（环境工程专业论文）酵母基微生物絮凝剂性能及作用机制研究.pdf

重庆大学硕士学位论文 中文摘要 摘要 本文以酿酒酵母作为微生物絮凝剂产生菌，通过菌种纯培养、富集培养以及 絮凝活性测试，筛选出生长稳定且具有较高絮凝活性的菌落作为研究对象，并对 其絮凝性能、物质组成以及絮凝剂机理进行了分析研究。 微生物絮凝剂絮凝性能研究表明，最佳培养时间为3 4 日；絮凝时间在3 0 m i n 左右；在5 0 m l 的反应体系中，当絮凝剂的投加量为2 - 一4 m l 范围内时，絮凝率最高 可达到8 8 4 ；添加c a c l 2 能有效提升絮凝活性；当原水p n 值在7 , - , 1 0 范围内，絮 凝剂对水体有好的去除效果；在3 0 8 0 的水浴中加热后，仍具有较高的絮凝活 性，显示出该微生物絮凝剂具有较好的热稳定性。 絮凝剂对实际生活污水的絮凝试验表明，该絮凝剂能部分去除水样中的悬浮 物，絮凝率为6 2 4 ；同时微生物絮凝剂对含c r ( ) 废水具有很好的去除效果， 当初始浓度为l o o m g l 时，在2 0 m l 的废水样品中投加6 m l 的絮凝剂，其去除率达 到了8 2 3 。 微生物絮凝剂组成分析表明，主要元素比为：c ：h ：o ：n ：s 为2 6 2 ：3 8 6 ：1 2 4 ：3 4 ：1 ， 其主体不是糖类但含有部分糖类物质。通过对微生物絮凝剂的电荷影响、结合键 以及其生理学结构这三方面分析了其絮凝作用机理。微生物絮凝剂在中性或弱碱 性反应体系下具有较好的絮凝效果；根据絮凝沉淀物对不同化学试剂的敏感程度 不同，推测出微生物絮凝剂与高岭土之间靠离子键结合，进一步的验证架桥吸附 作用的存在。c a 2 + 的存在极大的增加了絮凝效果，促进了桥联的作用产生。酵母基 微生物絮凝剂的絮凝机理主要是吸附架桥作用。 关键词：微生物絮凝剂，酿酒酵母，絮凝性能，絮凝机理 重庆大学硕士学位论文英文摘要 a b s t r a c t 1 1 1 es a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ei su s e d 鹞am i c r o b i a lf l o c c u l a n tp r o d u c i n gb a c t e r i a a l l i g ha c t i v eb a c t e r i a lc o l o n yo n eh a sb e e ns c r e e n e db yc u l t u r e ，e n r i c h m e n ta n d a c t i v i t i e st e s t 蛾，a n di t sf l o c c u l a t i n gp r o p e r t i e s ，c h e m i c a lc o m p o s i t i o na n df l o c c u l a t i n g m e c h a n i s mw e r er e s e a r c h e d t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t sa r es h o w nt h a tt h eb e s tc u l t u r et i m ei sb e t w e e n3a n d4 d a y s ，a n df l o c c u l a t i n gi s3 0 m i n f o rat e s t i n gs o l u t i o no f5 0 m l ，t h es u i t a b l ea m o u n to f m i c r o b i a lf l o c c l u l a n ti s2 - - 4 m l ，a n df l o c c u l a t i n gr a t i o nc a nb eu pt o8 8 4 c a c l 2c a l l p r o m o t et h ef l o c c u l a t i n ga c t i v i t yo fm b en eb e s tp hv a l u e so fw a t e rs a m p l ei s7 1 0 a c t i v i t yo fm b f w a ss t i l lh i g h e ra f t e rh e a t i n ga t3 0 8 0 i nw a t e r , s om b f p o s s e s s g o o dt h e r m a ls t a b i l i t y m b fc a np a r t i a l l yr e m o v es u s p e n d e dm a t t e ri nd o m e s t i c s e w a g e ，a n dt h e f l o c c u l a t i n gr a t i ow a sa t t a i n e dt o6 2 4 n el l i g l l e s tf l o c c u l a t i n gr a t i oa g a i n s tc r ( ) i nw a s t e w a t e ri s8 2 3 w h e ni