（农产品加工及贮藏工程专业论文）纤维素酶的制备及玉米秸秆固态发酵生产酒精的研究.pdf

摘要 纤维素是地球上最丰富、来源最广泛的有机物质。由于技术等诸多原因，这一类 宝贵资源，不仅未能得到充分利用，而且有相当大部分还被废弃，成为环境污染物之 一。将纤维原料酶解转化为可发酵的糖，进步用于生产酒精，不仅综合利用了大量 的工农业纤维废料，而且减轻了环境污染，对于可持续发展战略的实施有重大意义。 本试验采用固态发酵技术，利用丰富、价廉的玉米秸秆为原料，摸索了里氏木霉 【w l ( 办f c 加出删n 五p 倒fl ，w 1 ) 适宜的产酶条件，研究了秸杆粉和麦麸用量、料水比、 起始p h 值、发酵温度和发酵时间对该菌株产纤维素酶活力的影响。试验结果表明， 里氏木霉l w l 的适宜发酵条件为：在秸秆：麦麸= 1 ：1 ，料水比为l ：2 的前提条件下， 通过正交实验分析，在培养温度2 8 ，发酵周期为7 2 h ，起始p h 5 5 时产酶活力最高。 在适宜培养条件下，发酵液中羧甲基纤维素酶活为4 6 7 7 0 0 ，u ，滤纸酶活为2 7 1 3 6 3 u 。 研究了里氏木霉l w l 所产纤维素酶的主要酶学性质，结果表明，该纤维素酶的最 适温度5 0 ，最适p h 值为4 8 ；在温度范围3 0 5 0 ，p h 范围4 0 6 o 内有较高 的稳定性；9 0 处理1 5 m i n ，酶粉的c m c 酶活和f p a 酶活保存率分别为6 2 0 9 和 6 0 8 4 ：在模拟动物肠胃p h 值、体温的环境中处理3 0 f n i n ，羧甲基纤维素酶活和滤 纸酶活的保存率分别达到7 9 0 4 和7 6 “；在4 低温无菌条件下保存三个月后， 酶液的c m c 酶活和f p a 酶活保存率分别为8 2 9 3 和7 9 8 9 ；c a 2 + 、k + 、n a + 、m g ”离子 对酶活有激活作用，m n ”、z n ”、c u 离子有抑制作用。 采用正交试验方法对玉米秸秆同步发酵法发酵生产酒精的条件进行了研究。结果 表明在发酵温度3 2 ，发酵4 天，入池p h 值5 o ，酵母菌接种量1 0 8 个n l l ，纤维素 酶用量为3 5 i u g 时发酵酒精度最高，可达4 6 7 。麸皮添加量为5 0 时，对玉米秸秆 发酵生产酒精的促进作用最大。玉米品种对酒精产量无明显影响： 关键词：玉米秸秆；纤维素酶；酒精；固态发酵：同步糖化发酵 c e u u i a s ep r o d u c t i o na n dp r o d u c t i o 吐a l c o h o lf h mc o r ns f r a wt h r o u g hs o i i d s t a t e f e r m e n t a t i o n a u l h o r ：w m 唱j i n g s h a s u p e r v i s o r ：w 如g j i e ，z l l 锄gw e j m a j o r ：a 舻i c u l t l 】障p r o d u c tp m c 船s i n g 锄ds 协f a l g ee n g i n r i n g a b s n m c t c e l l u l o s ei st h em o s ta b m 池n ta n db m a do r g a l l i cm a t e r i a l 洫t 量l ee a r t h n 0 to l l l yl i l e k i l l do f p f e c i o i l sr e s o u r c ei sn o tm a d e 血i lt l s eb u ta l s om o s to f t h e ma 托a b 强d o i 湖蛐d t l l e nb e c 锄eo n eo ft l l e p o l l u t i o nm a t t e r sd ft h ee n v i r o n m e n t a f k ft h ee m 珂m a t i c h y d r o l y s i so fc e l l u l o s i cm a t e r i a l s ，t h e “a i l a b l er c d u c i i l gs u g a rc o u l db eu di n 龇 p r o d u c t i o fe t l l a n o l ；i tw 髂p r o m i s i n gi nt l i ec o m p r e h e i l s i v eu t i l i 动t i o no f t h er 韶i d u ea n d t l l ec o n t r o lo f t h ep o l l u t a n t i nt l l i se x p e r i m e n tc e l i u l a p m d u c t i o nw 勰c a 玎i e do u tb ys o l i ds t a t ef e m i e n t a 矗w i 也 丹枷口如删nr e 删fi j w