（环境工程专业论文）强磁场对芽孢杆菌b1偶氮还原酶酶学特性的影响.pdf

上海大学硕士学位论文 摘要 本文利用一株校园土壤中筛选出具有偶氮染料酸性红1 4 ( a c i dr e d 1 仁a r1 4 ) 脱色能力的芽孢杆菌b 1 ( b a c i l l u ss p ，a p i 鉴定) ，通过对其偶氮 还原酶( a z o r e d u c t a s v - - a z r ) 酶学性质的研究，探讨强磁场 不同p h 值缓冲溶液的配制见表2 1 l s s ： 表2 10 0 6 6 7m o l ln a 2 h p 0 4 k h 2 p 0 4 缓冲溶液表( 总体积为1 0 0m l ) 1 2 上海大学硕士学位论文 2 2 2 实验试剂 实验中所使用的主要试剂见表2 2 ： 表2 2 实验试剂表 2 2 3 实验仪器 1 3 上海大学硕士学位论文 本实验所用仪器见表2 3 ： 表2 3 实验主要仪器 其他小器具：培养皿、接种环、酒精灯、铁架台、石棉网、打火机、锥形瓶、 烧杯、台式天平、药匙、p h 广谱试纸( 4 0 1 1 o ) 。 2 3 方法 2 3 1 蛋白质标准曲线 学应劳蛋序教麽黝纺膨蒯辑邑用b r a d f o r d 检测法【叫测定蛋白质浓度， 以0 1m g m l 牛血清蛋白溶液为标准蛋白质溶液，以表2 4 方案确定标准曲线： 表2 4 牛血清白蛋白标准曲线【9 0 1 取6 支试管，编号为1 、2 、3 、4 、5 、6 ，按表2 4 加入试剂混匀后静置 2m i n ，以1 号管作空白对照，测定各管5 9 5 册下的吸光值a 5 9 5 ，以吸光值a 5 9 5 为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图，得到标准曲线。 1 4 上海大学硕士学位论文 测定样品的蛋白质浓度时，取1m u 洋品至试管内，再加入考马斯亮蓝g 2 5 0 染色液5m l 混匀，测其5 9 5n m 下的吸光度，对照标准曲线求得所测样品的蛋白 质浓度。 越蒯配磋必1 ) 马斯亮蓝g - 2 5 0 ：1 0 0m g 考马斯亮蓝g - 2 5 0 溶：j ：5 0m l9 5 7 , 醇中，加入1 0 0m l8 5 ( w v ) 磷酸，用蒸馏水稀释至1 0 0 0m l 。最终试剂中 o 0 1 o v v ) 考马斯亮蓝6 - 2 5 0 ，4 7 羽乃叼乙醇，s 5 0 v v ) 磷酸；2 ) 0 1r a g m e 牛血清白蛋白溶液标准溶液：取牛血清白蛋白1 0 0 m g ，溶于少量重蒸水中，并定 容至1 0 0m l 。 2 3 2 染料摩尔浓度标准曲线的绘制 以p h 为8 0 的p b s 为溶剂，配制摩尔浓度为1 0 衄o l l 的a r l 4 标准溶液，分 别取0 1 、0 2 5 、0 5 、0 7 5 、1 0 、2 5m l 置于试管中，再分别加适量p b s 补充至1 0 m l ，摇匀后用分光光度计于a r l 4 最大吸收峰5 1 4n l n 处测其吸光度( a s l 4 ) 。以 吸光度a 5 1 4 为纵坐标，a r l 4 摩尔浓度浓度( c , m m o l l ) 为横坐标作图，即得a r l 4 摩尔浓度浓度标准曲线。 2 3 3 偶氮还原酶酶活力测定 在a r l 4 浓度为0 1 0m m o l l 、酶液蛋白浓度为1 - 0 0m g m l 的5m lp b s ( p h 7 o ) 反应体系中，加入l m ln a d h ( 1 0 0m m o l a , ) 后，3 2 静置反应，于分光光 度计上测定在a r l 4 最大吸收峰刽7 ：( 5 1 4 姗) 吸光度a 5 1 4 值的变化，并以未加酶液 的反应体系为空白对照。 