（纺织工程专业论文）基于红麻生物酶脱胶改性机理研究.pdf

摘要 摘要 随着科学技术的发展，利用生物技术进行麻类纤维脱胶改性成为近年来的热点。本 文在借鉴国内外专家研究成果基础上，交叉利用生物技术和纺织技术对红麻韧皮纤维进 行生物酶脱胶，将红麻韧皮纤维中的果胶等杂质除去，并在同一反应装置中实现改性。 这将提高红麻纤维支数、柔软度和可纺性，缩短脱胶改性时间，简化工艺流程，并减少 环境污染。 文章主要分析了韧皮纤维组分，筛选驯化出适应于红麻的脱胶菌种。从微观角度分 析酶的作用位置( 包括外切酶和内切酶) 及其切断方式对纤维的影响，并通过酶促反应 动力学来研究酶反应速度。探索了红麻生物酶脱胶改性机理及工艺，从分子水平详细分 析阐述生物酶作用机制、化学键断裂位置，并通过实验确定脱胶改性工艺流程及相关参 数。 经筛选驯化，所得红麻脱胶菌种为黑曲霉，其外切酶活力测定采用d n s 法，内切酶 活力测定采用粘度下降法。经测定得知，果胶外切酶活力为5 6 5 4u ，纤维素外切酶活力 为9 9 9u ，果胶内切酶活力为4 1 6 7u ，纤维素内切酶活力为2 6 3 1u 。 经过大量的实验优化，红麻韧皮纤维脱胶的主要影响因素有温度、p h 值、浴比、时 间、酶用量。由单因素实验和正交实验结果可知，最佳脱胶工艺条件为：温度3 6 c ，p h 值7 ，浴i ：t l ：3 5 ，时间5 0 h ，酶用量3 m l l o g 麻皮。同时，改性采用纤维素酶和果胶酶复 合改性法，温度采用酶制剂最佳温度3 8 ，最佳用量比例为纤维素酶：果胶酶= l o m g - 2 0 m g l o g 麻皮。 关键词：红麻，生物酶，脱胶改性，菌种筛选，机理，影响因素，工艺 a b s t r a c t a b s t r a c t a l o n gw i t ht h ed e v e l o p m e n to fs c i e n c ea n dt e c h n o l o g y , b i o - e n z y m a t i cd e g u m m i n ga n d m o d i f y i n go nb a s tf i b e rb e c o m e ss i g n i f i c a n ti ni n d u s t r y b a s e do nm a n yr e s e a r c h e s ，m u l t i - p u r p o s eu t i l i z a t i o no fb i o e n g i n e e r i n ga n dt e x t i l ee n g i n e e r i n ga r eu s e di nd e g u m m i n ga n d m o d i f y i n g k e n a fb a s tf i b e ri nt h i se s s a y t h i sm e t h o dw i l li m p r o v ec o u n t ，s o f t n e s s ，s p i na b i l i t y o ff i b e r ，a n dw i l ls h o r t e nd e g u m m i n gt i m e ，s i m p l i f yt e c h n o l o g i c a lp r o c e s sa n dp r o t e c t e n v i r o n m e n t i nt h i se s s a y ，t h ec o m p o n e n to fb a s tf i b e ri s a n a l y z e d ，a n dt h ep r o p e rb a c t e r i u mi s s c r e e n e d a tt h em e a n t i m e ，i n f l u e n c eo fp o s i t i o na n dm o d eo fe n z y m ea c t i o n ( i n c l u d i n ge n d o - p e c t a s ea n de x o - p e c t a s e ) o nf i b e ri sa n a l y z e d ，a n de n z y m es p e e di sr e s e a r c h e db a s e do n e n z y m ek i n e t i c s a f t e rt h a t ，m e c h a n i c sa n dt e c h n o l o g yo fb i o - e n z y m a t i cd e g u m m i n ga n d m o d i f y i n g i sr e s e a r c h e dv i e w e df r o mm o l e c u l a rl e v e l ，a n di t s p r o c e s sa n df a c t o r s a r e d e t e r m i n e dt h r o u g he x p e r i m e n t s a f t e rb e i n gs c r e e n