（预防兽医学专业论文）牛γ干扰素和人溶菌酶共表达载体的构建和表达产物的纯化.pdf

周磊：牛丫- 干扰素和人溶菌酶共表达载体的构建和表达产物纯化 牛y 一干扰素和人溶菌酶 共表达载体的构建和表达产物的纯化 研究生：周磊 导师：秦爱建教授 摘要 一、牛y 一干扰素和人溶菌酶共表达载体的构建及表达 分别将牛y 干扰素基因( b o i f n 吖) 和内部核糖体位点( i r e s ) 从p f a s t - i f n 载体 和p i r e s 载体质粒上双酶切回收，亚克隆到p f a s t b a c - h l y z 载体中，构建转移载体 p f a s t b a c l i f n i i 也s 1 l i 拶z ；转移载体质粒转化d h l o b a c 感受态大肠杆菌，通过位点特 异性转座作用将牛y 干扰素基因( b o i f n - 丫) 和人溶菌酶基因( 1 岫z ) 整合到b a c m i d 穿梭 载体中。在含庆大霉素、四环素、卡那霉素、i p t g 和x g a l 的l b 平板上筛选发生转座的 白色菌落，提取d n a ，获得重组穿梭载体b a c m i d i f n i r s 岫z ；将重组穿梭载体 b a c m i d i f n i r s h l y z 用脂质体介导转染s f 9 昆虫细胞，产生有感染力的重组杆状病毒： p c r 扩增结果证实b o i f n 吖和h l y z 基因重组到杆状病毒基因组中；表达产物中含有牛y 一 干扰素和人溶菌酶重组蛋白。 二、牛y 一干扰素真核表达产物的纯化 分别以不同m o i 的重组病毒感染s f 9 细胞，并在感染后不同时间段收集上清，进行 表达产物的活性检测，选择最佳的优化条件进行重组蛋白的大量生产。将重组牛t 干扰素 感状病毒感染s f 9 细胞，5 天后收获细胞上清，透析浓缩后，用羟基磷灰石层析和疏水层 析过柱，获得初步纯化的牛y 干扰素重组蛋白。 关键词：牛y 一干扰素；人溶菌酶；杆状病毒；纯化 扬州大学硕士学位论文 c o n s t r u c ta n d c o e x p r e s s i o no fb o i f n 丫a n dh l l y za n d d u r i 6 c a t i o no fb o i f n 吖d u r l i l c a t l o n0 ib o i r 。n y a b s t r a c t m sc a i l d i d a t e ：l e iz h o u s u p e i 弋，i s o r ：p r d a i j i a nq i n 1c o n s t r u c ta n dc o e x p r e s s i o no fb o i f n 吖a n dh l y z i i b o i f n 吖g e n e 舶mp f a s t - i f nv e c t o r 锄di r e sg e n e 舶mp i r e sv e c t o rw e r er e s p i 刚v e l y s u b c l o n e d 硫op f a s t b a c h l y zv e c t o r t h er c c o m b i n 锄仃a n s f e rv e c t o r 、v a sn a m e d 嬲 p f a s t b a c - i f n - i r e s - h l y z n e nm ev e c t o rw a s 仃a n s f o n n e d 缸om ec o m p e t e n tc e l l so f e c 0 l id h lo b a u cw t l i c hc o r 晡nt h eb a c 面d 谢t 1 1an 蜥一a t t t n 7t 鹕e ts i t ea 1 1 dt h eh e l p e rp l a s i l l i d r e c o m b i 咖tb a c m i d - i f n - i r e s - h i 弘w 嬲g e n e r a t e db y 衄l s p o s m gt l l em i i l i t n 7e l e m e n t l o c a t e di np f a s t b a c i f n - i r e s - h l y zt 0t l l em i - a t t t n 7 甜a c l l n l e ms i t eo nt l l eb a c m i d t h c r e s u ho fp c rs h o w e db o i n g e n ea n dh 工o ，zg e n e 、v 部s u c c e s s m l l yi i l s e 毗di m ot l l eb a c h i d s u b s e q u e n t l yt h er e c o m b mb a c i l l i d i f n i r e s h l y zw 弱舰：l s f e c t e di n t ot l l es f 9 i n s e c tc e l l s m e d