。 关键词：超累积植物；龙葵；内生菌；去除率；c d 2 + 硕 ：学位论文 a bs t r a c t h e a v ym e t a li sak i n do ft y p i c a le n v i r o n m e n t a lp o l l u t a n t s i ti so n eo ft h eh a z a r d s t ow a t e ro ft h ee n v i r o n m e n ti nr e c e n ty e a r s ，a n dt h ef o r mo fv e r ys e r i o u s a m o n gt h e m e t h o d so ft r e a t m e n tt oh e a v ym e t a lc o n t a m i n a t i o n ，b i o s o r p t i o ni sar e c e n ts t u d yo f t h em o s te f f e c t i v ew a y s o l a n u mn i g r u ml i sr e p o r t e dh y p e r a c c u m u l a t o r i th a ss h o r t g r o w t hc y c l e ，g r e a tb i o m a s s i th a sc h a r a c t e r i s t i c sa sf o l l o w s ：s t r o n ga b i l i t yo f a n t i a d v e r s i t y ，a b s o r b i n gw a t e ra n dn u t r i t i o n ；r a p i dg r o w t h ，s t r o n gr e p r o d u c t i v e c a p a c i t y , a sw e l la si nt h ea p p r o p r i a t ec o n d i t i o n si nc i r c u m s t a n c e si tc a nd r a m a t i c a l l y i n c r e a s et h eb i o m a s s s oi ti sae x c e l l e n tm a t e r i a lf o rp h y t o r e m e d i a t i o n e n d o p h y t i c m i c r o o r g a n i s m s a r em i c r o o r g a n i s m st h a tl i v e i n p l a n t t i s s u e sw i t ho u t d o i n g s u b s t a n t i v eh a r ma n dm e d i a t ev a r i o u ss y m b i o t i c r e c i p r o c i t i e st o t h e i r sh o s t s e n d o p h y t i cm i c r o o r g a n i s m sc a np r o d u c eav a r i e t yo fa c t i v es u b s t a n c e sw h i l el i v i n gi n p l a n t s ，t h e s es u b s t a n c e sc a nb et h eh o s tp l a n t sh a v ea ne n o r m o u si m p a c t t h es t u d y f o u n dt h a te n d o p h y t i cm i c r o o r g a n i s m sc a np r o m o t et h eg r o w t ha n dc o m p e t i t i v e n e s s o ft h eh o s t i na g r i c u l t u r e ，m e d i c i n e ，t h eh e a l t h yf i e l de n d o p h y t eh a sg r e a tp o t e n t i a l a p p l i c a t i o n sa sab i o l o g i c a lc o n t r o lo fr e s o u r c e s ，t h ef o r e i g ng e n ec a r r i e r sa n dt h e s o u r c eo fn e wd r u g s t h ee n d o p h y t i cm i c r o o r g a n i s m