e da n dd o m e s t i c a t e d ，a s p e r g i l l u sn i g e ri st h eb e s tb a c t e r i u mf o rk e n a f d e g u m m i n g , a n dd n sc o l o r i m e t r i cm e t h o di su s e dt od e t e r m i n ec x o - p e c t a s e ，w h i l e v i s c o s i t y - d r o pm e t h o di su s e dt od e t e r m i n ee n d o - p e c t a s e t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w s ：e x o - p e c t a s ei s5 6 5 4u ；e x o - c m ci s9 9 9u ；e n d o - p e c t a s ei s4 1 6 7u ；e n d o - c m c i s2 6 3 1u a f t e ro p t i m i z e db ye x p e r i m e n t s ，t h em a j o ri n f l u e n c i n gf a c t o r so fd e g u m m i n ga r e t e m p e r a t u r e 、p hv a l u e 、l i q u i dr a t i o 、t i m ea n dd o s eo fe n z y m e f r o mr e s u l t so fp a r a l l e l e x p e r i m e n t sa n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t s , t h eb e s tc o n d i t i o na r e 舔f o l l o w s ：t e m p e r a t u r ei s 3 6 ：p hv a l u ei s7 ；l i q u i dr a t i oi s1 ：3 5 ：t i m ei s5 0 h ；d o s eo fe n z y m ei s3 m f l o gf i b e r m e a n w h i l e ，m o d i f y i n gm e t h o do fc m ca n dp e c t a s ec o m p o s i t ea l g o r i t h mi su s e d ，a n dt h e p r o p e rt e m p e r a t u r e i s3 8 。c ，t h ep r o p e rd o s er a t i oi sc m c ：p e c t a s e = 1 0 m g ：2 0 m g l o gf i b e r k e y w o r d s ：k e n a f ，b io - e n z y m e ，d e g u m min ga n d m o dif yin g ，b a c t e ria s c r e e nin g ， m e c h a nis m 。in fiu e n cin gf a c t o r s t e c h n olo g y u 关于硕士学位论文使用授权的说明 论文题目：基王红鏖生塑酶遨膣邀世扭理硒宜 本学位论文作者完全了解大连轻工业学院有关保留、使用学位论 文的规定，大连轻工业学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论 文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文 的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 是否保密( 是) ，保密期至2 0 0 8 年1 2 月3 1 日为止。 学生签名：辂导师签名：互恤 6 年中月f 2 日 第一章文献综述 1 1 课题意义 第一章文献综述 随着石油资源的日益匮乏，化学纤维价格持续升高，加之人们对纺织品的要求逐步 趋向生态性、保健性，天然纤维的开发利用成为近年来的研究热点。麻类韧皮纤维是最 古老的天然纤维材料，具有良好的吸放湿性、透气性及抗静电、抗菌、抗紫外线等保健 性能。在高新技术的平台上，麻类韧皮纤维的可再生性、可循环性及与人体自然协调性 等绿色生态性能就更为显著，生产生态保健服饰已成为国内外市场的迫切需要。因此， 美国、瑞士、日本等许多国家都在积极开展麻类纤维资源的开发利用研究1 1 - 2 j 。 目前，苎麻、亚麻等纤维的深加工技术已趋于成熟，而对于红麻方面的研究却比较 少，其纤维仅局限于生产包装材料等初加工产品。然而，红麻是一种气候适应性强、投 入少产出多的经济作物，且在我国种植区域分布广，原料资源丰富，如能对其加以深加 工精加工，既可同苎麻、亚麻混纺，缓解其原料紧张的局面，降低生产成本，又可为麻 类服用产品开发提供新途径。 为了在纺织加工业中更好的利用红麻韧皮纤维资源，纤维前处理过程尤为重要。