吡啶衍生物转化菌的部分分子生物学研究-硕士学位论文（pdf格式可编辑）.pdf

摘要 摘要 地IllllfllYllllllllIllllfIfllllfUIIl4ll Y 1 7 2 6 4 2 1 本实验室之前分别报道了嗜麦芽寡养单胞菌( S t e n o t r o p h o m n am a l t o p h i l i a ) 可 共代谢降解烟碱类农药吡虫啉( I M I ) 、啶虫咪( A A P ) 、噻虫啉( T H I ) 。但我们在预 实验中发现，添加不同的共代谢基质到嗜麦芽寡养单胞菌转化液中，会产生不同 的吡虫啉代谢产物，说明共代谢基质的不同会导致菌体启动不同的吡虫啉降解途 径。因而需要进一步采用分子生物学方法敲除共代谢途径的某些关键酶，构建嗜 麦芽寡养单胞菌突变株，以研究不同的共代谢基质进入的代谢途径及其与不同的 吡虫啉降解产物的关系，从而阐明共代谢基质调控吡虫啉代谢途径的分子机制。 研究发现，嗜麦芽寡养单胞菌( Sm a l t o p h i l i a ) R 5 5 1 3 菌株具有氨苄青霉素、卡那 霉素、四环素、安普霉素和链霉素等多种常用抗生素的抗性，因而难以采用上述 抗生素抗性作为遗传转化的筛选标记。本文先后尝试采用十二烷基磺酸钠( S D S ) 法、紫外法、高温法、高温S D S 法等消除嗜麦芽寡养单胞菌 m a l t o p h i l i a ) R 5 5 1 3 的抗生素抗性，均未获得成功。最后采用电穿孔法成功地消除该菌的四环素抗性， 为进一步开展参与吡虫啉共代谢的关键基因的敲除和回补奠定了基础。基于嗜麦 芽寡养单胞菌假m a l t o p h i l i a ) R 5 5 1 3 的全基因组序列信息，成功的克隆到6 磷酸 葡萄糖脱氢酶( G 6 P H ) 、6 一磷酸果糖激酶( F P K ) 上下各1 0 0 0 b p 左右的同源臂片段， 并从p E C B A C l 质粒上克隆到了氯霉素抗性基因，并构建出了6 磷酸葡萄糖脱氢 酶、6 磷酸果糖激酶的同源双交换质粒：p E X l 0 0 T l i n k + ( G 6 P H - u p ) + C m + ( G 6 P H - d o w n ) 、p E X l0 0 T l i n k + ( G 6 P H - u p ) + ( p r o - C m ) + ( G 6 P H - d o w n ) 、 p E X l0 0 T l i n k + ( F P K - u p ) + C m + ( F P K - d o w n ) 和p E X l0 0 T l i n k + ( F P K - u p ) + ( p r o - C m ) + ( F P K - d o w n ) 。为进一步的关键酶的基因敲除研究工作奠定了基础。 6 羟基烟酸和6 羟基3 氰基吡啶是吡啶衍生物中重要的合成烟碱类杀虫剂 的中间体，化学合成困难。本实验室先后报道了C o m a m o n a st e s t o s t e r o n iJ A l 可 以转化烟酸和3 氰基吡啶生成6 羟基烟酸和6 羟基3 氰基吡啶，而P s e u d o m o n a s p u t i d aK T 2 4 4 0 只能转化烟酸生成6 羟基烟酸，而其转化的本质都是烟酸脱氢酶 ( D 日) 的催化，已通过亚基的置换实验，初步确定了J A l 菌株的N a D H S 蛋 白亚基决定了3 一氰基吡啶羟基化功能。基于以上背景，本文试图探讨N a D H 功 能域( 结构) 与底物特异性( 功能) 之间的关系。通过N C B I ( p r o t e i n b l a s t ) T 具 对N a D H K l 2 4 4 0 和N a D H j A l 两个蛋白的每一个功能域进行了比较，找到了两者之 间的差异；接着又对S 亚基中哪些氨基酸决定了3 氰基吡啶的羟基化功能进行 了分析。经过一系列氨基酸置换和N C B I ( p r o t e i n 。b l a s t ) I 具的分析，找到了 N a D H K T 2 4 4 0 及N a D H j A IS 亚基中可能的决定底物特异性的氨基酸。即当将 D 两A lS 亚基中2 3 ( Y ) 和2 9 ( M ) 置换成N a D H K T 2 4 4 0S 亚基中2 3 ( L ) 和2 9 摘要 ( L ) 后，N a D H j A lS 亚基中原有的I 型 2 F e 2 S 】结构域消失，与N C B I 对 N a D H K 嗍。结构域的分析相同。同样，当将N a D H r , r 2 4 4 0S 亚基中2 6 ( L ) 和2 7 ( I ) 置换成N a D H j A lS 亚基中2 6 ( Y ) 和2 7 ( V ) 后，N a D H K 糊oS 亚基中出 现了原来没有的I 型 2 F e 2 S 结构域，与N C B I 对N a D H j A l 结构域的分析相同。 根据这一分析结果，设计了定点突变实验，通过o v e r l a pP C R 构建了突变的表达 质粒，H P L C 测定酶活，但结果显示突变前后烟酸脱氢酶N a D H K 硎。