sf o u n dw i d e l yi nm a n yk i n d so fp l a n t sm e d i a t e v a r i o u se f f e c t st ot h e i r sh o s t s i nt h i ss t u d y ，7d i f f e r e n td o m i n a n te n d o p h y t e s ( s d e 0 1 t o0 7 ) i s o l a t e df r o mah y p e r a c c u m u l a t o r s o l a n u mn i g r u ml w e r er e s i s t a n tt oc d 什， a n dt h es t r a i ns d e 0 6s u r v i v e de v e ni nt h em e d i u mc o n t a i n i n g8 0m g lo fc d 钟 b a c t e r i as t r a i ns d e 0 6w a si d e n t i f i e da sb a c i l l u ss p t h er e m o v a l so fc d 计o fs d e 0 6 i nd i f f e r e n tc o n d i t i o n sw e r es t u d i e d u n d e rt h eo p t i m a lc o n d i t i o n s ，t h ei n c u b a t i n g t i m ew a s3 6h ，t h es o l u t i o np h 6 0 ，t h et e m p e r a t u r ew a s3 7 。ca n dt h ec d 2 + c o n c e n t r a t i o no fm e d i u mw a s2 0m g l t h eh i g h e s tr e m o v a lr a t ew a su pt o8 0 5 a t t h i sc o n d i t i o n a f t e ro p t i m i z i n gt h es e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o nm e t h o d s ，5 4d i f f e r e n t e n d o p h y t e si s o l a t e df r o ms o l a n u mn i g r u ml k e yw o r d s ：h y p e r a c c u m u l a t o r , s o l a n u mn i g r u ml ；e n d o p h y t e s ；r e m o v a lr a t e ； c d 2 + i i i 超祟积 士物尼葵内乍菌的分离纯化及其去除c d 2 + 的实验研究 插图索引 图2 1龙葵16 图2 2s d e0 1 0 7 2 4 图3 1 芽孢杆菌生长曲线2 9 图3 2培养时间对生长量和去除率的影响3 0 图3 3p h 对生长量和去除率的影响3 1 图3 4 温度对生长量和去除率的影响3 2 图3 5c d 2 + 浓度对生长量和去除率的影响3 3 图4 1不同表面消毒方法对分离效果的影响比较4 l 图4 2 不同分离方法效果比较4 2 v i 硕 ：学位论文 附表索引 表1 1 几种主要膜分离法的特点 1 6 1 一3 表1 2 微生物对某些重金属或类金属离子的转化作用【18 1 一6 表2 1s d e 0 1 0 7 最小抑菌浓度测定结果2 5 表2 2s d e 0 6 形态和生理生化特征2 5 表3 1j 下交试验表头l 9 ( 3 3 ) 2 9 表3 2 不同培养时间的s d e 0 6 生长量和c d 2 + 去除率3 0 表3 3 不同p h 条件下的s d e 0 6 生长量和c d 2 + 去除率3 1 表3 4 不同温度条件下的s d e 0 6 生长量和c d 2 + 去除率3 2 表3 5 不同c d 2 + 浓度条件下的s d e 0 6 生长量和c d ”去除率3 3 表3 6 正交试验结果3 4 表4 1 单一消毒剂表面消毒效果3 9 表4 2 复合消毒剂表面消毒效果3 9 表4 3 不同表面消毒方法分离纯化得到的内生菌数量4 0 表4 4 不同分离方法分离纯化得到的内生菌数量4 2 v i i 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的沦文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成 果。