（营养与食品卫生学专业论文）微波固相合成低聚蔗果糖及其抗氧化与免疫功能研究.pdf

摘要 微波固相合成低聚糖蔗果及其抗氧化与免疫功能研究 学科、专业：医学、营养与食品卫生学 硕士研究生姓名：宋玉蓉 指导教师：施用晖 摘要 入学时间：2 0 0 7 9 答辩时间：2 0 0 9 1 2 授予学伊时间： 低聚蔗果糖( f r u c t o o l i g o s a c c h a r i d e s ，f o s ) 具有降低血脂、胆固醇和改善肠道 微生物区系组成、促进营养物质吸收等功能，这些功能与其清除自由基、增强机体抗 氧化和免疫能力的功能有关。本实验以蔗糖为原料微波固相合成低聚蔗果糖( w f o s ) ， 并对合成产物w - f o s 及副产物5 一跚f 的抗氧化和免疫功能性进行研究。 首先经过单因素实验和正交实验优化了微波固相合成w f o s 反应条件。合成 w - f o s 最优工艺条件为：催化剂添加量0 0 8 ，微波辐射时间1 2 0 s ，微波辐射功率 1 0 0 0 w ，引发剂添加量9 ；高效液相色谱分析合成产物主要成分为：低聚蔗果糖6 8 2 3 ， 5 一h m f 4 3 6 ，蔗糖1 3 3 1 ，葡萄糖7 5 6 。 其次研究了w f o s 及副产物5 一咖f 体外清除自由基活性。结果表明合成产物清除 d p p h 、o h 、a b t s + 的i c 为8 5 8 m g m l 、6 0 5 m g m l 、4 0 5 9 m g m l ，w f o s 与5 - h m f 体 外清除自由基能力具有协同作用。 为研究w f o s 的生物学功能及5 一h m f 对其功能的影响，采用高脂日粮中添加0 5 w - f o s 及不同剂量( o 0 0 、0 0 2 、0 2 ) 5 - h m f 饲喂昆明种小鼠5 周。结果表明0 5 w - f o s 及0 0 2 5 一跚f 能显著降低高脂日粮小鼠血脂水平( p ( o 0 5 ) ；显著提高高脂日 粮小鼠血浆、肝脏、十二指肠、心脏的总抗氧化能力( t a o c ) 、过氧化氢酶( c a t ) 活性( p ( o 0 5 ) ；显著降低脂质过氧化物( m d a ) 、氧自由基( r o s ) 水平( 尺0 0 5 ) ； 显著提高肝脏、十二指肠、脑部谷胱甘肽过氧化物酶( g s h - p x ) 活力( 尺o 0 5 ) ；显 著改善高脂日粮小鼠脑组织血栓素b 。6 一酮一前列腺素f 。比值( 只0 0 5 ) ，降低小鼠跳 台错误时间，提高记忆力。含0 0 2 5 - h m f 的w - f o s 组小鼠胸腺和脾脏指数、白介素 一4 、脾脏淋巴细胞转化率水平显著升高( p ( o 0 5 ) ，白介素一6 水平( p o 0 5 ) 显著降 低。相较于0 0 2 水平5 - h m f ，高剂量0 2 5 一h m f 不利于0 5 w f o s 保护高脂日粮小 鼠抗氧化与免疫能力的功能。大剂量灌胃实验显示产物w f o s 急性毒理l d 锄大于 1 5 9 k g b w ，属于无毒级别。 饲料中添加0 5 微波固相合成的低聚蔗果糖( w f o s ) ( 含0 0 2 5 - h m f ) 具有 清除小鼠体内自由基、降血脂、提高机体抗氧化能力和免疫功能的作用。 关键词：低聚蔗果糖；微波合成；5 羟甲基糠醛；血脂；抗氧化；免疫 a b s t r a c t f r u c t o o l i g o s a c c h a r i d e s ( f o s ) c a ni m p r o v et h eg u tm i c r o b i a lf l o r ac o m p o s i t i o n ，p r o m o t e t h ea b s o r p t i o no fn u t r i e n t s ，r e d u c eb l o o df a t ，c h o l e s t e r o la n do t h e rf u n c t i o n s ，w h i c hm i g h t b eb e n e f i tf o re l i m i n a t ef r e er a d i c a l s ，e n h a n c et h eb o d y sa n t i o x i d a n ta n di m m u n i t y i nt h i s p a p e r , m i c r o w a v es o l i d s t a t es y n t h e s i sf r u c t o o l i g o s a c c h a r i d e s ( w - f o s ) w a sm a d eb y s u c r o s e ，a n dt h e nt h ef u n c t i o n so fp r o d u c t sw - f o sa n db y - p r o d u c t s5 一h m ：fw e r e r