l t h en m 把r i a lw a sc o ms 打a ww m c hi sn o to i l l v 世l u e n tb 眦a l s o c h e a p t h ee 目b c t so fw h c a tb ma n dc o ms t a l k 枷o ，w a t e rc o n t e n tm t i o ，i i l i t i a lp ho f m e d i 啪，t e m p e r a t u r c ，t i m eo nc e l l u l a s es y n t t l e s i sw e r es t u d i e d t h ef e s u i t ss h o w c dt l l a tt h e 叩t i m 啪c o n d i t i o n so f p d o d u c i i i gc e i l l l l a w e r e ：u n d e rt h ea b o v ec o n d i t i o n so f w h e a tb 豫n 强dc o ms 嘣kf a t i ow a sl ：l iw a 主e rc o i l t e mr a t i ow a s1 ：2 ，t h r o u 窑h 也ea n a l y s i s 硝。 缸t o r s 缸dl e v e l so fo n h o g o n a le x p e r i m e n t ，t i l et e m p e m t i l f cw 雒2 8 ，t l l ei n m a lp hw 船5 5 跗d g m w n7 2 h1 1 1 e a e t i v i t i e so ff p 鹌ei nt l l ef e m e n t e dw a s2 7 1 3 6 3 lt h ea c t i 枷e so f c m c 船ei nt l l ef b m 懈t 酣w a s4 6 7 7 0 呐 e n z y m ep r o p e n i e so ft h ec n l d ee n 珂m e 疳o m 丹f 拍d 如嗍口r p 酊l w lw e r es t i | d i e d t h eo p t i m a lc o n d i t i o i 塔f o re n 巧，m a t i cr e a c t i o n 讨e r e5 0 ，a n dp hv d u ew e r e4 8 ：s h o w 耐a h i g hs 协b i l i 哆a tt e m p 啪t u r e3 0 5 0 ，p h 4 o 6 o ；s t a y e d1 5 m i na t9 0 ，c m c a c o u l d b eh e i d6 2 0 9 ，a n df p 船ec o t l l db eh e l d6 0 _ 8 4 ：s t a y e d3 0 m i na tt h c 即哳m n m 髓tw h i 曲 w a sl i k em ea 1 1 i m a ls t o m a c h ，c m c a s ec o u l db eh e l d7 9 0 4 ，a n df p 船ec o i l l db eh e l d 7 6 4 4 ；s t a y e d3m o m h s 砒4 锄dg e 咖骶ec o n d i t i o n ，c m c a s ec 0 i i l db ch e l d8 2 9 3 ，a n d f p a c o i l l db eh e l d7 9 8 9 ；c a 2 + 、k + 、n a + 、m 9 2 + 、惭t l l ea c 吐v a t o 硌肌dm n 2 + 、2 叠+ 、 c u 矿w e r et 1 1 ei 枷b i t o r so f t l l ee i u m e t h es i m i l l t a 】o u ss a c c l l a d f i c a t i o na n df e 眦e n t a d o nc o n d i t i o i l so ft h e e ( h a n o l p f o d u _ c t i o nb yc o ms 咖w e r ed e t e 肌i i l e di no m l o g o n a le x p e r 妇e n ta n dt h ef o l l o 咖叠s w e r ct h e 叩垃m a ic o n d 砌。璐：f e l l n e n 恤g 帅e r a t u 糟3 2 ，向m e 赫n gp e r i o d4 d ，t h ei n i 6 a 1 p h5 o ，c e l l u i a w e i g h t3 5i u g 锄di n o c u l a t i o no f y e a s tw 嬲1 0 8c e l i m l a tt h eo p 吐m a l c o n m 6 0 n ，m ee t h a ly i e l df e a c h c d4 6 7 w h e l l5 0 w h c a tb r a n 、嬲a d d c di n t ot h e m e d i 砌，也e 础觚o ly i e l dr e a c ht 0 伽em a ) i m u r n 。