病原生物学.ppt

病原生物学,基础医学院病原生物学教研室张育华教授主讲,微生物的发现,微生物在地球上已存活38亿年，但真正观察到微生物的时间在17世纪中后期荷兰人列文虎克用自制显微境观察到，从此，知道了微生物的存在，开始研究发酵与微生物的关系。19世纪60年代法国科学家巴斯德(Pasteur)发现酒变酸可能是微生物的有害作用，然而创立了消毒灭菌方法。,此后德国科学家柯赫（Koch）发明了纯培养，用灭菌平板培养基分离到单一菌珠形成的单个菌落。1929年弗来明（Fleming）发现了青霉菌的抑菌现象青霉素。20世纪初，微生物研究成为一门独立学科，发展迅速，进入分子水平和基因水平，中国人民对微生物的利用有5千年文明史，但对微生物的系统研究是20世纪初，最早是一批西方留学归来的科学家开始系统介绍微生物学知识，从此开始微生物学研究。,1910-1921年间，伍连德用近代微生物学知识对鼠疫、霍乱的防治研究，同时建立了中国卫生防疫机构，培养了一支预防鼠疫的专业队伍，居国际领先地位。20世纪30年代进入医学微生物学实验性研究，如汤飞凡等在医学细菌学、病毒学、免疫学方面做出了高水平成绩，如沙眼病原体分离和确证具有国际领先。,一些高校开始设立酿造科目，如魏岩寿等在应用微生物、工业微生物方面做出了开拓性工作，戴芳澜等创立了我国真菌学和植物病理学。陈华癸和张宪武对根瘤固氮菌作用研究开始了农业微生物学。高尚荫创建了我国病毒学基础理论研究和第一个微生物学专业。,总体看，新中国成立之前，微生物学研究力量较弱，且分散，未形成研究体系。新中国成立后，有了长足发展，培养了一大批微生物学人才。近年来，我国微生物学的专业工作者瞄准世界微生物学科发展前沿，进行微生物基因组学研究。,医学微生物学的发展前景,为了促进医学微生物学的发展，有效控制和消灭传染病，应继续加强以下几方面的研究：要高度重视、新现、再现病原微生物的研究。病原微生物的致病机制及机体抗感染机制的研究。建立标准化的微生物学诊断方法及技术。高效抗感染药物的研制与开发。特殊环境中的微生物研究加强和完善突发性公共卫生事件的应急处理。,生物安全Biosafety,一、概念：生物安全是生物技术安全（Safetyofbiotechnolgy）的简称。狭义讲：生物安全是指现代生物技术的研究、开发应用以及转基因在生物可能对生物多样性、生态环境和人类健康产生的潜在危险（害），特别是转基因活生物体释放到环境中对生物多样性构成的威胁。,广义讲：生物安全是指与生物有关的各种因素对社会经济、人类健康及生态环境所产生的危害或潜在风险。生物安全是一个系统的概念，从实验室研究到产业化生产，从技术研发到经济活动，从个人安全到国家安全。都涉及生物安全问题。二、起因：根据ISO15190:2003(E)医学实验室-安全要求和WHO实验室生物安全手册第二版（2003年修订版），由中国疾病预防控制中心、中国军事医学科学院等起草（车凤翔），经国务院69次常务会议通过，形成国务院令第424号病原微生物实验室生物安全管理条例。,凡属在实验室从事与病原微生物菌（毒）种、样本有关的研究、教学、检测、诊断等活动的相关人员，都应履行实验室生物安全管理条例。三、病原微生物的分类及管理国务院根据病原微生物的传染性、感染后对个体或群体的危害程度，将病原微生物分类四类：第一类病原微生物，是指能够引起人类或者动物非常严重疾病的微生物，以及我国尚未发现或者已经宣布消灭的微生物。,第二类病原微生物，是指能够引起人类或者动物严重疾病，比较容易直接或者间接在人与人、动物与人、动物与动物间传播的微生物。第三类病原微生物，是指能够引起人类或者动物疾病，但一般情况下对人、动物或者环境不构成严重危害，传播风险有限，实验室感染后很少引起严重疾病，并且具备有效治疗和预防措施的微生物。第四类病原微生物，是指在通常情况下不会引起人类或者动物疾病的微生物。,第一类、第二类病原微生物统称为高致病性病原微生物。按中华人民共和国传染病防治法将传染病分为甲、乙、丙三类。