和N a D H j A l 活性并无改变，并未出现预计的结果。 关键词：m a l t o p h i l i aR 5 51 - 3 、抗性消除、只p u t i d aK ，r 2 4 4 0 、Ct e s t o s t e r o n eJ A l 、 烟酸脱氢酶 A b s 订a c t A b s t r a c t O u rl a b o r a t o r yh a s r e p o r t e d t h a tS t e n o t r o p h o m n a sm a l t o p h i l i ac a l ld e g r a d e n e o n i c o t i n o i di n s e c t i c i d ei m i d a c l o p r i d0 M I ) ，a c e t a m i p r i d ( h A D ，c l o t h i a n i d i n m o r p h o l i n e ( T i1 1 ) H o w e v e r , w ef o u n dt h a td i f f e r e n tC O - m e t a b o l i s ms u b s t r a t e s i n i m i d a c l o p r i dc o n v e r s i o nw i l lp r o d u c ed i f f e r e n tm e t a b o l i t e so fi m i d a c l o p r i d , i n d i c a t i n g t h a td i f f e r e n tC O - m e t a b o l i s ms u b s t r a t e sw i l ll e a dt od i f f e r e n tb a c t e r i a ld e g r a d a t i o no f i m i d a c l o p r i d H e n c ew ew a n tt ok n o c k o u ts o m ek e ye n z y m e s i ni t sm e t a b o l i c p a t h w a y s T h eo b t a i n e dm u t a n t s C a nb eu s e dt os t u d yt h e d i f f e r e n tm e t a b o l i c C O m e t a b o l i s mm e c h a n i s m s & m a l t o p h i l i aR 5 51 3e x h i b i t sm u l t i p l ea n t i b i o t i c r e s i s t a n c e T h i sm a k ei td i 伍c u l tt ou s ec o m m o na n t i b i o t i c sr e s i s t a n c ea sas e l e c t i v e m a r k e ro fg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n W eh a v et r i e ds e v e r a lm e t h o d st oe l i m i n a t ei t s a n t i b i o t i c sr e s i s t a n c e ，s u c ha SS D Sm e t h o d ，U Vm e t h o d ，h lg h - t e m p e r a t u r em e t h o d , h i g h - t e m p e r a t u r e - S D S ，b u tf a i l e d F i n a l l y , t h r o u g he l e c t r o p o r a t i o nw eo b t a i n e da R 5 51 3m u t a n tw h i c hl o s tt e t r a c y c l i n er e s i s t a n c e B e s i d e s ，t h et e t r a c y c l i n er e s i s t a n t p l a s m i dp J B 8 6 6 H ：n d h S LW a ss u c c e s s f u l l yt r a n s f o r m e di n t ot h eR 5 5 1 3 T e r - s t r a i n 朋1 e t e t r a c y c l i n er e s i s t a n c el o s tm u t a n tk e e p st h ea b i l i t yo fh y d r o x y l a t i n gi m i d a c l o p r i d B a s e do nt h i sm u t a n t ，t