一个酶活力单位( t o 定义为在酶活力反应体系中，以每分钟还原1 t m o l 的 a r l 4 所需的酶量定义为一个酶活力单位( 1u = i 声衄o l m i n ) 1 6 1 j 。 上海大学硕士学位论文 2 3 4 偶氮还原酶的定位实验 按5 的接种量，将接种培养液转接到装有3 0m l 液体培养基的5 0m l 锥形 瓶中，3 7 、1 2 0r m i n 下摇振培养2 4 h 后，倒入已灭菌的离心管中，4 、8 0 0 0 r m i n 离心1 0r a i n ，分别收集培养液( 胞外粗酶液) 和菌株细胞。 菌株细胞用p b s0 h8 o ) 洗涤三次、称重( 以湿重计) ，并均分为二份，一 份备用，另一份按1g 湿菌与3g 无菌水比例配制菌悬液。 将上述菌悬液置于0 冰水混合浴中，用2 5 0 w 、工作1 0s 、间隙2 0s 、工 作1 5 次超声波破碎细胞，破碎结束后，4 、1 0 0 0 0r r a i n 离心3 0r a i n ，所得上 清液即为胞内粗酶液，同时收集超声波破碎的细胞碎片，将其重新悬浮于p h = 8 0 的p b s 中，得细胞膜悬浮液。 分别吸取1m l 胞内粗酶液、胞外粗酶液和细胞膜粗酶液，加入含0 1 0 m m o l l 浓度的a r l 4 中，保持各反应体系中酶液蛋白质浓度为1 0 0m g m l ，定 时测定a r l 4 的浓度。 此外，测定菌株细胞和相同量菌株细胞中提取的胞内粗酶液对0 1 0m m o l l a r l 4 的脱色情况。 2 3 5 产酶接种量的优化 分别按4 、5 、8 、1 0 、1 5 的接种菌液量将接种培养液转接到装有含 牛肉膏液体培养基的锥形瓶中，保持培养液总体积为3 0m l ，3 7 、1 2 0r r a i n 下摇振培养2 4h 后，洗涤并收集菌体，测定菌株细胞( 以湿重计) 和胞内粗酶 液蛋白质浓度。 2 3 6 偶氮还原酶的分离和纯化实验 2 3 6 1 超声波破碎条件的选择 将超声探头没入菌悬液( 于0 冰水浴中) ，选择不同破碎功率( 1 5 0w 、 2 0 0w 、2 5 0w 和3 0 0w ) ，不同超声波工作次数( 5 、1 0 、2 0 、3 0 和4 0 次) 超 声波破碎菌株细胞。破碎结束后，4 、1 0 0 0 0r r a i n 离心分离3 0m i l l 去除细胞 1 6 上海大学硕士学位论文 碎片，上清液即为胞内粗酶液。以破碎后上清液中的蛋白质浓度和酶活力为测定 指标，以确定超声波输出功率、工作次数对细胞破碎率和酶活的影响。 2 3 6 2 最佳硫酸铵盐析饱和度实验 取3 0m l 胞内粗酶液，在搅拌、冰浴的条件下，向胞内粗酶液中缓慢加入 预先研磨和烘干的固体硫酸铵粉末，按照调整硫酸铵饱和度计算表( 0 ) 1 9 1 1 ，使酶液中的硫酸铵分别达到0 - - - 2 0 、2 0 3 0 、3 0 - 4 0 、4 0 - 5 0 、5 0 - 6 0 和6 0 7 0 的饱和度，4 静置1h 后，分别于1 0 0 0 0r m i n 离心3 0m i n ， 收集各饱和度下的蛋白质沉淀；沉淀用5m l 的p b s 缓冲液( p h8 o ) 溶解后，即 获得不同硫酸铵饱和度下的盐析酶液。 2 3 6 3 透析 取分子截留量为8 0 0 0 - - 1 5 0 0 0 的透析袋，将其剪成长度为1 0 - 2 0c m 的小段， 在含2 ( w ) 碳酸氢钠的1m m o f l e d t a 溶液中煮沸1 0m i n ( 以水沸开始计时) ， 用重蒸水彻底洗净后，置于5 0 的甘油中4 保存。 