（生态学专业论文）一株对氯苯胺降解菌的分离鉴定及其降解特性的研究.pdf

摘要 从某化工厂污水处理车间好氧池活性污泥中分离到一株降解对氯苯胺 p c h l o r o a n i lj n e ，简称p c a ) 的细菌p c a 0 3 9 菌株，该菌株能够以对氯苯胺为唯一碳源、 能源和氮源生| 丈，同时还可以利用苯胺、邻氨对苯酚和间氨对苯酚生长。经过对其形态 特征、生理生化、以及1 6 sr d n a 序列分析，该菌株初步鉴定为d i a p h o r o b a c t e rs p 。进 一步研究表明，该菌株在生长过程中，氯离子释放同步于对氯苯胺降解，并且氯离子的 释放量与对氯苯胺的降解量相当。其利用对氯苯胺生长的最适温度和p h 分别为3 0 。c 和 7 5 ，3 天时间内的最适降解浓度为3 0 0m g l ( 2 3 5m m o l l ) 。最适通气量试验表明，在 5 0 0 m l 体系中，装液量为1 5 0m l 最好。测定了降解途径中相关酶的活性，表明对氯苯胺 经过苯胺双加氧酶初始氧化和羟基化后，芳环的裂解是由邻苯二酚2 ，3 一取加氧酶 ( c 2 3 0 ) 催化的，并且该酶的底物范围较广，可以转化多种邻苯二酚类化合物，并有较 高的酶活性。 目前，d i a p h o r o b a c t e rs pp c a 0 3 9 是国内首次分离出的一株以对氯苯胺为唯一碳源、 能源和氮源的高效降解菌通过本实验，在理论上初步阐明微生物降解此类化合物的特 性和机理，在应用上提供优良菌种，希望能对我国的氯代苯胺类化台物的污染治理有所 裨益。 关键词对氯苯胺；生物降解；d i a p h o r o b a c t e r v a b s t r a c t ab a c t e r i a ls t r a i nt h a td e g r a d e sp 。c h l o r o a n i l i n e ( p c a ) w a si s o l a t e df r o ma c t i v a t e ds l u d g e o fw a s t e w a t e rt r e a t m e n tp l a n tt r e a t i n gw a s t e w a t e rf r o mac h e m i c a lf a c t o r y r e s u l t si n d i c a t e d t h i ss t r a i nt o o kp c h l o r o a n i l i n ea ss o l ec a r b o n ，e n e r g ys o u r c e sa n dn i t r o g e n ，s i m u l t a n e i t i l y , i n c l u d i n ga n i l i n e 。- a m i d o p h e n o la n dm a m i d o p h e n o l ，i tw a s i d e n t i f i e da sd i a p h o r o b a c t e rs p p c a 0 3 9a c c o r d i n gt oi t sm o r p h o l o g y , a n db i o c h e m i c a lp r o p e r t i e s ，a n d1 6 sr d n as e q u e n c e a n a l y s i s f u r t h e rs t u d yi n d i c a t e dt h a tc h l o r i d ei o nw a sr e l e a s e ds i m u l t a n e o u s l ya n ds t o i c h e m i c a l l y t op - c h l o r o a n i l i n ed e g r a d a t i o nd u r i n gc u l t i v a t i o n ，t h eo p t i m a lp ha n dt e m p e r a t u r ef o rc e l l g r o w t ha n dp - c h l o r o a n i l i n ed e g r a d a t i o n w e r e7 5a n d3 0 c ，r e s p e c t i v e l y ，a n dt h eo p t i m a l c o n c e n t r a t i o no f p c h l o r o a n i i i n ei nt h r e ed a y sw a s3 0 0m l ( 23 5m m o l l ) a n d a i ra m o u n ti n 5 0 0m ls y s t e mi s 15 0m l e n z y m a t i ca n a l y s i ss h o w e d t h a ti n i t i a lr e a c t i o n so f p 。