除了文中特别加以标注引片j 的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发 表或撰写的成果作品。对本义的研究做出苇要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者日期m 7 年r 月习自 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权 湖南大学町以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复伟0 手段保存和汇编本学位沦文。 本学位沦文属于 1 保密口，在一年解密后适用木授权书。 2 不保密团。 ( 请在以上相应方框内打”) 作者签名： 导师签名： 黧习搿莩昌 硕 学位论艾 第1 章绪论 重金属是一类典型的环境污染物，其对水体环境的污染是近年的公害之一， 且形式十分严峻。在众多治理重会属污染的方法中，生物吸附法是近期研究的 最有效的方法之一【p 4 1 。龙葵( s o l a n u mn i g r u ml ) 为报导的重金属镉超累积植物， 它生长周期短，生物量大，具有较强的抗逆境能力，较强的争光、争水和争肥的 能力，营养生长迅速、繁殖能力强以及在环境条件适宜情况下生物量能够急剧提 高等特点，若对这些特点加利充分利用，有利于弥补现有修复植物生长周期长以 及生物量较小等缺点，因而是较理想的植物修复资源【5 】。植物内生菌是指在植物 体内完成其生活史的部分或全部，但又不引起任何病症，并与宿主建立互惠共生 关系的一类微生物。内生菌普遍存在于目前己研究过的各种高等植物中，它们在 植物体内进行生命活动时，能产生多种活性物质，这些物质能对宿主植物的产生 巨大的影响。研究发现，内生菌能促进宿主生长，提高宿主抗逆性，增强宿主竞 争力1 6 】。内生菌作为生物防治资源、外源基因的载体和新药的来源，在农业、医 药、卫生领域有着巨大的应用潜力【7 】。 1 1 重金属c d 2 + 污染的治理现状 镉是一种毒性很大的重金属，其化合物也大都属毒性物质，因此被认为是一 种危险的环境污染物。镉( c d ) 与铅、汞、d d t 和多氯联苯并称为对环境污染最 危险的5 种物质【8 】。极微量的镉就可对人体造成伤害，它通过食物链富集，具有 稳定、积累和不易消除的特点，可对人体产生慢性中毒，主要积累在肝、肾和骨 骼之中，使肾脏等器官发生病变，甚至使人疼痛而死【9 】，其毒理作用主要通过两 种方式：一是置换酶活性中心的必需金属；二是与酶分子中的咪哇基、疏基、按 基、氨基、肚基等功能基团相互作用，从而改变有机体内许多酶与结构蛋白质的 活性在福中毒事件中，既有急性中毒，患者由恶心、呕吐或肌肉疼痛到死亡；也 有慢性中毒，肾功能严重受损、骨骼疼痛等。因此，如何控制和减轻锡污染对环 境和人类健康造成的危害是现在我们所面临的一个日益突出的问题【10 1 。含镉废水 的来源包括金属矿山的采选，冶炼，医药，陶瓷，无机颜料制造，电镀，纺织印 染及某些照相废液等。含镉废水的处理方法较多，根据镉离子的含量及镉存在形 态的不同，所采用的处理方法也不同。目前常用的方法有三大类：化学法、物理 化学法和生物法l l 。 超累积植物庀甍内乍荫的分离纯化及j e 上除c d 2 的实验研究 1 1 1 化学法 现在国内外工业上大规模处理镉污染采用化学沉淀法处理含镉废水的应用较 多，这也是处理含镉废水的一种主要方法，特别适合于镉离子浓度较高的水体中 镉的去除。 1 1 1 1 中和沉淀法 在碱性条件下，镉离子可与o h 。发生反应生成难溶于水的、稳定的氢氧化物。 此方法能除去废水中大部分镉离子，但是此法有一些缺点：反应速度较慢、处理 后的沉渣容易造成二次污染等。因此，这个方法还需要进一步的研究改进【1 2 】。 1 1 1 2 硫化物沉淀法 金属硫化物的溶度积般比金属氢氧化物的溶度积小得多。如c d ( o h ) 2 溶度 积为2 2 1 0 。4 ，而c d s 溶度积则为7 9 1 0 讲。因此，使用硫化物沉淀法处理含 镉的废水比使用中和沉淀法处理含镉的废水的效率更高，尤其在含镉废水经过氢 氧化物沉淀法处理后仍不能达到排放标准时，可以采用硫化物沉淀法来处理上述 不达标的废水。硫化物沉淀法的优点是：去除重金属效率高，沉淀物体积小，而 且便于处理和回收金属。但是，硫化剂的价格昂贵，而且可能产生h 2 s 气体污染 环境，所以此法在工业上难以广泛应用。 1 1 1 3 铁氧体法 f e s 0 4 可使镉等重金属离子形成铁氧体晶体而沉淀析出。铁氧体即使堆存， 因其难溶于水，也不会造成二次污染。此法与其他净化废水的方法相比最大的优 点是无废渣产生，避免了二次污染，且能在常温下进行。该法面临的最主要的问 题是含镉铁氧体固体如何解决。 1 1 2 物理化学法 1 1 2 1 离子交换法 离子交换法是一种借助离子交换剂上的和水中的离子进行交换反应而去除水 中镉离子等有毒有害离子的方法。