t h e 谢既yo fc o ms 打a 【wh a dn o 豳c t t ot l l ep r o d u c t i o no f e ( b a 1 l ( e yw o r d s ：c o ms 咖；c c l l u l o ； s o l i d - s t d t ef c 册锄t a d o n ；e t h 咖l ； s i m u l t a n 璐 s c h 嘶f i c a t i o na n d 衔m e n t a t i o n ( s s f ) 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑些盛些盘鲎或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名 互暑哆 签字同期：h f 年f 月哆日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑些盔些盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权扭些盘些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 至季多 导师签名 签字r 期：h r 口红，月少i r签字同期： 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 日目拓年 立 纤维素酶的常 备及噩米秸轩耐态发酵生产酒精的研究 l 引言 随着科学技术的进步和工业的迅猛发展，资源的枯竭和对环保标准要求的逐步提高，迫切需 要开发新的、清诘的可替代能源m ”。纤维素类物质是自然界中数量很大的可再生物质，是生产酒 精的潜在资源，对解决未来能源问题有着巨大的潜力例。我国是农业大国，每年约产生农作物 秸秆7 亿吨，其中稻草秸秆2 3 亿吨，玉米秸秆2 2 亿吨，小麦秸秆l ，2 亿吨，豆类和秋杂粮作物 秸秆1 亿吨，另有花生等秸秆i 亿吨【4j ，但目前利_ h j 率不足2 0 绝大部分农作物秸秆被直接 焚烧，既造成严重的环境污染，义产生了惊人的资源浪费 。7 i 。 洒精是未米的新兴能源之一。作为一种清洁能源酒精有其独特的优越性。因此有“绿色石 油”和“液体黄金”之称，近年来越来越受到各国政府及科学家的注意。研究表明，用酒精代替 或部分替代汽油作为术来的汽午燃料，可以提高燃烧值，改善防爆性能并能保持机器的清洁。 同时从全球碳循环角度出发，由丁酒精燃烧后释放的二氧化碳己在绿色植物纤维资源生长过程中 被消耗，因而减少了人气中二氧化碳的排放，缓和了温室效应。另外，以酒精作为汽车燃料，与 汽油等其它燃料相比，酒精燃烧排放出更少的有毒物质，降低了对地球生态环境的影响，有利于 保护环境p j 。 随着各种高新技术的发展，现代生物工程技术开发出的t 业酶和下程菌，开辟了许多高效节 能污染少的利用途径。其中受到普遍关注和重视的是利用可再生农作物秸秆来生产替代能源燃料 酒精，利用秸秆生产酒精，不仅规模大、利用率高，而且可以变废为宝，保护环境，并缓解日益 紧张的能源危机。 因此，利用廉价而又可再生的农作物秸秆制取酒精，不仅可以锵决人类面临的能源不足、资 源不足。环境污染等闯题，甚至影响产业组织和结构的调整，并带来巨大的经济效益和社会效益 。 1 1 秸秆的化学组份 秸秆主要由纤维质原料构成，其中主要是纤维素( 3 7 4 0 ) 、半纤维素“3 0 3 5 呦和本质 素等成分。 纤维素分子是由葡萄糖苷通过d - l ，4 糖苷键联接起来的链状聚合体。纤维素具有 ( c 6 h l _ 0 5 ) h 2 0 的结构式，其分子量、聚合度根据种类及测定方法的不同有较大的差别。植物纤 维素结构复杂，基本上是由原纤维构成的微纤维束集合而成。原纤维是由1 5 4 0 根有结晶部和 非结晶部构成的纤维分子长链。纤维素的结晶部分是由纤维素分子进行非常整齐规则地折叠排列 而成的a 在结晶部分里，葡萄糖分子的羟基或在分子内部或与分子外部的氢离子相结台，没有游 离的羟基存在，所以纤维素分子具有牢固的结晶构造，酶分子及水分子难以侵入到内部。因此， 纤维素的结晶部分比非结晶部分滩分解得多i i “。 半纤维素是植物纤维原料的另一主要组分，半纤维素是一大类结构不同的多聚糖的统称。在 许多情况下半纤维素分子不是由一个单一的糖苷聚合而成，丽是由2 6 个不同的糖营组成。 在细胞壁中，它位于许多纤维素之间，好像是种充填在纤维素框架中的填充料。半纤维素与纤 维素不同，它很容易被水解。但是由于半纤维素和纤维素交杂在起，所以只有当纤维素也披水 河北农业人学硕十学位论文 解时，、卜纤维素才可能全部水解”“。 木质素是植物界中仅次于纤维素的晟丰富和摄重要的有机高聚物。术质素是一类由苯丙烷单 元通过醚键和碳碳键连接的复杂无定型物。