t si n i t i a lc o n c e n t r a t i o ni s10 0 r a m e l e m e n t a r ya n a l y s i si n d i c a t e st h a tt h ee l e m e n tp r o p o r t i o no fc ：h ：o ：n ：si nm b fi s 2 6 2 ：3 8 6 ：1 2 4 ：3 4 ：1 w h i c hc o n t a i ns o m ec a r b o h y d r a t e t h ea n a l y s i sr e s u l t so f c h a r g e e f f e c t s ，i o n i cb o n da n dp h y s i o l o g i c a ls t r u c t u r ep r o v e dt h a tm b fh a sg o o df l o c c u l a t i o n w h e nt h ew a t e ri sn e u t r a lo rw e a ka l k a l i n e b e c a u s em b fi ss e n s i t i v et os o m ec h e m i c a l r e a g e m ，i tc a nb et h o u g h tt h a tm b f a n dk a o l i na r ec o n n e c t e db yi o n i cb o n d i ti n d i c t e d t h a tt h e r ei sa d s o r p t i o nb r i d g i n ga c t i o ni nf l o c c u l a t i n gp r o c e s s c 毋a c c e l e r a t e s b r i d g i n g a d s o r p t i o na c t i o n ，a n dp r o m o t e st h ef l o c c u l a t i n ga c t i v i t yo f m b f s ot h ef u n c t i o n a r y m e c h a n i s mo fm b fi sm a i n l ya d s o r p t i o nb r i d g i n ga c t i o n k e y w o r d s ：m i c r o b i a lf l o c c u l a n t , s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ，f l o c c u l a t i n gp r o p e r t y , f l o c c u l a t i o nm e c h a n i s m 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的址 士 学位论文 略型蚴燃删捌豳峰西蝴赴 是我个人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：刹致 导师签名： 签字日期：0 2 d d 7 年6 f 国 赞础_ ” 学位论文使用授权书 本人完全了解重庆大学有关保留、使用学位论文的规定。本人完全同意中 国博士学位论文全文数据库、中国优秀硕士学位论文全文数据库出版章程( 以 下简称“章程) ，愿意将本人的丑士学位论文髓出勃熟碰毽蠲衄麴缓蚴 提交中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社( c n k i ) 在中国博士学位论文全文数 据库、中国优秀硕士学位论文全文数据库以及重庆大学博硕学位论文全文 数据库中全文发表。中国博士学位论文全文数据库、中国优秀硕士学位论 文全文数据库可以以电子、网络及其他数字媒体形式公开出版，并同意编入c n l 【i 中国知识资源总库，在中国博硕士学位论文评价数据库中使用和在互联 网上传播，同意按“章程规定享受相关权益和承担相应义务。本人授权重庆大 学可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文，可以公开论文的全部或部分内 容。 作者签名：司 垫曼： 导师签 备注：审核通过的涉密论文不得签署“授权书一， 该论文属于涉密论文，其密级是，涉密期限至年一月一日。 说明：本声明及授权书! 墼亟装订在提交的学位论文最后一页。 重庆大学硕士学位论文1 绪论 l 绪论 1 1 研究目的和意义 在生活污水和各种工业废水中，常含有不同种类和数量的悬浮体和胶体。如 采矿废水中含有大量无机悬浮体；炼焦煤气废水含有焦油及悬浮体；机械加工废 水中含有油脂及大量固体悬浮物；而造纸、制糖、染料行业和生活污水中则含有 大量的有机微粒【l j 。这些悬浮物、溶胶或有机污染物等，其大小均在1 0 9 - 1 0 。3 m 范 围内，且表面大多带有同性电荷，颗粒间因同性相斥而分散稳定，不易聚集。因 此这些颗粒自动凝聚成大颗粒并从分散介质中沉淀出来的速度很慢。对于上述各 类废水的处理，一般都要先使其中的溶胶和悬浮体脱稳，进而凝聚一絮凝成大颗 粒而沉淀出来，即絮凝法。 