透析除盐时，将透析袋一端用透析夹夹住，将样品装入处理好的透析袋中， 对折后夹紧( 注意密封，以免溶液漏出) ，置于5 0 0 m l 大烧杯中，4 用p b s 溶液( p h8 o ) 透析2 0 - 3 0h ，每5h 更换一次透析液，除去硫酸铵。定时用奈 氏试剂1 9 2 1 检验透析袋外的p b s 中有无朋叮：，若无沉淀产生，即说明酶液中已经 不含有硫酸铵分子，则可停止透析操作。 2 4 结果与讨论 2 4 1 蛋白质浓度标准曲线 以0 1m g m l 牛血清蛋白为标准蛋白质溶液，绘制蛋白质浓度标准曲线，结 果如图2 2 所示： 1 7 上海大学硕士学位论文 0 5 0 4 o 3 - o 曲 芷0 2 0 1 0 0 01 0约 4 07 0 蛋白质浓度( i ig m l ) 图2 2 牛血清白蛋白浓度标准曲线 图2 2 为牛血清白蛋白浓度标准曲线，相关系数r 2 - - 0 9 9 5 0 ( p 0 0 0 1 ) ，满 足线性回归分析的要求，表明待测样品的蛋白质浓度可根据其吸光度对照标准曲 线获得。 2 4 2 染料摩尔浓度标准曲线及酶活公式的确定 a r l 4 的摩尔浓度( c ，m m o l l ) 标准曲线如图2 3 所示： 1 8 上海大学硕士学位论文 c ( m m o v l ) 图2 3 a r l 4 摩尔浓度标准曲线 图2 3 的相关系数r 2 = 0 9 9 9 6 ( p o 0 0 1 ) ，满足线性回归分析的要求。根据 测定结果，得a r l 4 摩尔浓度c ( m m o l i ) 与吸光度a 5 1 4 的关系式为 c ( m m o l l ) - - - - 0 0 9 1 9 a 5 1 4 0 0 2 5 。 按照酶活定义，测定样品吸光度变化a a 5 1 4 和酶促反应时间t ( m i n ) ，得到酶 活力计算公式为：酶活力= 0 0 9 1 9 a 5 1 4 1 0 0 0 t 。 2 4 3 偶氮还原酶位置的确定 在胞内粗酶液、胞外粗酶液和细胞膜悬浮液反应体系中，a r l 4 浓度随时问 的变化曲线见图2 4 ： 1 9 上海大学硕士学位论文 图2 4 胞内粗酶液、胞外粗酶液和细胞膜悬浮液的脱色曲线 图2 4 显示，胞内粗酶液对a r l 4 的脱色迅速有效，3h 内几乎将a r l 4 完全 脱色；而在胞外粗酶液和细胞膜悬浮液的反应体系中，2 4 h 内始终未观察到a r l 4 的脱色现象，表明菌株b 1 的a z r 应位于细胞质内，为胞内酶。 比较菌株细胞与胞内粗酶液对0 1 0m m o l l 浓度的a r l 4 的脱色速率( 单位 时间a r l 4 摩尔浓度变化量) ，结果见表2 5 ： 表2 5 菌株细胞与胞内粗酶液对a r l 4 的脱色速率 表2 5 表明，胞内粗酶液和菌株细胞反应体系的平均脱色速率分别为0 7 1 比m o l l m i n 和0 1 5 比m o l l m i n ，表明细胞破碎后提取的胞内粗酶液具有更高的 脱色活性【9 3 1 ，对a r l 4 的脱色速率是菌株细胞的4 7 倍。 朋 聪 小 皿 o o o o 3苦垂一。 上海大学硕士学位论文 2 4 5 最佳产酶接种量的确定 前期实验表明，菌株最佳产酶条件为：3 7 、1 2 0r r a i n 培养2 4h 。为考察 不同产酶接种量对菌株产酶水平的影响，以菌株细胞( 以湿重计) 和胞内粗酶液 蛋白质浓度为指标，确定最佳产酶接种量( 表2 6 ) ： 表2 6 产酶接种量对菌株产酶水平的影响 表2 6 表明，接种量对菌株细胞的产酶水平有一定的影响，过多的接种液会 导致培养基的营养不足，致使菌株过早地进入衰亡期，从而使蛋白质浓度下降； 过少的接种液使得培养时间内培育出的菌株过少，蛋白质浓度也较低。