h ef o l l o w i n gg e n ek n o c k o u ta n dr e c o v e r ye x p e r i m e n t sC a nb e c a r r i e do u t W eh a v es u c c e s s f u l l yc l o n e d10 0 0 b ph o m o l o g ya 1 1 T lg e n e sf r o mt h e u p s t r e a m a n dd o w n s t r e a mo f6 - p h o s p h a t eg l u c o s ed e h y d r o g e n a s e ( G 6 P I - 1 ) a n d 6 - p h o s p h o f r u c t o k i n a s e ( F P K ) T h ec h l o r a m p h e n i c o lr e s i s t a n c eg e n eW a sc l o n e df r o m p l a s m i dp E C B A C l T h e nw eb u i l tg e n e k n o c k - o u tp l a s m i d s ：p E X l 0 0 T l i n k + ( G 6 P H - u p ) + C m + ( G 6 P H - d o w n ) ，p E X l0 0 T l i n k + ( G 6 P H - u p ) + ( p r o C m ) + ( G 6 P H - d o w n ) ，p E X l0 0 T l i n k + ( F P K - u p ) + C m + ( F P K - d o w n ) ，a n dp E X l0 0 T l i n k + ( F P K - u p ) + ( p r o C m ) + ( F P K - d o w n ) 6 - H y d r o x y - n i c o t i n i c a c i da n d 6 - h y d r o x y - - 3 - c y a n o p y r i d i n e a r e i m p o r t a n t i n t e r m e d i a t e si ns y n t h e s i z i n gn e o n i c o t i n o i dp e s t i c i d e s O u rl a b o r a t o r yh a sr e p o r t e d t h a tC o m a m o n a st e s t o s t e r o n iJ A lC a l lt r a n s f o r m en i c o t i n i ca c i da n d3 - c y a n o p y r i d i n e i n t o6 - h y d r o x y n i c o t i n i ca c i da n d6 - h y d r o x y 一3 - c y a n o p y r i d i n e ，w h i l eP s e u d o m o n a s p u t i d aK T 2 4 4 0c a l lo n l yt r a n s f o r m en i c o t i n i ca c i di n t o6 - H y d r o x y n i c o t i n i ca c i d A p r e l i m i n a r ys t u d yo nt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e ns t r u c t u r ea n ds u b s t r a t es p e c i f i c i t yo f N a D H K 砣4 4 0a n dN a D H j A Ih a sb e e na c c o m p l i s h e d ：T h eN a D H j A ISs u b u n i td e t e r m i n e s c a p a b i l i t yo ft h e3 - c y a n o p y r i d i n e Sh y d r o x y l a t i o na n dp e r h a p sI 2 F e 一2 S 】d o m a i n p l a y sak e yr o l e T h e r e f o r e ，w ea t t e m p tt oe x p l o r et h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nN a D H I I I A b s t r a c t d o m a i n s ( s t r u c t u r e ) a n dt h e s u b s t r a t es p e c i f i c i t y ( f u n c t i o n a