（分析化学专业论文）液相等电聚焦技术在蛋白质组学研究中的应用.pdf

论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的 研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明 并表示了谢意。 作者签名：盛墅 论文使用授权声明 本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内 容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名：笸聋鹭 导师签名：樊整之日期：翌z ：彳。，争 摘要 蛋白质组学研究中，极端性质的蛋白质，如极酸或碱、分子量极高或极低， 以及低丰度蛋白质的分离、富集、检测及鉴定仍然是当前难以逾越的技术难题。 大量的研究工作主要集中于从分离手段和鉴定手段两个方面上的改进和创新。目 前，蛋白质组学中主要的分离手段是双向凝胶电泳r 2 d e ) 和高效液相色谱 ( h p l c ) 。但与实际样品中所含的蛋白质种类、数量及丰度分布相比，这两种经 典技术的分离检测限度还远远不能满足当前研究的需要。各种预分离技术的发展 及各种分离技术的交叉组合策略大大提高了传统的双向凝胶电泳( 2 d e ) 和高效 液相色谱( h p l c ) 对于极端性质和低丰度蛋白质的检测限度。在众多的预分离技 术中，液相等电聚焦技术( l i q u i d p h a s ei s o e l e c t d cf o c u s i n g ) 以其可在溶液相中按 蛋白质的特有p i 点分离复杂样品的特点，成为最有前景的一种降低样品复杂性、 富集低丰度蛋白质的预分离方法之一。 本论文的研究工作旨在考察液相等电聚焦技术与其他技术的结合在蛋白质 组学研究中的应用。本论文的第一章主要概述了蛋白质组学研究及其对于极端性 质和低丰度蛋白质的分离鉴定所面临的技术难题，目自口经典分离技术的发展现状 及其缺陷，针对这些技术难题所发展的预分离技术及其应用，以及液相等电聚焦 预分离技术( l i e f ) 的技术特点、发展历程及其应用现状等背景技术。本论文的研 究工作主要分为两个部分，分别在第二章和第三章中作了详细介绍。第二章的研 究中，采用第一代经典的液相等电聚焦仪器r o t o f o r 对大鼠鼠肝进行了预分离， 并与碱性p h 范围的双向凝胶电泳结合，着重考察了预分离技术对碱性蛋白质分 离鉴定效果的提高。实验证明，经过液相等电聚焦预分离富集后，碱端区域的双 向凝胶电泳图谱质量显著提高，蛋白质点更清晰，并明显增多；蛋白质谱鉴定的 可信度提高，鉴定成功的碱性蛋白质，尤其是极碱蛋白质数目明显增加。同时， 在第二章中，对于液相等电聚焦仪器r o t o f o r 和碱性p h 胶条一维等电聚焦的条 件优化作了经验总结。第三章的研究工作中，采用新一代的液相等电聚焦仪器 i s o e l e c t r l q 2 ( p r o t e o m es y s t e m s ) 对小鼠鼠肝进行了预分离，并与窄p h 范围的双向 凝胶电泳结合，完成了小鼠鼠肝全蛋白质的双向凝胶表达谱。5 张窄p h 范围双 向凝胶拼接出的全图上共检测出6 2 7 1 个蛋白质点。与未经预分离的样品直接进 行相同的窄p h 范围双向凝胶相比，对应区域蛋白质点增加率在5 0 1 0 0 之问。 以酸性蛋白质为例，将全蛋白质经预分离后p h 3 - 5 的组分与未经预分离样品的 p h 3 6 的双向凝胶电泳图谱和质谱鉴定结果进行了比较分析。同时，预分离后 p h 3 - 5 的组分还进行了s d sp a g e 反相高效液相色谱( r p h p l c ) m s m s 分离 鉴定，并与前述基于2 - d e 策略的质谱鉴定结果进行了统计分析比较。分析显示： 液相等电聚焦可显著提高低丰度蛋白质的检测率，整体上提高质谱鉴定可信度， 尤其是低丰度蛋白质的可信度；更多的低丰度蛋白质得到检测使双向凝胶图可提 供更多的蛋白质翻译后修饰信息；基于双向凝胶电泳和高效液相色谱的分离鉴定 策略在样品表达谱的研究中有很好的互补优势。此外，本研究的质谱鉴定数据与 现有的高质量大规模小鼠鼠肝表达谱研究的文献数据进行了比较，得到2 2 8 个新 蛋白质鉴定数据。该数据中，大部分蛋白质置信度较高，具有较高的可信度。本 研究为小鼠鼠肝这理想的人肝模式样品的表达谱鉴定积累了数据。本论文的第 四章对对本论文的研究工作进行了总结和展望。 