c h l o r o a n i l i n e d e g r a d a t i o nb yd i a p h o r o b a c t e rs p p c a 0 3 9w e r ec a t a l y s e db ya n i l i n ed i o x y g e n a s ea n dt h e n t h ec l e a v a g eo fa r o m a t i cr i n gc a t a l y s e db yc h l o r o c a t e c h o l2 , 3 一d i o x y g e n a s e ( c 2 3 0 ) c 2 3 0 c o u i dt r a n s f o r ms e v e r a lc a t e c h o l s ，a n di t se n z y m a t i ca c t i v i t yi sh i g h e r - b y t h i s t i m e ，d i a p h o r o b a c t e rs p p c a 0 3 9 w a st h ef i r s tb a c t e r i ns t r a i n t o o k 口c h i o r o a n i l i n ea ss o l ec a r b o n ，e n e r g ys o u r c e s a n dn i t r o g e ni nc h i n a i tw a sp r i l i m i n a r i l y e x p l a i n e df o rt h ec h a r a c t e r i s t i c sa n dm e c h a n i s m t h ed e g r a d a t i o no f p - e h l o r o a n i l i n ef r o mt h e r c s e a r c ho fs t r a i np c a 0 3 9 ，a n dt h eb a c t e r i ls t r a i np c a 0 3 9w i t hh i g hc a p a b i l i t y t od e g r a d e p c aw a sp r o v i d e di na p p l i c a t i o np r a c t i c e ，i naw o r d ，t h i ss t u d y w a se x p e c t e dt ob eb e s t e a df o r t r e a t i n gw i t ht h ep o l l u t i o no f c h l o r o a n i l i n e s ( c a s ) o f c h i n a v 摘要 k e yw o r d sp c h l o r o a n i l i n e ；b i o d e g r a d a t i o n ；d i a p h o r o b a c t e r a p p l i a n t ：r e nh u a f e n g m a j o r ：e c o l o g y s u p e r v i s o r ：p r o f l is h u q i n 1 引言 1 1 研究背景和意义 氯代芳烃类化台物( c h l o r o a r o m a t i c s ) 是一类污染面积j 、毒性较大的化合物，f 泛 存在于纺织、皮革鞣制、干洗废液等 业废水中，且大多具有致畸、致癌、致突变效应。 作为环境外来物，由于天然微生物缺乏降解此类化合物的酶或酶系，故其通常难以生物降 解，持久滞留于环境中，并易于生物富集对生态环境和人体健康构成威胁。在美国环保 署( e p a ) 所列的1 2 9 种优先污染物中占2 5 种之多，受到人们的日益关注( 傅珊珊，2 0 0 1 ) 。 作为氯代芳烃化合物的一族，氯代苯胺类化合物在杀虫剂、染料、塑料和药物等的合成中 大量使用( fb r u n s b a c h 等，1 9 9 3 ) ，广泛污染环境。这类有毒、难降解的化合物已被欧盟 立法控制，并在e p a 优先污染物名单之中( nb o o n 等，2 0 0 1 ) 。另外，除了直接进入自 然界的氯代苯胺类化合物外，它又是氯代硝基芳烃类化合物和除草剂( 如苯脲、苯氨甲酸 酯和某酰苯胺) 的常见中间代谢产物( c wc h a n g 等，1 9 9 3 ) 。据报道，由于物理和化学 吸收、土壤及其腐殖质的吸附作用，施用除草荆的土壤在多年后仍有氯代苯胺类化合物的 存在，它们可以危害土壤中的微生物系统( c 下c o r k e 等，1 9 7 9 ：d f r e i t a g 等，1 9 8 4 ) 。由 于物理化学处理方法的高成本及其易产生二次污染，研究氯代苯胺类化合物的微生物降解， 不仅具有重要的生态环境效益和社会效益，而且还具有很高的经济价值。上世纪七八十年 代以来，国外研究者对氯代苯胺类化合物的微生物降解研究做了大量的工作。