絮凝沉降是目前国内外普遍采用的一种既经济又简便的技术，是水处理甚至 给水过程中的重要操作单元。絮凝处理主要是去除水体中的溶胶和悬浮体，包括 无机物和有机物。表观表现即为浊度、色度、c o d 、b o d 等指标。同时也能部分 去除一些溶解性杂质。实践证明，在污水三级处理中，采用絮凝处理方法除磷是 一种有效而经济的方法，此外，絮凝处理过程还可改善污泥的脱水性能。 絮凝即是向待处理水体中加入一定的絮凝剂，使水体中胶体体系在絮凝剂作 用下，相互接触、碰撞脱稳，凝集成一定粒径的聚集体，脱稳的聚集体由于进一 步碰撞、化学粘结、网捕卷扫、共同沉淀等作用而凝集成絮状体( 矾花) ，最终借 助重力作用沉淀，达到固液分离的目的。因此，在絮凝处理过程中，絮凝剂的种 类、性质、品种的好坏四关系到絮凝处理效果的关键因素，是絮凝污染控制技术 的关键部分和核心基础。 传统的絮凝剂包括无机絮凝剂和有机絮凝剂两种。无机的主要是三价铁盐和 三价铝盐，以及碳酸镁、氧化锌、硫酸锌等；有机絮凝剂分人工合成和天然两种。 传统絮凝剂的种类及其化学式如下表所示【2 一 。 虽然传统絮凝剂具有较好的絮凝性能，但其用量大、价格较贵，在生产和使 用过程中会造成二次污染。据文献报道1 4 ，当水中铝含量高于0 2 - - 4 ) 5 m g d m 3 时， 可使鲑鱼致死。铁盐对金属有腐蚀作用，也可造成处理水中带有颜色，且高浓度 的铁对人体健康和生态环境有不利影响。人工合成有机高分子絮凝剂广泛使用源 自2 0 世纪6 0 年代，其中使用较多的是聚丙烯酰胺，但因合成这些聚合物的单体 具有强烈的神经毒性，故其使用收到了限制。由于传统絮凝剂的缺陷，因此人们 开始寻找新型的絮凝剂。于是，上世纪七十年代，微生物絮凝剂应运而生，由于 其易被微生物降解、无毒无害、安全性高、适用范围广，近年来得到了各国学者 重庆大学硕十学位论文 1 绪论 的广泛关注并成为新型絮凝剂研发的热点。 表1 1 传统絮凝剂的种类 t a b l e1 1s p e c i a l so ft r a d i t i o n a lf l o c c u l a n t s 分类名称化学式 1 2 微生物絮凝剂研究进展 1 2 1 微生物絮凝剂及其分类 微生物絮凝剂( m i c r o b i a lf l o c c u l a n t ，简称m b f ) 是天然高分子絮凝剂的重 要种类，它是微生物在特定培养条件下，生长代谢至一定阶段产生的具有絮凝活 性的代谢产物和菌体，是一种高效、安全且能自然降解的新型水处理剂。国外微 生物絮凝剂的商业化生产始于2 9 世纪9 0 年代，因其不存在二次污染，使用方便， 已开始占据絮凝剂部分市场份额。我国对微生物絮凝剂的研究工作起步较晚，但 已经有越来越多的人认识到微生物絮凝剂的开发潜力，积极投入到这方面的工作 中，取得了一定的成绩。 微生物絮凝剂根据其来源、组成及絮凝剂产生菌株有不同的分类方式。根据 组成结构进行分类，可以分为以下四大类1 5 ，6 】： 直接利用微生物细胞的絮凝剂，如某些细菌、霉菌、放线菌和酵母菌，它 们大量存在于土壤、活性污泥和沉积物中； 利用微生物细胞壁成分的絮凝剂，如酵母细胞壁的葡聚糖、甘露聚糖、蛋 白质和n 一乙酞葡萄糖胺等成分均可用作絮凝剂。 利用微生物细胞代谢产物的絮凝剂，微生物细胞分泌到细胞外的代谢产物 主要是细菌的荚膜和粘液质，除水分外，其主要成分为多糖及少量的多肤、蛋白 2 重庆大学硕十学位论文 1 绪论 质、脂类及其复合物，其中的多糖和蛋白质在某种程度上可用作絮凝剂。 利用克隆技术所获得的絮凝剂，这类絮凝剂是利用基因工程技术和现代分 子生物学，把高效絮凝基因转移到便于发酵的菌中，构造高效遗传菌株，克隆絮 凝基因能在多种降解中产出有效的微生物絮凝剂，且具有较强的针对性。 按照来源不同，主要分为两大类： 利用微生物细胞壁提取物的絮凝剂； 利用微生物的细胞及其代谢物的絮凝剂。 根据产生絮凝剂的菌株情况，分为三类： 纯种菌种及其产生的微生物絮凝剂： 混合菌株及其产生的微生物絮凝剂； 基因复合型菌，不仅具有絮凝的功效，还具有降解污染物质的能力。 1 2 2 微生物絮凝剂产生菌 能够分泌絮凝剂和本身具有絮凝性的微生物，都叫做絮凝剂产生菌，就目前 的研究状况来看，已知种类有霉菌、细菌、放线菌、酵母菌等，从这些微生物中 分离出的絮凝剂不仅可以用于处理废水和改进活性污泥的沉降性能，还能用在微 生物发酵工业中进行微生物细胞核产物的分离。表1 2 列出了部分已见报道的絮凝 剂产生菌1 1 , 7 , 8 】。 1 2 3 微生物絮凝剂的制备方法及提取 微生物絮凝剂的制备一般可以利用生物技术，通过细菌、真菌等微生物发酵、 抽提、精炼而成，由于微生物絮凝剂的化学成分主要是多聚糖和蛋白质以及一些 金属离子，因此可借鉴提取多聚糖和蛋白质的方法。根据絮凝剂的结构不同，最 终要求的纯度不同，其提取方主要有以下三种【1 0 , 1 1 ： 凝胶电泳法：将微生物的培养物过滤，用6 m o l l 的h c i 将滤液p h 调到7 0 ， 离心分离沉淀，取沉淀物加0 5 m o l l 的n a o h 溶解，离心分离，取沉淀用1 ：1 的 氯仿和甲醇混合液提取，之后离心，用0 1 m o f l 盐酸将沉淀溶解，再加6 m o l l 的 n a o h 溶液调p h 至7 0 ，离心后用乙酸盐缓冲液( ( o 0 1 m o l l ，p h 为4 0 ) 溶解沉 淀物。