关键词液相等电聚焦低丰度蛋白质碱性蛋白质碱性p h 范围双向凝胶电 泳窄p h 范围双向凝胶电泳高效液相色谱 中图_ 濮号0 6 5 2 a b s t r a c t a t p r e s e n t ，s e p a r a t i o n ，e n r i c h m e n t ，d e t e c t i o n a n di d e n t i f i c a t i o no f p r o t e i n s o f l o w a b u n d a n c ea n de x t r e m ec h a r a c t e r i s t i c ss t i l lr e m a i ng r e a tc h a l l e n g e si np r o t e o m e r e s e a r c h m o s to fw o r kf o c u s e do na d v a n c e m e n to fs e p a r a t i o na n di d e n t i f i c a t i o n t e c h n o l o g i e s c u r r e n t l y ，t h em a j o rs e p a r a t i o n m e t h o d sa r et w o d i m e n s i o n a lg e l e l e c t r o p h o r e s i s ( 2 一d e ) a n dl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，w h i c hh o w e v e r c a n ts a t i s f yt h e d e m a n d so fc u r r e n t r e s e a r c h ，a s f o r t h ee n o r m o u s c a t e g o r yq u a n t i t i e s a n d a b u n d a n c e - d i s t r i b u t i o no fp r o t e i n si n s a m p l e s s o , k i n d so fp r e f r a c t i o n a t i o n t e c h n o l o g i e sa n dc o m b i n a t i o no fd i f f e r e n ts e p a r a t i o nt e c h n o l o g i e sw e r ed e v e l o p e dt o i m p r o v et h ea b i l i t yo fc o n v e n t i o n a lm e t h o d st od e t e c tm o r ep r o t e i n s a m o n gt h o s e n e wp r e f f a c t i o n a t i o nt e c h n o l o g i e s , l i q u i d - p h a s el s o e l e c t r i cf o c u s i n g ( l i e f ) i so n e o ft h em o s tp r o m i s i n gm e t h o d st or e d u c et h ec o m p l e x i t yo fs a m p l ea n de n r i c h l o w a b u n d a n c ep r o t e i n s ，b o a s t i n gi t s a b i l i t y t o p r e f r a c t i o n a t ep r o t e i n e x t r a c t a c c o r d i n g t os p e c i f i cp io fp r o t e i ni ns o l u t i o n t h i ss t u d ya i m sa tt h ea p p l i c a t i o no fc o m b i n a t i o no fl i e fa n do t h e rs e p a r a t i o n t e c h n o l o g i e s t h ef i r s tc h a p t e rg a v eab r i e f l yb a c k g r o u n di n t r o d u c t i o no fp r o t e o m i c s ， i n c l u d i n gc h a l l e n g e s f o rp r o t e i n so fl o w - a b u n d a n c ea n de x t r e m ec h a r a c t e r i s t i c s ， c u r r e n tc l a s s i c s e p a r a t i o nt e c h n o l o g i e s a n dt h e i rl i m i t a t i o n ，d e v e l o p m e n ta n d a p p l i c a t i o no fp r e f r a c t i o n a t i o nt e c h n o l o g i e s ，a n df e a t u r e s ，h i s t o r ya n dc u r r e n t a p p l i c a t i o no fl i e f t h i ss t u d yc o n s i s t e do ft w op a r t s ，w h i c hw e r ei n t r o d u c e d r e s p e