e s e a r c h e d f i r s t ，t h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n ta n do r t h o g o n a le x p e r i m e n tw e r ea p p l i e dt oo p t i m i z e r e a c t i o nc o n d i t i o n so fw - f o sb ym i c r o w a v es o l i d - s t a t es y n t h e s i s t h eo p t i m u mc o n d i t i o n s f o rs y n t h e s i z i n gw - f o sw e r ea sf o l l o w s ，t h ec a t a l y s td o s a g e0 0 8 ，m i c r o w a v et r e a t m e n t t i m e12 0 s ，m i c r o w a v ep o w e r10 0 0 wa n di n i t i a t o rd o s a g e9 1 1 1 eh p l ca n a l y s i si n d i c a t e d m a tt h em a i nc o m p o n e n t si nt h es y n t h e t i cp r o d u c t sw e l ef o s6 8 2 3 ，5 一h m f4 3 6 ， s u c r o s e13 31 a n dg l u c o s e7 5 6 s e c o n d , t h es c a v e n g i n gd p p h ，o h ，a b t s + f r e er a d i c a la c t i v i t yi nv i t r ow e r e s t u d i e d ，w i t hi c s 0o fp r o d u c tw e r e8 5 8 m g m l ，6 0 5 m g m l ，a n d4 0 5 9 m g m l ，w h i l e5 - h m f c o u l dp r o m o t et h ef r e er a d i c a ls c a v e n g i n ga b i l i t yo fw f o s h i 曲一f a t ，0 5 w f o sa n dd i f f e r e n td o s e s ( o 0 0 ，0 0 2 ，0 2 ) 5 - h m ff e dm i c ef o r 5 wt os t u d yt h eb i o l o g i c a lf u n c t i o no fw - f o sa n dt h ee f f e c to f5 - h m ff o rt h ef u n c t i o n , - r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ea d m i n i s t r a t i o no f0 5 w f o sa n d0 0 2 5 h m fc o u l d s i g n i f i c a n t l yr e d u c et h eb l o o d f a t ，m d a ，r o sl e v e lo fh i 曲一f a t - f e dm i c ei nb l o o d p l a s m a ， l i v e r , d u o d e n u m ，b r a i na n dh e a r t ( p 0 0 5 ) ，s i g n i f i c a n t l yi n 凹e a s et - a o ca n dc a ta c t i v i t y i nt h e s et i s s u e e x c e p tb r a i n ( p 0 0 5 ) ，s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e g s h p xl e v e li nl i v e r , d u o d e n u ma n db r a i n ( p o 0 5 ) ，s i g n i f i c a n t l yi m p r o v et x b 2 6 - k e t o p g f i 旺r a t i oi nb r a i n ， r e d u c ef a u l tt i m e sa n di n h a n e em e m o r ) - , t h y m u sa n ds p l e e ni n d e x ，i l - 4 ，l y m p h o c y t ec e l l s t r a n s f o r m a t i o ne x p e r i m e n t ( s i ) w e r es i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d 俨 0 0 5 ) ，i l - 6l e v e l ( 尸 0 0 5 ) w a ss i g n i f i c a n t l yr e d u c e d c o m p a r e dw i t h0 0 2 5 - h m f ，0 2 5 - h m fw e n ta g a i n s tt h e f u n c t i o nt h a tw f o si m p r o v e dh i g h - f a t - f e dm i c ea n t i o x i d a t i o nc a p a b i l i t ya n di m m u n e f u n c t i o n t h ea c u t et o x i c i t yl d s 0o f l f o sw a sg r e a t e rt h a nl5g k g + b w , b e l o n g i n gi nn o t o x i c i t yl e v e l 0 5 w - f o sw i t h0 0 2 5 - h m fc o u l dr e d u c eb l o o d - f a t ，i m p r o v ea n t i o x i d a n ta n d i m m u n i t yo fh i g h - f a tf e dm i c es i g n i f i c a n t l y k e y w r d s ：f r u c t o o l i g o s a c c h a r i d e s ；m i c r o w a v es o l i d s t a t es y n t h e s i s ；5 - h m f ；b l o o d - f a t ； a n t i o x i d a n t ；i m m u n i t y 主要缩略词汇 e f o s w - f o s 5 h 皿 d p p h a b t s + h r p r o s g s h p x c 妪 a o c m d a 6 - 酮- p g f t 。 t x b 2 si i l 4 i l 6 p b s m t t 主要缩略词总汇 酶法生产低聚蔗果糖 微波固相合成低聚蔗果糖 5 羟甲基糠醛 1 , 1 二苯基p 苦基肼 2 ，2 连氮双( 3 乙基苯并噻唑啉一6 磺酸) 辣根过氧化物酶 活性氧自由基 谷胱甘肽过氧化物酶 过氧化氢酶 总抗氧化能力 丙二醛 6 一酮一前列腺素f l 。 血栓烷b 2 转化率 白细胞介素4 白细胞介素6 磷酸盐缓冲液 噻唑蓝 i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 圣圣匿日期：渤7 年f 月f 占日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：鐾兰：爱导师签名 叫醐： 日 1 引言 1 引言 低聚蔗果糖( f i u c t o o l i g o s a c c h a r i d e s ，简称f o s ) 又称低聚果糖或寡果糖，分子式为 g f f n ，n = 1 3 ( g 为葡萄糖基，f 为果糖基) ，是果糖基以伊( 2 _ 1 ) 糖苷键与蔗糖中的d 果糖基连接而成的蔗果三糖( g f 2 ) 、蔗果四糖( g f 3 ) 、蔗果五糖( o f 4 ) 和蔗果六糖( g f s ) 的混 合物1 1 。 f o s 广泛存在于水果、蔬菜、谷物等物质中，如梨、蜂蜜、啤酒、细菌、酵母、洋 葱、香葱、牛蒡、菊芋、菊苣、香蕉、小麦、黑麦、燕麦等【2 j 。f o s 甜度为蔗糖的0 3 0 6 倍，既保持了蔗糖的纯正甜味性质，又比蔗糖甜味清爽，且具有类似脂肪的香味和 爽口的滑腻感【3 1 。f o s 是一种天然活性物质，除具有一般功能性低聚糖的物理化学 性质外，最引人注目的是其优越生理特性。 1 1 低聚蔗果糖的生理活性 ( 1 ) 低热能值。低聚蔗果糖分子中伊2 ，1 糖苷键不能为人体和动物消化酶所消化， 在代谢过程中几乎可以完整通过胃和小肠直接进入大肠，在盲肠和结肠内，厌氧菌能产 生切断低聚蔗果糖分子中肛2 ，1 糖苷键的酶将其水解和发酵成短链脂肪酸( 醋酸、丙 酸、l 乳酸和丁酸) 之后通过肠壁吸收，在发酵过程中还会产生氢气、二氧化碳和甲烷 等气体 4 1 ，f o s 的热值为1 5 k c a l g 以下，是蔗糖的1 3 ，对糖尿病患者来说也是一种 良好的甜味剂。 ( 2 ) 调节肠道微生物区系组成。许多研究证。明，f o s f l 皂够改变肠道微生物区系， 可使拟杆菌、梭状芽孢杆菌、产气荚膜杆菌、梭形杆菌属等有害菌比例减少，而双歧杆 菌等有益菌增加，使有益菌群在肠道中占有优势，具有益生元特性【5 7 】。