因此，当 接种量为1 0 ，即接种培养液和牛肉膏液体培养基的比例为1 ：9 时，菌株细胞 和蛋白质浓度都最高。 2 4 6 最佳超声波破碎条件的确定 芽孢杆菌b 1 为革兰氏阳性直杆菌，细胞壁坚固，破碎难度大，因而常需提 高破碎功率，然而，破碎功率的提高又常常导致蛋白质的变性失活。因此，为了 更好地从细胞中提取到更多、具有高酶活的粗酶液，本实验比较了不同超声波功 率和不同工作次数对提取出的胞内粗酶液的蛋白质浓度及其酶活力的影响，所得 结果如图2 5 所示： 2 1 上海大学硕士学位论文 3 喜 呈 赵 矮 峰 嘲 j o 0 8 器 繇 3 芒 o 一 0 2 12确枷 o5o15签笛404 6 破碎功率m 破碎次数( 次) 图2 5 破碎功率( a ) 和工作次数泐对胞内粗酶液蛋白质浓度和酶活力的影响 图2 5 ( a ) 显示，破碎功率较低时( 1 5 0w - - + 2 0 0w ) ，细胞破碎不彻底，菌株 细胞中的酶液不能完全提取出来，导致蛋白质浓度不高，酶活力也相对较低；随 着破碎功率的增加，破碎作用增强，蛋白质浓度有一定提高，说明较高的破碎功 率有利于液体中空穴的形成而破碎细胞，但当破碎功率达到3 0 0w 时，过高的 功率形成的超声空穴局部过热现象1 9 4 j ，导致了蛋白质的变性，因此酶活力有所下 降。由此可见，2 5 0w 是最佳的破碎功率，获得的胞内粗酶液的蛋白质浓度和酶 活力最高。 图2 5 ( b ) 表明，当破碎功率为2 5 0 w 时，工作次数对胞内粗酶液蛋白质浓度 的提取和酶活力也有一定影响。当工作次数低于2 0 次时，超声波破碎效果不理 想，而工作次数为2 0 - - + 3 0 次时，获得的胞内粗酶液的蛋白质浓度和酶活力较为 稳定。 同时，为保证足够的间隙冷却时间，防止蛋白质因高温而变性降低活力，本 实验选取工作时间：间隙时间- - 1 ：2 。因此，破碎功率2 5 0w ，工作1 0s ，间隙 2 0s ，工作次数2 0 次，总时间1 0m i n 为最佳超声波破碎条件。 2 4 7 最佳硫酸铵饱和度的选择 硫酸铵沉淀对酶活性损伤小，沉淀可长时间保存，同时，硫酸铵与不同性质 的酶蛋白之间的起始和完全沉淀饱和度也各不相同，所以本实验选用硫酸铵分级 沉淀的方法对胞内粗酶液进行提纯，以除去部分杂蛋白【9 5 1 ，结果见表2 7 ： 疆?舌浔fu) ：! 协 旺 o 9 7 5 3 2 3#吾越蜒蟮皿嘲 上海大学硕士学位论文 表2 7 不同硫酸铵饱和度下盐析酶液的蛋白质浓度和酶活力 表2 7 显示，当硫酸铵饱和度为0 - 一4 0 时，蛋白质的偶氮还原活性很低， 表明所得蛋白为非目的蛋白；饱和度为4 0 一- 6 0 时，盐析酶液的酶活力明显提高， 表明所得蛋白含有a z r ；而当饱和度高于6 0 的时候，盐析酶液的酶活力又急 剧下降，这是因为沉淀的是非目的蛋白的原因。因此，4 0 6 0 硫酸铵分级沉淀 后所得酶为a z r 盐析纯酶。 2 5 小结 1 ) 对照菌株b 1 细胞与细胞各组分的a r l 4 脱色实验，得到胞外粗酶液、细 胞膜悬浮液2 4h 始终对a r l 4 未显示出脱色活性，而胞内粗酶液的酶活力为o 7 1 u 、平均脱色速率是完整菌株细胞的4 7 倍的结果，表明菌株b 1 的a z r 为位于 细胞质内的胞内酶； 2 ) 当接种量为1 0 时，获得的菌株细胞( 以湿重计) 和胞内粗酶液蛋白质 浓度最高； 3 ) 最佳超声波细胞破碎条件为：破碎功率2 5 0w 、工作时间1 0s 、间歇时 间2 08 、2 1 2 作次数2 0 次，总时间1 0 m i n ； 钔4 0 - - 6 0 硫酸铵沉淀所得盐析酶液的酶活力最高，蛋白沉淀中含有盐析 纯的目标蛋白a z r 。 