在工业用水处理中，离子交换法占有很重要的 地位，用以制取软水或纯水。用离子交换法处理含镉废水，处理后，镉离子留在 了交换树脂上，而原本交换树脂上的离子被交换到处理过的废水中。因此，此法 处理含镉废水可以回收镉离子。镉离子选择性树脂种类很多，常用的树脂有阳、 阴离子交换树脂等。离子交换法具有去除率高、可浓缩回收有用物质、设备简单、 操作容易控制等优点；这个方法的缺点是：对预处理要求高、树脂再生频繁，容 易氧化失效或被污染，因此操作费用很高，且再生液的处理有时也是一个难题。 若能针对这些缺陷来改善离子交换树脂的性能，那么此种方法的应用前景十分广 顺l ：学位论文 泛【8 】。 1 1 2 2 物理化学吸附法 固体表面的分子或原子因受力不均而具有剩余的表面能，当某些物质碰撞物 体表面时，受到这些不平衡力的吸引而停留在固体表面上，这就是吸附。在污水 处理中，物理化学吸附法用来去除水中的难以生化处理的微量污染物。采用物理 化学吸附法去除废水中的镉，可用的吸附剂有壳聚糖【13 1 、矿渣【14 1 、硅藻土【1 5 1 等。 吸附法的优点是：原理简单，处理效率高。但是，吸附法处理含隔废水的控制条 件比较多，如z 吸附剂的用量、p h 、吸附时问等。这些要求都会增加实际中吸附 处理的操作难度。 1 1 2 3 膜分离法 膜分离法是利用特殊的薄膜对液体中的某些成分进行选择性透过的方法的总 称。溶剂透过膜的过程称为渗透，溶质透过膜的过程称为渗析。常用的膜分离方 法有电渗析、反渗透、超滤，其次是自然渗析和液膜技术等。 膜分离的作用机理往往用膜孔径的大小为模型来解释，实质上，它是由分离 物之间的作用引起的，同膜传质过程的物理化学条件，以及膜与分离物质间的作 用有关。根据膜的种类、功能和过程推动力的不同，各种膜分离方法的特征和它 们之间的区别如表1 1 所示。 表1 1 几种主要膜分离法的特点【1 6 1 t a b l e1 1s e v e r a lm a j o rc h a r a c t e r i s t i c so fm e m b r a n es e p a r a t i o nt e c h n o l o g y 超累积植物坨葵内牛菌的分离纯化及j c 上除c d 2 的实验研究 膜技术是一种新型分离技术，它既能处理废水，同时又能回收重金属离子， 因而在众多重金属废水处理技术中得到了广泛的研究和关注。近年来，膜分离技 术发展很快，在水和污水处理、化工、医疗、生化等领域得到大量应用。由于其 具有能耗低、分离过程中物质不发生相变、分离效果好、操作简便、无化学副作 用、无二次污染、分离产物易于回收等优点，成为回收废水中重金属离子的种 很有前途的方法。但是就目前而言，膜技术大规模应用还受到以下几个方面的影 响：一是作为一种迅速发展起来的新型分离技术，膜分离过程本身仍存在许多技 术问题有待解决，诸如高分离因子及高渗透通量膜的制备，高稳定性、污染易清 洗膜组件的研制等；二是某些方面的研究工作做的不够，也使该技术研究结果与 实际应用之间还存在一定的差距，离工业应用更有一定距离；三是由于膜的污染， 需要经常清洗等处理，使得该技术的应用受到一定影响；最后，膜组件由自制向 标准化的转变，膜价格的降低。性能的提高等有待解决的问题都制约了膜技术的 实际应用。如果这几个方面的问题能有效的解决，则膜技术在分离领域将会发挥 重要的作用【17 1 。 1 1 - 3 生物修复 生物修复( b i o r e m e d i a t i o n ) 是指利用生物的生命代i 身 活动减少存在于环境的 有毒有害物质的浓度或使其完全无害化，从而使污染了的环境能够部分或完全恢 复到原初状态的过程。生化处理技术是借助植物或微生物的絮凝、吸收、积累、 富集等作用去除废水中重金属的方法，包括微生物吸附、微生物絮凝、微生物代 谢、植物吸收等方法。 生物修复的产生尽管只有3 0 多年的历史，但其发展势头是其他修复技术无可 比拟的。与传统或现代的物理、化学修复方法相比，生物修复技术具有以下优点： ( 1 ) 生物修复可以现场进行，节省了很多治理费用。其费用只是传统物理、化学方 法的3 0 5 0 ；( 2 ) 环境影响小。生物修复只是一个自然过程的强化，其最终产 物是二氧化碳、水和脂肪酸等，不会形成二次污染或导致污染污染的转移，可以 永久性的消除污染物的长期隐患；( 3 ) 最大限度地降低污染物的浓度。生物修复技 术可以将污染物的产六浓度降到最低；( 4 ) 在其他技术难以使用的场地，如受污染 土壤位于建筑物或公路下面不能挖掘搬出时，可以采用就地生物修复技术，因而 生物修复技术的应用范围有其独到的优势；( 5 ) 生物修复的技术可以同时处理受污 染的土壤和地下水。此外，生物修复技术与其他处理技术结合使用，可以处理复 合污染。 当然，和所有处理技术一样，生物修复技术也有其局限性：( 1 ) 耗时长。