发现和分离 了一些可以降解此类化合物的降解菌，并对其降解特性、降解机理、代谢途径及相关降解 酶甚至降解基因的调控表达进行了较深入的研究。而在此方面国内至今还没有相关的研究 报道。本研究主要对一株高效降解对氯苯胺的细菌p c a 0 3 9 进行了分离鉴定研究了该菌 株降解对氯苯胺的生理生化特性并初步探讨了该菌的对氯苯胺降解酶系。在理论上初步 阐明好氧微生物降解此类化合物的特性和机理，在应用上提供优良菌种。希望能对我国的 氯代苯胺类化合物的污染治理有所裨益。 1 2 国内外研究动态 不北农业火学理学硕上学位论文 1 2 1 氯代苯胺降解菌 氯代苯胺是类难降解化合物，很难被一般微生物所降解，但在氯代苯胺长期污染的 环境中也存在一些降解菌。迄今为止，已经发现和分离了一些可以降解此类化合物的降解 菌。表1 - 1 列举了活性较高的微生物，它们分别属于假单胞菌属、睾丸酮丛毛单胞茁、 m o r a x e l l a s p 、d e 圻妇s p 和真菌中的r h i z o p u ss p 和镰刀菌属( f u s a r i u ms p ) 等，其中大 部分细菌属于变形菌纲( p r o t e o b a c t e r i a ) ( vm o l g a 等，2 0 0 2 ) 。h r e b e r 等用相应的降解 底物对一株洋葱假单胞菌m u l t i v o r a n s ) a n l 中的苯胺降解酶进行诱导，使其能够对2 - c a 、 3 - c a 、p c a 和3 , 4 d c a 进行分解代谢，氧化率分别为4 6 、6 6 、2 0 和3 ( h r e b e r 等，1 9 7 9 ) 。z e y e r 等于1 9 8 2 年首次在纯培养条件下，从土壤中分离出一株以氯代苯胺类化 合物为唯一碳源、能源和氮源的假单胞菌属( p s e u d o m o n a ss p ) 菌株g ，该菌在2 8 c 、p h 6 的好氧条件下1 0 天时间内可完全降解3m m o l l ( 3 8 5r a g l ) 的p c a 。通过测定“c 标记的 p c a 的降解，发现6 4 的碳以c 0 2 的形式释放，1 4 的碳成为生物有机体( j z e y e r 等， 1 9 8 2 ) 。j 1 a t o r r e 等通过假单胞菌属的苯胺或甲苯胺降解菌几和氯代邻苯二酚降解菌b 1 3 进行自然基因交换得到降解性能都有所提高的5 株杂交菌，其中菌株j l 5 对3 - c a 的降 解能力最强( j l a t o r r e 等，1 9 8 4 ) 。e gs u r o x c t s e v a 等于1 9 8 5 年从被一种除草剂( p r o p a n i d e ) 长期污染的黑钙土中分离出一抹缺陷假单胞菌( 户d i m i n u t a ) i n m ik s - 7 ，该菌株在2 8 c 、 p h7 、0 3 2 9 细胞于重馆底物条件下，约5 0 h 内可完全降解2 3 5m m o l l ( 3 0 0m g l ) 的p c a 和3 - c a ，同时也可在9 6 h 内降解0 3 1 m m o l l ( 5 0 m g l ) 的3 ，4 二氯苯胺( 3 ，4 一d c a ) ( e g s u r o v t s e v a 等，1 9 8 5 ) 。m 。l o i d l 等从土壤中分离出4 株食酸假单胞菌( 户a c i d o v o r a n s ) c a 2 6 、 c a 2 8 、c a 3 7 和c a 4 5 。它们都能够以苯胺、3 - c a 和p c a 为唯一碳源、能源和氮源。其中 菌株c a 2 8 降解能力最高，在2 5 c ，p h6 0 6 2 5 的条件下，7 2 h 内可完全降解2 6 0 r a g l ( 2 0 2 m m o i 儿) 的3 - c a ，延缓期为1 0 1 2 h ，降解速率1 ，6 3r e t o o l 克，生物量小时，细胞增倍时间 ( g ) 为7 7 h 但c a 2 8 不能完全降解p c a ，且基本不降解2 - c a ( m l o i d l 等，1 9 9 0 ) 。 c h i n t e r e 鹳e r 等从菌株c a 2 8 降解底物3 - c a 和2 - c a 的混合培养液中经过底物诱导分离到 一株以2 - c a 为唯一碳源、能源和氮源的食酸假单胞菌( 尸a c i d o v o r a n s ) c a 5 0 ，在p h 6 。1 2 0 j高 条件r ，3 天内菌株c a 5 0 可完全降解1 9 0 m g 几的2 - c a ( c h i n t e r e g g e r 等，1 9 9 4 ) 。nb o o n 等从活性污泥中分离出能够降解3 - c a 的一株睾丸酮丛毛单胞菌( c o m a m 。n t e s t o s t e m f ) 1 2 ，接种子活性污泥中，进行实验室规模半连续活性污泥试验( s c a s ) ，经过6 天的适应 期后，2 周对间内3 - c a 侄被完全降解( b o o n n 等，2 0 0 0 ) 。