由 于胶质复合体的存在，必须对红麻韧皮纤维进行脱胶处理得到成纤，且脱胶质量是决定 红麻韧皮纤维可纺性和染色效果的关键。由于传统的脱胶方法均采用天然水沤麻或化学 方法处理，存在反应时间长、效率低、环境污染严重等不足，制约了红麻纤维资源的开 发利用。因此，利用生物技术进行红麻韧皮纤维脱胶改性成为当今研究热点l 刈。 本论文交叉利用生物技术和纺织技术对红麻韧皮纤维进行生物酶脱胶改性，改变了 传统脱胶改性技术，并针对北方高纬度地区土壤及气候等特点，驯化分离出适应北方低 温的脱胶菌种，提高纤维支数、柔软度和可纺性，并缩短了脱胶时间，减少了环境污染。 通过实验结果的分析，确定了果胶内切酶( e n d o - p m g 、e n d o - p g ) 、外切酶( e x o p m g 、 e x o - p g ) 作用机制，并以此为理论指导实践，为解决目前红麻纤维深加工精加工的难题， 扩大对红麻资源的开发利用做出一定贡献。 第一章文献综述 1 2 国内外研究现状 1 2 1 国内外麻类生物脱胶研究现状 由于传统的天然脱胶法和化学脱胶法存在脱胶时间长，劳动生产率低，水资源消耗 大，环境污染严重等不足，在当前水资源匮乏的情况下，这些方法已受到限制。因此， 自2 0 世纪中叶起，生物脱胶开始倍受关注，愈来愈多的国内外专家学者致力于生物脱 胶技术研究【7 1 。生物脱胶主要利用脱胶菌分泌的胞外酶系果胶酶、半纤维素酶等混 合酶液降解麻类韧皮纤维中的胶质，从而达到脱胶之目的。生物脱胶方法主要有加菌发 酵法和在原麻加入生物酶制剂两种。前者主要依靠脱胶菌在生长繁殖过程中分泌果胶酶 等胞外酶系，实现脱胶。后者则直接向脱胶液中添加果胶酶等商品酶制剂，使酶系直接 作用于韧皮纤维以实现脱胶。研究表明，两者脱胶原理都是依赖于酶脱除杂质，但区别 在于加菌发酵法中，果胶等杂质可作为微生物生长繁殖的碳源，而分泌的酶又可以分解 果胶，是一个“胶养菌一菌产酶一酶脱胶”的循环过程。而加生物酶制剂法，则直接添 加果胶酶等，是一个单向过程，成本较高，但酶损失较少，脱胶废液中的酶可回收利用。 相比之下，二者各有利弊，可依据不同生产环境的要求来选择适当工艺。经检索有关资 料，国内外麻类纤维生物脱胶的研究进展情况如下： 1 9 9 8 年瑞士联邦研究院( s w is sf e d e r a lr e s e a r c hs t a ti o n ) 对大麻微生物脱胶进行 了深入研究，并将脱胶后纤维成分含量同天然法、化学法及超声波法脱胶进行了对比， 结果表明生物脱胶纤维柔软，单纤强度高，综合指标效果最佳瞄l 。 自1 9 9 7 年起，美国克莱姆森( c l e m s o n ) 大学和乔治亚( g e o r g i a ) 大学d a n n ye a k i n 、 h e r r i k s s o ng 等人研究了亚麻纤维，从理论上阐述了酶的作用机制及在胶质细胞酶 解过程中发挥的作用。同时，用富含果胶的混合酶对纤维表面处理，利用电子扫描显 微镜，核磁共振等方法对纤维表面情况进行了检测。同时提出了喷雾酶法脱胶概念， 并确定了最佳工艺参数【虬1 1 j 。 瑞士生物技术研究所( i n s t i t u t eo fb i o t e c h n o l o g y ) f r e d ib r 百h l m a n n 等人在 1 9 9 5 - 1 9 9 7 年期间，筛选出适合于苎麻韧皮纤维的脱胶菌种a m y c o l a t as p ，在温度 3 0 ，p h = 7 条件下，使用旋转振荡器( 1 5 0 r p m ) ，2 4 h 内完成整个脱胶过程，其残胶 率为1 4 7 一1 7 3 ，且纤维可纺性好1 1 2 q 3 l 。 2 0 0 1 年印度旁遮普( p u n j a b ) 大学c h a n d i g a r h 等人对苎麻、大麻脱胶分别采用生物 脱胶法、生物一化学联合法和化学脱胶法，进行了对比实验，结果表面采用脱胶菌 2 第一章文献综述 b a c i l l u ss p 脚誓和化学联合法效果最佳，并对脱胶影响因素进行研究【1 4 l 。 1 9 9 1 年中国农科院麻类研究所孙庆祥等用多粘芽孢杆菌b a c i l l u sp o l y m y x a 进行了 红麻干皮润湿脱胶试验，结果表明3 5 。c 振荡培养6 h 后的菌液可使红麻湿润干皮在7 6 h 完成脱胶，与不加菌液的陆地湿润脱胶相比，时间可缩短3 天1 1 引。 1 9 9 1 年华中农业大学杨瑞鹏等人筛选出果胶酶、木聚糖酶活力高，而纤维素酶活力 低的a s p n i g e r , 并确定了最佳培养时间及产酶时间【1 6 j 。 2 0 0 0 年中国农科院麻类研究所刘正初等进行了多粘芽孢杆菌脱胶的系列研究，确定 红麻干皮、鲜皮和鲜茎在振荡、静置两种发酵体系中完成脱胶的最佳参数 r q 。 2 0 0 0 年东华大学卢士森博士运用生物能力学原理分析了黄红麻微生物脱胶过程，并 研究了好氧微生物脱胶过程及其污水净化1 1 8 l 。 2 0 0 0 年武汉大学曹军卫等从4 8 株菌株中筛选出3 株最适合苎麻韧皮纤维的脱胶菌， 4 8 小时可完成纤维脱胶，并可使纤维白度增加5 4 。同时，对多聚糖酶解过程也进 行了一定的阐述1 w j 。 