甲类传染病是指：鼠疫、霍乱。乙类传染病是指：传染性非典型肺炎、艾滋病、病毒性肝炎、脊髓灰质炎、人感染高致病性禽流感、麻疹、流行性出血热、狂犬病、流行性乙型脑炎、登革热、炭疽、细菌性和阿米巴性痢疾、肺结核、伤寒和副伤寒、流行性脑脊髓膜炎、百日咳、白喉、新生儿破伤风、猩红热、布鲁病、淋病、梅毒、钩端螺旋体病、血吸虫病、疟疾。,丙类传染病是指：流行性感冒、流行性腮腺炎、风疹、急性出血性结膜炎、麻风病、流行性和地方性斑疹伤寒、黑热病、包虫病、丝虫病，除霍乱、细菌性和阿米巴性痢疾、伤寒和副伤寒以外的感染性腹泻病。,采集病原微生物样本应当具备下列条件：（一）具有与采集病原微生物样本所需要的生物安全防护水平相适应的设备；（二）具有掌握相关专业知识和操作技能的工作人员；（三）具有有效的防止病原微生物扩散和感染的措施；（四）具有保证病原微生物样本质量的技术方法和手段。,实验室的设立与管理,实验室对病原微生物的生物安全防护水平，并依照安全国家标准的规定，将实验室分为一级、二级、三级、四级。新建、改建、扩建三级、四级实验室或者生产、进口移动式三级、四级实验室应当遵守下列规定：,（一）符合国家生物安全实验室体系规划并依法履行有关审批手续；（二）经国务院科技主管部门审查同意；（三）符合国家生物安全实验室建筑技术规范；（四）依照中华人民共和国环境影响评价法的规定进行环境影响评价并经环境保护主管部门审查批准；（五）生物安全防护级别与其拟从事的实验活动相适应。,三级、四级实验室应当通过实验室国家认可。国务院认证认可监督管理部门确定的认可机构应当依照实验室生物安全国家标准以及本条例的有关规定，对三级、四级实验室进行认可；实验室通过认可的，颁发相应级别的生物安全实验室证书。证书有效期为5年。一级、二级实验室不得从事高致病性病原微生物实验活动。三级、四级实验室从事高致病性病原微生物实验活动，应当具备下列条件：,（一）实验目的和拟从事的实验活动符合国务院卫生主管部门或者兽医主管部门的规定；（二）通过实验室国家认可；（三）具有与拟从事的实验活动相适应的工作人员；（四）工程质量经建筑主管部门依法检测验收合格。,BSL-2实验室设施和设备基本要求,一、设施要求（一）无须特殊选址、普通建筑物即可，但应有防止节肢动物和啮齿动物进入的设计。（二）在实验室工作区域外应有存放个人衣物的条件，还应当有供存储长期使用物品的空间。（三）在实验室门口处应设挂衣装置。（四）实验室门应带锁并可自动关闭。实验室的门（隔墙）有可视窗。,（五）实验室的墙壁、天花板和地面应平整、易清洁、不渗水以及耐化学品和消毒剂的腐蚀。地面应防滑，不得铺设地毯。尽可能避免管线暴露在外。（六）实验台面应防水，耐腐蚀、耐热。（七）实验室应有足够的存储空间摆放物品以方便使用。实验室中的设备应当摆设稳定。实验台与其他设备之间应保持一定距离，以便于清洁。（八）每个实验室应设洗手池，宜设置在靠近出口处。,（九）实验室应保持通风，如使用窗户自然通风，应有防虫纱窗。（十）实验室内应保证工作照明，避免不必要的反光和强光。（十一）实验室内应有可靠的电力供应和应急照明。必要时，重要设备如培养箱、生物安全柜、冰箱等设备用电源。（十二）实验室出口应有在黑暗中可明确辨认的标识。有适当的火警报警器。,二、设备要求：（一）应在实验室内配备生物安全柜。（二）在实验室所在的建筑物内应配备高压蒸汽灭菌器，并按期检查和验证，以保证符合要求。（三）应设洗眼设施，必要时应有喷淋装置。,实验室感染的控制,一、实验室的设立单位应当指定专门的机构或人员承担实验室感染的控制工作。定期检查实验室的生物安全防护病原微生物菌（毒）种和样本保存与使用安全操作实验室废水、废气排放,二、对病原微生物有关的传染病防治知识进行宣传教育，并定期检查和了解实验室工作人员的健康状况。三、实验室工作人员出现与本实验室从事的高致病性病原微生物相关实验活动有关的感染临床症状或体征时，应当及时报告，并及时就诊救治。,四、实验室如发生病原微生物泄漏时，应立即采取控制措施，防止病原微生物扩散。