它和半纤维素一起作为细胞问质填充在细胞壁的徽细 纤维之间，加嘲术化组织的细胞壁；它也存在丁细胞间层，把相邻的细胞粘结在一起。木质素和 半纤维素形成牢固的结合层，紧紧地包阐着纤维素。阻碍酶与纤维紊的接触。因此要提高糖化 速度，必须除去木质素、半纤维素的结合层，使纤维素的孔隙增大，提高纤维素与酶接触的有效 比表面积，从而提高糖化速度”。 1 2 纤维素酶研究概况 自1 9 0 6 年s e r i l i e r e 在蜗牛的消化液中发现纤维素酶之后，人们对纤维紊酶的组成性质、作 用方式、培养条件、分离纯化、测定方法、同定化、工业应用等方面作了大量研究，其中以纤维 素转化成葡萄糖作为主要目标。但由于纤维素酶及其作用的底物非常复杂，影响因素繁多，水解 速度缓慢，酶的利用率低，所以实际应用还存在很多困难，酶解效率不高。 纤维素酶很早就被发现。1 8 5 0 年m i f s c h e r l i c h 已经观察到微生物分解纤维素的现象。但纤维 素酶的研究l i ! j j 是从1 9 0 6 年s e i i i i e r e 在蜗牛消化液中发现了分解天然纤维素的酶后才逐渐开始的 。1 9 1 2 年p r i n g s h e i m 由耐热性纤维素细菌分离出纤维素酶。1 9 3 3 年g r s m a f l 分辨出了一种真 菌纤维素酶的两个组分。四、五十年代。以美国陆军n a t i c k 研究发展中心为代表的世界许多研究 机构开始从不同方面对此进行了艰苦而卓有成效的探索；上世纪五十年代，纤维素酶工作转向纤 维素酶本身的性质、作用方式、培养条件、测定方法等研究1 1 “。1 9 5 0 年r e 等人提出了纤维素 酶作用方式的c l c x 酶假说，随后逐步发展完善成为当今占主导地位的c 1 c x 酶学说。1 9 5 8 年， 美国华盛顿大学f u 等人用酶水解非淀粉多糖，以大麦为基础原料喂鸡，从那时起，纤维素酶的 研究在世界许多国家迅速推广，特别在产纤维素酶的微生物选育、培养条件、纤维素酶的性质、 作用方式和测定方法、纤维紊酶的分离、提纯和协同作用方面的研究进展较快。上世纪6 0 7 0 年代，n i s i z a w a h ew o o 等人对绿色木霉( 挣f c d 如m 口v 埘如) 和黑曲霉似印e ，哥f 船嘲弘一的纤维素 酶做了大量的研究，采用色谱、光谱等分离纯化技术，将纤维素酶分成不同组分。并进行了鉴定。 上世纪7 0 8 0 年代开始用诱变等育种手段对产纤维素酶的微生物进行了改造，提高其产酶话性。 m a n d e l s 等人曾用线性加速器的高能电子流处理野生型的本酶孢子悬浮液后又采用复合诱变方法 获得一株高产纤维素酶的菌株。日本协和发酵株式会社的安户饶等人以t h e s e io m 9 4 1 4 为出发菌 株，利用u v 和n r b 诱变、选育出较优的突变株。1 9 7 6 年，s 她n b e l g 和n y s t r 报道了用绿色木 霉生产纤维素酶的发酵条件及中试试验情况”7 ，”i 。上世纪8 0 年代以后。人们开始利用遗传工程 从分子生物学水平对纤维素酶生产菌株进行诱变育种，并对纤维素酶蛋白质的氨基酸序列及其分 离纯化等方面进行了深入细致的研究。目前对纤维素的酶法转化研究最多的是美国、丹麦、前苏 联、日本和芬兰。获德了一些好的纤维素酶生产菌，并以纤维素制糖为主要目标分别建立了中 试工厂。 我国对纤维素酶的研究有几十年的历史，北京、上海、天津、山东、东北、四川和陕西等地 的科学工作者利用诱变、细胞融合等育种手段，筛选出了一些活性较高的纤维索分解菌，并在饲 2 竺丝墨墼竺型鱼墨王鲞壁笪塑查垄壁尘兰塑翌盟塑塑 一一一 丰= l 、卣品f ：业、纤维素制糖、造纸、纺织和“油等方面墩得了一定成果。 1 3 纤维素酶的组成与结构 1 3 1纤维素酶的组成 纤维素酶是一种多组分的复合酶系，现己确定纤维素酶含有三种主要组分”“： ( 1 ) 内切型b 葡聚糖酶( e c3 2 1 4 ) ；也称c x 酶、c m c 酶、e g 。它能水解溶解的纤维素衍生 物，以及膨胀的和部分降解的纤维素，但不能作用于结晶的纤维素。它以随机的形式在纤维素聚 合物内部的非结品区进行切割，对末端键的敏感性比间键小。它的主要产物是纤维糊藕、纤维二 糖和纤维三糖。 ( 2 ) 外切型一d 葡聚糖酶( e c3 2 1 9 1 ) ：也称c 1 酶、纤维二糖水解酶或微晶纤维素酶、c b h 。c l 酶是纤维索酶系中的重要纪分，在天然纤维素的降解过程中起主导作用，它能从纤维素链的非还 原性末端切割，生成可溶的纤维糊精和纤维二耱。 ( 3 ) 纤维二糖酶( e c3 2 1 2 1 ) ：也称c b 或d 葡萄糖苷酶、b g 。它能水解纤维二糖和短链的纤 维寡精生成葡萄糖，对纤维一糖和纤维三藉的水解很快，随着葡萄糖聚合度的增加水解速度下降。 这种酶的专一性比较差。 纤维素酶的每一个组分义由若干弧2 r 分细成，在将天然纤维素水解成葡萄糖的过程中。必须 依靠三种组分的协同作用才能完成。 