上海大学硕士学位论文 3 1 引言 第三章菌株b 1 偶氮还原酶酶学性质的研究 现有的a z r 酶学性质的研究表明【9 6 - 9 8 1 ：a z r 在不同的温度、p h 值环境 中，表现出不同的酶活力，且存在一个峰值；在脱色过程中，a z r 依赖辅酶因 子n a d h 和( 或) n a d p h 作为电子供体；金属离子能激活或抑制a z r 的酶活 力；e d t a 对a z r 的脱色活性有不同程度的抑制作用；酶动力学则是a z , r 的本 质特性。 本章将以菌株b 1 的4 0 - - - 6 0 硫酸铵盐析纯a z r 为研究对象、以a r l 4 为 底物，从( 1 ) 最适反应条件、( 2 ) 酶活影响因素、( 3 ) 酶促反应动力学三方面， 考察盐析a z r 对a r l 4 脱色的酶学特性。 3 2 材料 3 2 1 菌种、培养基和偶氮染料 同第二章。 3 2 2 实验试剂 本章实验中所使用的主要试剂见表3 1 ： 上海大学硕士学位论文 表3 1 实验试剂表 3 2 3 实验仪器 同第二章。 3 3 方法 3 3 1 蛋白质浓度测定 3 3 2 酶活测定方法 同2 3 3 。 3 3 3 酶液的制备 据第二章的最佳实验条件制备硫酸铵盐析酶液，纯化后的盐析a z r 冷藏于 4 冰箱中备用。 盐析纯a z r 的比酶活( u r a g ) 定义为每毫克蛋白质所含的酶活力，其计算 上海大学硕士学位论文 公式为： 比酶活( u m g ) = 酶活力( t o 蛋白质浓度( m 酚。 3 3 4 酶的最适反条件实验 3 3 4 1 最适反应温度及热稳定性实验 在1 5 、2 5 、3 2 、3 7 、4 2 和4 7 的温度下，将盐析纯a z r 与 0 1m m o l l 的a r l 4 反应3h 后( p h 为8 0 ) ，测定比酶活，确定最适反应温度。 p h 为8 0 时，将盐析a z r 分别在2 0 、3 2 、4 0 和5 0 中保温2 h ， 然后重新置于最适反应温度下与0 1m m o l l 的a r l 4 进行脱色反应3h 后，测定 不同保温条件下相对比酶活( 以最适反应温度的比酶活为1 0 0 ) ，确定盐析a z r 在不同温度条件下的稳定性。 3 3 4 2 最适反应p h 及酸碱稳定性实验 最适反应温度时，将盐析a z r 与o 1m m o l l 的a r l 4 在p h 分别为5 o 、6 0 、 7 0 、8 0 和9 0 的p b s 缓冲溶液( 配制见表2 1 ) 中反应3h 后，测定比酶活，确定 最适反应p h 值。 最适反应温度下，将盐析a z r 于p h5 0 、6 0 、8 0 和9 0 的缓冲液处理2h ， 用0 1 的h c l 或n a o h 调节到最适反应p h ，再与0 1m m o l l 的a r l 4 反应3 h 后，测定不同p h 处理条件的相对比酶活( 以最适p h 的比酶活为1 0 0 ) ，确定 盐析a z r 在不同p h 条件下的稳定性。 3 3 5 酶活影响因素实验 3 3 5 1 酶的辅酶依赖型试验 最适脱色反应条件下，在蛋白质浓度为1 0 0 o 0 5m g m l 反应体系中，分别 添加1 0 0m m o l ln a d h 或n a d p h ，以不加辅酶的体系为对照，测定盐析a z r 在不同辅酶条件下的酶活力。 上海大学硕士学位论文 3 3 5 2 金属离子对酶活力的影响 最适脱色反应条件下，在酶反应体系中分别加入1 0m l 浓度为5 0m m o l l 的m g c l 2 、c a c l 2 、n a c l 、k c i 、b a c l 2 、c u s 0 4 、m n c l 2 、f e s 0 4 、f e c l 3 、c o c l 2 溶液，以不加金属离子的反应体系的比酶活为1 0 0 ，考察金属离子对盐析a z r 相对比酶活的影响。 