封闭被病原微生物污染的实验场所开展流行病学调查对病人进行隔离治疗，对相关人员进行医学检查对密切接触者进行医学观察对现场进行消毒处理对染疫动物采取隔离、扑杀,法律责任,一、未依照本条例规定取得从事高致病性病原微生物实验室活动资格证书，或取得资格证书但未经批准从事高致病性病原微生物实验活动的。二、设立单位未建立健全安全保卫制度，未采取安全保卫措施的。三、未经批准运送高致病性病原微生物菌（毒）种或样本。,四、实验室在相关实验活动结束后，未依照规定及时将病原微生物菌（毒）种和样本就地销毁或送交相关部门的。五、实验室使用新技术、新方法从事高致病性病原微生物相关实验活动未经国家生物安全专家委员会论证的。六、未经批准擅自从事在我国尚未发现或已经宣布消灭的病原微生物相关实验活动的。七、在同一实验室的同一区域内同时从事两种或以上的高致病性病原微生物相关实验活动的。,绪论第一节微生物和病原微生物的概念一.微生物（microorganism）（一）定义：微生物(Microorganism)是存在于自然界中的一大群,结构简单、体形微小、肉眼看不见，必须借助光学显微镜或电子显微镜放大数百倍、数千倍，甚至数万倍才能观察到的微小生物。,（二）种类种类繁多，10万种以上，按其大小、结构、组成，从生物学角度分为三大类，即非细胞型微生物：病毒原核细胞型微生物：细菌、放线菌、衣原体、支原体、立克次体、螺旋体真核细胞型微生物：真菌归纳：一毒三菌四体,（三）分布自然界的分布：（无处不有、无孔不入、无时不在）正常人体的分布。病原微生物：具有致病性的能引起人和动物、植物病害的少数微生物。,第一章细菌的基本性状第一节细菌大小与形态,一、细菌的大小与测量单位测量细菌的单位微米（m）二、细菌形态(一)球菌(二)杆菌(三)螺形菌,第一篇医学微生物学基础,细菌的基本形态,细菌的结构分为基本结构和特殊结构一、细菌的基本结构细胞壁、细胞膜、细胞浆、核质。,细菌的基本结构模式图,第二节细菌的结构,1.革兰阳性菌的细胞壁(1)组成成分：主要成分肽聚糖（胞壁质、粘肽）次要成分磷壁酸肽聚糖（聚糖骨架、四肽侧链、五肽交联桥）(2)结构形式：肽聚糖为三维立体结构，具有机械强度十分坚韧，另有磷壁酸附着表面。,革兰阳性菌肽聚糖的结构,(2)革兰阳性菌细胞壁特殊成分磷壁酸分类：壁磷壁酸、膜磷壁酸作用：1.革兰阳性菌的表面抗原2.参与调节细胞内外离子进出3.与染色有关4.与致病有关,2.革兰阴性菌的细胞壁：(1)组成成分：肽聚糖（少量）外膜（主要部分）(2)结构形式肽聚糖为二维平面结构、单层平面、疏松、外有外膜加固，,革兰阴性菌肽聚糖结构,革兰阴性菌细胞壁特殊成分外膜组成：脂蛋白、脂质双层、脂多糖（酯质A、核心多糖、特异多糖）,革兰阳性菌与阴性菌细胞壁结构比较革兰阳性菌革兰阴性菌构型三维立体、坚韧平面网络、疏松肽聚糖厚、多层，50层薄、层少，1-2层糖脂含量糖多脂少糖少脂多特殊成分磷壁酸外膜意义：导致两类细菌在染色性、致病性及对药物的敏感性等方面不同。例如：青霉素，溶菌酶,3.细胞壁的功能维持细菌固有形态保护细菌抵抗低渗环境参与营养物质交换决定细菌抗原性与致病性有关,4.细菌细胞壁缺陷型(细菌L型，bacterialLform)概念：是细菌细胞壁的肽聚糖结构受到理化因素或生物因素的直接破坏或合成被抑制而导致细胞壁缺陷。特点：具有生命力，致病性和抗原性。有形态及染色性变化。具有高渗透压生长特性。具有对原菌敏感抗生素的耐受性。,2.细胞膜中介体（拟线粒体）概念：是细菌细胞膜内陷，折叠所形成的囊状或管状结构。种类：侧中介体和横隔中介体。功能：由于呼吸酶含量增多，参与细菌细胞呼吸，与细胞代谢相关。横隔中介体还与细胞分裂有关。,3.细胞质(1)核糖体：细菌合成蛋白质的场所(2)质粒（plasmid）概念：是存在于菌细胞内、独立于染色体外的一种遗传物质，为双链环状DNA，不受染色体控制，可自我复制，也可随意丢失。种类：有F质粒、R质粒和VI质粒。(3)胞质颗粒：异染颗粒4.核质,二、细菌的特殊结构1.