1 2 2 国内外麻类生物改性研究现状 1 9 9 5 年丹麦诺维信生物科技公司( n o v o z y m e s 公司) 大门浩作提出用一种特殊的纤维 素c e ll u s o f tl 对纤维素织物进行改性可以得到很好的效果，并介绍了酶处理结果及 工艺【捌。 1 9 9 9 年日本京都工艺纤维大学的小田耕平教授在自然界发现并培养出一种分解菌， 用其萃取制得的粗酶液对纤维进行表面减量处理1 2 l l 。 2 0 0 3 年印度加尔各达黄麻研究所( i n s t i t u t eo fj u t et e c h n o l o g yk o l k a t a ) 和印 度黄麻纺织研究院( n a t i o n a li n s t i t u t eo fr e s e a r c ho nj u t ea n dh l l i e d f i b e r t e c h n o l o g y 。i n d i a nc o u n c i1o fa g r i c u l t u r a lr e s e a r c h ( i c a r ) ) sb a n i k 等人对 黄红麻脱胶和后处理进行了研究，提出了菌种筛选驯化方案，并对处理后的黄红麻纤 维各项理化参数进行了测定，提高了纤维可纺性1 2 引。 2 0 0 3 年东华大学郁崇文教授对利用生物一化学联合方法对黄红麻纤维的精细化处理 进行了分析探讨，对精细化处理的工艺流程、工艺参数等进行了多因子回归试验设计 及参数优化，得出了生物一化学联合精细化处理红麻纤维的优化工艺参刻驯。 归纳现有文献资料，除了上述的国内外应用生物技术对苎麻、亚麻、大麻等脱胶改 性外，还有相当一部分红麻生物脱胶改性研究集中在制浆造纸等领域1 2 4 啦l ，而红麻作为 3 第一章文献综述 服用纺织原料的生物酶脱胶改性研究则鲜有报道。 在上述的国内外麻类纤维生物脱胶、改性研究中，有的采用了生物和化学结合的工 艺技术，有的纯粹应用生物技术，有的对于生物脱胶菌种筛选、检测及能量转换等进行 了一定基础研究工作1 2 7 2 s 1 。但针对红麻韧皮纤维胶质复合体结构，从分子水平阐述其脱 胶改性机理，这类报道还尚未见到，且现有文献的红麻韧皮纤维生物酶处理中存在工艺 流程冗长、反应条件变化剧烈、参数不易控制等不足。 1 3 本文主要研究内容及创新点 本课题在借鉴国内外研究成果的基础上，筛选出适用于红麻韧皮纤维的脱胶菌种， 探索生物酶脱胶改性机理，从生物学角度阐述脱胶改性菌种生物力学能量代谢转化过程 和机理，分析果胶内切酶( e n d o p m g 、e n d o - p g ) 、外切酶( e x o p m g 、e x o p g ) 作用机 制。在上述理论指导下，确定红麻生物酶脱胶改性最佳工艺条件，改善纤维理化性能， 降低结晶度、取向度和初始模量，提高纤维支数、柔软度和可纺性，为解决目前红麻纤 维深加工精加工的难题，开发绿色生态红麻纺织品提供理论基础和技术保证。 本文主要研究内容有以下三点： 1 筛选分离脱胶菌种，研究菌种生长繁殖及产酶的最佳条件，并测定菌种酶活力。 2 确定生物酶脱胶改性的最佳工艺及参数，包括温度、时间、p h 值等。通过生物检测 方法和纺织检测方法对纤维脱胶改性效果进行评价。 3 分析红麻大分子结构，探索生物酶脱胶改性机理。从生物学角度阐述脱胶改性菌种 生物力学能量代谢转化过程，分析果胶内切酶( e n d o p m g 、e n d o p g ) 、外切酶 ( e x o - p m g 、e x o - p g ) 作用机制、果胶大分子链断裂方式及其对纤维性能的影响。 本文创新点为以下三个方面： 1 驯化分离出适应北方低温的脱胶菌，测定其酶活力，分析脱胶改性菌种生物力学能 量代谢转化过程和机理及微生物生化反应过程的质量和能量衡算( 包括碳源、a t p 、 氧及反应热) 。 4 第一章文献综述 2 运用生物化学、分子生物学及纺织工程学科交叉研究从生物化学角度阐述脱胶改性 菌种生物力学能量代谢转化过程和机理，分析果胶内切酶( e n d o - p m g 、e n d o - p g ) 、 外切酶( e x o - p m g 、e x o - p g ) 作用机制。 3 运用酶促反应动力学来研究酶反应速度，分析底物浓度、酶浓度、p h 、温度、抑制 剂和激活剂等对果胶酶活力的影响。 5 第二章菌种筛选t 艺原理 第二章菌种筛选工艺原理 2 1 工业微生物菌种与种子的扩大培养 2 1 1 工业生产常用微生物及要求 微生物的资源非常丰富，广泛分布于土壤、水和空气中，尤以土壤中最多。其特点 是种类多，分布广；生长迅速，繁殖速度快；代谢能力强；适应性强，容易培养。 工业生产常用微生物有细菌、酵母菌、霉菌、放线菌、担子菌和藻类等，它们的代 谢产物掘统计已超过1 3 0 0 种，而大规模生产的不超过一百多种；微生物酶有近千种， 而工业利用的不过四五十种。因此，微生物在工业中的应用具有很大发展潜力1 2 9 l 。 尽管微生物工业用的菌种多种多样，但作为大规模生产，对菌种则有下列要求： 原料廉价、生长迅速、目的产物产量高； 易于控制培养条件，酶活性高，发酵周期较短； 抗杂菌和噬菌体的能力强； 菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，保 证安全生产。 