i a t e db yl i p o f e c t 证t 0p r o d u c er e c o m b i 彻mb a c u l o v i m s t h er e s u l t ss h 0 、e dt h a tb o t h b o i f n 吖趾l dh i 句，z 、e r ee x p r e s s e di 1 1s f 9c e l l s 2p u r i l f i c a t i o no fb o i f n 吖e x p r e s s e di ni n s e c tc e i i s s f 9i r 略e c tc e l l sw e r e i f 此c t e d 谢t 1 1t 1 1 er e c o m b i i l a n tb a c u l o v i m sr b a c - b o i f n 吖a td i 妇f e r e n t m u l t i p l i c 埘o fi r 疵c t i o n t h ec e l l ss u p e n l a t 觚tw e r ec o l l e c t e da td i 虢r e n tt 岫et 0m e 硒u r e 舭 a c t i v i t ) ，o fb o i n 、丁一ye x p r e s s i o np r o d u c t o p t i m a lf a c t o r s w e r es e l e c t e d p u r eb o i f n 吖w 部 o b t a i n e d 舶mt 1 1 ep o u c ho fs f 9c e l l si r 如c t e d 诵mt h cr b a c b o i f n 吖b yc h r o m a t o 铲印h k e y w o r d s ：b o v i n ei n t e 疵r o n g 咖a ；i l 眦a i ll o z y m e ；b a c u l o v i r u s ；p u r i f i c a t i o n 周磊：牛丫- 干扰素和人溶菌酶共表达载体的构建和表达产物纯化三 符号说明 英文缩写： 诅锄i 1 1 0a c i d 氨基酸 a d n p v a 呦鲫h a c a j i f 0 i l i c ar l u c l p o l y h e d r o v i 九墙 苜蓿夜蛾核型多角体病毒 a m p锄p i c i l l i n氨苄青霉素 朋) c a n t i g e np 陀r l t i i l gc e u抗原提呈细胞 a p s 釉o m 岫p e r s u l 伽e过硫酸铵 a ，口a d e n o s h l et r i p h o s p l l a t e 三磷酸腺苷 b e v s b u l o v i m se x p r e s s i o nv e c t o rs y s t e m 杆状病毒表达系统 b s a b o v i n es e r u ma l b u m i i l 牛血清白蛋白 b o i f n 吖 b 0 v i l l ei n t e 疵r o n 唱a m m a 奶牛y 一干扰素 c p e c 弘叩a t l l o g e i l i ce 侬蛾细胞病变 d m e md u l b e c c o sm o d i f i e de a 掣em e d i u m 基础培养基 e d t a e l y l e 鹏d i 锄i n e t e t r aa c e t i ca c i d乙二胺四乙酸 e l i s a 朋z y m e - l i i l l 【e di m m 岫o s o 慨n t 硒s a y酶联免疫吸附试验 f i t f l u 0 俺s c e i i li s o 廿l i o c ”a l e 异硫氰酸荧光素 g s tg l u t a ：l i o n es - 仃a n s f i 锄【s e 谷胱甘肽s 一转移酶 h l y zl m m 觚l o 巧m e 人溶菌酶 h h y p o 砒i n e 次黄嘌呤 h a h e m a g 西u t i n a t i o n 舾s a y 血凝试验 h i h e m a g g l u t i i l a t i o ni l “b i t i o n 鹕a y 血凝抑制试验 玎) a i h i g i lp a ：f l l o g e i l i ca v i 锄i n f l u e 】【l 盈 高致病力禽流感 h r ph o r s e d r a d i s hp e 删d 笛e 辣根过氧化物酶 i f a i i t l m u n o f l u o r e c e n t 豁s a y 免疫荧光试验 i f ni r l 钯m r o n 干扰素 i g gi 咖u n o g l o b u l i ng ， 免疫球蛋白质g i p l g i s o p r o p l y l p - d t 1 1 i o g a l a c t o s i d e 异丙基硫代半乳糖苷 也s h n