3 3 5 3e d t a 对酶活力的影响 最适脱色反应条件下，在酶反应体系内分别加入1 0m l 浓度为5 0m m o f l 、 1 0 0m m o l l 、2 0 0m m o l l 的e d t a 溶液，以不加入e d t a 的酶反应体系的比酶 活为1 0 0 ，测定e d t a 对盐析a z r 酶活的影响。 3 3 6 酶促反应的动力学实验 最适脱色反应条件、1 0 0m m o l ln a d h 时，在蛋白质浓度为1 0 0m g m l 酶 反应体系中，分别以摩尔浓度为4 0 - - 3 2 0 比m o l l 的a r l 4 为底物，测定不同底物 浓度下的酶活力并求出相应的反应初速度阼以底物浓度的倒数o c ) 为横坐标， 以酶反应的初速度的倒数( 1 功为纵坐标，作出l i n e w e a v e r - b u r k 图嗍，求得a z r 的米氏常数和最大反应速率k 峭。 3 4 结果与讨论 3 4 1 酶的最适反应温度 菌株b 1 盐析a z r 在1 5 - 4 2 范围内比酶活变化如图3 1 所示： 上海大学硕士学位论文 1 01 52 0 2 5 弱 4 0诣弱 t ( ) 图3 1 盐析a z r 的比酶活随温度变化曲线 图3 1 显示，盐析a z r 的最适反应温度为3 2 ，在2 5 c - 4 2 1 2 之间对a r l 4 显示出一定的脱色活性；随着温度的降低或升高，盐析a z r 逐渐丧失了脱色活 性。 3 4 2 酶的热稳定特性 在2 0 、3 2 、4 0 和5 0 下保温2h 后，将菌株b 1 盐析a z r 重新 置于3 2 下与a r l 4 进行脱色反应，并以3 2 的比酶活为1 0 0 ，相对比酶活 的变化如图3 2 所示i 6 2 8 4 m 眦 瀚 叭 o o o o 一西呈n)烬豁翌 上海大学硕士学位论文 1 0 0 尸、 永 v ! g 链 基4 0 莨 靶2 0 o 幻巧弱4 0牾 t ( ) 图3 2 盐析a z r 的热稳定性曲线 图3 2 表明，盐析a z r 在2 0 和4 0 时保温2h 后，剩余相对比酶活为 3 2 比酶活7 9 2 和6 8 3 3 ；但随保温温度的增加，剩余相对比酶活下降剧烈， 当5 0 下保温2h 后，剩余相对比酶活仅为3 2 比酶活的2 。8 ，表明盐析a z r 在4 0 以下，热稳定性良好。 3 4 3 酶的最适反应p h 值 菌株b 1 的盐析a z r 在p h5 0 9 0 范围内的比酶活变化如图3 3 所示： 上海大学硕士学位论文 a e 、 3 蜒 避 丑 0 呦 0 0 1 6 o 0 1 2 o 8 0 0 0 4 7 o8 0 9 0 p h 图3 3 盐析a z r 的比酶活随p h 变化曲线 图3 3 表明，3 2 时，盐析a z r 的最适反应p h 值为8 0 ，在p h7 0 9 o 的范围内对a r l 4 具有一定的脱色活性。 3 4 4 酶的酸碱稳定特性 菌株b 1 盐析a z r 在不同p h5 0 - - 9 0 处理2h 后，重新置于p h8 0 下与a r l 4 进行脱色反应，并以p h8 0 的比酶活为1 0 0 ，相对比酶活的变化如图3 4 所示： 上海大学硕士学位论文 5 06 o 7 08 09 0 p h 图3 4 盐析a z r 的酸碱稳定曲线 图3 4 表明，在p h5 0 - - 9 0 的区间内，酶活都有不同程度的损失，但总体 剩余酶活仍然较高，表明菌株b 1 所产的a z r 有较高的酸碱稳定性。 