2 1 2 工业微生物菌种的选育方法 菌种选育的目的是改良菌种的特性，使其符合工业生产的要求，包括自然选育和诱 变选育。前者不经过人工诱变处理，根据菌种的自发突变而进行菌种筛选；后者采用种 种措施打破菌种的正常代谢，对其进行调节控制，从而大量积累我们所需要的代谢产物。 2 1 2 1 自然选育 从自然界分离获得菌株一般包括以下几个步骤： 采样：采样地点的确定要根据筛选的目的、微生物的分布概况及菌种的主要特征与 外界环境关系等，进行综合具体的分析来决定。由于采样后的环境条件与天然条件 有很大差异，一般应尽快分离。 增殖培养：所谓增殖培养就是给混合菌群提供一写有利于日标菌株生产或不利于其 6 第二二章菌种筛选t 艺原理 他菌株生长的条件，以促使目标菌株大量繁殖，从而有利于分离它们。例如培养果 胶酶生产菌时，以果胶为唯一碳源进行增殖培养，使得不能分解果胶的菌不能生长。 除碳源外，微生物对氮源、维生素及金属离子的要求也是不同的，因此还应适当地 控制这些营养条件，以提高分离效果。 纯种分离：通过增殖培养还不能得到微生物的纯种，因为生产菌在自然条件下通常 是与各种菌混杂在一起的，所以还要进行分离纯化_ 才能获得纯种。其方法常选用单 菌落分离法。把菌种制备成单孢子或单细胞悬浮液，经过适当的稀释后，在琼脂平 板上进行划线分离。划线法是将含菌样品在固体培养基表面作有规则的划线，菌样 经过多次从点到线的稀释，最后经培养得到单菌落。 为了提高筛选工作效率，在纯种分离时，应通过培养条件，如营养成分、培养基p h 值、添加抑制剂、改变培养温度和通气条件及热处理等，来提高筛选效率。平板分离后 挑选单个菌落进行生产能力测定，从中选出优良的菌株。 性能测定：由于纯种分离后，得到的菌株数量非常大，如果对每一菌株都作全面或 精确的性能测定，工作量将十分巨大，而且是不必要的。一般采用两步法，及初筛 和复筛，经过多次重复筛选，直到获得卜3 株较好的菌株，供发酵条件的摸索和生 产试验，进而作为育种的出发菌株。 2 1 2 2 从自发突变体中获得菌株 一般微生物可遗传的特性发生变化称为变异，又称突变，是微生物产生变种的根源， 同时也是育种的基础。自然突变是指在自然条件下出现的基因变化。目前，发酵工业中 使用的生产菌种，几乎都是经过人工诱变处理后获得的突变株。这些突变株是以大量生 成某种代谢产物( 发酵产物) 为目的筛选出来的，因而它们属于代谢调节失控的菌株。 微生物的代谢调节系统趋向于最有效地利用环境中的营养物质，优先进行生长和繁殖， 而生产菌种常常是打破了原有的代谢调节系统的突变株，因此常常表现出生活力比野生 菌株弱的特点。此外，生产菌种是经人工诱变处理而筛选获得的突变株，遗传特性往往 不够稳定，容易继续发生变异，使得生产菌株呈现出自然变异的特性，如果不及时进行 自然选育，通常会导致菌种性能变化，使发酵产量降低。 自发突变的频率较低，因此自然选育筛选出来的菌株，不能满足育种工作的需要， 不完全符合工业生产的要求，如产量低、副产物多、生长周期长等。因而不能仅停留在 “选”种上，还要进行“育种。如通过诱变剂处理菌株，就可以大大提高菌种的突变 频率，扩大变异幅度，从中选出具有优良性能的变异菌株，这种方法就称为诱变育种。 7 第二章 菌种筛选一e 艺原理 本实验采用自然选育法。菌种分离的程序如图2 - 1 所示。 第二次平板分离l 第二次原种斜面 i 定性或半定量测定一 初筛( 1 株1 瓶) 一 q 攀 第四次平板分离 i 第四次原种斜面 i 图2 - 1黑曲霉菌种分离的程序 f ig u r e2 1p r o c e s so fb a c t e rias e p a r a ti0 1 1 8 第二章菌种筛选【艺原理 2 2 培养基的选择和制备 2 2 1 培养基的类型和用途 根据来源，可分为天然、合成和半合成培养基。天然培养基是采用化学成分不清楚 或化学成分不恒定的各种植物、动物组织或微生物的浸出物、水解液等物质( 如牛肉膏、 酵母膏、麦芽汁、蛋白胨等) 制成的。适合于各类微生物的生长，而一般自养生物不能 生长。合成培养基是使用化学成分和数量完全了解的物质配制而成的，成分精确，重复 性强，可以减少不能控制因素，适用于实验室范围作为有关营养、代谢、分类鉴定、生 物测定及选育菌种、遗传分析定量研究工作。半合成培养基为既含有天然成分又含有纯 化学试剂的培养基。从物理形状培养基又可分为液体、固体和半固体培养基。 根据主要成分或使用目的可分为基础、增殖、鉴别和选择培养基。鉴别培养基是培 养基中价有能与某一菌的无色代谢物发生显色反应的指示剂，从而用肉限区别该菌与其 它菌。选择培养基是根据某种生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设 计的培养基。 根据生产工艺的要求可分为孢子、种子和发酵培养基。孢子培养基是供制备孢子用 的培养基，种子培养基是满足菌种生长的培养基，发酵培养基是满足大生产中大量菌体 生长和繁殖以及代谢产物积累的营养基质。 