e m a jr i b o s o m ee n 仃ys i t e 内部核糖体进入位点 l 邡z 争g a l a c t o s i d 豁e b 一半乳糖苷酶 l g l - g l u t 锄i i l el 一谷氨酰胺 l p ：a il o wp a t l l o g e n i ca v i 锄i l l f l u e n 盈 低致病力禽流感 m c a bm o n o c l o n a la n t i b o d y单克隆抗体 m o i m u l t i p l i c i t yo fi i 疵c t i o n 感染量 n ct i i 仃0 c e l l u l o 硝酸纤维素 o d o p t i c a id e 眦n y 光密度 扬州大学硕士学位论文 o m o 粕 d 昭 p b 8 p c r 暇 r n a r t s p s s d s - p a g e s p s 鞭 t r 诋 羽鼢厄d v s v x 删 。尚c ci n t 啪a t 协n a ld e se p l z 0 0 t i e s 积帅h e n y l e n e 主a m i 董糟 o v a l b u m 斌 p h o s p h a l l eb u f i 研d i u m p o l y m e f 器ec h a i n 他a c t i o n p o l y e t 姆l e 霸e 垂y l r i b o n u c l e i ca c i d v e r s e 吣硎p t i o n 耐l 黼纛o & c y ls 蠢氢蹴 s o d i t 腿d o d e c y l 刚触e - p o l y a c f y l a m i d e e l e c 仃o p h o r e s i s p e 赫c i l l i n 鞠ds 骶p 的m y c 洫 s p e c i 矗c 脚删如e t r i sh y d r l o c h l o r i d e 套州n n 泡昀m 晌y l 咖l e 舱d i 蝴m e ￥e s i e 堪鑫fg 幻撵a 耋耋t 耋sv i 髑 5 b r o m o 4 吣h l o r o 一3 i n ( 1 0 l y - p d 札i o g a l a c t o s i d e 计量单位： ll 腧 升 稚m i l 融 毫舞 心 毽i c 羚l i 漩 微冀 m o l ，l氆d ，l i t t e r摩尔，升 m n l o 儿m i l l i m o l ，l i 仕e r毫摩尔，升 岬o l l m i c r o i n o l l i n e r徼摩尔，升 p m o lp i c o m o i 皮摩尔 琢韬l o 舒锄 千克 g替冁 壳 越瑶i l l i 群嗽 毫克 懒际兽疫局 邻苯二胺 卵自蛋自 磷酸盐缓冲液 聚合酶链式反应 聚乙二醇 核糖核酸 反转录 十二烷基硫酸钠 g e l 十二烷基硫酸钠一聚页烯酰胺凝胶 电泳 青霉素和链霉素 无特定病愿体 兰( 羟甲基) 氮基甲烷 n ，n ，n ，n 一四甲基乙二胺 水泡性露炎病毒 5 一溴一4 一氯一3 一吲哚一8 一沪半乳糖苷 m l c r o g r a m 燃i 黼p e r 掇速妇 b 毽 蕊i l 妓溉 d a y u m t l ( i l o d a l t o n b 笛e p a i r l c i l 曲a s e s v o l l 微克 辕| 食 小对 分钟 天 单位 千道尔顿 碱基对 千碱基对 伏特 2 一 n n ) 腭 唧 h 幽 d u 灶 却 褥 v 扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下独立进行研究工作所取得的 研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经 发表的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 签字日期：娜年月疹日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关保蜜、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和 借阅。本人授权扬州大学可；以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授 权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到 ：中国学位论文全文数据库， 并通过两络向社会公众提供信息服务。 学位论文作者签名： f 签字日期：湖年月 r 日 导师签名： 签字日期。妒q 年6 月哆日 陆睛 ，_冀吖乱 叁卞 _ 周磊：牛p 干扰素和入溶菌酶共表达载体的构建和表达产物纯化三 文献综述一：i 刚吖、i r e s 和h l y z 研究进展 一、i n 嘶的研究进展 干扰素( 趣e 彘玛妇限) 是在特定的诱生剂作用下，由绷胞分泌的族具有一定的抗 病毒、影响细胞的生长分化、抗肿瘤和调节免疫功能等活性的糖蛋白，由1 9 5 7 年英国伦敦 囡家医学院研究所的烈i c ki s 姐c s 和j e a i ll i l l d e m a n i l 在研究灭活的流感病毒的干扰现象时首 次发现并命名，是最早发现、研究最多、第一个克隆和第一个被f i ) a 批准用于临床治疗的 细胞因子。