中国卫生部食 品卫生监督检验所进行的国内首次人体试食试验表明f o s 可促使肠道菌群中双歧杆菌 等有益菌数量显著增加( 达1 2 倍以上) ，产气荚膜梭菌等有害菌群数量显著减少至原数 量的1 3 0 t 引。 由于f o s 的益生元特性，它还能减轻一些胃肠道疾病的严重程度。m a y ( 1 9 9 5 ) t 9 j 、 w o l f ( 1 9 9 6 ) 1 0 f f i c h e r b u t ( 2 0 0 3 ) 1 1 】的研究结果显示：在膳食中补充f o s o 皂抑制梭状芽孢杆 菌的生长，降低梭状芽孢杆菌引起腹泻的发生率，并对小鼠盲肠上皮组织有一定的保护 作用，并可延长梭状芽孢杆菌诱发的患结肠炎地鼠的生存时间，缓解三硝基苯硫酸诱发 的结肠炎大鼠的肠道炎症症状。o l e s e n ( 2 0 0 0 ) 0 2 l 还认为f o s 可用于肠道易激综合征 ( i r r i t a b l eb o w e ls y n d r o m e ，i b s ) 的治疗。f o s 的对胃肠道的疾病损害的保护功能可能 是f o s 使肠道双歧杆菌和乳酸菌等有益菌增加，从而抑制了外源性和内源性有害微生物 繁殖的结果。 ( 3 ) 可改善脂质代谢，降低血脂与胆固醇。国内外绝大多数的研究都认为f o s 具 有降低血脂的作用【1 3 】【1 4 】。 ( 4 ) 提高免疫力和减少癌症风险产物。它可以激活巨噬细胞，产生抗菌素，刺激淋巴 细胞有效分裂而增加淋巴细胞生成量【l5 】【1 6 1 。 江南大学硕士学位论文 ( 5 ) f o s 能促进营养吸收。f o s 在大肠内被细菌发酵生成l 乳酸，可以溶解钙、 镁、铁等矿物质，促进人体对矿物质的吸收与利用，其中对促进钙的吸收率效果最 为明显。大鼠试验发现补充f o s 可明显增加体内钙、镁、铁、和锌储留，促进钙、镁、 磷等矿物元素吸收，进而提高了股骨中相应矿物元素的含量，并导致股骨体积显著增加 【1 7 1 。v a n ( 1 9 9 8 ) t 1 8 1 等用通过稳定性同位素方法测定t f o s 对1 2 位年龄1 4 1 6 岁的青少年钙 吸收的影响，结果显示，钙吸收率从对照组的4 7 8 上升至6 0 1 ，因此f o s 可以有效的 促进生长发育和防止骨质疏松症。同时f o s 还能促进维生素b l 、b 2 、b 3 、b 6 、b 1 2 及 叶酸的自然形成，从而提高人体新陈代谢水平，预防及改善由于体内毒素而引起的 皮肤性疾病。 ( 6 ) f o s 不能被变异链球菌s m u t a n s 利用而具有防龋齿作用【l 】。 1 2 低聚蔗果糖的制备及生产 欧盟已经将天然来源的菊糖和由菊糖制备的低聚蔗果糖列为食物和食物组分，在美 国菊糖和f o s 也已经被美国食品与药品管理局批准为一般公认为安全的( 见f d ag r n n 0 0 0 0 0 4 4 ，2 0 0 0 ) 食品配料进入美国市场。国内外f o s 已经被广泛应用于乳制品、饮料 工业、高纤维食品、补钙食品、减肥食品、保肝食品、养颜食品、清肠食品等，市场需 求量大。 1 2 1 酶法生产低聚蔗果糖 目前低聚蔗果糖的生产以酶法为主，包括酶法水解和酶法合成 1 7 1 ( 1 ) 以菊芋为原料酶法水解生产f o s 。以菊芋为原料，酶法一步水解菊粉制取f o s 生产工艺如下：菊芋_ 菊粉_ 水解_ 过滤_ 脱色- 脱盐_ 浓缩_ f o s 。此方法具有工艺 简单、副产物少等优点。目前国内外研究较多的菊芋粉酶是由酵母、青霉、黑曲霉、黄 曲霉、米曲霉和枯草芽孢杆菌生产的。 ( 2 ) 以蔗糖为原料酶法合成f o s 生产工艺流程为：菌体斜面培养一增殖培养一发 酵( 产酶) 一培养液分离加入蔗糖液_ 加热保温一f o s 发酵_ 脱盐、脱色一浓缩_ 高浓 度低聚糖。工业上用黑曲霉生产果糖转移酶，其特点是在低浓度蔗糖溶液中催化蔗糖 的水解，但在高浓度蔗糖溶液中会发生转移反应生成一系列的低聚蔗果糖。 但传统酶法生产f o s 周期长，成本高，近几年开始研究的微波固相合成低聚糖可 以很好的解决低聚糖生产周期长，成本高的问题。 1 2 2 微波固相合成低聚糖研究现状及出现的新问题 低聚糖合成反应可以看作羟基与醛基之间的脱水缩合反应。微波固相合成技术利用 单糖或双糖合成低聚糖，原料来源丰富、工艺简单效率高，且生物学试验证实了微波固 相合成低聚糖具有降脂、提高机体抗氧化和免疫力的功能。程景雄( 2 0 0 5 ) 1 2 0 j 首次利用 葡萄糖单糖通过微波固相催化反应来合成低聚葡萄糖，在合成过程中，引发剂通过吸收 微波能量提高反应初始速度，催化剂通过与糖分子接触而促进糖分子的缩合，低聚葡萄 糖产率为7 6 5 6 。其后，王芳2 、丁苏【2 2 1 、王海松【2 3 】通过优化微波辐射功率，微波辐 2 射时间，催化剂添加量，引发剂添加量条件，利用微波固相催化技术分别合成了甘露低 聚糖、低聚木糖、葡一半乳低聚糖，合成率分别为8 6 5 0 、8 4 8 6 、8 2 7 1 。其中王海 松1 2 3 】以双糖半乳糖合成的葡半乳低聚糖在紫外2 8 4 n m 处有吸收峰，并推测产物中可能 含有5 羟甲基糠醛( 5 h m f ) 。