c t i v e l yi nc h a p t e r2a n d3i nd e t a i l i nc h a p t e r2 p r o t e i ne x t r a c tf r o mr a tl i v e r w a sp r e f r a c t i o n a t e db yr o t o f o r , w h i c hi sac l a s s i cr e p r e s e n t a t i v eo ft h ef i r s t g e n e r a t i o no fl i e fd e v i c e s ，t h e nt h ea l k a l i n ef r a c t i o n sw e r ec o m b i n e df o rf u r t h e r s e p a r a t i o nb ya l k a l i n ep hr a n g e2 - d e i tw a sd e m o n s t r a t e dt h a t ，u n d e rt h i ss t r a t e g y ， t h er e s o l u t i o no fa l k a l i n ep r o t e i n so n2 - d eg e la n dr e l i a b i l i t yo fp r o t e i n si d e n t i f i c a t i o n b ym s a r eg r e a t l yi m p r o v e d ，a n dm o r ea l k a l i n e ，e s p e c i a l l yh i g h l ya l k a l i n ep r o t e i n sa r e s u c c e s s f u l l yi d e n t i f i e dc o m p a r e dt o2 - d ew i t h o u tl i e f o p t i m i z a t i o no fo p e r a t i o no f r o t o f o ra z da l k a l i n ep hr a n g ei e fw e r ea l s os u m m a r i z e da c c o r d i n gt oe x p e r i e n c ei n t h i s c h a p t e r i nc h a p t e r3 ，m u l t i c o m p a r t m e n te l e c t r o l y s e r ( m c e ) w a su s e dt o p r e f r a c t i o n a t ep r o t e i ne x t r a c tf r o mm o u s e l i v e r f r a c t i o n sw e r ef u r t h e rs e p a r a t e db y5 k i n d so fn a r r o wp hr a n g e2 - d et om a k eu pa ni n t a c t2 - d eg e lr a n g i n gf r o mp h3t o 1 1 ，o nw h i c h6 2 7 1p r o t e i ns p o t sw e r ed e t e c t e d t h eq u a n t i t yo fd e t e c t a b l ep r o t e i n 3 s p o t so ft h ep r e 一疗a c t i o n a t e ds a m p l ew a si n c r e a s e db y5 0 - 1 0 0 c o m p a r e dw i t ht h a to f t h eu n f r a c t i o n a t e ds a m p l eo nc o r r e s p o n d i n ga r e a so f2 - d eg e l s a c i dp r o t e i n sw e r e t a k e n 舔e x a m p l ef o rc o m p a r i s o no f2 - d eg e l sa n dm s m si d e n t i f i c a t i o nr e s u l t s f r a c t i o no fp h 3 - 5a n dn i l - f r a c t i o n a t e ds a m p l ew e r es e p a r a t e db yp h 3 62 - d ea n d i d e n t i f i e db ym s m si np a r a l l e lf o rc o m p a r i s o n f r a c t i o no fp h 3 - 5w a sa l s oa n a l y z e d b ys d sp a g e - r p h p l c - m s m sa n dc o m p a r e dw i t ht h