根据i 烈蛋白的氨基酸结构、抗原性和细胞来源| 以及他们所结合受体的不同， 可将联分为两类即l 型和l l 型干扰素，其中b o l 烈l 型又可分为程、国和傅个亚型， l 烈奠型干扰素主要有了干扰素。b o l 烈i 和l l 型结构基因定位予不同的染色体上，l 型 烈基因均无内含子，两l i 型i f n 基因含有3 个内含子，二者作用受体不同。b o i f n 的结构 基因包括5 非编码区、信号肽编码区、成熟肽编码区和3 非编码区。 i f n 吖的基因结构 目前已有人和许多动物如羊、猪、牛、鹿、鼠、犬、兔、海豚、鸡、鸭的i f n 吖基因 被克隆出来，人删吖基因定位于第1 0 对染色体上，基因大小约6 0 k b ，删刚a 约1 2 k b ， 鼠i f n 吖基因基因定位于第l o 对染色体上，删 斟a 约1 2 k b 。与i 型干扰素基因编码的 连续性不同，劂吖基因均含有3 个内含子和4 个外显予，第一外显子编码5 端限和 信号肽以及成熟肽的部分氨基酸，第2 和第3 外显子编码成熟肽的部分氨基酸，第4 乡 显 子编码含终止密码子部分的氨基酸及3 端1 l j t r 。不同动物的外显予和内含子核昔酸数量 不同。 人和动物干扰素都是一种分泌性蛋白，它的基因c d n a 结构与其他分泌性蛋白的基 因是相类似的，即由5 端非编码区、分泌信号肽编码区、干扰素多肽编码区和3 端非编 码区组成( 图1 ) 。5 端非编码区含与转录调控有关的序列，与启动子一起调控基因的表 达，与入和动物的对疾病的抵抗力和敏感性不同有关，不同晶种动物存在差异，3 端非编 码区丽一种僮不同品种动物不同动物差异也较大。不同动物l 辩崎基因的核营酸序列和新 编码的氨基酸种类是不同的，健们之闻的嗣源性与进化关系相一致，亲缘关系较近的动物 其同源性较高，如山羊的l f n 吖基因在氨基酸水平上与绵羊相比具有9 8 8 的同源性，与 奶牛棚比具有9 4 6 的同源性，与鹿相比具有9 2 8 的同源性，而与人和鼠的氨基酸同源 性则分别为6 1 1 和1 0 3 。 扬州大学硕士学位论文 5 u r r信号肽成熟肽 3 u t r 图li f n y 基因c d n a 模式图 i f n 吖的空间构象 人和各种动物的i - 丫均是一种分泌性糖蛋白，对p h 2 和6 0 敏感，成熟蛋白含两 个糖基化位点，糖基化对i 烈丫的生物学活性并不是必须的，但与i f n 吖在体内的半衰期 有关。与i 型干扰素不同，i f n 吖活性形式是以二聚体形式存在，单体没有活性，二聚体 中两个单体反向相互以非共价键方式结合，单体内无二硫键存在，二聚体空间构象上曾现 球状，每个单体由6 个长度为9 2 1 个氨基酸的u 螺旋组成，占整个结构的6 0 以上，无 d 折叠，每一单体的前4 个仅螺旋( a 1 、b 1 、c 1 、d 1 ) 与另一个单体的后两个a 螺旋( e 2 、 f 2 ) 相互平行于二聚体的一条轴线，后两个a 螺旋( e 1 、f 1 ) 与另一个单体的前4 个a 螺旋( a 2 、b 2 、c 2 、d 2 ) 相互平行于二聚体的另一条轴线，这两条轴线相互垂直，二聚 体的6 个a 螺旋中均存在疏水区，以c 和d a 螺旋的疏水区最多，其中c q 螺旋因其疏水 区最多而被埋在整个二聚体的中心。单体内的a 螺旋及单体与单体之间的c 【螺旋均存在 非共价键作用，其中一个单体的前4 个q 螺旋形成以个裂隙，另一个单体的c 末端的c 【 螺旋则插入这个裂隙中，一个单体的n 端与另一个单体的c 端之间存在很强的非共价键 作用，所有这些作用将原先松散的两个单体紧密地结合在一起，构成了球状二聚体稳定存 在的基础。 i f n 吖信号传导的分子机制 自八十年代初人i f n 吖基因克隆以来，关于i f n 吖以及其他细胞因子的分泌后如何作 用于靶细胞并发挥其生物学活性一直是研究的热点，有着各种各样的假说与争论，一度曾 认为与激素或多肽一样通过细胞内第二信使( c a m p 、c a 离子等) 发挥作用。9 0 年代后， 随着人和鼠i f n 吖受体分离纯化、基因的克隆及其的功能进一步研究，关于i f n 吖与受体 的作用及其细胞内信号传导过程现已研究得相当清楚，并且由此发现了3 0 多种细胞因子 及其受体普遍采用的j a k s t a t ( j a k ，j a n u sk i n a s e 或j u s ta n o t h e rk i n a s e ，门神激酶； s 皿s i g n a lt r a n s d u c e ra n da c t i v a t o ro f t r a n s c r i p t i o n ，信号传导和转录激活因子) 途径，而且 已成为细胞内信号传导的一种经典模式之一。除了经典的j a k s w 虹信号传导途径外，近 年来也发现了i f n 吖的s n 订非依赖的信号传导途径。 