最后用d e a e 琼脂凝胶柱( a 5 0 ) 色谱和琼脂糖凝胶柱( g 2 0 0 ) 色谱分离 提纯，可用获得的纯品进行化学分析 9 1 。 溶剂提取法：用丙酮提取可获得微生物絮凝剂的粗制剂。将细菌培养物过 滤，取滤液，用丙酮以1 ：1 的比例提取，然后离心。取沉淀物用5 0 的丙酮洗，之 后冷冻干燥，就可得到絮凝剂的粗制剂，粗制剂可用于试验室的絮凝能力研究试 验和工业用途。 碱提取法：用n a o h 溶液从活性污泥中提取微生物絮凝剂的方法如下：将经驯 化的活性污泥静置，用水洗污泥3 次；加入n a o h 溶液，慢速搅拌数小时。离心 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 后取上清液，加6 0 乙醇，放置在冰箱中4 c 下过夜；离心后去上清液，加6 0 乙醇；离心后去上清液，加9 0 丙酮，离心后去上清液。加乙醚，离心后去上清 液；将沉积物重新溶于少量蒸馏水中，在2 3 天内透析数次。在5 0 。c 下减压浓缩， 并冷冻干燥成粉状，得到精制絮凝剂。 表1 2 一些能产生生物絮凝剂的微生物 ! 垒垒! 曼! ：兰塑! 里翌q 盟型墅兰! 垒i 堕里垫里翌至堂垒i q ! ! 塑曼旦! 型 a l c a l i g e n e s 产碱杆菌属 m e t h y l o b a c t e r i u m 甲基菌 a l c a l i g e n e s c u p i d u s 壳产碱杆菌m o n a s c u s红曲霉属 a l c a l i g e n e s c u p u l u s 协腹产碱杆菌 m o n a s c u s a n k a 安卡红曲霉 a n a b a e n o p s i s s p 项圈藻属 m y c o b a c t e r i u m 分枝杆菌属 a s p e r g i l l u s 曲霉属 m y c o b a c t e r i u m p h l e i 草分枝杆菌 a s p e r g i l l u s o c h r a c e u s 赭( 棕) 曲霉 n o c a r d i a 诺卡氏菌属 a s p e r g i l l u s p a r a s i t i c u s 寄生曲霉n o c a r d i a a m a r a e诺卡氏菌群 a s p e r g i l l u s s o c h r a c e l l s 赫曲霉n o c a r d i a c a l c a r e a石灰壤诺卡氏菌 a s p e r g i l l u s s o j a c e 酱曲霉n o c a r d i a r e s t r i c t a限定( 椿象) 诺卡氏菌 b a c i l l u s芽孢杆菌属n o c a r d i a r h o d n i i昆虫( 红色) 诺卡氏菌 b r e v i b a c t e r i u m 短杆菌属p a e c i l o m y c e s 拟青霉属 b r e v i b a c t e r i u m i n s e c t i 嗜虫短杆菌p h o r i m i d i u m s p 席藻属 o h i l i u m 棕腐真菌 丝状蓝藻 衣藻属 卷霉属 斯驼氏卷霉 棒状杆菌属 丛霉属 正青霉属 假单胞菌属 铜绿假单胞菌 粪假单胞菌 荧光假单胞菌 斯氏假单胞菌 产碱假单胞菌 红平红球菌 粟酒裂殖酵母 f l a v o b a c t e r i u m s p 黄杆菌属 s a c c h a r o m y c e s 糖酵母属 鱼2 塑丝! 丝垫墨星型堡丝型塑塑垫垫里 堕塑壁堡 4 一一一一一 一 一 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 1 2 4 微生物絮凝剂的空间结构研究概况 生物絮凝剂从组成上看是属于生物分子系列结构的复杂物质，主要含多糖、 糖蛋白、纤维素、d n a 、蛋白质及脂肪等。近年来，国内外的研究者借助各种技 术和手段对多钟絮凝剂的组成和结构进行了表征。1 9 8 5 年，h t a k a g i 等人【1 2 j 研究 得出生物絮凝剂p f l 0 1 的主要成份是半乳糖胺。k u r a n e 于从r e r y t h r o p o l i s s - i 培养 液种分离到了一种脂类絮凝剂【l 引，发现该分子种含有葡萄糖单霉菌酸酯( g m ) 、 海藻糖单霉菌酸酯( t m ) 、海藻糖二霉菌酸酯( t d m ) 三种组分。霉菌酸碳链长 度从c 3 2 到c 4 0 不等，其中以c 3 4 、c 3 6 和c 3 8 居多。j n a k a m u r a 等对酱油曲酶 产生的絮凝剂进行分离纯化和化学分析，研究结果表明，分离的聚合物具有聚氨 基乙糖和蛋白质的化学特征。邓述波等1 1 4 l 研制的m b f a 9 主要是由中性糖和已糖醛 酸组成，其中多糖的组成为中性糖的4 7 4 、已糖醛酸1 9 1 、氨基酸2 7 4 ，分 子量为2 5 9 4 1 0 6 ，分子中含有c o o 一。