ea b o v e2 - d eb a s e d s t m t e g i e s t h ea n a l y s i ss h o w e dt h a t ：a p p l i c a t i o no fl i e fc o u l dd e t e c tm o r e l o w a b u n d a n c ep r o t e i n sa n de n h a n c et h ec o n f i d e n c eo fl o w s c o r ep r o t e i n si d e n t i f i e d b yc o n v e n t i o n a lw a y ；w i t hi m p r o v e dd e t e c t a b i l i t yo fl o w - a b u n d a n c ep r o t e i n s ，m o r e p o s t t r a n s l a t i o nm o d i f i c a t i o ni n f o r m a t i o no fp r o t e i n sw e r es u p p l i e d ；a n d2 - d eb a s e d s t r a t e g i e sa n dh p l c - b a s e ds t r a t e g i e s w e r ec o m p l e m e n t a r yf o rc o m p r e h e n s i v e a n a l y s i so fp r o t e o m e f u r t h e r m o r e ，ar e f e r e n c ed a t a s e tw a sd e r i v e df r o mh i 曲q u a l i t y p u b l i s h e dm o u s el i v e rp r o t e o m es t u d i e sa n dc o m p a r e dw i t hd a t a s e to ft h i ss t u d y 2 2 8 n e w p r o t e i n s ，m o s to fw h i c hh a v eh i g hi d e n t i f i c a t i o ns o r e s ，w e r eo b t a i n e d t h i ss t u d y a c c u m u l a t e di d e n t i f i c a t i o nd a t af o rm o u s ef i v e lw h i c hi sa l li d e a lm o d e ls a m p l ef o r h u m a nl i v e r t h ec h a p t e r4s u m m a r i z e dt h i ss t u d ya n d g a v eap r o * 1 ) e c tf o ri t k e y w o r d sl i q u i d p h a s e i s o e l e c t r i c f o c u s i n g ( l i e f ) ；t w o - d i m e n s i o n a lg e l e l e c t r o p h o r e s i s ( 2 d e ) 1 0 w 。a b u n d a n c ep r o t e i n s ；a l k a l i n ep r o t e i n s ；a l k a l i n ep hr a n g e 2 - d e , n a f f o wp hr a n g e2 - d e ；h i g i lp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) c c o d 5 4 第一章前言 1 1 蛋白质组学研究概述 2 0 0 3 年4 月1 4 日，国际人类基因组序列联盟( i n t e r n a t i o n a lh u m a ng e n o m e s e q u e n c i n gc o n s o r t i u m ) 宣告人类基因组计划( h u m a ng e n o m ep r o j e d l 所有目标全 部实现，人类基因组序列图谱绘制完成【1 1 。这一宏伟计划的圆满完成成为生命 科学发展史中的一个里程碑，但这只是人类认识自身的万里长征的第一步。早在 人类基因组计划完成之前，“后基因组时代”就已悄然来临，生命科学的研究重 心从全面揭示遗传信息的结构基因组学，逐步转向系统水平上基因功能的研究。 但是，要了解复杂多变的生命活动仅限于基因还远远不够。数量有限、结构相对 稳定的基因仅从静态上反映了遗传信息，而动态复杂的生命过程是由基因的产物 蛋白质在执行全部生物功能的过程中具体体现的。要了解生命活动的本质规 律，寻求解决人类以及其他生物生长发育、疾病等研究难题的途径，就要掌握这 些蛋白质的信息【2 】。蛋白质组学一门整体水平上研究蛋白质组成及其活动 规律的新兴学科由此诞生，并成为功能基因组学最活跃的d 口沿领域之一。 