本研究在以蔗糖为原料微波固相合成低聚蔗果糖的工艺 研究中对5 h m f 生成量也进行了考察。 1 35 一羟甲基糠醛简介及研究现状 5 羟甲基糠醛( 5 h m f ) ，又称5 羟甲基2 糠醛，由单糖化合物加热分解产生。多糖 及苷类化合物在浓酸作用下首先水解成单糖，单糖在浓酸加热作用下，再脱去三分子 h 2 0 ，生成具有呋喃环结构的糠醛化合物。该物质稳定性欠佳，可进一步分解为乙酰丙 酸和甲酸或是聚合1 2 4 1 。 5 - h m f 主要存在于可能发生糖降解反应和美拉德反应的食品和植物中，干果、果汁、 面包、牛奶、蜂蜜、黄酒中都含有5 - h m f ，其中咖啡、梅干、黑啤，灌装桃子、葡萄干 中5 h m f 含量最高，浓缩苹果汁在储存7 0 d 后5 h m f 含量会缓慢增加【2 5 1 ，估计人体每天 会摄入3 0 15 0 r a g5 - h m f t 趵j 。 5 - h m f 可以作为很多重要药物中间体，也是化工高分子材料合成前体，如胶粘剂， 聚酯、聚酰胺合成的中间体而替代石油能源，5 - h m f j 丕可以作为液体烃类的合成前体1 2 。 近几年来，随着石油能源逐渐枯竭，从生物质生产高附加值化工产品已经成为许多国家 的重要发展战略和研究热点，5 - h m f 就是由糖制得的一种高附加值化工产品1 2 引。王军 ( 2 0 0 9 ) 【2 9 】利用1 2 蔗糖水溶液，以硫酸作为催化剂微波制取5 h m f ，产率为3 2 4 ； c h h e d ( 2 0 0 7 ) 3 0 】等用果糖、葡萄糖和木糖作为原料，水相用d m s o 调节以增进反应选 择性，有机相用甲基异丁酮$ n 2 丁醇增大有机相萃取5 h m f 能力，得到木糖、果糖和葡 萄糖转化为5 h m f 的选择性分别为9 1 、8 9 和5 3 。l e s h k o v 等( 2 0 0 6 ) d l j 通过改变 反应体系改进由果糖生产5 h m f 的工艺并认为果糖是以呋喃基果糖的形式脱水形成 5 - h m f ，而蔗糖酸催化水解的第一步是生成呋喃基果糖阳离子和葡萄糖【3 2 ，这使得在由 蔗糖合成f o s 过程中5 h m f 的生成不可避免。 5 - h m f 除由于其可替代不可再生能源而被关注外，还由于近年来发现5 一h m f 是一种 重要的中药成分而得到关注。很多中药材( 如白附子【3 3 1 、黄精【3 4 】、熟地黄【3 5 】) 中含有 多糖、还原糖等糖类物质，经炮制后5 h m f 含量增多，例如酒炖个黄精3 0 h5 - h m f 含量 最高0 0 7 5 ，4 5 h 之后含量可上升为0 4 ；刘美丽【3 5 】从熟地黄中分离得n 5 h m f ，其含 量为0 2 0 3 ；贾天柱【3 6 】等首次从狗脊中分离鉴定了有一定刺激性的5 h m f ，同时认 为可将其作为狗脊炮制品的一个指标物质。 对5 h m f 功能研究发现5 h m f 具有抗氧化【3 7 1 、保护大脑和抗心肌缺血【3 8 1 、c a 2 + 拮抗 活性、改善血液流变学、促进甘草酸、甘草次酸抑制肿瘤、抗炎、降低血中胆固醇【3 9 1 的作用；张如意( 2 0 0 8 ) 1 4 0 】研究认为山茱萸中5 - m f 能拮抗神经细胞骨架损伤；李林、 张兰、魏海峰1 4 1 - 4 2 1 等发表了关于5 h m f 用于制备神经系统用药和在制备防治神经退行性 疾病和认知损害的药品和保健品中用途的专利研究。 3 江南大学硕士学位论文 同时，5 - h m f 在很多物质中都有限量。例如蜂蜜中5 h m f 的存在会使蜂蜜的风味改 变和颜色加深，影响蜂蜜的口感、外观，降低蜂蜜的食用安全性【4 3 】，c a c 食品法典( 2 0 0 1 年修订) 中规定加工或混合后的蜂蜜中5 h m f 不得超过4 0 m g k g ；中国药典( 2 0 0 5 ) 规 定，葡萄糖注射液在2 8 4 n m ( 5 h m f 的紫外吸收波长) 处的吸收度不得大于0 3 2 。目前 对于5 h m f 毒副作用的研究结果主要有对人体横纹肌和内脏有毒副作用【删；5 0 m m 体外 培养会导致人体细胞内谷胱甘肽活性受到影响，但不会对人体造成伤害【4 5 】；大剂量 ( 1 0 0 3 0 0 m g k g ) 可能导致结肠小囊异常( a c f ) 生长，这表示5 h m f 能够诱导结肠干细 胞的突变【钧j 。 5 h m f 能对机体产生毒副作用的机理可能为【1 5 1 【4 7 。4 9 】：5 - h m f 的机体代谢主要产物为 5 - h m f a ( 5 羟甲基糠醛酸) ，但是有未知量的致变物质5 s u l p h o x y m e t h y l f u r f u r a l ( s m f ) 形成，这使5 h m f 对人体有了潜在的危险。在有磺基供体3 磷酸腺苷5 磷酸硫酸酯 o h 1 ：犷。 