胡筱敏i l5 j 报道m b f 9 主要分子量超过 2 0 0 万，是线性高分子，含1 9 1 糖醛酸、2 7 4 氨基酸和4 7 4 中性糖。陈欢等【1 6 】 采用气相色谱和红外光谱分析得出微生物絮凝剂s c 0 6 是由葡萄糖、甘露糖和葡萄 糖醛酸组成，其比例约为5 ：3 ：1 。华南理工大学成文、胡勇有【1 7 】通过研究微生物絮 凝剂m b f 7 、m b f 8 、m b f 2 1 、m b f 2 6 检测到其主要成份都是多糖，并且m b f 8 ， m b f 2 1 和m b f 2 6 的相对分子量分别为1 0 4 7 x 1 0 5 ，1 4 7 9 x 1 0 5 ，1 0 5 4 x 1 0 5 ，而m b f 7 是由1 4 7 9 x 1 0 5 ，4 1 7 x 1 0 5 ，3 1 0 x 1 0 5 ，2 7 2 x 1 0 5 这四个相对分子量段的物质组成的。 已知的微生物絮凝剂的微观立体结构主要有两种：纤维状。从 n o c a r d i a a m a r a e 提取的絮凝剂的蛋白质中含有7 5 的甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸， 由于这样的特殊结构，该絮凝剂可以形成丝绸一样的纤维，是絮凝体形成过程中 的颗粒间的联结物【l 引。球状。从曲霉a s p e r g i l l u s s o j a c 中获得的絮凝剂中有三种 成分：一种是聚已糖胺，一种是蛋白质，一种是2 葡糖酮酸【l9 1 。2 葡糖酮酸的作 用是维持絮凝剂成球形，一旦丧失2 葡糖酮酸成分后，絮凝剂的微观结构就发生 变化，而且絮凝行为模式也由非离子型絮凝剂的絮凝模式转为阳离子型絮凝剂的 絮凝模式。絮凝剂的空间结构受絮凝剂化学成分的影响，絮凝的模式与微观形状 有关。 从化学本质上来说，微生物絮凝剂主要是微生物代谢产生的各种多糖类【2 0 - 2 6 1 ， 这类多聚糖中有些是由单一糖单体组成，有些是由多种糖单体构成的杂多聚糖， 还有些是蛋白质( 或多肽) ，或者是有蛋白质( 或多肽) 的参与。另外，一些絮凝 剂中还含有无机金属离子，如c a 2 + ，m 矿+ ，a r ，和f e ”等，但并非细菌合成的多 糖均具有絮凝活性，研究表明，在p s e u s d o m o n a s p 絮凝过程中只有1 0 的多糖发 挥了作用【l 刎。生物絮凝剂的破坏对微生物的生长有一定的促进作用，这可能是因 为游离细胞与培养液中营养悟接触面积增加的缘故。这种现象说明，絮凝剂真正 5 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 的生理意义并不在于使微生物产生絮凝，而是在于构成微生物的多糖荚膜，微生 物的絮凝性也许是一种伴生性状。 有关微生物絮凝剂的化学结构的研究方法，归纳起来大致有三种，即“因子破 坏法”、化学分析法、再形成法。 “因子破坏法”，即测定纤维素酶、蛋白酶( 如链酶蛋白酶) 、金属阳离子螯 合剂( 如e d t a ) 和加热等处理对微生物絮凝剂絮凝能力的破坏，以判断絮凝剂的 化学组成。例如，e d t a 引起絮凝能力的下降，说明二价金属离子对絮凝剂的絮凝 能力有贡献；加热和蛋白酶造成的絮凝能力不足，说明蛋白质是絮凝剂的构成之 一，纤维素酶等造成的絮凝能力的破坏，说明多糖在絮凝剂中的存在 2 0 2 引。 化学分析法，能够有效的证明微生物絮凝剂的具体生化组成，包括多糖的 单体成分、蛋白质的氨基酸构成等。 “再形成法”，是将与絮凝剂形成有关的成分分别提取出来，再把它们加在一 起，如果可以形成絮凝物，絮凝剂的组成便得到证实。例如，先用e d t a 将金属 离子去除，再添加金属离子，观察是否会恢复絮凝能力，如果恢复，那么金属离 子的作用便得到充分的证实【2 0 】。 同时，絮凝剂所带的基团对絮凝剂的性质也起着很大的作用。不同的基团， 其极性、亲水性、电荷的性质及电荷的中和能力对胶体颗粒的吸附和反应都不相 同。一些特殊基团由于在絮凝剂中充当颗粒物质的吸附部位，或维持一定的空间 结构，对絮凝活性有很大影响。 1 2 5 微生物絮凝剂的絮凝条件 微生物絮凝剂毕竟是由微生物在特定培养条件下生长代谢至一定阶段所产生 的具有絮凝活性的一种物质，因此它的产生及絮凝效果的好坏肯定会受到微生物 生长环境及外界众多因素的影响。 影响微生物絮凝剂产出的因素 微生物絮凝剂产生菌的培养条件及影响因素因菌种的不同而不同，这些影响 因素大体包括：培养基的成分、培养基的p h 值、培养温度、通气量、培养时间、 搅拌速率等。 培养基的成分：培养基的营养成分有碳源、氮源、无机离子、水、生长因子及 其它物质，不同微生物絮凝剂产生菌对培养基中不同营养成分的要求是不一样的， 即使是同一种成份，不同产生菌的要求也是不一样的。例如，产生n o c 1 的红平 红球菌以葡萄糖、果糖、山梨糖醇等水溶性碳源较好，而用非水溶性碳源如橄榄 油则活性下降；而寄生曲霉产生絮凝剂的晟适碳源为蔗糖、葡萄糖，最适氮源为 硝酸钠。目前对培养基的研究焦点主要集中在降低培养基的成本上。如余荣升【2 9 】 利用处理后的黄豆豆汁作为微生物活性菌m b f 1 生长的主要碳源和氮源，能够部 6 重庆大学硕士学位论文1 绪论 分替代价格较高的酵母膏及蛋白胨从而降低絮凝剂的成本。 