3 4 5 辅助因子对酶活力的影响 以a r l 4 为底物，得到n a d h 和n a d p h 对盐析a z r 比酶活力的影响，结 果列于表3 2 中： 表3 2 盐析a z r 催化还原a r l 4 的辅酶依赖型 毫以加入n a d h 的比酶活为1 0 0 表3 2 表明，在添加辅酶n a d h 后，菌株b 1 的盐析a z r 由对照组的0 1 9 7 3 1 o 0 o 0 o o o 0 0 0 o 加 伯 o 9 6 v 烬避翌莨巽 上海大学硕士学位论文 u n a g 上y t - y g0 2 5 2 u m g ，相对比酶活提高了2 1 8 3 ，而加入n a d p h 的反应体 系却没有观察到相对比酶活增加的现象，表明盐析a z r 催化还原偶氮染料a r l 4 时，能以n a d h 而不是n a d p h 作为电子供体裂解偶氮双键。 3 4 6 金属离子对酶活力的影响 以不含金属离子的反应体系的比酶活为1 0 0 ，得到金属离子对盐析a z r 相 对比酶活的影响，结果见表3 3 ： 表3 3 金属离子对盐析a z r 活力的影响 金属离子溶液浓度( 5 0r e t o o l l ) 相对比酶活( ) 1 0 0 6 2 2 5 8 2 6 7 5 2 0 7 7 2 8 2 6 0 2 7 0 2 7 6 0 2 1 5 7 2 0 2 8 o 表3 3 表明，文中的金属离子都对盐析a z r 的酶活力有一定的抑制作用， 抑制作用顺序为c u “、c 0 2 + 、f e 3 + 、f e “、m n 2 、n a + 、b a “、m g “、k + 、c a 2 + 。 勰 时 铲 肘 r 矿 舻 舻 矿 矿 护 上海大学硕士学位论文 3 4 。7e d t a 对酶活力的影响 e d t a 对菌株盐析a z r 酶活力的影响数据如表3 4 所示： 表3 4e d t a 对盐析a z r 酶活力的影响 e d t a 浓度( m m o l l )相对酶活( ) 对照 5 0 1 0 0 2 0 0 1 0 0 0 0 6 6 1 3 7 1 2 1 7 7 7 9 表3 4 表明，浓度从5 0 - - - - 2 0 0 m m o l l 的e d t a 对盐析a z r 的酶活均呈现部 分抑制作用，喻示着菌株b 1 的a z r 的活性中心中含有某种具有催化活力的金 属离子，由于e d t a 的螯合作用，从而减弱了a z r 的脱色活性。a z r 酶的特殊 结构有待于将来的进一步研究。 3 4 8 酶促反应动力学常数 以1 对1 c 作图，得到a z r 脱色a r l 4 的l i n e w e a v e r - b u r k 图( 图3 5 ) ： o 0 4 5 0 4 0 之 t - 0 3 5 o 3 0 0 2 5 8 0 0 0 3 0 0 0 0 3 50 0 0 4 0 0 0 0 4 50 0 0 5 00 0 0 5 50 0 0 6 00 0 0 6 5 1 c 图3 5 盐析a z r 的l i n e w e a v e r - b u r k 曲线 上海大学硕士学位论文 图3 。5 表明，反应速率倒数( 1 功与底物浓度倒数( 1 c ) 的米氏方程为l v = 7 2 4 7 l c + 0 0 1 8 ( r 2 - 0 9 9 0 3 ，p 0 0 0 1 ) ，其横轴截距为2 5 1 1 0 r 4 ，纵轴截距 为0 0 1 8 。经计算，得到盐析a z r 在3 2 、p h 8 。0 、1 0 0m m o l ln a d 时，与 a r m 酶促脱色反应的值为3 9 9m m o l l ，k 哪为5 5 0 7 z m o l l r a i n 。 