5 - h y dr o x y m e t h y l f u r f u r a l h oo 5 - h y d r o x y m e t h y l - 2 - f u r o i ca c i d (hmf)(hmfa) ( p a p s ) 存在时，5 - h m f 在磺基转移酶的作用下羟甲基基团磺化形成s m f 。去掉磺基 的p a s p 中的硫酸根能够产生很多能与d n a 反应的活性中间体以及一些大分子，因此能 够对机体产生毒性和致突变性。 王芳【2 1 1 、丁苏【2 2 1 、王海松【2 3 】利用微波固相催化技术合成的低聚糖均对小鼠机体的 抗氧化功能具有良好的保护作用，且显著( p o 0 5 ) 强于酶法合成低聚糖，在王海松合 成葡半乳低聚糖实验中已经推测存在5 一h m f ，5 - h m f 对提高低聚糖的功能性可能具有 一定的作用，但并没有做进一步的考证。在微波固相合成蔗果低聚糖的过程中，蔗糖和 酸的存在使5 h m f 的产生不可避免，由于近年来对5 h m f 对机体功能正负两方面的报 道，研究表明其过量使用产生毒性，适宜添加可能改善机体功能，然而未见低聚糖生产 过程中产生的5 h m f 对机体影响的系统研究。本实验将对微波固相合成低聚蔗果糖产物 中5 h m f 对机体抗氧化、免疫功能的影响和毒副作用做进一步的研究。 1 4 低聚蔗果糖与降脂、抗氧化和免疫功能 脂类是人体必需的营养和能量物质，但大量摄入脂肪在能量产生的同时伴随着大量 活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 生成，导致血脂代谢紊乱。血脂代谢紊乱引起血 液中胆固醇或甘油三酯的含量过高，造成高脂血症，导致低密度脂蛋白胆固醇( l d l c ) 含量升高，同时降低高密度脂蛋白胆固醇( h d l - c ) 含量，而高水平l d l c 和低水平 h d l - c 是引起动脉粥样硬化( a t h e r o s c l e r o s i s ，a s ) 的重要诱因【5 0 。5 。高脂膳食能够诱发 糖尿病、胰岛素抵抗、冠心病、高血压、心脑血管疾病、肾病综合症和癌症，是威胁人 类健康状态的危险因素之一5 2 】。 国内外绝大多数研究都认为f o s 具有降血脂的功能。f i o r d a l i s o 等( 1 9 9 5 ) 0 3 用含 4 1 0 f o s 的饲料饲喂大鼠j1 w 后血浆甘油三酯( t g ) 、磷脂和胆固醇( t c ) 开始降低， 并持续到1 6 周。t g 低伴随着血浆极低密度脂蛋白( l d l 广c ) 的降低，分离实验组大鼠 肝脏进行体外研究发现，长期摄入含1 0 的f o s 饲料降低了肝脏合成t g 的能力。在雄性 大鼠粉状基础饲料中添加1 0 f o s 饲喂3 0 d 后，大鼠血和肝脏中t g 、磷脂水平显著低于 对照组，但t c 浓度未受影响【1 4 】。国内1 9 9 7 年1 1 月中国卫生部食品卫生监督检验所试验 证明：f o s 具有降低血脂的功能。徐进等报道日粮中添加o 5 - 2 5 9 k g 体重的f o s ，可显著 降低高脂动物模型的大鼠血清t c 和t g 水平，但对高密度脂蛋白胆固醇( h d l - c ) 的水 平无显著影响。 研究表明部分低聚糖对物理、化学以及生物来源的多种活性氧( r o s ) 均具有清除作 用。邢荣娥等 s 3 】报道，壳聚糖分子量影响清除超氧阴离子的活性，水溶性低分子 ( n i r = 9 x 1 0 3 ) 部分清除率高于高分子壳聚糖( m w = 7 6 x 1 0 5 ) ；w a n g 等( 2 0 0 4 ) 【蚓证实琼 脂低聚糖具有体外抑制o h 、0 2 、r 0 0 的活性的作用，从而降低脂质过氧化程度；c h c n 等( 2 0 0 3 ) s s l 研究表明壳寡糖能螯合c u ”，抑制c u 2 + 催化的过氧化反应，体现抗氧化 活性；孙丽萍等 5 6 】报道较低聚合度褐藻胶寡糖清除自由基能力较强：陈筱娟等【5 7 】报道甲 壳低聚糖可提高小鼠s o d 的活性，加速氧自由基清除；陈建红掣5 8 】报道魔芋葡甘低聚 糖能够有效地保护d n a 免受羟自由基的损伤，并且能降低肝脏中m d a 水平，提高肝 脏和血浆s o d 、g s h p x 的活性。n a k a m u r a y ( 2 0 0 4 ) 等发现f o s 能增加小鼠肠粘膜上 i g a 分泌和p i 球的表达。在饮食中补充抗氧化剂有助于改善机体的氧化还原状态，对 与氧化应激密切相关的疾病有很好的预防和治疗效果【5 妯引。 1 5 立题意义及研究内容 f o s 已经作为一种重要的功能性低聚糖在食品及其他领域广泛应用，f o s 在我国 2 0 世纪9 0 年代初就已开发生产，但是f o s 作为一种新的食品添加剂还存在着许多问题： 比如生产周期长、生产条件要求严格、价格贵等。微波固相合成低聚糖技术具有操作简 单、反应时间短、得率高、能耗低等优点，且生物学试验已经证明了微波固相合成低聚 糖具有降脂、提高机体抗氧化和免疫力等方面的功能，因此微波固相合成技术可以为低 聚糖的快速制备提供条件。 