培养基的初始p h 值：培养基的初始p h 值可影响絮凝剂产生菌的生长和絮凝 剂的分泌，调节好合适的培养基初始p h ，使微生物开始生长良好，同时通过自身 的调节，使其生长的环境p h 保持在某一最适值，这时，微生物分泌絮凝剂旺盛。 任何絮凝产生菌都存在产絮凝剂的最适p h ，但不同絮凝剂产生菌的最适产絮凝剂 p h 值是不同的，如：r e r y t h r o p o l i s 3 0 j 在碱胜环境中育睡合成更多的絮凝剂，产生絮 凝剂的最适p h 值在8 0 9 5 。菌产絮凝剂最佳p h 值和生长最适p h 值略有差异， 如：一直控制p h 值为6 0 时，a s o j a e 菌丝生长旺盛，但根本不表现出絮凝活性， 而c x e r o s i s 只有在酸性条件下才能产生絮凝剂。 培养温度：培养温度对菌的生长和絮凝剂的产生都有明显的影响，虽然不同 的微生物絮凝剂产生菌的最适培养温度不同，但一般的最适温度范围在2 5 3 5 之 间。温度太低，菌体生长速度变漫，温度太高，会使菌体产生的絮凝剂活性阳氏。 如：对r e r y t h r o p o l i s 的研究表明，在3 0 时絮凝剂的产量要高于2 5 和3 7 时的 产量，a s o j a e 合成絮凝剂的最适培养温度范围为3 0 , - 4 0 。绝大部分报道的细菌 产絮凝剂的最适温度为3 0 。 通气量：通气量对絮凝剂的产生有一定影响，一般认为通气量会影响絮凝剂 产生菌的生长及所分泌的絮凝剂性能，并且在不同的生长期通气量是不同的，应 该通过试验来确定不同时期的最佳通气量。通气量不应该太大或太小，否则都会 影响到絮凝剂的产量，尤其是在培养后期更要注意减少通气量，如果曝气速率过 大会使絮凝活性大大降低。 其他：如离子种类和离子强度对微生物絮凝活性也有明显影响，其中二价阳 离子都或多或少的对絮凝有促进作用。此外接种量、种龄、培养时间、遗传因素 和工艺流程等都会对絮凝剂的产生有影响。 影响絮凝活性的因素 微生物絮凝剂除了会受到上述因素的影响外，它的絮凝活性还会受到所处反 应体系中外界一些因素的影响，这些因素主要要有： 被絮凝物质的性质：有些研究者认为，大部分微生物絮凝剂是通过化学桥联 作用将被絮凝物质集聚在一起，所以其絮凝作用通常是广普的，絮凝效果易受微 生物个体和颗粒表面特性的影响。被絮凝的物质包括各种细菌、放线菌和真菌的 培养物、活性污泥、微囊藻、泥浆、土壤固体悬浮液、底泥、煤灰、血细胞、活 性碳粉末、硅胶粉末、氧化铝、高岭土和纤维素粉等，对它们均有较好的絮凝性。 絮凝剂的分子结构及其分子量：絮凝剂的分子结构对絮凝效果有较大的影响。 一般来说，有线性结构的大分子絮凝剂的絮凝效果较好，如果分子结构是交联或 支链结构，其絮凝效果就差。另外，微生物絮凝剂相对分子量的大小对絮凝剂的 7 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 絮凝活性至关重要，相对分子量大，吸附位点多，携带的电荷就多，中和能力也 强，架桥作用和卷扫作用明显。目前已分离纯化的微生物絮凝剂都是多聚糖和蛋 白质之类的生物大分子，分子量大都在万级至十万级，也有极少数达百万级。分 子量的减少会降低絮凝剂的活性，例如絮凝剂的蛋白质成分降解后，分子量减小， 絮凝活性明显降低1 3 1 1 。 絮凝剂的投加量：絮凝剂都有一个最佳投加量，投加量过大或过小都会影响 到微生物絮凝剂的絮凝效果。有的报道认为，絮凝剂的最佳投加量是固体颗粒表 面吸附大分子化合物达到饱和时的一半吸附量，因为此时大分子在固体颗粒上桥 联的机率最大。 p h 值：微生物絮凝剂的絮凝活性受外界环境p h 值的影响较明显。因为环境 的p h 值会直接影响到微生物絮凝剂表面的z e t a 电位，使酸碱度发生变化从而影 响到微生物絮凝剂及悬浮颗粒表面的带电状态和中和电荷的能力，进而影响到它 们之间的靠近和吸附能力。 温度：温度对某些微生物絮凝剂活性的影响，主要是因为高温可以使某些生 物高分子物质的空间结构发生改变，从而导致变性( 如蛋白质) ，使它的某些活性 基团不再与悬浮颗粒结合，最终导致絮凝活性的下降。但也有一些微生物絮凝剂 对温度并不敏感，如p a e c i l m y c e s s p i 1 产生的絮凝剂，它的絮凝活性就不随温度而 变化，因为该絮凝剂主要是由多聚糖构成的，其表现絮凝活性的主要部分是多聚 糖结构( 如聚己糖胺) ，它在高温处理后，结构不发生改变，仍能与胶体颗粒结合， 因此活性不随温度而改变p 2 。 金属离子：在微生物絮凝剂发生絮凝作用时，加入一定浓度的金属离子可以 加强微生物絮凝剂分子与悬浮颗粒物之间的离子键结合从而促进絮凝作用，即加 强了其架桥作用和中和作用。大多数阳离子如c a 2 + 、m n 2 + 、m 孑+ 、a 1 3 + 、f e 2 + 、n 矿 都可以作为助絮凝剂来提高絮凝活性。但是加入的金属离子浓度也不是越高越好， 太高的金属离子浓度会使大量的金属离子占据微生物絮凝剂分子的活性位置，把 絮凝剂分子与悬浮颗粒物隔开而抑制絮凝活性。 此外，微生物絮凝剂的絮凝性能还与絮凝体系中被处理物质的浓度、胶体粒 子的表面结构、细胞表面的疏水性、分离方法和工艺设计等有关。 