fb r u n s b a c h 等在利用外加降 解菌与士著菌治理氯代苯胺污染土壤的可行性研究中认为，在3 0 。0 温度下、6 周时间内土 著菌可部分降解2m m o l l 的3 - c a 和3 , 4 - d c a ( 5 0 去除率) ，而按入8 1 0 6 个菌克干土 的食酸假单胞菌( pa c i d o v o r a n s ) b n m 3 1 和f r b 4 ，5 后，2 4 h 便可降解8 6 的3 - c a ( f b r u n s b a c h 等，1 9 9 3 ) 。q e m t i a z i 等报道了1 0 株能够在水中降解苯胺及氯代苯胺类化合物 的真茁，其中r h i z o p u ss p 和镰刀菌属( f u s a r i u ms p ) ，仅在葡萄糖( 1 0m m o l l 底物；5 m m o l l 葡萄糖) 存在的条件下，以2 - c a 和3 - c a 为氮源，同时生成邻苯二酚、氨和氯化物 ( ge m t i a z i 等，2 0 0 i ) 。通过比较以上各氯代苯胺类化合物高效降解菌的降解能力可知， 虽然假单胞菌属( p s e u d o m o n a ss p ) 菌株g 可完全降解3 8 5m g ，l 的p c a ，是p c a 高效降 解菌中降解底物浓度晶高的一株，但降解时间却k 达1 0 天的时间。而缺陷假单胞菌( p d i m i n u t a ) 1 n m lk s 。7 可在约5 0 h 内可完全降解3 0 0t o g a 4 2 3 5m m o l l ) 的p c a 和3 - c a ， 同时也可在9 6 h 内降解5 0m g l ( 0 3 1m m o l l ) 的3 ，4 - 二氯苯胺( 3 , 4 d c a ) ，虽然其降解p c a 的最高浓度略低于菌株g ，但从降解速率和底物范围等方面综合考虑，缺陷假单胞菌【| f = 馥n “幻) 1 n m ik s 7 应是迄今已报道的氯代苯胺类化合物高效降解菌中降解底物能力最 高的一株降解菌。 1 2 2 代谢途径 g t 前为止，人们对氯代芳烃类化合物的好氧微生物降解代谢途径已做了较深入的研究。 多数研究者认为，氯代芳烃的降解代谢有两种途径：修饰邻位开环裂解途径( i ，2 位开环) ( j l a t o r r e 等， 1 9 8 4 ：j z e y e r 等，1 9 8 5 ；v m o l g a 等，2 0 0 2 ) 和间位开环裂解途径( 2 ， 3 位或1 ，6 位开环) ( g m k i e c k a 等，1 9 8 1 ：jj ，a r e n s d o r f 等，1 9 9 5 ；a e m a r s 等，1 9 9 7 ) 。 这两种代谢途径都是以氯代邻苯2 2 酚为中间代谢产物的，所以与邻苯二酚的降解代谢有许 多相似之处( m s c h l o m a n n 等，1 9 9 4 ) 。以氯代苯胺类化合物为例，见图i - 1 ，2 - c a 、3 - c a 、 表1 - 1 降解氯代苯胺类化合物活性较高的降解菌 t a b e l1 - 1r e l a t i v eh i g he f f i c i e n t d e g r a d a t i o ns t r a i n s = ：一菌株底 物 最高浓度参j f 戛_ 广 m m o l o 一一 ( ，l 1 p s e u d o m o n a s s p -3 - c a + p c a3 j z e y e ri 1 丽i p a c i d o v o r a n sc a 2 8 尸a c i d o v o r a n sc a 5 0 m o r c c c e l l a s p s t r a i ng pd i m i n u t as t r a i ni n m i k s - 7 p a c i d o v o r a n ss t r a i n b n 3 1 d e l f t t i aa c i d o v o r a n s l m e l c o m a m o n a sl e s t o s t e r o n i s t r a i nf 2 f u s a r i u ms p 3 一c a p c a 2 一c a 3 - c a p c a 3 - c a + 3 4 d c a m l o i d l 等，1 9 9 0 c h i n t e r e g g e r 等， 1 9 9 4 j ，z e y e r 等，1 9 8 2 ： 1 9 8 5 e gs u r o v t s e v a 等， 1 9 8 5 eb r u n s b a c h 等，1 9 9 3 3 - c a 17 3 n b o o n 等，2 0 0 1 3 - c a 1 5 7n b o o n 等，2 0 0 0 2 c a ( 加5 m m o l 葡萄糖) q e m t i a z i 等，2 0 0 1 p s p s t a i nj