1 9 9 4 年，意大利的次学术会议上，澳大利亚m a c q u a r i e 大学w i l k i n s 和 w i l l i a m s 首次提出“蛋白质组”【3 】，其含义为：1 个基因组、1 种生物或1 种细 胞所表达的全部蛋白质【4 1 。这是一个动态的概念，由于基因翻译表达过程的时 空性和错综复杂性，加上多种翻译后修饰作用，在同一机体中不同的组织和细胞 中，在不同的生命阶段、生理状态下，所表达的蛋白质组都是不同的。但获得“全 部蛋白质”是非常困难的，因此科学家将研究定位在特定时空和特定环境下细胞 或组织等的蛋白质组研究，这使得蛋白质组学的概念具体化，更易于研究者深入 探索不同生理状态或病理状态下组织或细胞中蛋白质的表达模式和功能模式的 变化，揭示重要的生命活动规律和疾病发生规律【5 ，6 】。 当前，蛋白质组学的任务主要包括3 个部分：表达蛋白质组学、结构蛋白质 组学和功能蛋白质组学【7 】。表达蛋白质组学是指对一个指定的细胞、组织或生 物所产生全部蛋白质的鉴定。结构蛋白质组学是指对上述全部蛋白质精确三维结 构的测定。功能蛋白质组学的任务是阐明上述全部蛋白质所形成的类似于电路的 功能网络f 8 1 0 】。具体的说，就是将数以万计的蛋白质分离鉴定，获得细胞或组 织中蛋白质的种类、细胞定位和表达量，同源蛋白质的比较，蛋白质的加工和修 饰，三维结构等信息，构建数据库；在此基础上，进行基因产物识别，基因功能 鉴定，基因调控机制分析；研究重要生命活动的分子机制，如细胞周期、分化与 发育、肿瘤发生发展、环境反应与调节等；同时寻找和分析医药靶分子，包括新 药靶分子、肿瘤分子标记、人体病理介导分子、病原菌毒性成分等。 蛋白质组学的研究具有巨大的潜在经济利益和社会效益。比如，通过正常和 病变样本的蛋白质组的比较分析，可能发现可用于疾病早期诊断的表征疾病产生 的标准参照蛋白质，或者新的药物靶蛋白质【“一1 3 】；对药后组织内蛋白质组的 研究，寻找到表征药物毒性或疗效的标志蛋白质，用于药物毒性及疗效评价，以 及药物作用机理研究 1 4 ，1 5 】；建立农作物和家畜蛋白质组数据库，研究生长发 育机理、病虫害防治、遗传育种以及确定优良性状基因【1 6 ，1 7 】。目前，蛋白质 组学研究覆盖了原核微生物、真核微生物、植物、动物和人类的范围，涉及各种 重要的生物学过程，如信号转导、细胞分化、蛋白质折叠等等。其中，早期的研 究工作较多集中于原核生物及一些简单的真核生物，尤其是一些基因组序列被完 全或大部分测定的生物，如流感嗜血杆菌 1 8 - 2 0 1 、大肠杆菌1 2 1 、酿酒酵母、线 虫1 2 2 1 和果蝇【2 3 】等。人类蛋白质组学的研究也一直是关注热点，研究内容主要 集中于人类组织、器官、体液、细胞、细胞器以及疾病的表达或差异蛋白质组学 【2 4 2 7 1 。2 0 0 1 年4 月，“人类蛋白质组研究组织( i - i o p o ) ”宣告成立。随后欧洲、 亚太地区都成立了区域性蛋白质组研究组织，试图通过合作的方式，融合各方面 的力量，完成人类蛋白质组计划。到目前，人类蛋白质组计划已启动多项研究工 程，并已取得了卓越进展，其中包括分别由美国、中国、德国、瑞士、英国、加 拿大和r 本牵头的人类血浆蛋白质组计划、人类肝脏蛋白质组计划，人类脑蛋白 质组计划、大规模抗体计划、蛋白质组标准计划、模式动物蛋白质组计划以及糖 蛋白质组计划。 目前，蛋白质组学研究仍然面 临很多难题和挑战。其中之即是表达谱研究 中低丰度蛋白质、分子量极大极小蛋白质、极酸极碱蛋白质、疏水性蛋白质和膜 蛋白质等其他极端性质蛋白质的检测鉴定。目前的技术水平所能检测到的蛋白 质，与实际生物样品中的蛋白质数相比只是冰山一角。大量的低丰度和极端性质 蛋白质因技术的局限性还无从检测，而它们都参与重要的生理或病理过程。因此， 挖掘更多的低丰度和极端性质蛋白质信息是目前蛋白质组学研究中关注的热点 【2 8 1 。 1 2 蛋白质组学研究中分离技术的发展及现状 技术的突破进展往往会丌拓一大片新的研究领域。1 9 7 5 年，0 f a r r e l 和k l o s e 等人建立了基于蛋白质等电点和分子量两维的双向电泳技术( t w o - d i m e n s i o n a l e l e c t r o p h o r e s i s ，2 - d e ) 1 2 9 3 1 1 ，使得复杂蛋白质样品的分离成为可能。2 0 世纪舳 年代未，生物质谱突飞猛进，电喷雾电离( e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o n e s l ) 和基质辅助 激光解吸电离( m a t r i xa s s i s t e dl a s e rd e s o r p t i o n i o n i z a t i o n ，m a id d 两种软电离技术 的发明 3 2 ，3 3 ，使质谱技术从传统的小分子分析扩大到生物大分子鉴定的范畴。 6 正是这两大技术手段的突破性进展，解决了蛋白质组学的研究中两个关键步骤一 分离和鉴定的难题，从而带来了蛋白质组学的突飞猛进。生物信息学的兴起和 发展也促进了这一领域的开拓，并j 下成为蛋白质组学研究中的第三大核心技术。 