1 2 6 微生物絮凝剂的絮凝作用机理 由于对微生物絮凝机理的研究对微生物的开发应用有着重要的意义，因此国 内外对絮凝剂机理提出了很多假说：电中和作用，带正电荷的生物大分子絮凝 剂与污水中带负电荷的胶体粒子结合，中和胶体表面的负电荷，减少静电斥力， 从而使胶体间发生碰撞并凝聚；架桥学说，由于高分子絮凝剂的线状或分枝状 长链结构，且其表面的化学基团能与胶体产生特殊的吸附作用，形成“胶粒一高分 8 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 子胶粒”的絮凝体，起到架桥连接作用；b u t t e r f i d l d 粘质假说；f r i e d m a n 菌 体纤维素行为学说；离散细胞和伸展桥键之间的三维基质模型假说，离散细胞和 伸展桥键之间可形成三维基质模型，在静止条件下沉降；病毒学假说，由 s t r a n t f o r d 提出，通过研究酵母絮凝机理认为外源凝集素可能从酵母的一种感染剂 产生，而非酵母本身产生。 目前，研究较多是由菌体自身引起的絮凝，即所谓胞壁絮凝，尤其是对酵母 菌的絮凝机理的研究【2 7 2 8 】。酵母菌产生絮凝的解释主要有三种模型：l l a ( 1 e c t i n - l i k e a d h e s i o n ) 模型、阴离子基团架桥模型( c a l c i u m b r i d g i n g ) 、表面电荷 中和模型。表面电荷中和模型由于不能解释某些酵母菌絮凝时需要钙离子这个情 况，因而未被大多数接受。而阴离子基团架桥模型则不能说明甘露糖和它的衍生 物对絮凝的抑制作用。与其他两种模型相比，l l a 模型得到比较普遍的认同。 l l a 模型最初是由t a y l o r 和o r t o n 提出，他们认为酵母的絮凝跟一种类似于 拌刀豆球蛋白酶的物质有关，这种物质被钙离子活化后，分子构象会变成活性大 的构型，这种构型有利于它跟酵母菌的细胞壁上的甘露聚糖结合，从而引起絮凝。 m i k i 等人通过研究表明，酵母菌絮凝是由于其分泌一种类似外源凝集素类的蛋白 质，是细胞壁上的a 甘露聚糖相互结合，并提出了l l a 絮凝模型图。k i h n 等人认 为通过向酵母菌中加入甘露糖的衍生物，会使甘露糖衍生物与细胞壁上的a 甘露 聚糖结合，阻止细胞壁上的a 甘露聚糖相互结合，最后导致絮凝效果大幅度降低。 1 2 7 微生物絮凝剂的应用 随着工业和科学技术的发展，种类不同、用途各异的各种絮凝剂越来越广泛 地应用于废水处理和给水工程领域，获得了极好的效果。其中微生物絮凝剂作为 一类新型絮凝剂其广谱絮凝活性、可生物降解性和应用安全性显示了其在给水工 程、废水处理、食品加工和发酵工业等方面的应用前景。下面着重介绍微生物絮 凝剂在废水处理中的应用。 给水处理：陶力生认为【3 3 】在给水处理中，原水经微生物氧化分解后，在后 续的加药混凝中，矾耗量减少，去除色度的能力增强，形成的絮凝颗粒大且密实， 沉降快。这些现象与微生物分泌絮凝剂有关。 红薯淀粉废水的处理：红薯淀粉废水含有水溶性淀粉、可溶性蛋白质、多 糖、氨基酸、维生素以及无机盐等多种有机和无机物质，其c o d 值高达5 0 0 0 m g l ， 处理难度大。最近南开大学李琳等【3 4 】将胶质芽抱杆菌和酿酒酵母产生的絮凝作用 处理红薯淀粉废水。其絮凝率高达9 7 ，红薯淀粉废水的c o d 去除率达到6 5 。 酱油废水的处理：曹建平等【3 5 j 用微生物絮凝剂m 2 5 应用于酱油废水的处理 中，取得了较好的处理效果。m 2 5 处理酱油废水所形成的絮体具有沉降快的特性， 在投量为6 0 m g l 时，沉淀时间仅为1 0 m i n 时，絮凝率和c o d 去除率分别达6 8 5 9 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 和7 4 7 ，且在p h 值5 9 的范围内处理效果较稳定。目前的废水处理技术虽能降 低b o d ，但是对可溶性色素溶液的脱色效果不佳，使用微生物絮凝剂处理可以达 到理想的效果。 乳化废水的处理：废乳化液是一种较难处理的工业废水，且排放量较大， 严重污染环境。南昌大学杨圣云等【3 6 1 用从活性污泥中分离筛选出一株絮凝活性较 高的絮凝剂产生菌h x c s 1 ，采用其产生的絮凝剂处理南昌市客车厂乳化液废水。 絮凝试验的结果表明：絮凝菌h x c s 1 所产絮凝剂对废乳化液c o d c r 有很好的。去 除效果，去除率为8 7 8 4 。 应用于活性污泥：在浓缩后的污泥中加入r e r y t h r o p o l i s 培养物和1 的钙离 子溶液，可使污泥体积在2 0 m i n 内浓缩为原来的9 2 。不少工业废水在采用活性 污泥处理时，形成的活性污泥容易发生膨胀，从而影响处理效率，若添加微生物 絮凝剂，会取得良好的效果。微生物絮凝剂可以改善污泥的沉降性能。活性污泥 处理系统的效率常因污泥沉降性能变差而降低。某些微生物絮凝剂能有效防止污 泥解絮，提高处理系统效率，而不会降低有机物去除率1 3 7 】。 对畜产废水的处理【3 8 】：畜产废水是含有b o d 较高的难处理有机废水，采用 合成有机絮凝剂虽然有较好的效果，但存在二次污染。