生物 修复的机理在于生命体的新陈代谢，生物特别是套戥动植物的生长繁殖需经过一 定的生命周期j 能完成其代谢活动，因此需要花费较长的时间；( 2 ) 条件苛刻。生 硕i 学位论义 物修复是一种科技含量高的处理方法，其运作必须符合污染场地的特殊条件，生 物的代谢活动容易受环境条件变化的影响；( 3 ) 并非所有进入环境的污染物都能被 生物利用。污染物的低生物有效性、难利用性以及难降解性常常使生物修复不能 那个进行；( 4 ) 特定的生物只能吸收、利用、降解、转化特定类型的化学物质，状 态稍有变化的化合物就可能不被同一种生物酶破坏【1 8 】。 按照用于生物处理技术的材料可分为植物材料处理法和微生物材料处理法。 1 1 3 1 植物 用来修复镉污染的植物包括藻类和高等植物界的一些植物，如水生的植物、 野生的草以及栽培的作物等。如：海藻植物p a d i n as p 可对c d 2 + 在短时间内完成 吸附作用【伸】；水生植物凤眼莲在长期供给低浓度c d 2 + 的条件下具有较高的生物聚 积能力，能够将体内有害物质定向转移到老叶中，然后通过叶片或其他器官的衰 老脱落而去除【2 0 】；天竺葵对c d 也有很好的富集效果【2 1 1 。国外的一些学者不仅用 生长中的植物来吸附c d ”，还尝试用某些植物的废弃部分如枯叶来吸附c d 2 + ，效 果也很好【2 引。 1 1 3 2 微生物 近年来，环境重金属污染的微生物修复与检测技术受到了国内外专家学者到 广泛关注。微生物室环境中一类重要到资源，其具有种类繁多、分布广、表面积 巨大、带点、繁殖快和代谢旺盛等特点，在生长代谢过程中不断向体外分泌小分 子有机酸、无机酸和大分子物质，并伴随有死亡解体。微生物本身及其产生到各 种物质广泛参与水体、土壤、矿渣和沉积物等环境中的物理、化学和生物化学反 应，改变坏境粘土矿物表面到物理化学性质、分解矿物或形成新矿物等等，进而 影响诸多元素到迁移转化，在重金属污染环境中，微生物种群结构、生理代i 身 会 产生各种变化以响应重金属的胁迫，这些信息可用于重金属生物有效的检测；微 生物又可以通过对重金属到吸附富集、氧化还原、成矿沉淀、淋滤、协同植物吸 收等作用修复环境重金属污染【23 1 。 微生物可以通过多种直接或间接作用影响环境中到重金属的活性1 2 4 】，如微生 物可以通过电性吸附或专性吸附直接将重金属离子富集于细胞表面，降低重金属 离子在环境中到生物有效性；微生物的氧化还原作用可以改变变价重金属离子到 价态，降低重金属在环境中的毒性；成矿沉淀作用固定重金属离子，淋滤作用滤 除污染环境中的重会属；改变环境中重金属的形态及其在固液体系中到分配，促 进超累积植物对重会属离子到吸收。合理利用微生物的这些作用，可以有效的进 行环境重金属污染的生物修复【2 3 25 1 。 环境中重会属离子到长期存在是自然界中形成了一些特殊微生物，他们对有 毒重金属离子具有抗性，可以使金属离子发生转化。对微生物而言，这是一种很 超累积植物尼葵内乍菌的分离纯化股j c 太除c d 2 + 的实验研究 好到解毒作用，对坏境而言，则是一种很好到修复作用。汞、钱、锡、硒、砷等 金属或类金属离子都能在微生物作用下通过氧化还原作用而失去毒性。表1 2 是 微生物对某些金属或类金属离子到转化作用。 表1 2 微生物对某些重金属或类金属离子的转化作用【1 8 】 t a b l e1 2t h et r a n s l a t i o no fm i c r o o r g a n i s mf o rc e r t a i nm e t a l l i ca n dm e t a l l o i di o n 微生物吸附主要是生物体细胞壁表面得一些具有金属络合、配位能力到基团 起作用，如羧基、羟基等基团。这些基团通过与吸附到重金属离子形成离子键或 共价键来达到吸附重金属离子到目的。与此同时，重金属也可能被胞外分泌物或 细胞壁到腔洞捕获而沉积。由于微生物吸附与微生物到新陈代谢作用无关，因此 将细胞杀死后，经过一定到处理，使其具有一定到粒度、硬度及稳定性，以便于 贮存、运输和实际应用；微生物积累主要是利用生物新陈代谢作用产生到能量， 通过单价或者二价离子到转移系统把重金属离子输送到细胞内部。由于有细胞内 到累积，微生物累积到去除效果可能比单纯的微生物吸附效果好。但是，由于环 境中要去除的重金属大多有毒有害，抑制生物的活性，甚至使其中毒死亡，并且 生物的新陈代谢作用受温度、p h 、能源等诸多隐私到影响，因此微生物累积在实 际应用中受到很大到限制。 1 微生物吸附法 可以利用某些微生物体本身的化学结构及成分特性，吸附溶于水中的会属离 子，通过固液两相分离来去除水溶液中金属离子。其作为一种新兴的处理技术， 与传统方法相比具有的优点：( 1 ) 原料来源丰富，品种多，成本低；( 2 ) 设备简单， 硕 学位论义 易操作，投资小，运行费用低；( 3 ) 吸附量大，处理效率高；( 4 ) 在低浓度下金属可 以被选择性地去除；( 5 ) p h 值和温度范围宽：( 6 ) 可有效地回收一些贵重会属。