2 2 2 培养基的配制原则 培养基的配制必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分；有利于减少培养基 原料的单耗，单位营养物质所合成产物数量大或产率大；有利于提高培养基产物的浓度， 以提高单位溶剂发酵罐的生产能力：有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期；尽量 减少副产物的分离和纯化；尽可能减少产生“三废 的物质。 2 2 2 1 根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基 不同的微生物所需要的培养基成分是不同的，要确定一个合适的培养基，就需要了 解生产用菌种的来源、生理生化特性和一般的营养要求，根据不同生产菌种的培养条件、 生物合成的代谢途径、代谢产物的化学性质等确定培养基。 9 第二章菌种筛选工艺原理 2 2 2 2 营养成分的恰当配比 微生物所需的营养物质之问应有适当的比例，培养基中的碳氮的比例( c n ) 在发 酵工业中尤其重要。如培养基中氮源过多，会引起微生物生长过于旺盛，而不利于产物 的积累；氮源不足，则微生物菌体生长过于缓慢。当培养基中的碳源供应不足时，容易 引起微生物菌体的衰老和自溶。培养基的碳氮比不仅会影响微生物菌体的生长，同时也 会影响到发酵的代谢途径。不同的微生物菌种，不同的发酵产物所要求的碳氮比是不同 的，即使同一微生物在不同的培养阶段，对培养基的碳氮比的要求也是不一样的。 2 2 2 3 渗透压 配制培养基时，应注意营养物质要有合适的浓度。营养物质的浓度太低，不仅不能 满足微生物生长对应用物质的需求，而且也不利于提高发酵产物的产量和提高设备的利 用率。但是，若培养基中营养物质的浓度过高，也会影响到培养基的渗透压和微生物的 代谢活动。因此，培养基中各种离子的比例需求要平衡。在发酵生产过程中，在不影响 微生物的生理特性和代谢转化率的情况下，通常趋向在较高浓度下进行发酵，以提高产 物产量，并尽可能选育高渗透压的生产菌株。 2 2 2 4p h 值 各种微生物的正常生长均需要有合适的p h 值，一般霉菌和酵母菌比较适合于微酸 性环境，放线菌和细菌适合于中性或微碱性环境。为此，当培养基配制好后，若p h 值 不合适，必须加以调节。当微生物在培养过程中改变培养基的p h 值而不利于本身的生 长时，应以微生物菌体对各种营养成分的利用速度来考虑培养基的组成，同时加入缓冲 溶液调节培养液本身的p h 值。 2 2 3 培养基成分配比的选择 培养基的组分( 包括这些组分的来源和加入方法) 、配比、缓冲能力、黏度、消毒 是否彻底、消毒后营养破坏的程度及原料中杂质的含量都对菌体生长和产物形成有影 响。目前主要在生物化学、细胞生物学等基本理论指导下，参照前人所使用的较适合于 某一类菌种培养基的经验配方，再结合所用菌种和产品的特性，对碳、氮无机盐和前体 等进行逐个单因子试验，观察这些因子对菌体生长和产物合成量的影响，最后再综合考 虑各因素的影响，得到一个适合该菌种的培养基的配方，以达到高产的目的。 1 0 第一二章菌种筛选工艺原理 2 3 黑曲霉好氧发酵机制 黑曲霉是好氧菌，其发酵机制遵循好氧发酵的基本规律。它可以由糖类、乙醇和醋 酸经过t c a 循环，发酵生产有机酸。t c a 循环是大多数动物、植物、微生物在有氧条件 下，经e m p 途径产生的丙酮酸脱羧得到乙酰c o a ，再经一系列的氧化、脱羧，最终生成 c o 。和h z 0 并产生能量的过程【3 0 1 。图2 2 是黑曲霉t c a 循环与乙醛酸循环途径。 葡萄糖 i 1 5 l 谷氨酸 衣康酸 果胶酶 图2 - 2 黑曲霉t c 循环与与乙醛酸循环 f i g u r e2 - 2a s p e r g i il u sn i g e rt c ac y c i e 卜丙酮酸脱氢酶：2 一柠檬酸合成酶：3 一顺乌头酸酶：4 ，5 一异柠檬睃脱氢酶； 6 - a 一酮戊二酸脱氨酶：7 - 琥珀酰辅酶a 合成酶；8 琥珀酸脱氢酶；9 一延胡索酸酶； 1 0 一l 一苹果酸脱氧酶：1 卜异柠檬酸裂解酶；1 2 一苹果酸合成酶；1 3 - 丙酮酸羧化酶； 1 4 一苹果酸酶：1 5 - 谷氮酸脱氧酶；1 6 - 呜头酸脱羧酶 柠檬酸合成酶是t c a 循环的关键酶，其活力受a t p 的终产物抑制，a t p 降低此酶 对乙酰c o a 的亲和力，在某些细菌中受n a d h 2 的抑制，h d m p 能促进反应加快，该酶 第- 二章菌种筛选工艺原理 催化草酰乙酸和乙酰c o a 合成柠檬酸，该反应t c a 循环中的限速反应。t c a 循环的速 度取决于该酶促反应的速度，该反应又取决于两个底物的浓度和酶的活力。乙酰c o a 可来自于e m p 途径、脂肪酸的1 3 一氧化，与其调节有关。 每分子葡萄糖经e m p 途径与t c a 循环彻底氧化时，共产生3 8 分子a t p ，可提供 生物体利用的能量，是生物体生命活动能量的主要来源。e m p 途径t c a 循环中的一系 列中间产物提供了合成其它生物物质的原料。如反应中放出c 0 2 ，可参与嘌呤与嘧啶的 合成；乙酰c o a 可合成脂肪酸；q 一酮戊二酸可转化为谷氨酸；草酰乙酸可转化为天 冬氨酸，这两种氨基酸都可能参与蛋白质的合成。反之，核酸、脂肪、蛋白质的分解代 谢最终也都可以进入t c a 循环而被彻底氧化。t c a 循环是联系各类物质代曝的枢纽。 