这里，仅将蛋白质组学研究中的主流分离技术的发展作简要介绍。 双向电泳技术自诞生以来就不断改蝴 3 4 - 3 6 。1 9 8 8 年，固相p h 梯度 ( i m m o b i l i z e dp hg r a d i e n t , 口g ) 等电聚焦技术的建立克服了手工制作的载体两性 电解质管稳定性差、操作复杂、质量和效果不佳的问题，实现了o 0 0 1 p h 单位差 别的蛋白质分离，且能保证p h 梯度稳定，聚焦准确，无阴极漂移，提高了上样 量和重复性，成为蛋白质组学中的经典分离手段【3 7 】。但是，双向凝胶电泳技术 仍然存在难于逾越的技术障碍，如：疏水性蛋白质、极酸极碱蛋白质、极大极小 分子量蛋白质和低丰度蛋白质难以检测；可承受的上样量较少；分辨率和重复性 仍不理想、操作繁琐费时，不能完全自动化。其中，最突出的问题仍然是低丰度 蛋白质的检测问题。目前，双向凝胶电泳理论上分辨检测能力可达1 0 0 0 0 个点左 右，并已有文献报道采用3 0 c m 4 0 c a l 的大胶获得这一结果 1 1 ，3 8 1 ，但通常的实 验室都不具备这样的实验条件，一般采用的1 8 c m * 2 0 c m 的胶能够分离1 0 0 0 - 3 0 0 0 个蛋白质点，采用2 4 c m t 2 0 c j m 的胶也一般只能达到3 0 0 0 - 5 0 0 0 个蛋白质点。而 仅酵母菌的全部蛋白质组就约有6 0 0 0 个蛋白质，一个哺乳动物的细胞中就有至 少1 0 0 0 0 - 2 0 0 0 0 个蛋白质，组织中蛋白质更是可高达5 0 0 0 0 以上1 3 9 。这些蛋自 质的丰度动态范围可达1 旷一1 0 9 ，远远超出目前双向凝胶电泳可检测的1 0 4 的丰 度动态范围1 4 0 。这些都对双向凝胶电泳技术的分离能力提出了巨大的挑战。近 年来，窄范围p h 胶条( 2 一或1 个p h 单位) 的发展较显著的提高了上样量、分辨 率和低丰度蛋白质的检测率 4 q ，但还远远不能满足研究需要。为了进一步提高 分离检测能力，挖掘更多的低丰度蛋白质，样品的预分离处理技术近年来成为活 跃的研究领域。 高效液相色谱( h i g l lp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，h p l c ) 以其快速、高通 量、自动化、重复性好等特点，在蛋白质组学研究中也逐步发展成为双向凝胶电 泳技术的互补分离手段h 2 。一维纳升级反向高效液相色谱( r p h p l c ) 与电喷雾 质谱( e s i m s 或m s m s ) 联用可达到1 0 - 1 5 1 0 墙m o l l 的检测灵敏度和2 ( 肌3 0 0 种 蛋白质天的分析速度，但一般只能适用于体系较简单的蛋白质混合样品【4 3 i 。 o p i t e c h 等首次提出将多维色谱用于蛋白质混合样品分析 4 4 1 。蛋白质复合物直接 分析( d i r e c ta n a l y s i so fp r o t e i nc o m p l e x e s ，d a l p c ) 4 5 1 汞q 多维蛋白质鉴定技术 ( m u l t i d i m e n s i o n a lp r o t e i ni d e n t i f i c a t i o nt e c h n o l o g y ，m u d p i t ) 的提出使得多维色谱 在复杂的样品体系的分离检测中得到成功应厍 4 6 - 4 8 1 。其分析路线为先将样品 酶解，得到肽段混合物，再进行多维色谱分离，质谱鉴定，采用s e q e s t 算法 7 查找与多肽序列匹配的蛋白质。复杂样品中通常含以万计的蛋白质，其酶解后的 肽段数目则更加庞大，因此，寻求能降低样品复杂性，与色谱兼容的预分离手段 成为迫切需要。 1 3 预分离技术的发展及其应用 生物样品体系的极端复杂性使得蛋白质组学中的分离检测技术面临了巨大 的挑战。降低样品体系复杂性，分离富集低丰度蛋白质或其他目标蛋白质的各式 预分离技术近年来不断涌现，并与现有的分离检测技术相结合，形成了众多的分 离策略，极大的提高了蛋白质检测率 4 9 - 5 i l 。 基于色谱方法的预分离技术的主要策略是富集感兴趣的蛋白质或去除高丰 度蛋白质，采用方法包括常规的离子交换色谱 5 2 - 5 3 1 、亲和色谱1 5 5 1 和其他一些 非常规的色谱方法 5 6 1 。一些研究小组对采用色谱预分离方法降低样品复杂性作 了较深入的探索，并取得了弓1 人注目的进展。f o u n t o u l a k i s 的研究小组在血红素 流感细菌的蛋白质组研究中，采用三种色谱预分离方法总共获得约3 5 0 个蛋白 质，而采用常规双向凝胶电泳仅能分离检测到1 0 0 个左右【5 7 6 0 ；在埃希氏大 肠杆菌的蛋白质组研究中，采用羟磷灰石色谱作为预分离手段，获得了1 5 0 个双 向凝胶电泳未能检测到的新蛋白质1 6 1 1 。但是，基于色谱的预分离技术也存在一 些局限性。例如在色谱柱( 尤其是离子交换色谱柱) 的洗脱过程中，往往需要较高 浓度的盐溶液，使得在后续的除盐过程中会造成蛋白质损失。 