l 2 3 - c a2 j l a t o r r e 等1 9 8 4 p a r g 口o c c 3 , 4 d c a0 9 3 e gs o u r o v t s e 等， d e n i t r i f i c a n s3 c a p c a + 3 c a 5 5i1 9 9 6 注：p c a ：x q 氯苯胺；3 - c a ：间氯苯胺；2 - c a ：邻氯苯胺：3 , 4 d c a ：3 ，4 二氯苯胺 p c a 经苯胺双加氧酶初始氧化和羟基化生成3 氯邻苯二酚和4 - 氯邻苯二酚，然后再经过氯 代邻苯二酚1 ，2 双加氧酶或氯代邻苯二酚2 ，3 双加氧酶以及其他一系列酶的作用下，最 后进入三羧酸循环( t c a ) ，生成c 啦、h 2 0 和c 1 一( j l a t o r r e 等，1 9 8 4 ) 。但氯代芳烃的 闻位开环裂解途径( 2 ，3 位开环) 经常导致“死”产物( d e a d e n dp r o d u c t ) ( 所谓死产物就是可 4 吆钾如 d 婚 ： 如 m 玛 2 使关键降解代谢酶失活的中间代谢产物) 的形成( gm k i e c k a 等，1 9 8 1 ) ，如3 氯邻苯二 酚、4 一氯邻苯二酚、2 氯4 一草酰巴豆酸( j z e y e r 等，1 9 8 5 ) 等。j ，z e y e r 等认为能够以氯 代苯胺为唯一碳源、能源和氮源的微生物应该同时具有两个基本的性质：( 1 ) 含有专一性 低的苯胺双加氧酶：( 2 ) 具有修饰邻位开环裂解途径( i ，2 位开环) ( j z e y e r 等，1 9 8 5 ) 。 w i h n 等通过研究氯代芳烃降解菌a n1 1 7 、a n2 1 3 和l m b t7 4 8 1 ，也得出类似的结论( w l h n 等，1 9 8 9 ) ，否则就会有“死”产物的产生。 分& 。蚕 ，删1 2 懈1 “ 卣。 图1 - 1 氯代苯胺类化合物好氧微生物降解的初始化反应1 2 6 f i g i - i i n i t i a lr e a c t i o n so f c h l o r o a n i t i n e sd e g r a d a t i o n 1 2 2 1 修饰邻位开环裂解途径 j z e y e r 等认为，虽然“普通”( n o r m a l ) 邻位开环裂解途径广泛存在于芳烃类化合物 ( 苯胺、苯甲酸、苯酚等) 的微生物降解中，但芳烃类化合物降解菌的“普通”邻位开环 途, 径( c 1 2 0i ) 不能分解代谢氯代芳烃，故推断此代谢途径不是“酱通”邻位开环裂解途径， 而是经过修改的，所以人们把氯代芳烃邻位开环裂解途径称为“修饰”( m o d i f i e d ) 邻位开 网严 一忸一兽! 网卜 忸 口 。卣+ 环裂解途径( c 1 2 0 i i ) ( jz e y e r 等，1 9 8 5 ) ，这个概念首先被j l a t o r r e 等在研究氯代苯胺 类降解苗间的基因自然交换时提出，并在尸s p b 1 3 中发现( jl a t o r r e 等，1 9 8 4 ) ，随后在 3 一氯苯甲酸降解菌j m p l 3 4 中也发现了此代谢途径( m s o n d o s s i 等，1 9 9 2 ) 。相对于问位 开环裂解途径( c 2 3 0 ) ，修饰邻位开环裂解途径是大多数氯代芳烃类化台物的好氧微生物降 解代谢的一条最有效和较普遍的完全降解途径。许多降解菌都是通过此选径进行代谢的 故研究者对此降解途径研究的较多和较深入如莫拉氏属g ( 降解p c a ) ( j z e y e r 等，1 9 8 5 ) 、 食酸假单胞菌c a 2 8 ( 降解3 - c a ) 和c a 5 0 ( 降解2 - c a ) ( ml o i d l 等，1 9 9 0 ) 、浑浊红球菌 i c p ( 降解2 一氯苯酚和2 ，4 - 二氯苯酚) ( v mo l g a 等，2 0 0 2 ) 、r a l s t o n i ae u 加o p h aj m p l 3 4 ( 降 解3 - 氯苯甲酸) ( c m l a e m m l i 等，2 0 0 0 ) 、铜绿假单胞菌( 户a e r u g i n o s a ) 1 4 2 ( 降解2 - 氯苯甲酸和2 ，4 一二氯苯甲酸) ( m ec o r b e l l a 等，2 0 0 1 ) 、伯克氏菌属( b u r k h o l d e r i as p ) n k s ( 降解3 或4 r 氯苯甲酸) ( s l i u 等，2 0 0 1 ) 、绿针假单胞菌( 尸c h l o r o r a p h i s ) r w 7 1 ( 降 解四氯苯1 ( tp o t r a w f k e 等，2 0 0 0 ) 等都是通过修饰邻位开环裂解途径进行降解代谢的。 