1 3 2 纤维素酶的结构 大多数纤维素酶都有由一个或多个催化结构域( c a t a i y t i cd o m a i nc d ) 和纤维素结合区 ( c e l l u l o s e b i n d i n g d o m a j n ，c b d ) 组成，中间由一段可辨认的连接肽( 1 j n k e rp c p t i d e 所连接”“，只有 少数微生物和高等植物产生的纤维素酶不具有这类结构域。如tf e e s e ib g 的e g 3 就没有c b d 结构域p ”。通常认为c b d 在离效降解纤维素起到关键的作用，然而t r e c s e i 的c b h l 在没有c b d 的情况下仍具有水解纤维素的活性，同样的现象也在t r s e i 的e g l 的酶解过程中被观察到1 2 4 1 2 ”。 此外，h u m i c o j a 妇o l e n s 的e g 5 和c e i l u l o m o n f j r n l 的c e l l e g 都发现并不具备c b d 结构，但仍 然具有水解酶活性，这些实验证明在有些外切和内切酶中c b d 的结构可能不是必需的口“。 1 4 纤维索酶的来源和应用 1 4 1 纤维素酶的来源 纤维素酶的来源非常广泛。真菌、细菌和放线菌等在一定条件下都能产生纤维素酶，原生动 物、软体动物、昆虫和植物的一些组织等也能产生纤维素酶。 微生物以外的生物生产纤维素酶缺乏大规模应用的实际意义，在生产中采用微生物生产则是 河北收业人学硕+ 学位论文 蛀为方便和有效的方法。不同微生物产生的纤维素酶的组成和催化特性不同：细菌生产的纤维素 酶的活力较低，升多数不能分泌到细胞外；真i 觏牟纤维素酶的能力强，一般都能分泌到菌体外， 井且酶的组分适当，酶之间有强烈的协同作j = i = f ，有的同时能产生木聚糖酶”葡聚搪酶等，对天然 术质纤维索的水解特别重要。 自然界中能产生纤维素酶的微生物很多，包括细菌、放线菌和真菌1 2 。但对纤维素作用较强 的菌多是术霉属( t r j c h o d e r m a ) 、曲霉属( a s p e r g | l l u s ) 、青霉属( p e n i c i l l i u m ) 和枝顶孢霉属 ( a c r e m o n i u m ) 的菌株m ”j ，其中真菌木霉属是迄今所知形成和分泌纤维素酶系成分最全面、活力 最高的一个属删，国内外许多研究人员对此作了很多报道胁3 ”。 在细菌中目前对生产高温纤维素酶的耐热梭状芽胞杆菌( c h 护i d ：f l 脯e m o ，f l ) h 8 j 9 1 和 作为基因工程菌的人肠杆菌( 凸c p r f c 觚? c o 产生纤维素酶研究较多。目前通过基因工程手段， 正在研究开发备种新的生产纤维素酶的菌种。 麻h j 丁纤维素酶规模化生产的菌种士要为绿色术霉( 开缸k 血m 口v 删如) h 。l 、里氏木霉 ( 开缸 d 出册d 柙甜p 叫扎4 3 州和黑曲霉卅即日曙埘瓣”辔盯) 4 m 。 1 4 2 纤维素酶的应用 地球上每年光合作用约产生1 5 0 0 亿吨植物材料，其中5 0 为纤维素。这些植物多聚糖为数 量巨大的真菌和细菌提供能量来源。但这些材料需转换成葡萄糖、乙醇、甲烷等低分子物质才能 被利用。用纤维素酶水解的方法与化学方法相比有许多好处，尤其是在避免环境污染上。纤维素 酶还可广泛应用于食品加工、饲科加工、水果蔬菜加工、酿造工业、服装加丁、制药、造纸、天 然成分提取、纤维废料处理和可再生资源的开发等方面h “。 1 5 固态发酵方式的选择 i 嗣态发酵( s o n ds l a t ef e r m e n t a l i o n ，s s f ) 传统上是指在缺乏自由水的固体颗粒组成的基质上进 行微生物培养和发酵的技术【4 ”。 现代发酵工业主要以液体深层发酵为主，但许多现代生物制品的固态发酵产率比液体深层发 酵高得多，这是因为液体深层发酵产生的大量发酵废水、通气与机械搅拌的高动力能耗成为阻碍 液体深层发酵进一步发展的因素，迫使其向高浓度、高粘度方向发展，而高粘度、高浓度的极限 就是固态发酵。固态发酵的优点有： 1 固态发酵的培养基中水活度很低，大多数细菌和酵母生长不好，而霉菌的生长则不受影响。 2 蛋白属于次级代谢产物。霉菌的次级代谢产物通常是在霉菌进行分化时形成的，液态培养 抑制霉菌分化，所以霉菌固态发酵单位体积的酶产量往往比液态发酵高。 3 固态发酵能耗低，一般不需要搅拌，只需要通入少量低压无菌空气。液态发酵的通气量比 固态发酵大得多，而且进气压力也较高，在9 8 0 6 1 0 4 p a ( 表压) 左右。 4 周态发酵的原料比较粗放，终产物往往是含有多种酶活性的复合酶，很适合做饲料添加剂， 而液态发酵的酶系往往比较单一。 5 固态发酵设备投资少，后处理简单，基本无污染。液态发酵投资大，技术要求高，需要排 4 纤维素酶的制备及玉米秸秆瞄态发酵生产酒精的研究 放人堞r 0 水。 与然，i 嚏卷发酵也并非卜全十美，也存在着一些不足：( 1 ) 机械化样度低， 动强度大：( 2 ) 发 酵水平不稳定，重复性差，不适于大规模生产。 