荚膜（capsule）概念：是某些z细菌细胞壁外包绕的一层粘液性物质。种类：真荚膜(0.2m)、微荚膜(0.2m)成分：多糖或多肽形成条件：营养丰富、动物体内功能：抗吞噬作用粘附作用抗有害物质的损伤作用具有抗原性,2.鞭毛（flagellum）概念：是附着于某些细菌表面细长、柔软，呈波浪状弯曲的丝状物。种类：根据数目、位置分四种成分：蛋白质（弹性纤维蛋白）功能：运动器官（数目与运动力无关）与致病性有关具有抗原性检查：电镜观察、特殊染色、暗视野观察半固体穿刺、平板接种,革兰阴性细菌鞭毛的构造,细菌鞭毛的类型,3.菌毛（pilus）概念：是附着于某些细菌表面，比鞭毛的数目众多，纤细、短而直的丝状物。种类：普通菌毛、性菌毛功能：与细菌的致病性有关性菌毛为中空管状，能通过接合传递质粒，故与细菌的变异有关特点：由于纤细普通光镜不能观察，需电镜观察。,4.芽胞（spore）概念：是某些细菌在一定条件下，胞浆脱水浓缩在菌体内形成的圆形或椭圆形小体。种类：根据形态、大小、位置分若干种。,意义：有鉴别细菌的作用芽胞对环境的抵抗力强，可作为临床上消毒灭菌的指标,细菌芽胞形态示意图,细菌芽胞结构示意图,组成：元素、化合物、无机盐、水物理性状：光学性质、表面积、带电现象、半透性、渗透压,第三节细菌的化学组成与物理性状,第四节细菌的营养与生长繁殖条件1.营养物质2.pH3.温度根据细菌对温度的适应范围不同可分为：嗜冷菌：生长范围(530)最适温度(1020)嗜温菌：生长范围(1045)最适温度(2040)嗜热菌：生长范围(2595)最适温度(5060),4.气体：O2、CO2、混合气体根据细菌对氧的要求不同将细菌分为四类：（1）专性需氧菌：结核杆菌（2）微需氧菌：幽门螺杆菌（3）兼性厌氧菌：大多数病原菌（4）专性厌氧菌：破伤风杆菌,专性厌氧菌在有氧环境中不能生长的机制：缺乏氧化还原电势高的呼吸酶细胞色素和细胞色素氧化酶缺乏分解有毒氧基团的酶超氧化物歧化酶、触酶和过氧化物酶细菌的生长繁殖1.细菌个体的生长繁殖2.细菌群体的生长繁殖,生长曲线:（1）迟缓期：（2）对数期：研究细菌的生物学性状在此期（3）稳定期：细菌代谢产物多在此期产生（4）衰亡期：,细菌的生长曲线图,细菌代谢及代谢产物1.分解代谢产物(1)糖发酵试验（单糖发酵试验）,(2)甲基红试验,丙酮酸,分解,产生其他酸类,使培养基PH低于4.5,加入甲基红指示剂数滴,显红色为甲基红试验阳性显桔黄色为甲基红试验阴性,大肠杆菌,(3)VP试验,葡萄糖,些细菌某分解,丙酮酸,乙酰甲基甲醇,硷性环境中氧化,二乙酰,培养基中精氨酸所含胍基,生成红色化合物（VP试验阳性）,脱羧缩合,(4)吲哚试验,培养基内蛋白质中的色氨酸,某些细菌具有色氨酸酶,分解,吲哚（靛基质）无色气体,加入吲哚试剂,形成玫瑰红色吲哚,(5)硫化氢试验,培养基中的含硫氨基酸,某些细菌能分解,产生硫化氢（H2S）无色气体，,遇铅或亚铁离子,形成黑色的硫化铅或硫化铁,(6)枸椽酸盐还原试验细菌能利用的碳源只有枸橼酸盐，当某种细菌利用枸橼酸盐时，可将其分解为碳酸钠，使培养基变为碱性。指示剂溴麝香草酚兰由淡绿色变成深蓝色。合成性代谢产物1.热原质2.毒素和侵袭性酶3.色素4.抗生素5.细菌素6.维生素,细菌人工培养的方法、培养基、细菌在培养基中的生长情况及用途。意义：1.研究细菌2.传染病诊断3.研制生物制品4.基因工程,第六节细菌的人工培养及形态检查,病原微生物感染的实验诊断,一、标本采集的基本原则1、根据感染特征：采集相应标本，无定位体征常取血样本2、尽早采集：疾病早期使用抗菌药物之前未出现继发感染及合并症之前机体免疫因素未形成之前,3、无菌采集：避免人为污染，确保结果可靠性。4、正确运送及保存：标本采集后运送到实验室最好在2h之内，用于培养的标本不应超过24h。5、标本量必须满足检验需要：如血液成人510ml，婴幼儿13ml。