氯代芳烃类化台物，如氯代苯胺、c h l o r o d i b e n z o f u r a n 、氯代联苯、氯代联苯醚、氯代苯甲 酸、氯代苯酚、氯苯、c h l o r o p h e n o x y a c e t a t e s ，经初始双加氧酶氧化产生氯代邻苯二酚氯 代邻苯二酚首先在氯代邻苯二酚1 ，2 - 双加氧酶作用f 开环产生氯代康粘酸，然后经氯代康 粘酸环异构酶和氯代康粘酸去卤酶作用下产生顺- 或反- 二烯内酯，在顺- 二烯内酯水解酶的 作用下产生；i i 唤q 一烯二酰基乙酸，再经顺丁烯二酰基乙酸还原酶生成3 - 氧代己二酸，最后进 入t c a 循环( ms c h l o m a n n 等，1 9 9 4 ；v m o l g a 等，2 0 0 2 ) 。当然这只是一个基本的修 饰邻位开环裂解途径对于不同的底物、不同的降解菌，其各种代谢酶甚至中间代谢产物 是有筹异的。图1 - 2 为浑浊红球菌( r h o d o c o c c u so p a c u s ) 1 c p 降解2 氯苯酚的修饰邻位 开环代谢途径( vm o l g a 等，2 0 0 2 ) a 6 引言 卣：，氯邻革瑚。一。 9 l 邻苯二酚m 。 上0 。谚9 。氯蝴9 凛一。， l 、一 2 氯扁 占酸q _ c “。f 删c o n 址e ) 、r值瞳h 她n 州、 。豢点_ 。差oo 搿。 0 图i 2 在r h o d o c o c c u so p a c u s1 c p 中2 - 氯苯酚的部分修饰邻位开环裂解途径代谢途径“ f i g 1 2d e g r a d a t i v em o d i f i e do r t h o c l e a v a g ep a t h w a y sf o r3 - c h o l r o c a t e c h o la n d 4 - c h l o r o c a t e c h 0 1 t h ec e n t r a li n t e r m e d i a t e si nc h l o r o p h e n o ld e g r a d a t i o n a sf o u n di n r h o d o c o c c u s o p a c u s 1c p 12 2 2 间位开环裂解途径 普遍认为氯代芳烃类化合物不能通过3 - 氯邻苯二酚途径进行间位开环裂解代谢。因 为3 氯邻苯二酚通过间位开环裂解产生的一种酰基氯化物( 如恶臭假单胞菌p a w l ) ，甚至 3 氯邻苯二酚本身，都可通过与氯代邻苯二酚2 ，3 双加氧酶( c 2 3 0 ) 中的f e “发生螫合作用， 从而导致c 2 3 0 发生不可逆失活，如恶臭假单胞菌f 1 ( gm k i e c k a 等，1 9 8 1 ) 。通常4 - 氯邻苯二酚也是一种可使酶失活的“死”产物，但有些降解菌却可以通过4 氯邻苯二酚的 间位开环裂解代谢途径进行降解，但十分缓慢( a e ，m a r s 等，1 9 9 7 ) 。a e m a r s 等报道认 为氯代芳烃和甲基芳烃的代谢也可通过3 - 氯邻苯二酚途径进行问位开环裂解代谢，因为通 过研究一株恶臭假单胞菌( 户p u t i d a ) g j 3 1 对氯苯和甲基苯的代谢途径及酶机理，发现菌 株g j 3 l 的间位裂解酶c 2 3 0 能够不被酰基氯代物失活，并且在菌株g j 3 l 的细胞中没有检 7 的( f r o j o 等，1 9 8 7 ：ae m a r s 等，1 9 9 7 ；s r k a s c h a b e k 等，1 9 9 8 ) ，这是很难得的+ 羟基康粘酸半醛恰恰是4 - 氯邻苯二酚间位开环裂解途径的重要中间产物，因此证明此降解 6 孚连：鼍。：争蕊：7 氯苯 王氯埠犀苯二酚磕邻荤二置 2 羟基丘氯继基康估酸二羟基- 畸i 辱日# 舌破 善当6h 。卜r 蕈h 也c ：。 4 - 覃酰巴豆酸 2 - 氧麟艘蝇蒌2 氧媸 丙酮驶 置譬 。c f o t m2 叫e e却p 2 o x o v d 苒w d m 2 啪 图1 3 甲苯和氯苯降解菌，u t i d ag j 31 的推测问位开环裂解途径1 相关酶：1 ，氯笨双加氧酶：2 ，氯苯双氢二醇脱氢酶：3 。邻苯二酚2 ，3 - 双加氧酶： 4 ，4 - 草酰巴豆酸异构酶；5 ，4 - 草酰巴豆酸脱羧酶；6 ，2 - 氧4 戊烯酸水合酶； 7 ，4 - 羟基2 - 氧戊酸水台酶。其中2 ，3 ，5 号酶己测出。 f i g 卜3p r o p o s e dc a t a b o l i cp a t h w a y o f c h l o r o b e n z e n eb yp p u t i d ag j 3 l b ya n a l o g y t ot h ek n o w n m e l a - c l e a v a g ep a t h w a y e n z y m e s ：l , c h l o r o b e n z e n ed i o x y g e n a s e ；2 。