本研究中固体发酵产酶的原料简单粗放且含有足够的碳氮源和无机元素，又舒松适度利于通 气，表面积大特别适合于好气性微生物生长，利用廉价的原料采用固态发酵技术可望有助于进一 步降低纤维素酶的生产成本1 4 9 、5 “。 1 6 酒精发酵工艺 桎以纤维素类物质为原料的酒精生产技术中，其发酵工艺也是个重要环节，研究者在这方 面做了大量的研究工作。总结起来，有如一r 几种： 艺方法：直接发酵法，糖化、发酵二段发酵法， 同时糖化发酵法，固定化细胞发酵法。生产中应用较多的是糖化、发酵二段发酵法和同时糖化发 酵法州。 1 6 1糖化、发酵二段发酵法 先用纤维素酶水解纤维素，酶解后的糖液作为发酵碳源。酒精产物的形成受以下因素限制： 末端产物抑制，菌体细胞浓度以及基质抑制。为了克服酒精产物的抑制，必须不断地将其从发酵 罐中移出，采取的方法有：减压发酵法、快速发酵法、阿尔法拉伐公司的b i o s n i e 法。对细胞进 行循环使用，可以克服细胞浓度的问题。筛选在高糖浓度下存活并能利用高糖的微生物突变株， 以及使菌体分阶段逐步适应高基质浓度可以克服基质抑制。 1 6 2同时糖化发酵法( s s f 法) 纤维素酶对纤维素的酶水解和发酵糖化产生酒精在同一装置内连续进行。这样酶水解产物葡 萄糖有菌体的不断地发酵而被利用，消除了葡萄糖困浓度高对纤维素酶的反馈抑制。在工艺方面 采抖= | 一步发酵，简化了设各，节约能源。缩短了总生产时间，提高了生产效率，但也存在一些抑 制因素，如木糖的抑制作用、糖化和发酵的温度不协调等”“。 纤维素类物质大多含有本质素、半纤维素本质素在原料预处理过程中绝大部分已被除去。但 半纤维素产生的木糖、阿拉伯糖”q 存留在反应液中，当浓度达到5 时，本糖对纤维素酶的抑制 率可达l o 。消除木糖抑制的办法是利用能转化木塘为酒精的菌株。如，假丝酵母、管囊酵母等。 现在研究较多的使用能利用葡萄糖与能利用木糖的菌株混合发酵，与单纯用葡萄糖发酵菌和单纯 用戊糖发酵菌相比，酒精的产量分别提高3 0 3 8 和1 0 3 0 。 在纤维素酶糖化过程中，纤维素酶的最适温度为5 0 左右，而酵母发酵的控制温度是3 7 4 0 ，解决这两个过程温度不协调的方法有：采用耐热酵母i 獬( 如假丝酵母，克劳森氏酵母) ； 进一步选育耐热酵母与普通酵母混合发酵。 1 7 课题研究的意义 我国是一个人口大国，随着经济的发展，能源问题日孺突出另一方面，我国是一个农业大 5 河北农业人学硕士学位论文 国，农作物纤维卜i 脚料如稻杆、麦杆、玉米秸杆等十分丰富，估计每年产越为7 亿吨，这些可再 生资源除少量用于饲料、纺织、造纸等行业外，犬部分被白白浪费掉，甚至造成环境的污染，因 此，对这些资源进行生物转化，实现其生物量的利辩! | 。缓解井解决日益匮乏的能源和环保的压力， 是关系到可持续发展的重大闽题。 目前，制约纤维素酶的应用因素主要是生产成本过高，酶活力比较低。采用秸秆这种自然界 中含量最丰富、虽廉价的可再生资源生产纤维素酶，不但降低了纤维素酶的生产成本，而且为玉 米秸秆的综合利用又提供了一个新的途径缓解了由于秸秆焚烧引起的环境污染等诸多社会问 题。本试验止是基丁对此的考虑，采川简单方便的i 刮态发酵技术，利用廉价的原料麸皮和玉米秸 秆为碳源，摸索了里氏术霉l w l 适宜的产酶条件，旨在得到较高的滤纸酶活和c m c 酶活，降低 纤维素酶的生产成本，为纤维素酶的工业化生产奠定一些试验基础。 利用植物纤维发酵生产酒精已经研究了2 0 多年，国外学者对麦秆、蔗渣、水稻秸秆等进行 了j 泛研究，但对玉米秸秆的研究鲜见报道l ”。7 ”。虽然国内对玉米秸杆的研究较为广泛，但大多 是采用诱变、融合后的菌株或混菌发酵，发酵方法人多采用液态发酵法m “1 。单独利用酿酒酵母 对未经预处理的玉米秸秆进行固态同步发酵的研究未见报道，麸皮及玉米品种对玉米秸秆发酵的 影响也未有人进行，关于玉米青秆发酵的研究也未见进行。基于对上述原因的考虑，本试验对单 独使用酿酒酵母固态同步发酵玉米秸秆生产酒精，麸皮及玉米品种对玉米秸秆发酵的影响，玉米 青秆发酵进行了研究，旨在为玉米秸秆固态同步发酵生产酒精提供一定的理论依据，为进一步扩 人生产奠定一定的基础。 1 8 研究内容 鉴下秸杆发酵酒精的巨人经济效益，及对纤维素分解菌分解纤维素的机理的了解，本研究的 主要内容包括以下几个方面： 1 试验菌株的确定 2 不同因素对产酶的影响及产酶适宜条件的确定 3 粗酶液的酶学性质 4 发酵液的初步纯化 5 玉米秸秆发酵生产酒精工艺 6 秸秆麦麸比例对发酵的影响 7 不同品种玉米秸秆发酵试验 8 青秆发酵试验 6 纤维泰酶的制器及玉米秸手十崩态发酵生p 酒精的研究 1 9 技术路线 i 试验菌株的确定 i 1 确定适宜发酵时间卜 上 试验卤株适宜产酶条件的确定卜 一确定适宜发酵温度 l 止 _ 一确定适宜p h 值l 交 试 4 确定j 司体培养基适宜配比l 验 粗酶液的酶学性质 一一确定培养基适宜料水比 l 发酵液的初步纯化 _ j 正交试验确定适宜发酵条件 j秸秆、麦麸单独发酵试验 玉米秸秆发酵生产酒精试验l一秸秆麦麸比例对发酵的影响 一 不加酶秸秆发酵试验 i 叫不同品种玉米秸秆发酵试验j l i _ 1 青秆发酵试验 i 7 河北农业大学硕士学位论文 2 1 试验材料 2 1 1 原料及菌种来源 2 1 1 1 原料来源 2 材料与方法 玉米秸秆： 先玉3 3 5 ：采于河北农业大学标本园( 如未说明本试验所有玉米稍秆均为此品种) 郑2 2 门7 8 、2 4 4 ，1 7 8 、郑单9 5 8 、邢抗2 、农大1 0 8 、k 2 4 门7 8 ：采于农大一分厂 麦麸：购于保定胜利面粉厂 2 1 1 2 菌种来源 作曲曲种：里氏小霉( 打幽。