PCR的原理和操作过程课件.ppt

PCR原理和基本操作过程,2015.12.5,临床146生化实验小组,第一节PCR技术原理,聚合酶链式反应（polymerasechainreation,PCR)是一种DNA体外核酸扩增技术。该技术能在短时间内将极微量的目的基因或某DNA片段扩增至十万乃至百万倍，从极微量的标本中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。PCR技术具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。PCR基本原理PCR基本反应步骤,一、PCR的原理,PCR技术是一种在体外模拟DNA的复制过程的核酸扩增技术。其原理是根据DNA的半保留复制，以及DNA分子在体外不同的温度下双链和单链可相互转变的机制，在体外人为地控制反应系统的温度，使双链DNA变性，成为单链DNA；其次，单链DNA与人工引物链在退火过程中配对结合；最后，在DNA聚合酶的催化作用下，使引物沿单链模板延伸为双链DNA，实现DNA的扩增。PCR三个基本反应步骤构成，即变性、退火、引物延伸。,二、三个基本步骤,变性(denaturation)-高温下将模板DNA双链打开退火(annealing)-引物在较低温度下以共价键结合到模板DNA互补部位延伸(extension)-TaqDNA聚合酶作用下，不断向引物3端添加DNTP，DNA链不断延伸,反应液中含有所有成分，以温度变化来控制反应阶段：变性95度，退火55度，延伸72度。,重复13步2530轮,目的DNA片段扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链与引物复性,DNA变性形成2条单链,子链延伸DNA加倍,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,模板DNA,变性,第一轮扩增,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,退火,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,延伸,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第2轮结束,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,PCR的特点,PCR的特点,第二节PCR的实验步骤,标准的PCR反应体系,10X扩增缓冲液：5l模板DNA:0.12g引物：各0.21mol/L4种dNTP:各200mol/LMg2+:1.5mmol/LTaqDNA聚合酶：2.5UddH2O补齐总体积：50l,可以按照比例放大或者缩小体系，不同的PCR反应需要优化按照实验方案进行即可,1.加样将上述总体积为50l的反应体系加入一无菌0.5ml离心管中2离心将加入的反应物混合均匀后稍离心，加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上3扩增在PCR仪上设置PCR反应参数（具体数据根据引物和扩增片段的大小而定）：94下加热4分钟左右；依次94变性1分钟，45退火1分钟，72延伸2分钟，循环32次左右；72下保温7分钟，使反应产物扩增充分4PCR扩增产物分析PCR产物是否为特异性扩增，其结果是否可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法,PCR循环参数,（热力学参数）,94，3min；94，45s；58，1min；循环30次72，1min；72，10min；16保温,94预变性，3min使DNA双链完全打开,退火：58，1min温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合，降低温度