c h l o r o b e n z e n ed i h y d r o d i o l d e h y d r o g e n a s e ；3 , c a t e c h o l2 , 3 d i o x y g e n a s e ；4 ，o x a l o c r o t o n a t ei s o m e r a s e ；5 o x a l o c r o t o n a t e d e c a r b o x y l a s e ；6 , 2 o x o p e n t - 4 - e r l o a t eh y d r a t a s e ；7 , 4 一h y d r o x y 2 一o x o v a l e r a t ea l d o l a s e e n z y m e s 2 - 3a n d5h a v eb e e nd e t e c t e d ，w h i l e3 - c h o l r o c a t e c h o la n dp y u v a t ew e r ed e t e r m i n e dt ob e i n t e r m e d i a t e s 3 e i 言 c 0 。赳 。 一r 对氧联苯 4 c h i o f 曲l 出e d r 严、c 。o h 弋 4 氯幂甲艋 4 - c m d m l m k 5 - 氯2 羟i 2 嘏二埔蛭( 始盱式) 5 - 出呷- 2 却由吲雷时2 年r 瞄邋e n 曲 。 + 一“7 每7e ：嚣7 4 邻笨= 茁1 饵。蛭基i 硝糨5 _ 氧i 羟基雕粘破 ，氯4 弪丞2 - 簸基戊醺 5 - c h l o f d 卑坤由皿弘2 m o p e n l m o i c 0 - c l c h 2 c h o + c h 3 c c o o h j 氧乙醛丙酮酸 c l a l o z c - 吐e t t d e h y d ep f u n c a c i d 6 c f c h 4 3 0 0 h 氯乙酸 c h h 艟c e h c & 口d 1 t c a 兰羧酸循环 协c 砧o f o a c b cn e i d 钟d 口 囤i - 44 毒e 联苯( 4 c b p ) 降解菌洋葱假单胞菌属p c e p a c i a p l 6 6 的推测间位开环裂解途径【5 5 f i g 1 - 4p r o p o s e dp a t h w a y f o r t h ec a t a b o l i s m4 - c b p b y 尸c e p a e i a p l 6 6 1 2 3 主要相关降解酶的分离纯化及其基因的克隆、表达 随着分子生物学和相应实验应用技术的发展，多年来的研究表明，邻苯二酚1 ，2 - 双 加氧酶( c 1 2 0 ) 和邻苯二酚2 ，3 双加氧酶( c 2 3 0 ) 是氯代苯胺类化合物微生物代谢途径 中最为重要的降解酶，所以这两种酶的分离纯化、机理及其基因的克隆和表达成为近年来 人们的研究热点( h c h a n g 等，1 9 9 2 ：k y d a l a 等，1 9 9 4 ：b 一s k a n g 等，1 9 9 4 ：j l e e 等，1 9 9 6 ；a e m a r s 等，1 9 9 9 ：wd e j o n g h e 等2 0 0 2 ) ，如z e y e r 等、vb r e n n e r 等、 c m l a c m m l i 等、o vm o i s e e v a 等、v m o l g a 等、tl e d g e rt 等、1 p l u m e i e r 等对c 1 2 0 的研究( j z e y e r 等，1 9 8 5 ；vb r e n n e r 等，1 9 9 4 ；c m l a e m m l i 等，2 0 0 0 ；0 v m o i s e e v a 等，2 0 0 1 ：v m o l g a 等，2 0 0 2 ：一l e d g e r 等，2 0 0 2 ：1 p l u m e i e r 等，2 0 0 2 ) ，w i n n i ed e o n g h e 等、a s t r i de 等、k i m 等、b o - s e o n g k a n g 等、j e o n g r a i - l e e 等对c 2 3 0 的研究( b s k a n g 等，1 9 9 4 ：ky 啦l a 等，1 9 9 4 ；j l e e 等，1 9 9 6 ；s r k a s c h a b e k 等，1 9 9 8 ：wd e j o n 曲e 9 。寸。 东北农业大学理学砸l 学位论文 等- 2 0 0 2 ) ，通过他们的深入研究，使我们对此有了更加深入的了解。 研究者认为，人多 数氯代芳烃类化合物的微生物降解是由厦粒控制的( wd e j o n g h e 等，2 0 0 2 ) 。w d e j o n g h e 等从被3 - c a 和3 ，4 - d c a 污染的土壤中分离得到1 2 株降解菌，通过研究它们的相关降解质 粒多样性首次证明：所有降解菌中的相关降解质粒都属于i n c p 1b 类质粒，进而表明i n c p 。1 0 是一类在氯代芳烃化合物的微生物降解中起重要作用的质粒( 、d e j o n g h e 等，2 0 0 2 ) 。 