l ) W eu s e dN C B I ( p r o t e i n - b l a s t ) t o o l st oc o m p a r ee a c hd o m a i no ft h et w op r o t e i n s ：t h em a i nd i f f e r e n c e b e t w e e nt h et w ow e r ef o u n di nSs u b u n i t s T h e nw ea n a l y z et h eSs u b u n i t st of r e dt h e k e ya l l l i n oa c i d sw h i c hd e t e r m i n et h eh y d r o x y l a t i o no f3 - c y a n o p y r i d i n e A f t e ra s e r i e s o fa r g oa c i dr e p l a c e m e n ta n dN C B I ( p r o t e i n - b l a s t ) t o o l sa n a l y s i s ，t h ep o s s i b l e f u n c t i o n a lk e ya m i n oa c i d si nSs u b u n i t sw e r ef o u n do u t W h e n2 3ma n d2 9 ( M ) i n N a D H j A ISs u b u n i t sw e r es u b s t i t u t e db y2 3 ( L ) a n d2 9 ( L ) i nN a D H K T z 4 4 0Ss u b u n i t s ， t h eI - t y p e 【2 F e - 2 S 】d o m a i n si nN a D H j A ISs u b u n i t sW a sd i s a p p e a r e d ，j u s tl i k et h e N a D H K T z 4 4 0Ss u b u n i t S i m i l a r l y , W h e n2 6 ( L ) a n d2 7 ( I ) i nN a D H K r 2 4 4 0Ss u b u n i t s w e r es u b s t i t u t e db y2 6 ( a n d2 7 i nN a D H j A ISs u b u n i t ，t h eI - t y p e 2 F e 一2 S 】 d o m a i n si nN a D H K T 2 4 4 0Ss u b u n i t sw a sa p p e a r e d ，j u s tl i k et h eN a D H j h lSs u b u n i t A c c o r d i n gt ot h i sa n a l y s i s ，w ed e s i g n e ds i t e - d i r e c t e dm u t a g e n e s i se x p e r i m e n ta n d c o n s t r u c th e t e r o l o g o u se x p r e s s i o np l a s m i d st h r o u g ho v e r l a pP C R T h e nw eu s eH P L C t od e t e r m i n et h ee n z y m ea c t i v i t y B u tt h ea c t i v i t yo fn i c o t i n i ca c i dd e h y d r o g e n a s e f r o mN a D H K 1 2 4 4 0a n dN a D H j A la f t e rm u t a t i o nw e r en o tc h a n g e d K e yw o r d s ：s m a l t o p h i l i a ，r e s i s t a n c ee l i m i n a t i o n , P p u t i d aK T 2 4 4 0 ，c t e s t o s t e r o n e J A l ，N i c o t i n a t ed e h y d r o g e n a s e ( N a D H ) I V 符号说明 H P L C O D L Bm e d i u m D M S O E P R N A 6 H N A 3 一C P 6 H C P X O M C D N Q D H F A D I o r Q o r N D H G 6 P H F P K 蹦I 凇 T m 符号说明 H i 曲- P e r f o r m a n c eL i q u i dC h r o m a t o g r a p h y ，高效液相色谱 O p t i c a ld e n s i t y ，光密度 L u r