血培养时，培养基与血液标本量比例应大于10:1呼吸道：上呼吸道取咽拭子，鼻咽试子，下呼吸道取痰液（晨疾最佳）尿液标本：中段尿、肾盂尿、膀胱穿刺,粪便：脓血粘液区23g，液体便12ml脑脊液：腰椎穿刺采集35ml生殖道：分泌物、宫颈粘液脓液、胸腹水：穿刺法,二、病原微生物的形态学检查1、显微镜普通光学显微镜：光源、单双目暗视野显微镜：通过遮光板形成暗场背景荧光显微镜：产生365435nm之间波长相差显微镜：通过相差板的光栅作用，使光相差异转换成光的强度差异。倒置显微镜：光线从物体背面穿透电子显微镜：利用电子流代替可见光，波长一般为0.005nm,2、不染色标本检查：用于观察病原微生物活体的运动状态，常用悬滴法、压滴法、毛细管法3、染色标本检查：染色原理：目前使用的染料一般为人工合成染料，为一种含有色基和助色基的苯环有机化合物，前者赋予化合物颜色，后者赋予化合物结合能力。染料性质：目前医学检验中常用染料有三种：酸性染料：显色离子带负电荷，如刚果红碱性染料：显色离子带正电荷，如结晶紫复合染料（中性染料）：如伊红美兰染色方法：分单染色法和复染色法，前者有正染和负染色法，后者有革兰染色、抗酸染色、荧光染色另外有特殊染色法：如英膜染色、芽胞染色、鞭毛染色,三、病原微生物的分离培养1、培养基（概念、种类）2、接种方法液体：研磨接种法涂布接种法半固体：穿刺接种法倾注接种法固体斜面：蜿延划线接种法固体平板：连续分区划线接种法,3、培养方法普通培养：37、1824h二氧化碳培养：510%CO2环境（烛缸法、二氧化碳培养箱）厌氧培养基：物理、化学、生物法四、病原微生物的代谢产物检测与鉴定1、糖发酵试验2、氧化-发酵试验（O-F试验）,常用鉴定方法有：1.双歧索引对于较特征性的细菌来说，双歧索引较为方便实用，对少数相互区别较困难的细菌，鉴定项目较多显得繁琐。2.表解法：将各种菌及其多种特性列成炬阵表格，显而易见，便于分析。3.数码鉴定法将生化反应模式数学模式某细菌的生化反应结果数字再将获得的数字细菌名称,转化成,查阅检索手册,转化成,病原微生物的分子生物学检测,一、核酸杂交：1、核酸杂交技术检测病原微生物核酸是临床诊断学的重大发现，是基因组相似性研究中更加直接的方法。其原理是利用双链DNA加热后产生的单链DNA混合物，在温度降低并保持恒温25（低于溶点温度）时，互补序列会发生重新配对，形成稳定的双链DNA。,将分离于不同微生物的DNA单链混合，并保持在一定的恒温条件下，DNA的互补序列发生配对，形成杂交DNA双链，该过程称交杂（Hybridization）常用带有酶、化学荧光物或放射性同位素标记的已知序列核苷酸单链作为探针，在一定恒温条件下，按碱基互补配对原则，探针与待测标本中的核酸杂交，通过杂交信号的检测，从而鉴定标本中有无相应的病原微生物基因及其分子大小。,将未标记的来源于某种微生物DNA单链固定于硝酸纤维膜或民龙膜上，在适宜温度下与用32P、3H或14C放射性标记的已知微生物DNA单链片段进行杂交，如果杂交同源性在70%以上，熔点温度（Tm）相差小于5%，则可以认为是同一微生物的不同菌珠。,一、细菌DNA由四个碱基组成：鸟嘌呤（G）腺嘌呤（A）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）严格的碱基配对：ATGC常以GC碱基对的摩尔百分比来测定细菌DNA四个碱基对的含量来鉴定细菌。,二、细菌DNA提取过程(一)细菌的培养及细菌收集细菌培养：液体培养，固体培养细菌收集：一般要求收集2-3克湿菌体(二)细菌破壁1.超声波破壁法2.氧化铝磨碎法3.反复冻融法4.化学试剂破壁法，十二烷基磺酸钠“SDS”5.溶菌酶溶解法6.其他方法：细菌研磨法、玻璃珠研磨法。