在 后处理方面，用一般的化学方法就可以解吸生物量上吸附的金属离子。且解吸后 的生物量可再次吸附重金属。生物吸附技术在处理重会属污染和回收贵重金属方 面有着广阔的前景，深入进行这方面的研究，具有较好的经济价值和社会效益。 许多研究表明生物吸附剂具有高选择性，快速有效地分离废水中的特殊亲缘 性金属。尤其当废水中金属污染浓度存10 10 0 0 p p m 时，此时传统的物理化学方 法相当耗资，而廉价的微生物则有从稀溶液中分离它们的能力，通常能将它们浓 缩几千倍或更多，随着一些金属价值的增加及环境污染的日趋严重，开发利用微 生物对金属的回收和分离的能力将是不可避免的【2 引。 2 微生物絮凝法 生物絮凝法是利用微生物或微生物产生的代谢物进行絮凝沉淀的一种除污方 法。由于许多微生物具有一定的线性结构，有的表面具有较高的电荷和较强的亲 水性或疏水性，能与颗粒通过各种作用( 比如离子键、吸附等) 相结合，如同 高分子聚合物一样起着絮凝剂的作用。 生物絮凝法的开发虽然不到2 0 年，却已发现有多种微生物具有较好的絮凝 功能，如霉菌、细菌、放线菌和酵母菌等，其中多种微生物可以用于重金属处理。 生物絮凝法具有其它絮凝法所无法比拟的优点，例如安全无毒、絮凝效率高和絮 凝物易于分离等，此外还可通过遗传工程，驯化或构造出具有特殊功能的菌株， 因此生物絮凝法有着广阔的发展前景【2 7 】。 3 微生物代谢法 微生物法处理重金属的作用机理是利用硫酸盐还原菌( s u l f a t er e d u c i n g b a c t e r i a ，s r b ) 为主的厌氧微生物，将处于高价位的重金属离子还原为低价位 的重会属离子并利用s r b 菌代谢产生的s 2 - 与重金属离子反应生成难溶的硫化物 沉淀。这一代谢反应过程是微生物去除重金属离子的主导过程，同时利用生物吸 附和絮凝作用，使废水中重金属得以有效去除。利用以s r b 菌为主的厌氧微生 物菌群能够有效去除废水中的重金属，投资及运行费用低，产泥少，操作简单。 但含高浓度重金属的废水( 重金属离子浓度 2 0 0 0m g l ) 对微生物毒性大，应 用此法有一定局限性1 2 7j 。 1 2 超累积植物 1 2 1 超累积植物简介 超累积植物2 8 1 ( h y p e m c c u m u l a t o r ) 是一种可在植物体内超量积累重金属并 能将其大量转运到地上部分的特殊植物，这类植物对重金属的积累量超过一般植 超祟积植物龙葵内牛荫的分离纯化及j t2 除c d 2 的实验研究 物lo o 倍以上，而且地上部分的积累量超出了地下部分的积累。超累积植物富集 重金属并不影响其正常生理活动【2 引。由于超富集植物这种对重金属特殊的积累性 质，使其在进化、遗传、生理、生化以及生物地球化学和环境污染生态学等领域 具有重要的研究和应用价值，逐步成为各个学科的研究热点。特别是在环境科学 领域，利用超富集植物对重金属污染土壤、水体进行修复治理的技术正成为环境 治理的一项新兴的、最具前景的技术。 1 2 2 重金属污染的植物修复 1 2 2 1 植物修复概况 重金属污染修复的严重性和普遍性，早已引起了国内外广泛关注。近年来， 有关重金属污染修复问题的研究已经成为当今农业，生态和环境领域研究的重要 内容。国内外的专家学者针对重金属的污染修复进行了研究，但是用物理的或是 化学的方法不但有破坏土壤结构和肥力的可能，而且费用较高。而利用植物的累 积去除重金属被认为是一种有效的修复方法【3 0 】。其核心任务就是利用植物一微生 物系统原位治理污染环境，也就是植物修复( p h y t o r e m e d i a t i o n ) 【3 l 3 2 1 。 目前，全世界已经发现许多对重金属具有超累积功能的植物 3 3 3 5 1 ，如：a s 超富集植物蜈蚣草( p t e r i sv i t t a t a ) 3 6 】、z n 超累积植物东南景天( s e d u m a l f r e d i i ) 37 1 、a s 超累积植物大叶井口边草( p t e r i s n e r v o s a ) 【38 1 、m n 超累积植物商陆 ( p 办y f d 口c c 以以c f 疗d s 口) 3 9 】以及c d 超累积植物宝山堇菜( v i o l ab a o s h a n e n s i s ) 【4 0 】 等，苎麻【4 1 1 、月季4 2 1 、油菜f 4 3 1 等植物对c d 也有很好的富集作用。 植物修复是以植物耐受和累积某些或某种污染物为基础，利用自然生长或遗 传培养的植物清除环境中污染物的技术| 4 4 1 。在重金属污染治理中植物修复具有不 可替代的优势，并以其治理过程的原位性、治理成本低廉性、管理与操作的简易 性以及环境美学的兼容性受到人们的重视【4 引。 