i a - B e r t a n im e d i u m ，L B 培养基 D i m e t h y ls u l f o x i d e ，二甲基亚砜 E l e c t r o nP a r a m a g n e t i cR e s o n a n c e ，电子顺磁共振 N i c o t i n a t e ，N i c o t i n i cA c i d ，烟酸 6 - H y d r o x y n i c o t i n a t e ，6 - H y d r o x y n i c o t i n i ca c i d ，6 一羟基烟酸 3 - C y a n o p y r i d i n e ，3 一氰基吡啶 3 - C y a n o - 6 一H y d r o x y p y r i d i n e ，6 - 羟基一3 一氰基吡啶 X a n t h i n eO x i d a s ef a m i l y ，黄嘌呤氧化还原酶家族 M o l y b d o p t e r i nC y t o s i n eD i n u c l e o t i d e N i c o t i n a t eD e h y d r o g e n a s e s ，烟酸脱氢酶 F l a v i nA d e n i n eD i n u c l e o t i d e ，黄素蛋白 I s o q u i n o l i n e1 - o x i d o r e d u c t a s e ，异喹啉氧化还原酶 Q u i n o l i n e2 - o x i d o r e d u c t a s e ，喹啉氧化还原酶 。 N i c o t i n ed e h y d r o g e n a s e ，尼古丁脱氢酶 6 - g l u c o s ep h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e ，6 - 磷酸葡萄糖脱氢酶 f i u c t o s e - 6 一p h o s p h o k i n a s e ，6 - 磷酸果糖激酶 I m i d a c l o p r i d ，吡虫啉 A c e t a m i p r i d ，啶虫咪 t h i a c l o p r i d ，噻虫啉 V 目录 摘要 A b s t r a c t 符号说明 第1 章 1 1 1 2 1 3 1 4 第2 章 目录 绪论。 烟碱类杀虫剂吡虫啉概述 烟碱类杀虫剂吡虫啉微生物转化研究进展 V l 2 吡虫啉合成前体6 - 羟基烟酸的微生物转化研究进展6 本课题的研究内容、思路及方法 9 m a l t o p h i l i aR 5 5 1 3 四环素抗性消除及G 6 P H , F P K 同源双交换质粒的构建1 2 第一节& m a l t o p h i l i aR 5 5 1 - 3 四环素抗性消除。 1 材料与方法 1 1 材料 1 2R 5 5 1 3 内源性质粒的提取及鉴定。 1 3 抗生素抗性检测 1 4 抗性消除方法 1 5 1 51 6 Sr D N A 序列测定分析 1 6 抗性质粒的电转化及菌落P C R 鉴定 1 7 羟基化毗虫啉活性的检测 2 实验结果 2 1 R 5 5 1 - 3 菌株对抗生素的抗性 2 2 R 5 5 1 3 菌株抗生素抗性的消除 2 3 R 5 5 1 3 T * 菌株的分子鉴定 1 5 1 6 1 7 1 7 1 7 1 8 1 8 1 9 1 9 2 4R 5 5 1 - 3 R 菌株的内源性质粒分析。 2 5R 5 5 1 3 n 嘴株的四环素抗性质粒的转化 2 6R 5 5 1 3 R 菌株羟基化吡虫啉活性的检测 3 讨论 第二节& m a l t o p h i l i aR 5 5 1 - 3G 6 P H , F P K 同源双交换质粒的构建。 1 材料与方法 1 1 材料 1 2 菌株培养与保藏 1 3D N A 操作 1 4 感受态细胞制备及转化 1 5 酶连产物转化感受态细胞。 2 结果 2 0 2 1 2 1 2 3 2 3 2 3 2 5 2 8 2 9 2 9 目录 2 1 2 2 3 讨论 G 6 P H 同源双交换质粒的构建 F P K 同源双交换质粒的构建3 l 第3 章Ct e s t o s t e r o n iJ A l 和Rp u t i d aK T 2 4 4 0 烟酸脱氢酶N a D H 结构与功能关系的研 究 第一节ct e s t o s t e r o n iJ A l 和Rp u t i d aK T 2 4 4 0 烟酸脱氢酶N a D H 功能域分析。 1 生物软件及网站 2 结果 2 1 3 讨论 烟酸脱氢酶功能域分析 3 2 3 3 3 3 3 3 3 4 3 4 3 7 第二节Ct e s t o s t e r o n iJ A l 和Rp u t i d aK T 2 4 4 0 烟酸脱氢酶N a D HS 亚基的定点突变3 8 1 材料与方法 1 1 材料 ：I l i 3 8 4 0 1 2 菌株培养与保藏。 