,三、细菌DNA的提取方法(一)Marmur氯仿提取法,湿菌体23克,离心洗涤一次,悬浮于3035ml250g/L的SDS,于60加热10分钟，使之破裂,加入5mol/LNaCIO4(终浓度为1mol/L),置入带塞的玻璃溶器中，加入等体积的氯仿一异戊醇(24:1v/v),50001000r/min离心5min分层,0.1mol/LNaCl50ml溶液,0.1mol/LEDTApH8.0溶液,冷却到室温后,振荡20min,上层水相含核酸,中层蛋白质,下层氯仿一异戊醇,吸出上层含核酸的水相,加入二倍体积的乙醇,用搅拌棒搅拌,用棒卷出丝状DNA，靠壁挤干,再充分溶于1015ml0.1SSC,(0.15mol/LNaCl0.15mol/L柠檬酸三钠)Ph7.00.2简称ISSC稀释10倍为0.1SSC,待全部溶解，再用10SSC(1SSC浓缩10倍),调整到约1SSC的浓度,再与等体积的氯仿一异戊醇一起振荡15min,重复一次进行清除蛋白，直到看不见变性蛋白为止,注意：1.被溶解的细菌浓度不能太低。2.SDS为阴离子去污剂，各厂家、批号、等级差异较大。3.离心分层后，取水相液体要准确。,(二)细菌DNA中G+C摩尔百分比测定1.化学方法用电泳和层析等技术2.物理方法用热变性温度(目前常用方法)G+C摩尔百分比测定，是细菌分类鉴定的一种重要方法。缺点：不能表达出DNA碱基的排列顺序。,核酸杂交技术,核酸杂交技术（techniqueofnucleicacidhybridization）是由现代分子生物学的重要方法之一。是用特定标记的已知核酸序列与待测核酸进行特异性的杂交结合，形成杂交体，并利用相应的显示技术来检测目标核酸的存在及其位置的分子生物学方法。,一、核酸探针(DNA探针)就是指带有标记物的，能与特定核酸序列发生特异性互补的已知核酸序列片段。(一)核酸探针的种类,根据标记方法,放射性探针,非放射性探针,根据核酸性质,DNA探针,CDNA探针,RNA探针,寡核苷酸探针,1.NDA探针DNA探针是目前最常用的核酸探针，因具有三大优点：这类探针克隆在质粒载体上，可无限繁殖，取之不尽；DNA探针与RNA探针相比，不易降解，一般能抑制DNA酶活性；DNA探针标记方法较成熟，制备方法简便。,DNA探针一般长度在几百碱基对，可以是双链DNA，也可是单链DNA；可以是某一基因的全部序列，也可是部分序列。,2.CDNA探针CDNA是指互补于mRNA的DNA分子(complementaryDNA)，CDNA是由RNA经反转录产生的，这种DNA探针不含有内含子序列，尤其适用基因表达检测。3.RNA探针是一类很有前途的核酸探针，常用细胞mRNA和病毒RNA，具有高杂交效率。但易降解，标记复杂之缺点。,4.寡核苷酸探针根据某一特殊核酸序列，选择其中最稳定区域，经人工合成，为1830个碱基，能识别一个碱基。,具有以下特点：由于链短，序列复杂底低，分子量小，交杂耗时短；一次性可合成大量寡核苷酸探针；短探针，碱基错配能降低杂交体的Tm值。,二、标记物32P半衰期14.3d35S半衰期87.1d14C半衰期125I半衰期60d3H半衰期12.3年,三、基因重组载体载体的功能是将一个外源基因导入受体细胞具体的条件1.其本身是复制子，能自我复制。2.分子量小，带有选择标记。3.对几种限制性内切酶有单一切点。4.并有一定非必要区，允许外源基因插入。,Southern印迹杂交,两个主要过程：一是将待测核酸分子通过一定方法转移并结合到一定的固相支持物上(即印迹，blotting)。二是固定于膜上的核酸同标记的探针在一定温度和离子强度下退火(复性)即分子杂交过程。,一、待测核酸样品的制备,病毒感染的细胞组织或分泌物提取DNA,酚/氯仿抽取法,用限制性内切酶消化基因组DNA,0.11g待切DNA适当限制性内切酶缓冲液2050ul,用灭菌Eppendorf管,置合适温度下保温一个小时，加入EDTA,65加热灭活限制性内切酶,样品DNA,二、琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA,DNA样品,0.33%琼脂糖凝胶,在一定电场下进行电泳13h,得到很多DNA条带,将电泳凝胶浸泡在0.25mol/L的HCl溶液,短暂的脱嘌呤处理,移到碱性溶液(0.5mol/LNaOH，1.5mol/LNaCl),在用中性pH的缓冲液(0.5mol/LTris-HClpH7.51.5mol/LNaCl),使DNA变性并断裂形成较短的单链DNA片段,中和凝胶中的缓冲液,在20SSC中平衡凝胶10min,保持单链状态DNA片段，易于同探针杂交,三、转膜,将凝胶中的单链DNA片段,转移到固相支持物上(硝酸纤维膜),(必须保持凝胶电泳时区带位置不变),四、杂交(一)预杂交DNA片段与探针进行杂交前必须先进行预杂交，因能结合DNA片段的膜，同样能结合探针DNA，所以须将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭。(二)正式杂交,五、放射性自显影用放射性同位素标记dNTP（2-单脱氧核苷酸），测定核酸序列是应用最早。,放射性试剂,a-32p有强放射性和散射性，少用,a-35S标记dATP，高自显影条带分辨率,Northern印迹杂交(Northernblotting),一、原理：是将RNA样品通过琼脂凝胶电泳进行分离，再转移到固相支持物上，用带标记物的探针对固相膜上的RNA进行杂交，常用于RNA病毒核酸的检测。,二、步骤,1.RNA样品提取,氯化锂尿素法,热酚法,PolgA+的寡聚dT纤维素亲和法,2.电泳分离：甲醛琼脂糖凝胶电泳3.转移和紫外线交联:将RNA转移到尼龙膜后，用波长254nm，600w/cm2，紫外线灯下，曝光5min，取出尼龙膜置80，烘烤60min后尼龙膜即可杂交。4.杂交与结果检测,原位杂交,是用特定标记的已知顺序核酸为探针，与细胞或组织中的核酸进行杂交，此杂交能保持细胞的完整性，但能对细胞或组织中的核酸进行定性、定位测定。,临床标本,组织切片,经甲醛溶液固定,经石蜡包埋,将标本片和组织片上加入探针,如果是细菌菌落称菌落原位杂交如果是细胞称组织原位杂交,斑点杂交,硝酸纤维素膜具有吸附单链DNA或RNA的特性，可将样品直接点在样品膜上，经变性，固定后进行杂交，称斑点杂交(dotblothybridization)。,免疫印迹法(immunoblot),免疫印迹法，也称免疫转印技术。1975年southern首先用于分析核酸，故称核酸印迹，southernblot。1977年Alwine将此法用RNA研究，取名Northernblot1979年Towbin，又扩展到蛋白分析，又称蛋白印迹。其后，Burnetle则名之为Westernblot，以后Gershou改称为immunoblot。1982年Reinhart将此方法中转移电泳一步省去，而采用直接吸印法，因而把该法改良后，又称Easternblot,基本原理：是将凝胶电泳与固相免疫测定两种方法结合起来的一种技术。,方法步骤：1.将抗原物质(蛋白质、多糖)通过聚苯烯酰胺凝胶电泳分离。2.将电泳分离的组分转移到固相基质上(硝酸纤维素滤纸)。3.转移后的组分进行免疫法测定。,应用范围：1.病原体抗原的鉴定与分析，筛选寻找特异性抗原。2.抗体的鉴定与分析，分析患者对不同抗原组分的抗体应答状态，目前用于艾滋病的诊断。3.免疫复合物的分析。,一、基本原理：是一种在体外模拟天然DNA复制过程的核酸扩增技术，但反应体系较为简单。包括变性-复性-延伸三步循环反应。(1)变性：通过加热(95)使双链DNA解开成单链DNA。(2)退火(引物粘合)：当温度突然降低时(55)，浓度很高的引物与其互补的模板在局部形成杂交链，以提供DNA聚合酶催化聚合所需的3-OH末端。,聚合酶链反应PCR,（3）聚合(引物延伸)：在Taq-DNA聚合酶、4种dNTP及Mg2+存在的条件下，聚合酶催化引物在3端不断延伸，在模板DNA链上形成新链，从而使模板DNA扩增1倍。（4）在DNA聚酶作用下，引物扩增延伸，每经过变性、复性、延伸一个循环，模板DNA增加一倍，而新合成的DNA又作为下一循环的模板，经过25-30个循环后原DNA量增加至106-109倍（拷贝）,引物的要求：长度在15-30bPG+C含量应在45-55%之间碱基分布均匀，避免连续出现4个以上自身无互补序列两个引物之间同源碱基小于4个,以上三步构成一个循环，每一循环的产物可作为下一次循环反应的模板，大约经25-30次循环反应，可使特异性DNA片段扩增100万倍(2小时)。