酶法生产的低聚蔗果糖( e f o s ) 功能性研究显示了其优越的生理活性，微波固相 合成低聚蔗果糖( w - f o s ) 的功能性以及在w - f o s 合成过程中产生的5 - h m f 对w - f o s 功能和安全性的影响也亟待证明，以此为w - f o s 的开发和应用提供理论依据。 本实验主要从以下几个方面展开研究： 1 以蔗糖为原料，对微波固相合成低聚蔗果糖( w - f o s ) 的工艺进行优化，并对产 物进行分析； 2 w - f o s 及5 h m f 体外清除自由基能力研究； 3 w - f o s 及5 - h m f 对小鼠血脂、抗氧化能力及免疫活性影响； 4 w - f o s 及5 - h m f 的l d 5 0 实验及对小鼠机体r o s 的影响。 5 江南大学硕士学位论文 2 1 实验材料 2 1 1 主要实验试剂 酶法合成低聚蔗果糖( e f o s ) 五羟甲基糠醛( 5 - h m f ) 辣根过氧化物酶( h i 冲) 鲁米诺 昆明种雄性小鼠 牛血清白蛋白 r p m l l6 4 0 培养基 刀豆球蛋白a ( c o n a ) 噻唑蓝( m t t ) 蔗糖 催化剂a 其他试剂均为分析纯 2 1 2 主要实验仪器 m u l t i s k a nm k 3 酶标仪 高压液相色谱仪 超低温冷冻冰箱 u v l10 0 型紫外可见分光光度计 2 材料与方法 江门量子高科生物工程有限公司 e p o e h e mc o ，l t d ，纯度9 9 厦门太阳马生物科技有限公司 苏州亚科有限公司 购自苏州大学动物实验中心； 生化试剂 g i b c o 公司 s i g m a 公司 s i g m a 公司 中国医药集团上海化学试剂公司a r 级 x h 2 0 0 4 型电脑微波固相合成萃取仪 m p i b 型多参数化学发光检测仪 c 0 2 培养箱 超净工作台 7 2 2 分光光度计 台式离心机 超级恒温水浴锅 q l 9 0 1 旋涡混合器 低温高速离心机 生物显微镜 美国t h e r m o 公司 w a t e r s 6 0 0 美国 美国i n v e t r o 北京瑞利科学仪器有限公司 北京祥鹄科技发展有限公司 西安瑞迈分析仪器公司 美国t h e r m o 公司 苏净集团安泰公司 上海第三仪器厂 上海精密科学仪器有限公司 上海市化学仪器总厂 江苏海门其林医用仪器厂 上海安亭科学仪器厂 日本o l y m p u s 6 2 材料和方法 2 2 实验方法 2 2 1 低聚蔗果糖的微波固相合成工艺及r 产物成分分析方法 ( 1 ) 微波固相法合成w - f o s 路线：蔗糖_ 加入引发剂、催化剂_ 混匀一微波辐射反应 _ 冷却- 粉碎一产物。用单因素条件筛选、正交试验优化反应条件( 引发剂和催化剂添 加量、微波辐射功率和时间) 。 ( 2 ) 蔗糖转化条件的单因素实验 a 催化剂添加量对蔗糖转化率的影响：考察o 、0 0 1 、0 0 5 、0 1 、0 2 、0 5 的催化剂a 添加量对蔗糖转化率的影响，其它实验条件为：微波辐射时间1 2 0 s ，微波 辐射功率1 0 0 0 w ，引发剂添加量8 。 b 微波辐射时间对蔗糖转化率的影响：考察了6 0 s 、8 0 s 、1 0 0 s 、1 2 0 s 、1 4 0 s 、1 6 0 s 的微波辐射时间对蔗糖转化率的影响，其它实验条件为：催化剂添加量o 1 ，微波辐 射功率1 0 0 0 w ，引发剂添加量8 。 c 微波辐射功率对蔗糖转化率的影响：在催化剂添加量0 1 、微波加热时间1 2 0 s 、 引发剂添加量8 保持不变的条件下，“考察微波辐射功率分别为4 0 0 w 、6 0 0 w 、8 0 0 w 、 1 0 0 0 w 对蔗糖转化率的影响。 d 引发剂添加量对蔗糖转化率的影响在催化剂添加量0 1 、微波辐射时间1 2 0 s 、 微波辐射功率1 0 0 0 w 保持不变的条件下，考察4 、6 、8 、1 0 、1 2 引发剂添加 量对蔗糖转化率的影响。 ( 3 ) 正交实验因素及实验设计 通过单因素实验，选取催化剂添加量、微波辐射时间和功率、引发剂添加量做四因 素三水平正交实验。 ( 4 ) 全波长扫描、高效液相色谱法( h p l c ) 和总糖测定分析产物成分 a 全波长扫描。将合成产物的蒸馏水溶液进行全波长扫描，观察产物的吸收光谱。 b h p l c 分析产物中的糖组分及5 h m f 含量。 产物糖组分h p l c 分析条件：w a t e r s 6 0 0 ，色谱柱：s u g a r p a r k l ，6 5 m m i d x 3 0 0 m m ， 钙型阳离子交换柱；流动相：纯水；流速：0 4 m l m i n ；检测器：示差折光检测器， w a t t s 2 4 1 0 ；检测器灵敏度：4 ；柱温：8 5 。c ；进样体积：l o l l 。 