但用于植物修复的植物不仅要求地上部分对重金属的累积量要高，而且要求 植物的生物量要大。如何提高植物的累积量以及促进植物的生长成了研究的焦点。 用于植物修复的超富集植物通常需要具有如下特点【4 6 】：( 1 ) 在重金属重污染或弱污 染土壤上，都有很强的吸收富集能力；( 2 ) 吸收的重金属元素可大量迁移至地上部 分9 ( 3 ) 地上部分能耐受和积累高含量的重会属；( 4 ) 生长速度快，生长周期短，生 物产量高；( 5 ) 能反复种植、多次收割；( 6 ) 具有发达的根系组织；( 7 ) 具有抗虫、 抗病能力；( 8 ) 最好能同时积累几种金属【47 1 。 超累积植物富集重金属的过程包括诸多的环节和控制位点【4 8 】：( 1 ) 跨根细胞质 膜运输；( 2 ) 根皮层细胞中横向运输；( 3 ) 从根系的中柱薄壁细胞装载到木质部导管； ( 4 ) 木质部长途运输；( 5 ) 从木质部卸载到叶细胞；( 6 ) 跨叶细胞的液泡膜运输。 顾l j 学位论文 1 2 2 1 植物修复存在的问题及展望 由于植物修复技术绿色环保，社会生态综合效益良好，易为公众所接受，尤 其是治理费用比传统技术低一至几个数量级，对重会属污染的治理成效具有永久 性因此，植物修复概念提出后很快成为环境领域的世界性前沿热点研究课题， 普遍认为植物修复技术将成为环保领域的朝阳产业然而，由于该项技术起步时 间不长，重金属污染的植物修复方面仍存在一些不足，主要表现在以下几个方面 【49 5 0 j ：( 1 ) 目前大部分超累积植物植株矮小，生物量低，生长缓慢且生长周期长， 因而修复效率和速率低，不易进行大规模商业化运作；( 2 ) 一种植物通常只能耐受 或吸收一种或两种重金属元素，对土壤中其他浓度较高的重金属则表现出某些中 毒症状，从而限制了植物修复技术在重金属复合污染土壤治理中的应用；( 3 ) 植物 是活的有机体，壤的治理及应用。因此对土壤肥力、水分、温度等等都有在基础 理论、修复机理及技术方面，还需进行大量研究。 植物修复的近期研究工作主要集中于以下几个方面：( 1 ) 寻找、筛选自然界中 累积、超累积植物，经过培育驯化以满足实际应用需要；( 2 ) 深化应用基础理论研 究，如植物对重金属的超量吸收与积累及其解毒机理、根际作用及根际微生物群 落的生态学和生理学特征、根际土壤环境条件对重金属的生物有效性制约机理等 一系列基础理论问题有待深入研究，以指导基因工程技术、根际土壤处理和调控 技术、合理耕作技术的应用；( 3 ) 应用转基因技术，提高植物修复效率使其实用化， 将自然界中超累积植物耐重金属相关的基因移植到生物量大、生长速率快的植物 中去，寻找基因工程中特异的启动子，以指导与重金属吸收相关的基因在植物的 特定部位表达，使重会属富集在植物的某一部位( 如植物的地上部位) ；( 4 ) 与传 统的修复技术相结合，如：通过改变土壤的微生物环境，向土壤中施用螯合物等 措施来提高植物对重金属的吸收效率：( 5 ) 植物修复的后续处理，当重金属富集到 植物后，如何和处理含重金属的植物并回收重金属也是今后需要研究的重点；( 6 ) 增加田问试验的次数，以往的研究结论多数是由实验室人工实验得出的，而大田 生态环境较实验室条件更为复杂，所以，目前实验室的研究成果还暂时不能应用 于大田 s l l 。 1 3 植物内生茵 1 3 1 植物内生菌定义 关于植物内生菌和内生关系的定义和用法较为混乱，目前在学术界仍有很多 争论和分歧52 1 。最早的内生菌的提出，可以追溯到l8 3 3 年，人们发现从小麦叶 片可长出一种性质不明的锈状物，将它形象的称为o u t g r o w s 。经过进一步的研究， 到l8 4 6 年l e v e i l l e 确定这种o u t g r o w s 是真菌的一种结构，即现在所说的锈菌夏 超累积植物尼葵内牛葡的分离纯化及j c 去除c d 2 。的实验研究 孢子。真菌在产生症状前久己经生在植物体内，于是，人们提出了内生菌的概念， 这个概念最初针对病原菌( p a t h o g e n ) ，而现在的含义与以前完全不同，比较普遍 使用的概念是：植物内生菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健 康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌，被感染的宿主植物( 至少是暂时) 不表现出外在病症，可通过组织学方法或从严格表面消毒f 53 j 的植物组织中分离或 从植物组织内直接扩增出微生物d n a 的方法来证明其内生。即我们可把植物内 生菌理解为植物组织内的正常菌群，它们不仅包括了互惠共利的( m u t u a l i s t i c ) 和 中性的( n e u t r a l ) 内共生微生物，也包括了那些潜伏在宿主体内的病原微生物1 5 4 。 