基于电泳方法的预分离技术如今也己成为蛋白质组学分析中挖掘低丰度蛋 白质、极端性质蛋白质等的又一有利工具，所采用的技术涉及连续自由流动电泳 【6 2 - 6 3 1 、介体电泳( g r a d i f l o w ) 6 4 - 6 5 、区带电泳1 6 6 、液相等电聚焦1 6 7 7 8 1 、以 及采用等电珠预分蛋白质 7 9 - 8 1 、采用交联葡聚糖【8 2 1 预分蛋白质等新方法。 除此外，细胞器离心分离法 8 3 1 和顺序提取法 8 4 1 等方法也广泛应用于样品预 分离富集。 1 a 液相等电聚焦技术的发展及其应用 在众多的预分离技术中，液相等电聚焦( l i q u i d p h a s e i s o e l e c t r i c f o c u s i n g ，l i e n 是降低样品复杂性和富集低丰度蛋白质最有前景的预分离方法之一。其基本原理 与双向凝胶电泳的第一维等电聚焦相同，即根据蛋白质不同p i 点进行等电聚焦 分离，但整个聚焦过程在溶液体系中进行。与其他预分离方法相比，液相等电聚 焦技术的独特优势在于：第一，基于蛋白质等电点的分离富集利于特定p h 范围 蛋白质的后续分析，尤其是极酸极碱的蛋白质；第二，其上样量可达毫克级以上， 加之等电聚焦分离的过程本身也是一个富集过程，利于低丰度蛋白质的后续检测 8 鉴定；第三，等电聚焦过程在溶液相中进行，方便了与其他分离技术的结合应用。 液相等电聚焦技术的历史可追溯到二十世纪六十年代，天体物理学家 s h j e r t 6 n 模仿行星的运动，设计出一个以窄内径的试管为电泳腔，并可围绕水 平轴自转的装置，首次将电泳分离应用于自由区域f 如聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖 凝胶) ，由此引发了众多科研工作者的兴趣【8 5 】。瑞典乌普萨拉大学的一个大学生 设计了一个由4 6 个腔体组成，总长1 米，承载7 6 升样品溶液的多腔体电泳分 离器，但使用操作非常不便 8 6 1 。 1 9 7 9 年，b i e r 经过5 0 年对液相制备电泳技术的潜心研究，终于迈出了革命 性的一步，推出了经典的液相等电聚焦仪器r o t o f o r ( b i o r a dh e r c u l e s ，c a , u s 舢【8 7 】。其分离腔由液体可渗透的尼龙筛隔成2 0 个腔体，两端分别由阳离子 膜和阴离子膜与电极腔隔开。等电聚焦过程中，p h 梯度由溶液中的两性电解质 形成。分离结束后，复杂蛋白质混合样品可被分离成2 0 个p 8 值连续分布的窄 p h 范围的组分，由连有真空泵的2 0 个针头刺破分离腔的隔膜收集( 图1 ) 。分离 后的组分可进行二次等电聚焦分离。制备型r o t o f o r 可承载达l g 的蛋白质上样量， 迷你型r o t o f o r 可承载达约5 0 m g 的蛋白质上样量。r o t o f o r 的推出使得等电聚焦 技术作为预分离方法在蛋白质组学中迅速德到广泛应用。但r o t o f o r 的一些缺陷 也限制了它的应用。其分离仅依靠溶液中的两性电解质使得分辨率较低，通常特 定p h 的蛋白质分布在相邻的三个组分中；溶液体积较大，上样量较大时才能保 证分离后的组分的蛋白质浓度不至于太低，但大部分实验都较难满足十毫克以上 的上样量；溶液中两性电解质含量较高，影响后续的双向凝胶电泳或色谱的分离， 需采用透析、沉淀等纯化方法，但会造成蛋白质的损失；操作繁琐复杂，要求操 作人员有较丰富的经验。 图l 液相等电聚焦仪器r o t o f o r 上样和收集样品图 r i 曲e t t i 等人的工作将液相等电聚焦技术又向i i 推进了一大步。他们设计的 多腔体电解分离器( m u l t i c o m p a r t m e n te l e c t r o l y z e r ，m c e ) 采用共价接合了传统双 向凝胶电泳一维等电聚焦中i p g 胶条上相同的圃相化合物的具有特定p h 值的等 9 电位膜来隔开分离腔，并依靠这些连续排列的等电位膜来分离样品，样品溶液中 可以不添加两性电解质 8 8 ，8 9 1 。基于这种原理的商品化仪器陆续推出，如 i s o p r i m e ( a m e r s h a mb i o s c i e n c e s ，图2 ) 和i s o e l e c t r l q 2 ( p r o t e o m es y s t e m s ，图3 、等。 与r o t o f o r 相比，基于这种原理的商品化仪器分离效果更好，分辨率更高，基本 没有相邻组分徊j 的交叉污染；分离后的组分可直接进行后续分离，不需额外的纯 化处理；操作简便。 图2 液相等电聚焦仪器i s o p r i m e图3 液相等电聚焦仪器i s o e l e c t r i q z 图4 液相等电聚焦仪器m i c r o r o t o f o r图5 液相等电聚焦仪器 z o o m i e ff r a c t i o n a t o r 为了满足研究需要，一些研究者设计出经过改进的其他液相等电聚焦仪器。 