产物5 h m f 含量条件：a m i i l e x h p x 8 7 h 氢型阳离子交换色谱柱( 3 0 0 x 7 8 m m ，美国) 紫外检测器，检测波长x = 2 8 4 n m ，流动相乙腈：水= 1 ：2 0 ，进样量l 此。 总糖测定：d n s 法测总糖。6m o l l 的h c i 溶液水解w - f o s 产物4 0 m i n ，用1 0 n a o h 溶液调至中性，采用d n s 法测定反应后总糖量。 ( 5 ) 合成产率的计算方法 合成产率= ( 反应后总糖量反应后蔗糖量反应后葡萄糖量反应后果糖量) 反应 初始蔗糖量1 0 0 w - f o s 得率= 反应后总糖量反应初始蔗糖量x10 0 7 江南大学硕士学位论文 其中，反应后蔗糖、葡萄糖、果糖的量均使用h p l c 法测定，测定条件同h p l c 糖成分分析。 5 - h m f 产率= 5 - h m f 量反应初始蔗糖量x10 0 ，5 - h m f 量使用h p l c 法测定。 ( 6 ) 5 h m f 的去除条件【6 3 】 在6 0 m i n 、8 0 c 、p h 3 0 、1 6 0 r m i n 、活性炭添加量2 0 、合成产物浓度3 0 0 m g m l 条件下去除5 - h m f 。 2 2 2 合成产物体外清除自由基能力测定方法 ( 1 ) d p p h 清除率的测定【6 4 1 。取不同浓度的样品2 m l ，加入l x l 0 4 m o l ld p p h 无水 乙醇溶液2 m l ，混匀，室温避光反应2 0 r a i n ，5 1 7 n m 处测定吸光度，空白组以等体积无水 乙醇溶液代替d p p h 溶液，对照组以等体积蒸馏水代替样品溶液，并以等体积蒸馏水 和无水乙醇混合液空白调零，清除率按下式计算：清除率i = 1 - ( o d i - o d j ) o d o x 1 0 0 o d o ：对照组吸光度；o d i ：样品组吸光度；o d ；空白组吸光度 ( 2 ) 羟自由基清除率测赳6 5 】。在试管中依次加入6 m m o l l 的f e s 0 4 溶液2 m l ，不同 浓度的样品溶液2 m l ，6 m m o l lh 2 0 2 溶液2 m l ，摇匀，静置1 0 m i n ，再加入6 m m o l l 水杨酸溶液2 m l ，摇匀，置于3 7 水浴中3 0 m i n ，5 1 0 n m 下测定吸光度a i ，用水代替水 杨酸时测定浓度a i ，对照组以等体积蒸馏水代替样品溶液，并以等体积蒸馏水和无水 乙醇混合液空白调零，清除率按下式计算： 清除率i _ 【1 - ( a i - a j ) a o x 1 0 0 a o ：对照组吸光度；a i ：样品组吸光度；a i ：空白组吸光度 ( 3 ) a b t s + 清除能力测定参照k o n g 6 6 】的方法，抑制率i ( ) = ( a o - - a ) a o x l 0 0 ， 其中舢为空白对照液的吸光度，a 为加入合成产物后的吸光度。 2 2 3 微波合成低聚蔗果糖及5 羟甲基糠醛对高脂日粮小鼠机体抗氧化剂免疫功能影响 2 2 3 1 实验动物 清洁级雄性昆明小鼠6 0 只，体重2 0 a ：2 9 ，购自上海伊莱克斯实验动物有限责任公司， 实验动物证号s c x x 沪2 0 0 7 0 0 0 5 。 ( 1 ) 实验设计及日粮： 表2 - 1 实验动物分组 t a b 2 - 1t h e g r o u p so fm i c e 木a 按照 6 3 】去除合成产物中的5 - h m f 为研究w - f o s 及其合成产物中5 h m f 对饲喂高脂日粮小鼠机体的影响，将实验小鼠 8 2 材料和方法 预饲1 w 后，空腹称重，随机分成6 组，按照表2 1 在高脂日粮中添j j i ：i e f o s ( 酶法生产低 聚蔗果糖) 、w - f o s ( 微波低聚蔗果糖产物) ，w o f o s 中分别含o ，0 0 2 、0 2 5 h m f ， 其中a 、b 分别为w - f o s 中去除、不去除5 h m f ，c 添加5 - h m f 。实验日粮组分见表2 2 。 表2 2 日粮组分 t a b 2 - 2c o m p o s i t i o no fd i e t 注：掌微量元素预混剂( m o 0 6 9 微量元素预混剂) ：f e s 0 4 h 2 0 ，1 5 3 ；c u s 0 4 h 2 0 ， 1 6 7 6 ；m n s 0 4 h 2 0 ，1 5 2 2 5 ；z n s 0 4 h 2 0 ，8 2 3 ；n a 2 s e 0 3 ，0 0 2 8 2 3 ；k i ，0 0 4 0 。 宰毒维生素预混剂( m g o 0 2 9 维生素预混剂) ：硫胺素，0 6 ；维生素b 2 ，0 6 ；维生 素b 6 ，0 7 ；烟酸，3 o ；泛酸钙，1 6 ；叶酸，0 2 ；维生素b 1 2 ，0 0 0 1 ；维生素k ， 0 0 0 5 ；生物素，0 0 2 ；维生素d 3 ，0 0 0 2 5 ；维生素a ，0 1 2 ；维生素e ，5 0 。 (