内生菌在植物体内广泛存在，从藻类、苔藓、蕨类、裸子植物和被子植物中均己 分离得到了内生菌，其分布于植物的根、茎、叶、花、果实和种子等器官组织的 细胞或细胞间隙中【5 引。对于一种植物而占从中可分离到的内生真菌通常为数种至 数十种，甚至多达数百种【5 6 一。 1 3 2 植物内生菌研究进展 植物与内生菌呈互利共生关系：一方面，植物为内生菌提供光合产物和矿物 质；另一方面，内生菌此生代谢到代谢物，具有刺激植物的生长发育和提高宿主 植物对生物胁迫或非生物胁迫抵抗能力的作用1 5 8 1 内生菌不仅能够参与植物次生 代谢及成分的转化合成，而且还能够独立产生丰富到次生代谢物，是天然产物到 来源。这些代谢产物有很多是应用前景广阔到新型生物活性物质。目前陆地动植 物药用资源同渐减少，生物多样性受到破话到形势下，加强对微生物多样性到研 究，并加以开发利用，具有良好到前景和丌发利用价值。 植物内生菌能产生多种全新的活性物质，作为生物防治资源、外源基因的载 体和新药的来源，在农业、医药卫生领域有着巨大的应用潜力。据研究报道，个 别“感染”内生菌的宿主植物往往具有生长快、抗逆境、抗病害、抗动物危害等 优势，比未“感染”植株更具有生存竞争力。这种差异的物质基础是内生菌所产 生的丰富多样的次生代谢产物。随着人们对微生物资源的不断开发，微生物研究 领域的不断扩展，微生物研究方法的不断创新和改进，内生菌的研究越来越受到 科研工作者的重视。虽然经过几十年的研究，但是目前植物内生菌的研究仍处于 起步阶段，人们对于内生菌还知之甚少，对内生菌的开发和应用刚刚展开，现已 成为国内外学者的研究热点。近年来的研究表明很多植物的内生菌是新属或者新 种，目前对于植物内生菌的歼发和研究主要集中在热带、亚热带和温带地区，大 多数植物的内生菌还没有得到丌发和应用。因此植物内生菌是宝贵的菌种资源库， 有待于进一步的开发和更多的学者深入的研究【5 9 】。 1 3 2 1 内生菌产活性物质的应用 内生菌其自身合成至0 抗生素、极速、酶抑制剂、诱导物等多种活性物质通过 硕l ：学位论文 诱导胁迫宿主植物合成到萜类、生物碱、皂苷、分类和多炔类等次生代谢物1 6 0 1 ， 这些次生代谢物事具有生物活性的，这也是现代学者研究的热点之一。 19 9 3 年美国蒙大拿州立大学的s t r o b e l 小组首次从短叶红豆杉( t a x u s b r e v i f o l i a ) 中分离得到一株能合成抗癌物质紫杉醇的内生真菌，证明内生菌具有 合成与宿主植物相同或相似的活性成分的能力【6 。这一发现掀起了一场从药用植 物中分离内生菌的热潮，并利用植物内生菌进行发酵生产得到了某些重要的天然 药物，为解决某些药用植物生长缓慢、资源紧缺等引起的药源嚼乏和生态破坏问 题提供了新的思路。随着对微生物与植物关系的研究日益深入，对微生物次生代 谢产物的研究趋向活跃。从微生物作用的药用植物中获得生物活性物质，己成为 行之有效的途径。近年来，科学工作者先后从数十种药用植物中分离得到了多种 内生菌，并从这些内生菌的培养物中得到了与宿主植物相同或相似的活性成分。 植物内生菌影响活性成分产生和积累的途径主要有两种：一是内生菌自身产生药 用植物活性成分：二是内生菌促进药用植物产生活性成分。许多研究表明 6 2 - 6 5 】 内生菌能够产生多种全新的生物活性物质。其中有很多对严重威胁人类健康的疾 病有着神奇的疗效。因此，对于植物内生菌的研究和开发对医药卫生领域有重大 的现实意义。 1 内生菌代谢物的抗癌作用 从内生菌发酵液中得到的第一个抗肿瘤活性成分是紫杉醇，属菇类化合物。 后来研究者们又相继从其他内生菌发酵产物中得到了生物碱类、黄酮类、苯丙素 类、幽体类等抗肿瘤活性成分。 2 内生菌产生抗菌活性物质 植物内生菌中存在大量具有抗菌活性的菌株，从中发现抗菌活性新物质的几 率较高【66 6 7 】。如雷公藤中分离得到的内生菌，经体外试验发现能够减少致炎物质 的分泌，抑制外周血管单核细胞的增殖，可防治类风湿性疾病【68 1 ；云南美登木共 生放线菌发酵产生的苯丙素化合物也表现出了很好的抗菌活性【6 9 1 。随着对具有抗 炎、抗菌作用药用植物内生菌研究的深入，药用植物内生菌可能会成为未来筛选 新型抗生素的重要资源。同时，某些内生菌对病原菌所产生的抑制作用也为研制 农业生物菌剂、解决化学农药残留问题提供了良好的途径和方法。 3 内生菌产生其他活性物质 除了上述内生菌能够产生抗肿瘤、抗炎抗菌活性物质外，迄今还发现少数内 生菌也可以产生其他活性成分，例如：胰岛素类似物、免疫抑制物等”列。 1 3 2 2 内生菌对宿主植物的直接促进作用 一些研究结果表明，植物内生细菌在增加植株株高、干重、提高根茎重量以 及增强植株生长势等方面均有明显的作用，感染内生菌的植物一般具有比未感染 超累积 i i i 物尼葵内牛葡的分离纯化及j c 上除