1 3D N A 操作 1 4 感受态细胞制备及转化 1 5 酶连产物转化感受态细胞 1 6 菌体发酵培养方法 1 7 菌体静息细胞转化方法 1 8 烟酸脱氢酶酶活测定 2 结果 2 1Ct e s t o s t e r o n iJ A l 突变体克隆与鉴定 2 2Rp u t i d aK T 2 4 4 0 突变体克隆与鉴定 3 讨论 全文总结 论文创新和不足之处 附录 4 0 4 0 4 0 4 0 4 0 4 1 4 6 参考文献 在读期间发表的学术论文及研究成果 致谢 5 0 5 1 5 2 5 3 2 6 3 6 4 第1 章绪论 第1 章绪论 微生物转化( M i c r o b i a lt r a n s f o r m a t i o n ) 是利用微生物细胞代谢过程中的某个 酶或一组酶对底物进行催化反应的一种方法。本实验室长期致力于微生物转化的 研究，一方面是指选择微生物转化途径降解烟碱类农药，通过微生物修复法降低 农药在环境中的残留；另一方面指对微生物转化酶加以研究以期获得更为简单节 约的生产农药或农药中间体的过程。随着微生物转化实验的深入，探讨微生物转 化的机制和对微生物转化酶进行分子生物学研究已成为刻不容缓的需要。本文主 要包括两方面内容：一是对嗜麦芽寡养单胞菌Sm a l t o p h i l i a 降解烟碱类农药吡虫 啉的分子机制的研究，二是探讨Ct e s t o s t e r o n iJ A l 和Pp u t i d aK T 2 4 4 0 细胞内的 烟酸脱氢酶N a D H 功能域( 结构) 与底物特异性( 功能) 之间的关系。 1 1烟碱类杀虫剂吡虫啉概述 烟碱类杀虫剂源于植物源农药烟碱，它主要作用于害虫的乙酰胆碱酯酶受 体。早在上世纪4 0 年代前，烟碱曾是杀虫剂中的主体之一。后来由于化学农药的 迅速发展，并且烟碱又由于活性、毒性、资源等系列问题而日趋萎缩。然而， 人们对烟碱高活性的特点却一直十分关注，在化学合成农药的创制越来越困难的 情况下科技人员着手从天然源物质中经结构改造，“仿生”合成新的农药。由此， 以吡虫啉( I M I ) 为首的烟碱类杀虫剂也应运而生，并成为杀虫剂市场中一个大的 系列品种( 图1 1 ) 。 c p k 盯、飞圳。 映鱼绩 ( 日奉= - - I 公埘) c 删删 如 辱r 飞鹄N v N N q 毒I 键空投 ( 穗晒瓯d | 图1 1 烟碱类杀虫剂结构及开发公司 F i g1 1S 仃u c t u r ea n dc o m p a n i e so fn e o n i c o t i n o i di n s e c t i c i d e s 蓼孥 ( 。 第1 章绪论 吡虫啉( M I ) 由日本特殊农药制造公司和B a y e r A G 开发，属硝基亚基类内吸 杀虫剂。其具有优良的内吸性，可早期持续防治农作物害虫，效果优于噻嗪酮、 醚菊酯、抗蚜威和杀螟丹等。吡虫啉以其高效、低毒、广谱、内吸长效和独特的 杀虫机制受到国内外农药研究生产部门的极大关注，是目前市场上竞争异常激烈 的农药新品种，目前已在全球超过1 2 0 多个国家和1 4 0 多种作物上使用【l 】。 随后，武田公司的T I 3 0 4 ，及曹达公司的啶虫脒分别于1 9 9 5 和1 9 9 6 年推向市 场。其中吡虫啉和啶虫脒已在国内开发成功并批量生产，目前进入市场的杀虫剂 还有噻虫啉等。 目前国内吡虫啉及其制剂产品已有7 0 余家登记，总生产能力已过5 0 0 吨年， 究其原因主要是吡虫啉市场前景看好并具有开拓市场的潜在能量。从长远看，随 着技术的进展，质量的提高，价格的降低，剂型多品种大量的上市，吡虫啉将以 其高效、低毒、广谱的特点逐渐取代其它农药成为杀灭蚜虫、飞虱等害虫的主要 用药，市场容量会迅速扩大。杂环类杀虫剂是继有机磷、氨甲基酸酯、拟除虫菊 酯类杀虫剂之后，杀虫剂发展史上新的里程碑。 1 2 烟碱类杀虫剂吡虫啉微生物转化研究进展 1 2 1 微生物共代谢 微生物共代谢( c o m e t a b o l i s m ) 作用在难降解有机物的生物降解中发挥了非常 重要的作用。D a l t o n 和S t i r l i n g 将共代谢定义为在生长基质或其他可被转化的物 质存在的条件下对非生长基质的部分转化 2 1 。其中非生长基质( n o n g r o w t h s u b s t r a t e ) 不能作为碳源和能源用于细胞生长。共代谢包含了：生长基质存在的条 件下，生长细胞对非生长基质的转化；在缺乏生长基质的条件下，利用休眠细胞 ( 或称为静息细胞) 对非生长基质的转化；在能源物质存在的条件下利用休眠细 胞对非生长基质的转化1 3 1 。 生长基质的代谢对非生长基质的降解和转化的影响，与添加的生长基质的种 类和微生物的种类有关1 4 。最常用的两大类生长基质分别是葡萄糖、果糖、蔗糖 和淀粉等糖类化合物以及丙酮酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸和乙酸钠等有机酸盐 删。