（1）两种引物：为保证DNA聚合酶能够对两条互补链均能进行延伸，需要两种引物，分别位于两条互补DNA链的3-端。引物决定了PCR扩增产物的大小及其特异性，引物设计及合成的优劣直接涉及有效扩增能否成功，引物设计应考虑下述原则:,引物长度：1530个碱基为宜，引物过短会使特异性降低，引物越长，扩增的特异性越好，但敏感性相应下降。G+C含量：在40%-60%为宜，引物Tm值可用公式计算：Tm=4（G+C）+2（A+T）碱基分布的随机性。应尽量避免具有多聚嘌呤或嘧啶核苷酸的序列，尤其3端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。,引物自身：不应该存在互补序列，连续互补碱基不能多于3bp，否则引物自身会折叠形成发夹状二级结构。两个引物之间不应该有多于4个的互补或同源碱基，尤其应避免3端的互补重叠，以防形成二聚体。引物的3端：引物的3端是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。引物的3端最佳碱基选择是G和C，因为它们形成的碱基配对比较稳定。,引物的5端：引物的5端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大，因此可以被修饰。引物的5端的修饰包括加酶切位点，标记生物素、荧光素、地高辛等，引入蛋白质结合DNA序列，引入突变位点等。引物的特异性：引物与非特异性扩增序列的同源性不要超过90%或有8个互补碱基同源。,(2)耐热Taq-DNA聚合酶（Taq酶）：这是在耐热细菌体内提取的一种DNA聚合酶，可保证在95，30分钟以上不会变性失活。0.5-5U/100L。(3)四种脱氧核糖核苷酸：用作底物的dNTPs。20-200M。(4)缓冲溶液：保证DNA聚合酶催化时所需的适当的溶液pH值。10-50mmol/LTris-HCl(室温pH8.3-8.8,72pH7.2)。(5)Mg2+：是Taq-DNA聚合酶活性所必需。加入量比dNTPs浓度高0.5-2.5mmol/L。,三.反应条件(1)温度和时间变性:95,30S；退火：45-55，30S-1min；延伸：72，5055），其扩增的特异性是很高的。其它因素如：酶浓度、dNTP、Mg2+、pH等对PCR的忠实性也有一定的影响。,3.操作简便、迅速已有多种类型的PCR扩增仪，只需把反应材料按一定的比例混合，置于仪器内，反应便会按所输入的程序进行。4.适用样品广PCR可特异扩增任何微量（pg、ng）的目的DNA或RNA片段，样品既可以是纯化的，又可以是粗制的；既可以是新鲜组织，也可以是陈旧样品；既可以是细胞，又可以是体液；既可以是完整的大分子DNA，也可以是部分降解的DNA。因此，PCR技术对扩增样品的要求不严格。,五、PCR技术在医学中的应用由于PCR技术敏感、特异且操作简便，加上商品化PCR试剂盒的广泛应用，使得PCR在临床疾病的诊断、法医学鉴定中具有极为重要的应用价值，并能为大多数实验室所接受。1.PCR用于感染性疾病病原体的诊断和研究（病毒、细菌、寄生虫检测）2遗传性疾病及肿瘤的诊断,第八节动物试验,动物试验是临床细菌学检验的重要组成部分。具有以下实用价值：1、分离鉴定病原体2、测定细菌的毒力LD50、ID503、制备免疫血清4、建立致病动物模型，很多疾病的机制，首先采用动物模型进行研究所证实5、动物血液、器官是配制培养基或制备实验材料6、用于生物制品的安检、毒理、药理测试鉴定,一、实验动物的分类1、按遗传控制分类(1)近交系动物（纯系动物）指兄妹交配或亲子交配繁殖20代以上，纯系动物具有以下优点：具有长期遗传的稳定性具有个体遗传的均一性对实验的敏感性和结果的一致性对实