4 一 周磊：牛1 ，干扰素和人溶菌酶共表达载体的构建和表达产物纯化三 漆 1 1 1 c 鲥 嘲( 疆 n 1o 础 积喇 曩i 经典的蜊y 产生模式示童固围2 a p c 产生i f n y 模式示意图 i f n 吖受体 除成熟红细胞外，几乎所有细胞都表达牛i i 型干扰素受体( b o i f ng r ) ，并且表现出严 格的种间特异性。b o i f n 吖受体至少包含两种种属特异性多肽，i f ng r l ( 0 【链) 和i f ng i 也 ( p 链) ，a 链和p 链都包括胞外区、跨膜区和胞内区3 个部分，其中胞外区负责与i f n 吖结合， 具有种属特异性；与受体胞外区相连的是一个跨膜区，负责信号向胞内传递；胞内区也有 一些蛋白酶与之相连。由0 【链和p 链组成的受体可以激活宿主效应基因，抑制病毒复制。 b o i f n 吖与细胞表面特异性受体结合后可触发受体蛋白的磷酸化和二聚体化。i f n 吖与受体 结合后主要通过j a k s t a t 途径进行信号传导和启动相应基因的转录，产生与i f n y 的反 应。 戮霉i n b 溜；擘 图l o 人鞫限擎麓受体绪雷嚣豹豹馕弩传譬逾缝援式图 扬州大学硕士学位论文 6 一 i f n 吖的主要生物学活性及其作用机制 丫干扰素具有抗病毒，影响细胞生长分化、抗肿瘤和免疫调节等多种活性，与i 型干扰 素相比，i f n y 具有较强的免疫调节活性，而抗病毒活性和抗肿瘤活性较弱。 i f n 吖的抗病毒作用及其机制 与i 型干扰素一样，蜊吖也具有抗病毒作用，但其作用不及i 型i f n ，只约占i 型i f n 抗病毒作用的l 1 0 0 1 1 0 0 0 。通过基因缺失i f n y 或i f n g r l 、i f n g r 2 以及i f n 吖信号传导过 程中所需的分子如蚴l 等后，i f n 吖在病毒感染如乙型肝炎病毒、淋巴细胞脉络丛脑炎病毒、 鼠痘病毒感染中抵抗作用明显下降，尽管i f n 吖抗病毒效果远远低于i 型干扰素，但在机体 对病毒感染的长期控制过程中着非常重要的作用。病毒感染机体后，各种i f n 相关基因表 达增加或减少。 蜊吖引起的抗病毒作用主要是通过诱导一些目的基因的表达来实现的，这些目的基因 表达产物主要是一些参与病毒i 矾a 降解和剪切的酶和蛋白质，这是i f n 吖抗病毒作用的主 要机制，一些病毒感染过程中产生的抑制其信号传导过程的蛋白也是通过抑制i f n 吖诱导这 些酶类的产生而进行的。与i f n 吖抗病毒有关的酶主要有3 种：双股r n a 依赖的蛋白激酶、 2 ，5 腺苷酸合成酶和腺嘌呤核苷酸氨基酶，这三种酶也能被i 型i f n 所诱导产生，但i 型i f n 诱导产生的一些蛋白如m x 蛋白由于其基因启动子区域内不含g a s 序列，不受i f n 吖所诱导， 也不能被i f n 吖诱导后的产生转录因子二次诱导，不参与i f n 吖诱导的抗病毒作用。 曙 婚p 圈回 p f r 2 - 5 a 合成重m x 蛋白 腓琶| 病毒d l r n a 激活爿 心2 棚蝴知棚+ 柚p 信号传导 p p p 2 p 5 a 2 p 5 a ( 2 - 5 1 2 5 依赖性r n a ( r n - 冀l ) l s r n a u p n 3 p ， 抑制蛋白质合成r n a 切割 和进行转录控翻 i f n 抗病毒机制 ijl|l 、 p 周磊：牛丫干扰素和人溶菌酶共表达载体的构建和表达产物纯化2 刀f n 吖抗肿瘤活性及作用机制 蜊吖在机体肿瘤发生、肿瘤移植排斥和肿瘤免疫监测过程中发挥着重要的作用。删吖 抗肿瘤作用的发现最初主要通过大量的实验来加以证实的，这些实验主要在小鼠上通过一 些化学诱变剂人工诱发建立肿瘤模型进行的，通过m c a ( m e l y l c h o l 觚t l 矾n e ) 诱导的 b a l b c 小鼠的纤维肉瘤移植正常小鼠后，经过亚致死剂量的l p s 注射处理后发现，肿瘤生 长受到了明显抑制，尽管随后的研究发现这种抑制作用主要是通过l p s 诱导机体产生n 盯a 而实现的，但应用抗鼠i f n 吖特异性中和单抗却阻断了这种抑制作用，而且经过抗鼠i f n 吖 特异性中和单抗处理的小鼠纤维肉瘤比未处理的小鼠生长速度明显迅速，这些实验首次证 实了i f n 吖在提高机体对移植肿瘤排斥应答中发挥了至关重要的作用。目前i f n 吖依赖的抗 肿瘤作用机制归纳起来主要体现在以下几个方面：i f n y 通过移植肿瘤细胞增殖和促进肿瘤 细胞凋亡发挥抗肿瘤作用，与正常细胞相比，肿瘤细胞的增殖分裂失控是肿瘤发生的重要 原因，无论肿瘤细胞还是正常细胞的分裂均是一种周而复始的过程，其动力主要来自于细 胞周期素依赖性蛋白激酶c d k ，由c d k 激活和磷酸化相应的蛋白质，使得细胞周期启动和 细胞分裂的各个时相的转换调控。i f n 吖除了具有抗肿瘤细胞增生分裂外，还具有促进瘤细 胞凋亡的作用，删一y 与受体结合后，激活产生活化的s t a t l 同源二聚体复合物，进入核内， 激活一些参与细胞凋亡的基因表达。 二、i i 也s 的研究进展 蛋白质的生物合成有3 个阶段：起始、延伸和终止。翻译起始阶段是整个蛋白质合成 的限速阶段，也是进行蛋白质合成调控的靶点。