同一个微生物菌株，分别以糖类和有机酸为共代谢基质，可显示出相近或不 同的降解能力，如B u r k h o I d e r i ac e p a c i aS H 1 共代谢葡萄糖和琥珀酸，具有相同 的T N T 的消除能力嗍；而A c i n e t o b a c t e r j o h n s o n i iM A l 9 能共代谢降解有机磷农药 马拉硫磷，共代谢琥珀酸和乙酸盐能加速农药马拉硫磷的降解，但共代谢葡萄糖 和果糖的促进降解效果则低于琥珀酸和乙酸盐【l o 】。 1 2 2 微生物共代谢I M I 及其共代谢途径 随着I M I 的施用范围越来越广，有越来越多的报道显示，I M I 在土壤中有残留， 其降解半衰期超过1 0 0 天，也有报道I M I 在土壤中的半衰期为6 9 个月【7 ，l I 】。M i l e s 2 第1 章绪论 公司报道I M I 降解半衰期最长可达2 2 9 天【1 2 1 。抗性监测结果表明，害虫能在较短时 间内对烟碱类杀虫剂产生抗性。采自加利福尼亚甜瓜田的粉虱B e m i s i a a r g e n t i f o l i i 种群，在温室用I M I 筛选2 4 代，可对其产生8 2 倍抗性。随着害虫对I M I 抗性的增加， I M I 的使用剂量呈现不断增加的趋势，因而其对环境的危险性也在不断增加忉。 在土壤降解和微生物代谢途径中，I M I 先羟基化生成5 h y d r o x yI M I ，5 - h y d r o x yI M I 脱水后生成o l e f mI M I 是一条主要的代谢途径【1 1 ( 图1 2 ) 。因此，微生物代谢I M I 可降低M I 在环境中的残留，这对减少环境污染也有较重要的理论和应用价值。 有关土壤、动植物代谢烟碱类杀虫剂及代谢产物的研究已有很多文献报道【1 ， 1 3 】，I M I 在土壤中的代谢途径见图1 2 。在微生物共代谢I M I 研究方面，A n h a l t 报道L e i f s o n i as p P C 2 1 菌株可共代谢降解I M I ，在培养基中分别添加琥珀酸和 葡萄糖，三周后L e i f s o n i as p P C 2 1 可分别降解3 7 和5 8 的I M I ，其代谢中间 产物为g u a n i d i n e 和u r e aI M I 【7 1 。 I C 0 2 + b o u n dr e s i d u c e s 图1 2I 在土壤中的代谢途径 F i g1 2P r o p o s e dm e t a b o l i cp a t h w a yo fl M Ii ns o i l s 本实验室自2 0 0 2 年起开展了微生物代谢烟碱类杀虫剂的研究，先前分别报 道了嗜麦芽寡养单胞菌 m a l t o p h i l i a ) 共代谢降解烟碱类农药吡虫啉( I M I ) 、啶 虫咪( 丸心) 、噻虫啉( T H I ) 等叶1 7 1 。其中m a l t o p h i l i aC G M C C1 1 7 8 8 菌株具有最 高I M I 羟基化活性。本实验室在研究嗜麦芽寡养单胞菌假m a l t o p h i l i a ) 共代谢烟 碱类农药吡虫啉叫D 时，发现分别以糖类和有机酸为生长基质，m a l t o p h i l i a 具有不同的I M I 降解能力，以糖为共代谢基质，m a l t o p h i l i a 产生羟基化代谢途 径，生成5 - h y d r o x yI M I 和o l e f i nI M I ；以有机酸为共代谢基质，m a I t o p h i l i a 除 产生羟基化代谢途径外，还产生硝基还原代谢途径，生成中间代谢产物u e aI M I 第1 章绪论 和n i t r o s o i m i n eI M I ( 图1 3 ) 。羟基化反应和硝基还原反应是两种截然不同的反 应类型，显然共代谢基质的不同代谢途径影响了M I 不同代谢途径中酶的活性， 从而导致产生了不同的M I 代谢途径，其机理目前尚不清楚。 5 - h y d r o x y H 胪p c H u r e a g u a n i d i n e 一，共代谢基质为蔗糖，一，共代谢基质为琥珀酸钠 图1 3 & m a l t o p h i l i a 共代谢I l v l I 的降解途径 F i g1 3 T h ep a t h w a yo f m a l t o p h i l i ac o m e t a b o l i cd e g r a d a t i o no fl M I 比较糖类和琥珀酸的代谢途径，糖类首先经过E M P 或H M P 途径生成丙酮 酸，丙酮酸在有氧条件下，生成的乙酰辅酶A 进入T C A 循环或乙醛酸循环 ( G A C ) ，因而课题组推测糖类和有机酸的共代谢引起了I M I 代谢途径的改变极 有可能是由于E M P 或H M P 途径引起的。按照有关共代谢理论，静息细胞( 细 胞不生长) 共代谢中的共代谢基质的作用应为生产还原力( N A D H 或N A D P H ) ， 糖代谢途径和有机酸代谢途径均产生N A D H ，而H M P 途径产生N A D P H 。