a s t r i d e 等进一步对恶臭假单胞菌g j 3 l 中一段包含有c 2 3 0 基因( c b z e ) 的3 1 k b 长的基因簇 d n a 片段进行了克隆和测序，发现c b z e 存在于质粒中，并与其他c 2 3 0 基因：t d n c ( 恶 臭假单胞菌( p p u t i d a ) u c c 2 ) 、t b u e ( r a l s t o n e a p i c k e t t i ip k 0 1 ) 具有7 1 和5 l 的同源性 ( a e 。m a r s 等，2 9 9 9 ) 。j p l u m e i e r 等对3 氯苯甲酸降解菌j m p l 3 4 的降解功能基因的研 究初步认为，其修饰邻位开环裂解途径主要降解酶( 邻苯二酚1 ，2 - 双加氧酶、氯代康粘酸 环异社j 酶、二烯内酯水解酶和顺丁烯二酰基乙酸还原酶) 的编码基因由位于质粒p j p 4 中的 日qi ) d ( i ) e ( i ) f ( i ) 和晌r c ( i i ) d ( i i ) e ( i i ) f ( i i ) 两个基因簇组成，通过将这两组功能基 因簇分别克隆到运载质粒p b b r l m c s 2 中，再分别把含有口胃i 和i i 的运载质粒转导到 宿主菌re u ，r o p h aj m p 2 2 2 ( i m p l 3 4 的缺陷型) 和pp u t i d ak t 2 4 4 2 中，比较两株宿主菌 相关降解酶的活r 生，得出两组基因簇g 日i 和i i 在3 氯苯甲酸降解菌j i v i p l 3 4 ( p j p 4 ) 中 都是必须的，且t f d c d e 由甜i 调控，归由i i 调控，在这些开放阅读框中。c d c 编码 c 2 3 0 ( d p e r e z p a n t o j a 等，2 0 0 0 ：ip l u m e i e r 等，2 0 0 2 ) 。s l i u 等克隆、分析了3 - 或4 - 氯 苯甲酸降解菌n k 8 的修饰邻位开环裂解途径相关基因，得到编码c 1 2 0 、氯代康粘酸环异 构酶、二烯内酯水解酶和顺丁烯二酰基乙酸还原酶的相关基因c a r 、汀c 、班f d 、筛和卯， 它们与已知的邻苯二酚降解基因簇t d f f - c d e f 非常相似，并与菌株j m p l 3 4 的降解质粒p j p 4 氨基酸序列7 9 - - 8 8 同源( s l i u 等，2 0 0 1 ) 。但到目前为止，氯代苯胺类化合物降解菌 在此方面的报道还没有见到。 1 3 研究展望 2 0 世纪7 0 年代以来，国外研究者在氯代苯胺类化合物的微生物降解基础研究方面做 1 0 l 吾 了大量工作- 得到一些降解菌，并对其降解因素、降解机理、代谢途径、相关降解酶及其 酶解基因的调控表达进行了较深入的研究。使人们对其有了较深入的认识。丽国内，在氯 代苯胺类化合物微生物降解方面却没有报道。但也存在一些问题自然界中难以得到此 类化合物的高效降解菌；由于“死”产物的生成和积累使代谢途径中断，即不完全降解代 访 ，这使氯代苯胺类化台物一直成为氯代芳烃类化合物微生物降解研究中的一个难点。因 此，利用基因工程方法，在已有的研究基础上构建出降解氯代苯胺类化合物的高效工程菌 应当是今后：【作的研究重点。另外，随着我国此类化合物土壤、水体污染情况日益严重， 目前阶段，除了进行氯代苯胺类化合物微生物降解的基础研究外，还要在借鉴国外研究成 果的基础上，从我国实际国情出发，尽快进行微生物处理氯代苯胺类化合物污染土壤和水 体的工艺可行性研究，以解决当前迫切的环境问题，服务于人类生存环境质量的提高和社 会、经济的可持续发展。而对与处理工艺的可行性研究，翟福平等认为氯代芳烃类化合物 的共代谢降解机理和厌养好氧交替处理条件下的氯代苯芳烃化合物微生物降解性研究，应 当是今后工作的两个重点研究方向( 瞿福平等，1 9 9 7 ) 。 1 4 结语 近十年来。微生物降解氯代芳烃类化台物尤其是氯代苯胺类化台物的研究工作取得了 许多进展，但仍有许多方面有待予进一步的研究，如外界条件对降解代谢的影响，如何避 免“死产物”的产生以及代谢途径和高效工程菌的构建等，此外，能够高效降解氯代苯胺 类化合物菌株的分离筛选也将是一件长久的工作。研究这些问题将会使我们对微生物降解 氯代苯胺类化合物的复杂性有进一步的认识。 本研究从某化工厂污水处理车间好氧池活性污泥中分离到一株降解对氯苯胺 ( p - c h l o r o a n i l i n e 简称p c a ) 的细菌p c a 0 3 9 菌株，该菌株能够以对氯苯胺为唯一碳源、能 源和氮源生长。经过对其形态特征、生理生化、以及1 6 sr d n a 序列分析，该菌株初步鉴 定为d i a p h o r o b a c t e rs p 。进一步研究表明，该菌株的生长过程中，氯离子释放同步于对氯 苯胺降解并且氯离子的释放量与对氯苯胺的降解量相当。其利用对氯苯胺生长的最适温 度和初试p h 分别为3 0 c 和7 5 ，3 天时间内的最