出，m 。胁“p f ) ，由天津科技人学发酵工程实验室提供 酿酒酵母：丹宝利酿酒活性干酵母，东莞市丹宝利酵母厂出品 2 1 2 培养基 ( 1 ) 菌种保存培养基：葡萄糖马铃薯琼脂( p d a ) 培养基 马铃薯：2 0 0 9 琼脂：2 0 9 ，葡萄糖：2 0 9 ，水：1 0 0 0m l ；将马铃薯去皮，切成小块加水 煮沸l o m i n ，纱布过滤，再加入琼脂和葡萄糖加热融化后，于1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 ( 2 ) 刚果红培养基( 初筛培养基) ：配法参考张宇昊等的配制方法”“ ( 3 ) 固体曲培养基 麦麸：5 9 ，玉米秸秆：5 9 ，l 硫酸铵，0 3 磷酸二氢钾，0 0 5 硫酸镁7 h 2 0 t 加水2 0 m l 该培养基1 2 l 灭菌6 0 m i n 。 玉米秸秆先于7 0 平衡水分2 4 h ，后用组织捣碎机捣碎备用。 ( 4 ) 酵母菌活化培养基( y m ) 葡萄糖1 、酵母膏o 3 、蛋白胨o 5 、麦芽汁0 3 ，自然p h 值。该培养基1 2 l 灭菌2 0 n 妇。 ( 5 ) 发酵培养基 秸秆5 0 9 ，麦麸5 吨，固液比l ：2 ，2 9 硫酸铵，o 6 9 磷酸二氢钾，o 1 9 硫酸镁7 h 2 0 混匀- 2 1 - 3 其它试剂及材料 8 ( 1 ) 3 ，5 二硝基水杨酸试剂( d n s 试剂) ：配法参见大连轻工业学院等编著的食品分析跏 ( 2 ) o 2 m o l ，l p h 4 8h a c - n a a c 缓冲液：配法参见夏玉宇主编的化验员实用手册i 删 ( 3 ) 1 羧甲基纤维素钠( c m c n a ) - 醋酸缓冲液( p h 4 8 ) 取1 9 c m c n a 加入到l o o m l p h 4 8 h a c _ n a a c 缓冲液中即可。 纤维录鲜的制爵及玉米秸野：碡鸯发酵生产酒精的研究 f 4 ) 0 8 5 生理盐水 8 5 9 n a c l 加蒸馏水至1 0 0 0m l ，1 2 1 灭菌1 5 m i n 。 ( 5 ) 1 m m l 标准葡萄糖液 精确称取1 0 5 烘至恒重的无水葡萄糖( a r ) 1 0 0 0g ，咀蒸馏水溶解，定容至1 0 0 0 m l 容量 瓶中制成l m m l 浓度的标准葡萄糖液。 ( 6 ) 中性洗涤剂：配法参见大连轻工业学院等编著的食品分析1 ( 7 ) 其它试剂均为分析纯和化学纯 2 1 4 主要仪器设备 序号 名称 用途 i l r h 一2 5 0 a 型生化培养箱 微生物培养 2 d l c j 2 n 医用型洁净工作台 无菌操作 3 y x q s g 4 6 2 8 0 s i 锈钢，提艇力灭菌锅 湿法灭菌 4 h z q q x 垒温震荡器 酶解反应 5 0 m p 2 0 0 a 型f u 于天平 精确称量 6 o l y m u p u s 强微镜 镜检 7 p b 一2 0 酸度计 测定p h 值 8 t 6 紫外分光光度汁 测定吸光值 9 冰箱 保存菌种和试剂 1 0 b p l l 型托盘天平般称量 i l d z k w c 电干恒温水浴锅 保温 f 2 7 9 一f 型磁力搅拌器 掘匀 1 3 h z q f 仝温震荡培养箱酶解反应 1 4 t d l 8 0 2 b 离心机 离心 1 5 酒精蒸馏设蔷 蒸馏酒精 1 6 酒精比重计 酒精度测定 1 7 d l 1 0 i 一2 电热鼓风干燥箱 千法灭菌 1 8 l d z x 一4 0 型立式电热蒸汽压力消毒器 湿法灭菌 1 9 h q 一6 0 精涡混合器 打散孢子 2 0 d z f 一6 0 5 0 型真守干燥精 真空干燥 2 i l g 一1 0 冷冻干燥帆 真空狰冻干燥 2 2 中空纤维超滤膜组件u i f a p 一5 0 3 超滤 2 3 s h b i i i 循环承式多用真空泵 抽滤 2 4 d s _ i 电动高速组织捣碎机 捣碎秸秆 2 5 lz-l，5螺旋棒汁帆榨汁 2 2 试验方法 2 2 1 玉米秸秆组分的测定 测定方法参照杜甫佑等的实验方法o “。 9 河北农业人学硕 十学位论文 2 2 2 试验菌株的确定 筛选和培育高产的菌株是生产纤维素酶的关键。虽然很多真菌和细菌都能利用纤维素，但是 有的只生产微生物细胞和代谢产物如甲烷等，有的微生物产生的纤维素酶只能水解可溶性纤维素 而不能降解天然纤维素。冈此选择生产菌种应要求它生产的纤维素酶同时具有高活力的c 。和c x 酶能够有效的降解天然纤维素，并且是胞外酶，便于酶的收集。术霉产生的纤维素酶活力往往最 高，粗酶制剂中含有高活力的c l 和c x 酶，酶组分最全，因此以术霉做为首选的研究菌株。 ( 1 ) 菌种活化 菌种于p d a 斜面培养基上3 0 培养7 d 后，放下4 冰箱中备用。 ( 2 ) 孢子悬液的制备 州0 8 5 生理盐水从活化好的p d a 斜面洗p 孢子，川漩涡混合器打散孢子后通过血球记数 扳i 生显微镜f 记数，井调节孢子浓度至3 5 4 1 0 7 个m l 。 ( 3 )试验菌株的一级筛 筛选方法：葡萄糖马铃薯琼脂( p d a ) 平皿培养法 筛选指标：菌丝体生长期 接种量： 孢子浓度3 5 4 x 1 0 2 个，m l 和3 5 4 x1 0 1 个，m l ( 4 )试验菌株的二级筛 筛选方法：刚果红培养基平皿培养法 筛选指标：水解圈大小 接种量：点样法接种孢子 ( 5 ) 试验菌株的三级筛 筛选方法：滤纸酶活法，c m c 酶活法 筛选指标：产酶滔性高低 接种量：孢子浓度i 7 2 1 0 6 个，m l 2 ，2 3 孢子接种与菌丝接种发酵的比较 分别将孢子悬液和菌丝体接入固态发酵培养基中。在2 8 条件下进行发酵，考察这两种不同 的接种方式对纤维素酶形成的影响。 2 2 4 试验菌株产酶活力的测定 2 2 4 1 试验菌株产酶活力的测定的原理 测定酶活力的方法为3 ，5 一二硝基水杨酸比色定糖法。3 ，5 二硝基水杨酸与还原糖共热后被 还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量和反应液的颜色强度里比例关系，利用 比色法可测定样品的含糖量。该方法为半微量测糖法，操作简便，快速，杂质干扰少。 l o 纡绺袭阻的制备及下米种什| 州态发酹生产酒精的研究 2 2 4 2葡萄糖标准曲线的制定 取o 、l 、2 、3 、4 、5 、6 m m l 的葡萄糖标准溶液各1 m l ，分别至于2 5 m l 容域瓶中，分别 按袭l 顺序加入各种试剂，定容至2 5 m l 。以空白调零，在5 4 0 n m 处测定吸光度值，绘制标准曲 线。 裹i 葡萄糖标准曲线的制定方法 丁曲l ei1 m en o r 巾a ig l u c o s e - s o l u t i o n sp 咒眦弧o n 2 2 ，4 3酶液的制备 取培养适当的固体曲5 9 ，加o 2 m o l ，l p h 4 8h a c - n a a c 缓冲液4 5 m l ，酶液浸提方法为：摇 床上3 0 浸提1 h ，摇床转数为9 5 转，分钟。z 后用中速定性滤纸及真空泵抽滤，滤液既为用 于测定的固体酶液。 2 2 4 4滤纸酶活的测定 采用m a r i d e i s 等的测定方法1 8 ”：在试管中加p h 4 8h a c n a a c 缓冲液2 m l ，再加入一条 1 c m 6 c m 的滤纸，约5 0 m g ，5 0 预热5 1 0 分钟后在试管中加入0 5 m l 酶液，5 0 保温6 0 分 钟，加入2 5 m l 容量瓶中( 事先容量瓶中加入3 m l d n s 试剂) 。在沸水浴5 分钟，用冷流水冷却 终止反应，用蒸馏水定容至刻度。同时用失活的酶液作对照。在5 4 0 n m 下测吸光度值，并从葡萄 糖标准曲线查出相应的葡萄糖含量，折算成酶活力单位。 2 2 4 5 羧甲基纤维素酶( c m c a s e ) 活力测定 采用m a n d e i s 等的测定方法。删：在试管中加质羹浓度1 c m c - n a - 醋酸缓冲溶液( p h 4 8 ) 2 i n l ， 加入1 m l 酶液，5 0 保温3 0 m i n ，取出加入3 m u ) n s 试剂，其他同滤纸酶活测定。 2 2 4 6 滤纸酶活力单位定义 以滤纸为底物，在反应条件 5 0 ，p h 4 8 ，恒温1 h ) 下，以水解反应中每小时催化纤维素 河北农业人学硕+ 学位论文 水解形成1 m g 葡萄糖的酶域为一个单位( u ) 。 2 2 4 7c m c 酶活力单位定义 以c m c - n a 为底物，在反应条件( 5 0 ，p h 4 8 ，恒温3 0m i n ) 下，以水解反应中每小时催 化纤维素水解形成j m g 葡萄糖的酶韬为一个单倚( u ) 。 2 2 5试验菌株适宜产酶条件的确定 2 2 5 1适宜发酵时间的确定 按孢子浓度为i 7 2 1 0 6 个觚l 的接种量将里氏木霉的孢子悬液接种至固体培养基，2 8 培 养3 6 h 后开始测酶活，每1 2 h 测一次。测1 5 6 h 。 2 2 5 2固体培养基适宜配比的确定 碳源是构成菌体细胞物质和代谢产物的主要成分，同时也是能量的来源。由于纤维素酶是诱 导酶，因此必须在培养基中供给纤维素，以诱导纤维素酶合成。但在纤维素酶大量合成之前，必 须保证菌体细胞增殖对易同化碳源的需求。由于麦麸中不仅含有丰富的易同化碳源和有机氮源， 还含有b 族维生素等营养物质，故在玉米秸秆中加入一定量麦歙将促进纤维素酶的合成。为此， 比较了玉米秸秆与麦麸不同配比对里氏木霉产酶活力的影响。 按玉米秸秆与麦麸比例分别为l ：4 ，2 ：3 ，l ：l ，3 ：2 ，4 ：l 配制固体培养基，按孢子浓度为1 7 2 1 0 矗个，m l