因而 糖类和有机酸的共代谢引起I M I 代谢途径的改变可能与N A D P H 有关。 m a l t o p h i l i aR 5 5 1 3 具有完整的E M P 和H M P 途径，也存在G A C 途径。因而试图 以模式菌株m a l t o p h i l i aR 5 5 1 3 菌株为研究对象，通过分子生物学方法敲除其 代谢途径中的关键酶的基因，将获得的糖和有机酸共代谢途径阻断的突变株用于 共代谢I M I ，研究糖类和有机酸代谢的代谢途径与I M I 降解和降解途径的关系， 从而从共代谢基质代谢途径的差异阐明其对共代谢的影响及其机制( 图1 4 ) 。 这一现象发生机理的阐明，相信对于研究共代谢基质的代谢途径与非生长基质代 谢和代谢途径关系，深入了解和认识共代谢的内在调控机制具有较重要的理论意 义和实用价值，同时也为研究烟碱类农药的微生物法消除，减少环境污染提供理 论依据和应用指导。 4 帅p k 第1 章绪论 蕾鼙 l I O P H + 1 4 N D P H + 伊 蕾1 1 1 - I 辟t l 叠U e 与乙弋名 1 0 9 个转化- - T - I t g D N A ，这一密度通常要培养2 5h 。) ： 4 ) O D 6 0 0 值达到0 4 时，从摇床中取出摇瓶，迅速将培养物置于冰上冷却1 5 3 0 r a i n ，不时缓慢摇匀以保证内容物充分冷却，将离心管至于冰上预冷，为下 一步做准备； 5 ) 将细菌转移至冰冷的离心管中，在4 5 0 0 0 r p m 下离一1 二, 1 5r a i n ，回收细胞， 弃上清液，沉淀用5m L 灭菌的冰水重悬浮细胞； 6 ) 加5 0 0m L 灭菌的冰水，混匀，按步骤5 重复离心一次，小心弃去上清液，用 残余液体重悬浮细胞； n 用4m L 灭菌的、冰冷后的1 0 甘油重悬浮细胞，4 5 0 0 0 r p m 下离一t , 1 5r a i n ， 小心弃去上清液( 沉淀可能会很松散) ； 8 ) 估计沉淀体积( 约5 0 0 止5 0 0m L 培养基) ，然后加入等体积冰冷后1 0 甘油， 重悬菌体，按5 0 此等份装入预冷的微量离心管中，于8 0 保存。 1 4 2C a C l 2 ( 氯化钙) 转化Ec o l iD H I O B 感受态细胞的制备方法 1 1 将适合菌株( Ec o l iD H l 0 B ) 于L B 固体培养基上划线，在3 7o C 下过夜培养； 2 ) 从L B 平板上挑取新活化的Ec o l iD H l 0 B 单菌落，接种于含2 0m LL B 液体培养 基的1 0 0m L 锥形瓶中，3 7 ，2 2 0r r a i n 下振荡培养过夜； 3 ) 1 接种量将培养过夜的菌液接种至盛有5 0m LL B 液体培养基的2 5 0m L 锥形 第2 章& m a l t o p h i l i aR 5 5 1 3 四环素抗性消除及G 6 P H 、F P K 同源双交换质粒的构建 瓶中3 7 ，2 2 0r r a i n 下振荡培养，每隔2 0I I l i n 测量一次O D 6 0 0 值； 4 ) O D 6 0 0 值达到0 4 时，从摇床中取出摇瓶，迅速将培养物置于冰上冷却1 5 - - 3 0 m i n ，不时缓慢摇匀以保证内容物充分冷却，将离心管至于冰上预冷，为下 一步做准备； 5 ) 将细菌转移至冰冷的离心管中，在4 ，4 0 0 0 r p m 下离，b 5m i n ，回收细胞， 弃上清液； 6 ) 加入1 0m L 灭菌、预冷的7 5m MC a C l 2 ，轻轻吹吸悬浮细胞( 不能震荡) ； 7 ) 冰浴菌体4 0m i l l ，在4 ，4 0 0 0 r p m 下离一b 5m i l l ，回收细胞； 8 ) 弃上清液，加入3 3 m l7 5m MC a C l 2 ，1 1 m l5 0 甘油轻轻吹吸悬浮细胞( 不 能震荡) ； 9 ) 按1 0 0I x L 等份装入预冷的微量离心管中，于8 0 保存。 1 5 酶连产物转化感受态细胞 在冰上解冻C a C l 2 感受态细J 孢E c o l iD H l 0 B 后，加入5 此连接液，冰浴1 5 r a i n 。 4 2 0 C 热击9 0 S ，冰浴l m i n ，加入8 0 0 1 x LL B 培养基，3 7o C2 2 0r r a i n 下培养细胞1h 以复原，涂布L B 平板，室温下待培养板中的液体被完全吸收，将平板置于3 7o C 培养箱培养1 6h 。 2 结果 2 1G 6 P H 同源双交换质粒的构建 从m a l t o p h i l i aR 5 5 1 3 基因组上P C R 扩增G 6 P H _ 1 2 下游基因同源臂约1 0 0 0 b p ，从 p E C B A C l 质粒上P C I 咿增单独的C m 基因约6 7 0 b p 和含自身启动子的C m 基因约7 4 0 b p ， 割胶回收所得片段，与p M D l 8 T 相连，挑取阳性克隆，经测序公司测序正确后，用相 应的限制性内切酶消化，同时也将质粒p E X l 0 0 T l i n k 用相应的限制性内切酶消化，后 将E