畜类粪便废水使用n o c 一1 加钙离子处理1 0 r a i n 后，废水的上清液几乎透明，浊度去除率达到9 4 5 。 r f l h r o p o l i s 培养物与一定浓度的钙离子溶液混合后，对该种废水的t o c 去除率 将会更高，同时对总氮也有显著的去除作用。 其他应用：已有的研究表明，微生物絮凝剂可以对包括细菌、真菌、放线 菌以及藻类在内的大多数微生物产生絮凝作用。因此，微生物絮凝剂不仅可以应 用于废水处理，更可以成为发酵上业和食品上业中安全有效的絮凝剂，为取代传 统上艺中的离心和过滤分离细胞提供了可能性。同时，据研究，对含硫、氮的上 业废水的净化作用也十分明显。只是产生这种多糖类微生物絮凝剂的菌株培养过 程较为复杂。 1 3 本论文主要研究内容 微生物絮凝剂有诸多优点，各项研究表明，微生物絮凝剂在微生物发酵工业、 医药工业和废水处理中具有广阔的应用前景。但目前对其研究仍停留在产生菌的 分离、筛选和培养上，自然界中能产生絮凝剂的微生物众多，要找到它们费时费 力，效率较低，增加了絮凝剂产生菌的筛选成本。因此本论文根据前人的研究成 果及实践经验，并结合试验室实际情况，选用酿酒酵母作为微生物絮凝剂产生菌， 通过对酿酒菌种的培养及驯化，综合运用环境微生物学、仪器分析、生物化学、 物理化学及水处理等知识，对酿酒酵母产生的絮凝剂进行絮凝性能评价、物质组 1 0 重庆大学硕士学位论文1 绪论 成以及絮凝剂机理的研究，本论文研究内容如下： 微生物絮凝剂筛选、提取及固化； 微生物絮凝性能评价试验( 絮凝活性测定、p h 值影响试验、絮凝剂投加量、 阳离子影响试验、试验热稳定性研究等) ； 微生物物质组成研究( 通过元素分析法，测定微生物絮凝剂中各主要元素 所占比例) 。 微生物絮凝剂的应用，微生物絮凝剂的絮凝机理探讨。 重庆大学硕士学位论文 2 微生物絮凝剂产生菌的筛选 2 微生物絮凝剂产生菌的筛选 2 1 试验材料及仪器 2 1 1 试验水样 高岭土悬液：称取4 9 高岭土溶于1 l 蒸馏水中，配成0 4 高岭土悬液； 生活废水水样：取至重庆市渝北区王家污水处理站生活污水； 重金属废水水样：模拟c r ( v i ) 离子浓度为l o o m g l 重金属废水样品。 2 1 2 微生物样品来源 酿酒酵母由中国食品发酵工业研究院提供。 2 1 3 培养基成份 基础培养基( 牛肉膏蛋白胨培养基) ：牛肉膏5 o g ，蛋白胨1 0 0 9 ，n a c l 5 0 9 ， 蒸馏水1 0 0 0 m l ，琼脂2 0 0 9 ，p h = 7 0 - 一7 2 。 富集培养基( 葡萄糖培养基) ：葡萄糖2 0 9 ，k h 2 p 0 4 0 2 9 ，k e h p 0 4 0 5 9 ，( n h 4 ) 2 s 0 4 0 2 9 ，n a c l 0 1 9 ，脲0 5 9 ，酵母膏0 5 9 ，m g s 0 4 7 h 2 0 0 2 9 ，水1 0 0 0 m l ，p n = 7 肚7 2 。 2 1 4 使用的设备、仪器 根据试验设计方案和要求，本文使用到的主要设备及仪器如表2 1 所示。 表2 1 试验设备及仪器 ! 垒垒! 曼兰：! 呈臼坚i 仑堡皇! 壁璺璺里垒i 望! 垒! 坚望呈坐 设备及仪器 型号 生产厂家 2 2 微生物絮凝剂产生菌的选择 产生絮凝剂的微生物众多且分布较广，因此，筛选出高效优良的絮凝剂产生 菌具有重要意义。根据以往研究表明，具有絮凝能力的微生物主要有细菌、霉菌、 1 2 重庆大学硕士学位论文2 微生物絮凝剂产生菌的筛选 放线菌、酵母和藻类等。絮凝是酿酒酵母菌重要特性之一，其絮凝现象最早由法 国人l o u i s p a s t e u r 于1 8 7 6 年研究啤酒酵母时发现。一个多世纪以来，酵母的絮凝 特性因其在实际生产中的重要意义而备受关注。s t e w a r t 和r u s s e l l 3 9 1 认为酵母絮凝 是酵母细胞从介质中由悬浮状态聚集成团并快速沉降的现象。啤酒发酵临近结束 时，大量酵母细胞絮凝在一起结块沉下，发酵液因而得到澄清。酵母菌种不同， 生理特性存在差异，絮凝性能也不同。国向云等对酵母菌的絮凝活性研究表明， 酵母菌对高岭土的絮凝率可以达到9 4 5 8 m 。另一方面现阶段的微生物絮凝剂的 研究多集中在微生物絮凝剂产生菌的分离、筛选和培养上，不仅费时费力，而且 菌种的不确定性给后续的研究造成困难。因此本论文选用酿酒酵母作为微生物絮 凝剂产生菌。而现在常用的絮凝剂产生菌筛选方案为：样品采集及预处理一富集 培养一挑选菌落一发酵培养_ 菌种筛选絮凝试验。筛选过程随菌种的不同略有 差异。由于本试验的菌种组成明确，因此采用与常规不同的筛选方案，既：富集 培养_ 筛选絮凝剂产生菌_ 絮凝性能评价。 2 3 菌种的分离及筛选 2 3 1 培养基的制备 培养基是指由人工方法配合而成，专供微生物培养、分离、鉴别、研究和保 存用的混合营养物制品1 4 l j 。因此在对于微生物进行培养时应根据微生物对营养的 要求不同，配置适宜其生长的培养基。对于那些具有较强合成能力的自养微生物， 由于它们能从简单的无机物如二氧化碳和无机盐合成本身需要的糖、脂类、蛋白 质、核酸、维生素等复杂的细胞物质，因此，其培养基可以采用简单的无机物组 成；对于异养微生物而言，它们的合成能力较弱，不能以二氧化碳作为唯一碳源， 因而它们的培养