2 4 生物反应动力学 生物反应基本上有两种情况：一是使底物在酶( 游离酶或固定化酶) 的作用下进行 反应，如淀粉的液化、异构糖的生产、无侧链青霉素的制造等；二是通过细胞的培养， 利用细胞中的酶系，把培养基中的物质通过复杂的生物反映转化成新的细胞及其代谢产 物。本文主要讨论后者，即黑曲霉发酵生产过程中生长、基质消耗、产物生成的动态平 衡及其内在规律。菌体浓度、基质浓度、温度、p h 值、溶解氧等工艺参数的控制方案， 可作为设计生物反应动力学模型的理论依据。 2 4 1 黑曲霉生物反应过程动力学描述 2 4 1 1 黑曲霉菌体生长速率 微生物进行发酵过程反应系统的动力学描述常采用群体来表示，其群体的生长速率 反映群体生物量的生长速率。因此，菌体量的生长概念是生产速率的核心。菌体量一般 指其干重，在液体培养基中的群体生长，其生长速率通常用单位体积来表示，指单位体 积、单位时间里生长的菌体量；在表面上的群体生长，其生长速率应以单位表面积来表 示，生长的微生物群体存在着细胞大小的分布。由于单细胞生长速率与细胞的大小直接 相关，因此也存在生长速率分布。本文所讨论的黑曲霉生长速率是指具有这种分御的群 体平均值。 比生长速率是黑曲霉菌体浓度除菌体的生长速率和菌体浓度除菌体的繁殖速率。在 平衡条件下，比生长速率i l 的定义式为： 1 2 第二章菌种筛选1 二艺原理 口! d e ( x ) 或 ，。疋万t 疑 ，。了d c ( x ) p 。( 工) y ，。j f 一。p c 。五 式中t 时间h ；1 ，x 菌体生长速率，g ( l h ) 菌体生长速率ux 与黑曲霉的浓度c ( x ) 成正比。比生长速率p 除受细胞自身遗传 信息支配外，还受环境因素的影响。 2 4 1 2 基质消耗速率 以黑曲霉菌体得率系数为媒介，可确定基质的消耗速率与生长速率的关系。基质的 消耗速率us 可表示为- - v ，= ，式中k ，菌体得率系数， g m o l 。 lx | s 基质的消耗速率常以单位菌体表示，成为基质的比消耗速率。当以氮源、无机盐、 维生素等为基质时，由于这些成分只能构成菌体的组成成分，不能成为能源，e ，近似 一定，上式能够成立。但当基质既是能源又是碳源时，就应考虑维持能力。 碳源总消耗速率= 用于生长的消耗速率+ 用于维持代谢的消耗速率 1 ， - - v 一l + m c ( x ) 式中m 基质维持代谢系数，m o l ( g 菌体h ) 一，。碳源总消耗速率，m o l ( l h ) ，。黑曲霉菌体生长速率，g ( l h ) e 黑曲霉菌体生成得率系数，g t o o l 。 2 4 1 3 黑曲霉代谢产物的生成速率 由黑曲霉反应生成的代谢产物种类很多，并且细胞内的生物合成途径与代谢调节机 制各有特色，因此很难用统一的生成速率模式来表示。代谢产物有分泌于培养液中的， 也有保留在细胞内的，因此讨论生成速率的数学模式应分为两种情况。 与生长速率和底物消耗速率相同，当以体积为基准时，称为代谢产物的生成速率u p ；当以单位质量为基准时，称为产物的比生成速率q 。c o 。不是目的代谢产物，但是在 反应中是一定产生的。c o ：的q 值，常表示为q ( c o ：) 。好氧微生物反应中c 晚相对于氧 的消耗，又称呼吸商( r q ) 。 1 3 第二章菌种筛选工艺原理 咖瓣一面u ( c 0 2 ) 一丽q ( c o z ) 一般q 是p 的函数，考虑到生长偶联与非生长偶联两种情况，q 与p 的关系可写成 q = a + bl l + cu2 ，其中a 、b 、c 为常数。 2 4 2 生物反应模式与发酵方法 2 4 2 1 生物反应动力学分类 本文将各种生物反应动力学分类归纳如表2 - 1 。 表2 - 1发酵动力学分类 t a b i e 2 1c i a s s i f i c a t i 0 1 3o ff e r m e n t a t i o nd y n a m ic s 1 4 第二章菌种筛选工艺原理 2 4 2 2 发酵方法 微生物发酵过程根据发酵条件要求分为好氧发酵和厌氧发酵。好氧发酵法有液体表 面培养发酵、在多孔或颗粒状固体培养基表面上发酵和通氧深层发酵等。厌氧发酵采用 不通氧的深层发酵。因此，无论好氧与厌氧发酵都可以通过深层培养来实现，在具有一 定径高比的发酵罐内完成。具体分为以下几种： ( 一) 分批发酵法( b a t hf e r m e n t a ti o n ) 发酵工业中常见的分批发酵方法是采用单罐深层分批发酵。每一个分批发酵过程都 经历接种、生长繁殖、菌体衰老进而结束发酵，最终提取产物。其特点是：微生物所处 的环境是不断变化的，可进行少量多品种的发酵生产，发生杂菌污染很容易终止操作， 当运转条件发生变化或需要新生产新产品时，易改变处理对策，对原料组成要求较粗放。 分批培养过程细菌生长，可分为调整( 停滞) 期、对数生长期、平衡( 稳定) 期和 衰亡期四个阶段。研究细胞的代谢和遗传宜采用生长最旺盛的对数生长期细胞，把它们 接种到发酵罐新鲜培养基时，几乎不出现调整期，这样可在短时间内获得大量生长旺盛 的菌体，有利于缩短生产周期。在研究和生产中，常需要延长细胞对数生长阶段。 ( 二) 补料分批发酵法( f e d b a t hf e r m e n t a t io n ) 补料分批发酵又称半连续发酵或半连续培养，指在分批培养过程中，间歇或连续地 补加新鲜培养基的培养方法。其优点在于使发酵系统中维持很低的基质浓度，可出去快 速利用的碳源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，使不致加剧供氧的矛盾，亦可避免 培养基积累有毒代谢产物。 补料分批发酵广泛应用与抗生素、氨基酸、酶制剂、核苷酸、有机酸及高聚物等的 生产。 ( 三) 连续发酵法( c o n ti n u o u sf e r m e n t a ti o n ) 连续发酵过程是当微生物培养到对数生长期时，在发酵罐中一方面以一定速度连续 不断地流加新鲜液体培养基，另一方面又以同样的速度连续不断地将发酵液排出，使发 酵罐中微生物的生长和代谢活动始终保持旺盛的稳定状态，而p h 值、温度、营养成分 的浓度、溶解氧等都保持一定，并从系统外部予以调整，使茵体维持在恒定生长速度下 进行连续生长和发酵，这样就大大提高了发酵的生长效率和设备利用率。 连续发酵主要有开放式和封闭式两种类型。 1 、开放式连续发酵 在开放式连续发酵系统中，培养系统中的微生物细胞随着发酵液的流出而一起流 第一二章菌种筛选工艺原理 出，细胞流出速度等于新细胞的生成速度。在这种情况下，可使细胞浓度处于某种稳定 状态。最后流出的发酵液或通过循环系统部分返回发酵罐进行重复使用，或不循环不重 复使用。 ( 1 ) 单罐均匀混合连续发酵培养液以一定的流速不断地流加到带机械搅拌的发酵罐 中，与罐内发酵液成分混合，同时带有细胞和产物的发酵液又以同样流速连续流 出。 ( 2 ) 多罐均匀混合连续发酵将若干搅拌发酵罐串联起来，就构成多罐均匀混合连续 发酵装置。新鲜培养液不断流入第一只发酵罐，发酵液以同样流速依次流入下一 只发酵罐，在最后一只罐中流出。多级连续发酵可以在每个罐中控制不同的环境 条件以满足微生物生长各阶段的不同需要，并能使培养液中的营养成分得到较充 分的利用，最后流出的发酵液中产物的浓度较高，所以是最经济的连续方法。 ( 3 ) 管道非均匀混合连续发酵管道的形式有多种，如直线形、s 形、蛇形管等。培养 液和从种子罐出来的种子不断流入管道发酵器内，使微生物在其中生长、繁殖和 积累代谢产物。这种连续发酵的方法主要用于厌氧发酵。如在管道中用隔板加以 分割，每一个分隔等于一台发酵罐，就相当于多罐串联的连续发酵。 ( 4 ) 塔式非均匀混合连续发酵用多孔板将其分隔成若干室，每个室等于一台发酵罐， 这样一台多孔板塔式发酵罐就相当于一组多级串联的连续发酵装置。也可在罐内 装设填充物，使菌体在上面生长，这种形式仍然属于单罐式。 2 、封闭式连续发酵 在封闭式连续发酵系统中，运用某种方法使细胞一直保持在培养器内，并使其数量 不断增加。某些限制因素在培养器中发生变化，最后大部分细胞死亡。因此，在该系统 中，不可能维持稳定状态。封闭式连续发酵可以用开放式连续发酵设备加以改装，只要 使用部分菌体重新循环。也可采用间隔物或填充物置于设备内，使菌体在上面生长，发 酵液流出时不带细胞或所带细胞极少。 近年来，透析膜连续发酵法逐渐被采用，它是采用一种具有微孔的有机膜将发酵设 备分隔，这种膜只能通过发酵产物，而不能通过菌体细胞。这样，将培养液连续流加到 发酵设备的具有菌体的间隔中，微生物的代谢产物就通过透析膜连续不断地从另一间隔 流出。在一些发酵过程中，当发酵液中代谢产物积累到一定程度，就会抑制它的继续积 累，而采用透析膜发酵的方法可使代谢产物不断透析出去，发酵液中留下不多，因而可 以提高产品得率。 1 6 第二章菌种筛选工艺原理 2 4 2 3 黑曲霉发酵动力学 发酵生产水平高低除了取决于生产菌种本身的性能外，还要受到发酵条件、工艺等 的影响。只有深入了解生产菌种在合成产物过程中的代谢调控机制以及可能的代谢途 径，弄清生产菌种对环境条件的要求，掌握菌种在发酵过程中的代谢变化规律，才能有 效控制各种工艺条件和参数，使生产菌种能始终处于生产和产物合成的优化环境中，从 而最大限度地发挥生产菌种的合成产物的能力。 本文主要介绍黑曲霉分批培养反应动力学。 2 4 2 3 1 分批发酵的不同阶段 在分批培养过程中，随着黑曲霉生长和繁殖，细胞量、底物、代谢产物的浓度等均 不断发生变化，可分为停滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期四个阶段，如图2 3 所示。 ，总 菌 数1 0 和 活 菌 数c 的各 对 数 时间h 图2 - 3 分批培养过程中黑曲霉菌体生长曲线 f i g u r e2 - 3b a c t e r i ag r o w t hc u r v ei nb a t hf e r m e n t a t i o n 活菌数；一一总菌数 a 停滞期：b 对数生长期；c 稳定期；d 衰亡期 处于不同生长阶段的黑曲霉细胞成分也有很大差异。停滞期是黑盐霉细胞适应新环 境的过程，细胞内会产生新的营养物质运输系统，可能有一些基本的辅助因子扩散到细 胞外，同时参与初级代谢的酶类再调节状态以适应新环境。 1 7 第二章菌种筛选 ：艺原理 处于对数生长期的黑曲霉细胞，单位时间内数目或质量的增加恒定，并达到最大值。 如在半对数纸上用细胞数目或细胞质量的对数值对培养时间作图