已知的翻译起始方式有帽子依赖性翻译起 始( c a p d 印e n d e mi i l i t i 撕o n ) 、重新翻译起始( r e i n i t i a t i o n ) 、核糖体支路( m o s o m es h u n t i n g ) 及 内部起始( m t e m a li i l i t i a t i o n ) 。大部分真核删斟a 的翻译起始方式是帽子依赖性翻译起始。内 部翻译起始是由一段特殊的r n a 序列来介导的，这些序列被称为内部核糖体进入位点 ( 珧n l a l 曲o s o m ee n 仃) rs i t e ，i i 冱s ) 。这些i r e s 元件允许一些i i a 在有丝分裂、凋亡、缺氧 及病毒感染等生理或病理条件下当大部分删刚a 的翻译受到抑制时能够继续进行翻译。 1i r e s 发现 i r e s 元件最早是在微小核糖核酸病毒中被发现的。小核糖核酸病毒家族的不同种类 病毒都有共同的特征：基因组是长约7 5k b 的r n a ，无帽子结构，由一个编码蛋白的开放阅 读框( o r f ) 组成；5 端非翻译区非常长，通常为6 0 0 l2 0 0 个碱基，而且含有高度的二级结 构。这些特征与核糖体滑动机制的高效翻译不符。这种滑动机制对大多数真核细胞和病毒 的m r n a 是有效的【4 】。经典的翻译模型是核糖体通过m r n a5 端的帽子结构结合4 0 s 核 扬州大学硕士学位论文 8 一 糖体亚基，然后沿5 一3 方向滑动，直到起始密码子，形成起始复合物。所有m r n a 的5 端帽 子结构都在核糖体进入和结合步骤中起重要的作用，而无5 帽子结构的m r n a 通常翻译效 率是低的。另外，存在于微小核糖病毒5 端非翻译区中的稳定的二级结构已经被证实对核 糖体滑动具有很强的阻碍作用。再者，微小核糖核酸病毒5 端非翻译区中，在o r f 前有几个 a u g 密码子，根据k o z a k 序列的原则，其中几个a u g 密码子的周围序列表明其翻译效率是 较高的，然而，它们在翻译中却是沉默的。这就引出了新的翻译机制的出现。1 9 8 8 年，p e l l e t i e r 等发现，脊髓灰质炎病毒( p o l i o v n s ) 5 端非翻译区长约4 5 0 个核苷酸的p 2 序列可以指导真 核r n i 斟a 的翻译【5 】；同年，j a n g 等发现，e m c v5 端非翻译区的一段序列能够指导核糖体在 r 心咐a 内部进入，从而起始翻译【6 1 。这些序列元件直接指导核糖体从该处进入r i 水n a 起始 翻译过程，因此将该元件命名为内部核糖体进入位点。内部核糖体进入位点是m r n a5 。端 非编码区的一段特殊的序列，它允许核糖体直接在此序列处结合i i l 】 a 并起始翻译。 目前，在所有的微小核糖核酸病毒的r 1 1 i 矾a 中都发现有i r e s 元件。d n a 病毒，如卡博 氏肉瘤相关病毒、疱疹病毒等的基因组中也有i i 也s 元件。 2i r e s 的分类 目前，病毒i i 也s 根据其结构和功能分为4 类：类型i 主要存在于心病毒属( c a r d i o v 挑) 和口疮病毒属( a p m h o v ) ，通过茎环结构h l ，直接引导核糖体进入聚嘧啶区域下游1 2 1 5 m 处的a u g 起始密码子。该类型在兔网织红细胞裂解物系统( u ) 中进行翻译是有活性的。 e m c vi r e s 是此类型的典型代表：类型i i 主要存在于肠道病毒属( e m e r o v i m s ) 和鼻病 ( r h i n o v i r u s ) ，其翻译起始位点位于i r e s 下游较远处，但是它们在兔网织红细胞裂解物系( i 泳l ) 中进行翻译是没有活性的，如果加入h e l a 细胞提取物，活性将显著增加。此类型的典型代表 是p vi r e s 。类型1 只存在于肝病毒属( h e p a t o v i r u s ) 的甲型肝炎病毒( h a v ) 中，具有i 和i i 型 i i 迮s 的共同结构特征，但它们在兔网织红细胞裂解物系统( u ) 中的活性需要在加入肝 细胞提取物后才能显现。类型是最近报道的与h c v 类似的病毒i r e s ，主要存在于丙型肝 炎病毒属( 1 l e p a c i v i r l l s ) 的丙型肝炎病毒( h c v ) 和瘟疫病毒属( p e s t i v i m s ) 的猪瘟病毒( c s f v ) 中，它们都是黄病毒科的成员。双顺反子病毒科( d i c i s 仃0 v i r i d a e ) 的蟋蟀麻痹病毒( c r p v ) i i 也s 结构和功能上与此类型相似，但与4 0 s 核糖体亚基结合的作用机制不同。 