x u nz u o 和d a v i dw s p e i c h e r 设计出微体积液相等电聚焦仪( m i c r o s c a l es o l u t i o n i s o e l e c t r o f o c u s i n g , l ls o l - i e f l ，其蛋白质上样量可达3 m g ，分离腔体积约为2 5 m l ， 分离原理结合了r o t o f o r 和l s o p r i m e 的方法，依靠两性电解质和等电位膜。该仪 器很好的解决了其他商品化仪器上样溶液体积太大，所需蛋白质上样量超出通常 实验可以拿到的样品量的难题，同时提高了蛋白质上样量、分辨率和可承受蛋白 质丰度动态范围【9 0 ，9 1 1 。t a n y ao s h a n g 改进了r o t o f o r ，采用特定p h 值的固 相聚丙烯酰胺膜分离蛋白质，两性电解质可加可不$ i i 9 2 。近来，也有微体积的 液相等电聚焦仪器推出，如m i c r o r o t o f o r ( b i o 。r a d ，图4 ) 、z o o m i e ff r a c t i o n a t o r ( i n v i t r o g e n ，图5 1 等，更加适合通常实验室的需求。 目前，液相等电聚焦技术与双向凝胶电泳、色谱、电洗脱和质谱等多种技术 相结合，组成各种分离策略，广泛应用于蛋白质组学，尤其是低丰度蛋白质和极 端性质蛋白质的分离检钡1 6 7 7 3 】。a w e s t m a n b r i n k m a l m 和d a v i d s s o np 在脑脊 髓液的蛋白质组研究中证明，l i e f 的分离富集作用可提高低丰度蛋白质谱鉴定 的肽段覆盖率 7 4 ，7 5 。s o o h a nb a e 等以由碱性蛋白质为主导的h p y l o r i 蛋白 质为模型对象，证明了l i e f s d s p a g e l c m s m s 的技术路线在碱性蛋白质研 究中的优势【7 6 】。p e d e r s e n 等人运用液相等电聚焦技术进行预分离，鉴定得到更 多膜蛋白质和低丰度蛋白质【7 7 】。r o n g - x i al i 等人将液相等电聚焦与双向液相色 谱相结合用于c e r e v i s i a e 酵母蛋白质组表达谱研究，检测到1 1 0 3 个c a i 低于0 2 的蛋白质，以及一些极端性质蛋白质f 7 8 1 。 1 5 本论文的立意及创新点 目前，基于液相等电聚焦技术作为预分离方法的多种分离策略已应用于组织 液、血浆、细胞、细菌等的蛋白质组表达谱研究，但大多数研究工作都是针对较 简单的样品体系，对于复杂样品体系，如哺乳动物组织的研究报道还较少。本课 题针对鼠肝理想的人肝模式样品，采用液相等电聚焦与双向凝胶电泳和色谱 技术结合，通过较大量的鉴定数据的统计分析，着重考察了液相等电聚焦技术对 碱性蛋白质和低丰度蛋白质的分离检测鉴定效果的提高，菇对不同的分离策略作 了对比分析。本论文的工作为鼠肝的表达谱鉴定积累了数据，同时为人肝蛋白质 组项目提供了技术支持。 第二章液相等电聚焦技术应用于碱性蛋白质的分离鉴定 2 1 引言 碱性蛋白质是组织和细胞中蛋白质组的重要组成部分，具有重要的生物学意 义及研究价值。如：在人胎肝蛋白质中碱性蛋白质约占4 0 【9 3 】；组蛋白质、精 蛋白质、染色体蛋白质和核糖体蛋白质等也属于碱性蛋白质 9 4 1 。但最经典的蛋 白质组学分离方法双向凝胶电泳( 2 。d e ) 对于碱性蛋白质不能获得有效的分离检 测效果，双向凝胶的碱性区域被形象地比作。无人地带”9 5 ，4 9 1 。 如何提高碱性蛋白质的分离检测效果一直是蛋白质组学领域关注的问题 【9 4 ，9 6 - 1 0 1 1 。大部分研究工作关注于双向凝胶电泳中的条件优化，如试剂的改 进、固相p h 梯度胶条的改进和第二向凝胶电泳中溶剂的改进等。其中，窄p h 范围和中p h 范围的固相p h 梯度胶条的出现显著的提高了蛋白质上样量、分辨 率和检测率，在极碱极酸和低丰度蛋白质的研究中具有很大潜j j 3 6 1 。对于碱性 蛋白质，采用p h 6 1 1 ，p h 6 - 9 、p h 弘1 0 、p h 4 - 1 2 、p h 9 - 1 2 和p h l 0 - 1 2 的i p g 胶条可更好的分离碱性蛋白质。但对于碱性蛋白质，尤其是极碱蛋白质中的低丰 度蛋自质，碱性范围双向凝胶的分离检测能力仍然有限。随着上样量的增加，碱 性i p g 胶条p h 范围以外的蛋白质的沉淀对于碱性蛋白质的一维等电聚焦的影响 也是一个问题。 采用预分离方法处理样品是一种有效的分离富集碱性蛋白质的解决措施 【1 0 2 。目前，最有效的一种策略是根据蛋白质的p i 点进行预分离，再进行碱性 p h 范围的双向凝胶电泳。g o r g a 等采用胶联葡聚糖等电聚焦预分离蛋白质，然 后将沿p h 梯度聚焦成的凝胶片段切割下来，转移到i p g 胶条上进行双向电泳， 这种方法可有效分离检测极酸和极碱蛋白质。液相等电聚焦技术也是根据蛋白质 的p i 点进行预分离，且已有多种商品化仪器。 本章的工作采用经典仪器r o t o f o r ，将液相等电聚焦与碱性双向凝胶电泳相 结合，强