周磊：牛t - 干扰素和人溶菌酶共表达载体的构建和表达产物纯化呈 w a 产_ o _ k 黼a ； k 畸 ld 腿e 宣 i 帕 i y p 铭o f 地se i e m e n 缸 s 眦t u m lr e p 他s e n t a t i o n0 f t l l e5 u t r 舾n e m c v ( a ) ，p 0 l i o v i m s ( b ) ，h a v ( c ) 锄dh c v ( d ) t h e 豫g i o ne n c o m p 弱s i n gm ei r e si su n d e r l m e d f ) 丽m i d i n e - r i c hs e q u e n c ee l e m e n t s 如d 勺m s l a t i o ni n i t i a t i o n c o d o n ( a u g ) 玳i l l d i c 劬e d 3i r e s 的功能与特征 i r e s 是一段与众不同的r n a 分子，能够募集真核生物核糖体到r i 水n a 分子5 u t r 上 进行翻译起始。这个过程就是内部起始翻译。具备i i 迮s 元件的r n a 病毒5 端不含有帽子结 构，g c 含量较高，具有复杂而且稳定的二级和三级结构。但是在一级和二级结构上还没有发 现它们的共同特征。 p i l i p e i 岫等根据微小核糖病毒5 r l j t r 序列中i r e s 元件的序列和结构的保守性将其分 为3 类：心血管病毒和溃疡病毒眦s 序列、肠道病毒和鼻病毒i r e s 序列和甲肝病毒的 i i 也s 序列。b o m a i l 等根据在6 个细胞系中的体外活性和序列同源性，也将微小核糖病毒 的瓜e s 序列分为相同的3 组：心血管病毒和溃疡病毒的也s ( h c v 元件) 在所有细胞系中 均高效指导内部起始翻译；肠道病毒和鼻病毒的也s 元件在几个细胞系中的效率相同，在 某些细胞系中效率非常低；甲肝病毒的i r e s 元件在任何细胞系中都不能有效指导内部起 始翻译。在这3 类病毒中，每一类的i r e s 片段都有很好的序列保守性。而且，即使一致性 程度稍差，碱基配对后形成的二级结构仍有很好的保守性。这种保守方式说明，内部核糖体 进入位点机制要求非连续的主要序列基序形成基于正确二级结构的合适的空间关系。各种 微小核糖核酸病毒的核糖体进入位点图已经被绘制出来。所有微小核糖核酸病毒的i r e s 扬俏大学硕士学位论文 序列的3 端都有一个a u g 密码子，位于富含嘧啶序列起始的下游2 5 个核苷酸。在e m c v 这个a u g 密码子是起始密码子，核糖体不通过扫描，直接结合至f j 该密码子上f 2 5 】。在口蹄疫 病毒谬凇v ) ，翻译起始也出现在该密码子处，但是在下游的a u g 密码子起始翻译的频率更 高。脊髓灰质炎病毒l r e s 序列3 镱 的a u g 密码子起始翻译的频率很低，其起始密码子位 于下游1 6 0 个核苷酸处。肠道病毒和鼻病毒的5 。端j # 翻译区的i 腿s 序列，核糖体进入5 8 0 5 8 5 位核苷酸，位于鬻含u 的序列的下游2 0 2 5 个核营酸，从该进入位点，核糖体滑行至起 始位点开始合成蛋白质。在不同的病毒属和种类间，起始位点前的序列不是高度保守的。 这说明除了富含u 的序列和不含二级结构外，起始位点前的序列并不重要。 目前，e m c v 中的砒s 序列作为模式i r e s 被研究较多，已广泛应用到细胞生物学的实 验中。e m c v 的5 端非翻译区前1 0 0 个核营酸序列可能是薹心限复铡信号序列，起始密码子 翦4 5 0 个核苷酸序列是王r 置s 序列。删除实验分析表明，l 薹洹s 高效的功能霈要从第4 0 0 个 核菅酸到起始密码予a u g 前的序列完整。起始密码子位于8 3 4 位核苷酸，是r 病毒株的 第1 1 个a u g 。在脑心肌炎病毒5 u 讯的i r e s 序列中有1 1 个a u q 其中a u g 1 0 在真正 起始密码子a u g 1 1 的上游，而且距离很近，位于不同读框。当应用完整的e m c v 的i 】5 汪s 序列时，非帽子依赖的翻译起始完全出现在a u g - l l ，而a u g 1 0 根本不起作用。这意味着 当内部核糖体进入机制发生作用时，核糖体不是通过滑动机制进入a u g 1 l ，而必定是壹接 结合在a u g - l l 或其非常近的位置。 目前细胞眦s 的结构特征还很不清楚。研究发现，一些细胞珏也s 具有这样的特点： 由几个短的序列片段组成，这些序列片段或者有独立的珉e s 功能，或者共同作用来影响整 体的i i 也s 功能。因为细胞眦s 之间没有明显的相似性，有人认为它们在二级结构上有相 似性。有研究发现，种y 形双发夹与随后的一个小发夹形成的一种r n a 结构可以在一 系列细胞i r e s 元件的起始密码子上游被找到，但对这种结构在翻译的内部起始中的功能 还没有找到证据。许多细胞i r e s 的另一个显著特征是，它们在不同类型的细胞中起始翻译 的功能变纯很大。 4l r e s 的作用机制 目前对l 墨s 的机制仍然泰知。a 崩等报道，脊髓灰质炎病毒和脑心飘炎病毒的翔 通s 元件位予第1 个顺反子的终止密码子之蜃约l o o 个挝时，活性是最强的；当把它们放在约 3 0 0 5 0 0 n t 的间隔序列之后时，这些舭s 没有任何活性。这些结果与所公认的礅e 8 作用 机制并不一致，似乎这些眦s 是非常深奥的翻译刺激因子。b o c h k o v 等的实验结果证 实，e m c v 的眦s 元件翻译效率依赖于眦s 的序列和基因位簧【2 8 1 。基于i r e s 构建的双 周磊：牛丫干扰素和人溶菌酶共表达载体的构建和表达产物纯化 旦 顺反子表达载体是现今细胞生物学研究中的重要工具。在应用中，受同一个启动子调控的2 个蛋白的表达，可以使一个蛋白表达后，通过检测另一个易检测蛋白来跟踪。然而，对已发表 的利用i r e s 双顺反子表达载体的结果分析表明，i r e s 控制的翻译效率在载体间变化较大， 即使使用同一个迮s 元件。m a n i n 等观察到，具有相同的i i 也s 序列的不同的载体，i r e s 控制的表达效率最高差1 0 倍。 细胞i i 也s 的详细作用机理还不清楚，可能与脑心肌炎病毒的起始翻译机理很相似，能够 在e i f 4 e 不能发挥作用时允许一些带有i r e s 元件的r r l i 矾a 进行翻译。 5i l 地s 的应用 随着对r n a 病毒i r e s 元件研究的深入，其应用价值也随之体现出来。以i r e s 介导的 翻译起始已成为治疗r n a 病毒引起的严重疾病的重要靶目标之一。例如，病毒依赖i i 也s 的翻译起始作为治疗靶目标的潜力已经在h c v 中体现出来，即通过i i 也s 元件鉴定能够抑制 病毒翻译的有效成分。如r n a 适体( 印t a i n e r ) 就是从与h c vi i 也s 紧密结合的众多r n a 分 子中筛选出来的，它在体内和体外条件下都能够与h c vi i 也s 的核心区i 区结合，阻止核 糖体的进入，从而抑制依赖i r e s 的h c v 的翻译起始，使病毒增殖能力丧失，达到防治该病 毒病的目的。维生素b 1 2 也是一种i r e s 抑制剂，因为它能够与h c vi r e s 的区结合。对 p v 眦s 元件的突变可以使p v 在神经细胞中的增殖效率大大降低，从而获得其弱毒株，这 是制备重组型减毒疫苗的前提条件。i r e s 也在表达载体中有很广泛应用。因为i r e s 的突 变能够导致病毒活性降低，这个特点为调控对细胞有毒性的某些蛋白表达或者测定这些蛋 白具有致病性所需要的最低浓度提供一种工具。逆转录病毒载体已经被广泛应用，因为它能 在以n i h3 t 3 或2 9 3 为基础发展的包装细胞中高效表达病毒蛋白( 如g a g 、p o l 和e n v ) 。 e m c vi r e s 为基础的载体则能够在鼠中枢神经细胞中使基因成对的翻译，而且发展越来 越稳定。而含有i i 也s 的腺伴随病毒( a d e n 0 2 a s s o c i a t e dv i m s ，a a v ) 载体能使2 种蛋白稳定 地共表达。利用i 岫vi r e s 构建的双顺反子表达载体则能够在昆虫反应器内大量高效地表 达重组蛋白。另外，i i 也s 元件的应用在基因治疗方面已经卓有成效，例如，也s 可以使肿瘤 抑制基因( 如i l 2 2 ) 和肿瘤自杀基因( 如胸腺激酶) 这2 个肿瘤治疗基因共同表达。 三、溶菌酶的研究进展 溶菌酶( 1 y s o 巧m e ) 是由弗莱明在1 9 2 2 年发现的一种有效的抗菌剂，全称为l ，4 一p - n 一溶 菌酶，又称粘肽n 乙酰基胞壁酰水解酶，是由1 2 9 个氨基酸组成的碱性球蛋白。它能切断肽 聚糖中n 乙酰葡萄糖胺和n 乙酰胞壁酸之间的p 1 ，4 糖苷键之间的联结，破坏肽聚糖支架， 在内部渗透压的作用下细胞胀裂开，引起细菌裂解。有些革兰氏阴性菌，如埃希氏大肠杆 扬州大学硕士学位论文 1 2 菌、伤寒沙门氏菌也会受到溶菌酶的破坏。人和动物细胞无细胞壁结构亦无肽聚糖，故溶 菌酶对人体细胞无毒性作用。它具有溶解细菌细胞壁的能力，起到抗菌消炎的作用，所以 用作婴儿食品的添加剂，母乳与牛奶相比含溶菌酶的量要高的多。而溶菌酶本身是一种无 毒、无害、安全性很高的高盐基蛋白质，所以作为天然防腐剂的溶菌酶在食品工业中有广 阔的应用价值，除此之外还可以广泛应用到医疗行业和科学研究领域。 1 溶菌酶的分型 溶菌酶可分为三型：c 型( 鸡卵清溶菌酶c i l i c k e ne g g - w 1 1 i t el y s o z y m e ，c l y ) 、g 型( 鹅 卵清溶菌酶，9 0 0 e g g - w 1 1 i t el y s o z i i l e ，舀y ) 、噬菌体溶菌酶。大部分溶菌酶都属于c 型， 从人乳汁、尿和胎盘中提取的溶菌酶也属c 型。c l y 由1 3 0 个氨基酸残基组成，相对分子质 量为1 4 7 0 0 。g l y 最早是由j o l l e s 和c 心e l d 发现的，约含有18 5 个氨基酸残基，相对分子质量 为2 1 0 0 0 。j o l l e s 等报道，c 型与g 型溶菌酶轻度同源。c 型活性中心的g l u 一3 5 和a s p 3 2 可能 和g 型的g 1 u - 7 3 和a s p 一8 6 同源，此结果已被x 线衍射所证实。噬菌体溶菌酶位于各种噬菌 体内，对溶解宿主菌起重要作用。它含有1 6 4 个氨基酸残基，相对分子质量为1 8 7 0 0 。噬菌 体溶菌酶在序列上与c 型溶菌酶同源性较差，但它们组成的主干、结合底物的定位及催化 的特异性方面有很多相似之处等。噬菌体