3 5 小结 ( 1 ) b 1 菌a z r 的最适反应温度为3 2 ，适宜温度为3 2 4 7 ；酶在4 0 以下热稳定性良好，相对比酶活保持6 5 以上，但5 0 下保温2h 后相对比 酶活仅为2 8 ( 以3 2 的比酶活为1 0 0 ) ； ( 动a z r 的最适反应p h 值为8 0 ，在p i - i7 o 9 0 的范围内对a r l 4 具有一 定的脱色活性：在p h 值为5 0 9 0 的区间内，a z r 有较高的酸碱稳定性( 以 p h 值为8 0 的比酶活为1 0 0 ) ； ( 3 ) a z r 催化还原a r l 4 时，依赖n a d h 而不是n a d p h 为电子供体裂解偶 氮双键； ( 4 ) 大部分金属离子对酶活表现出一定的抑制作用，抑制顺序为c u 2 + 、c 0 2 + 、 f c 2 + 、f c 2 + 、m n 2 、n a + 、m 2 + 、m 9 2 + 、k + 、c a 2 + ； ( 5 ) 浓度为5 0m m o l l 、1 0 0m m o l l 和2 0 0m m o l l 的e d t a 能抑制部分酶 活力； ( 6 ) 3 2 、p h8 0 、n a d h 浓度为1 0 0m m o l l 时，a z r 与a r l 4 脱色反应 时的米氏常数焉值为3 9 9m m o ! l ，最大反应速率为5 5 0 7 比m o f l - m i n 。 上海大学硕士学位论文 第四章强磁场对偶氮还原酶酶学特性的影响 4 1 引言 近年来，h m f 生物效应在细胞工程i 枷l 和生物工型1 0 1 】中的应用研究日益增 多。h m f 通过增加微生物的酶活力f 1 0 2 ，或( 和) 改变细胞酶的表达量【1 0 3 ，提高微 生物对降解污染物的效率。现有h m f 的研究表明，磁场强度、暴露时间是磁处 理的关键因素。 本章将从( 1 ) 磁场处理条件对胞内粗酶液酶活力的影响和( 2 ) 磁场盐析 a z r 的酶学特性二方面，考察唧对处理菌株a z r 酶学特性的影响及规律。 4 2 材料 4 2 1 磁场处理菌株的培养 将接种于牛肉膏斜面培养基上的菌株b 1 分别置于2t 、3t 和4t 的h m f 暴露2 0m i n 后，3 7 培养2 4h ，即获得不同磁场强度处理菌株c 2 、c 3 、c 4 。 将接种于n b 培养基上的菌株b 1 在1 0 t 的h m f 中分别处理4 0 m i n 、6 0 m i n 、 2 4 0m i n 和7 2 0m i l l 后，3 7 培养2 4h ，即获得不同磁场暴露时间处理菌株t 4 、 t 6 、t 2 4 和1 7 2 。 4 2 2 实验试剂 同第二、第三章。 4 2 3 实验仪器 同第二、第三章。 上海大学硕士学位论文 4 2 4h m f 实验装置 h m f 的实验装置如图4 1 所示： 2雎u 圆 、 3 酬 因 5 矿、i i a 1 r e a c t i o n2 w a t e r - c o o l i n gs h e a t h 3 u p p e rb o r d e r l i n eo fs t a t i cm a g n e 面cf i e l d 4 s u p e r c 0 n d u c t e rm a g n e t 5 u n d e rb o r d e r l i n eo fs t a t i cm a g n e t i cf i e l d 图4 1h m f 示意图 h m f 工作仪( o x f o r di n s t r u m e n t ，1 2 1 4 侈8 ) ，最大磁场强度1 4 0t ，工作腔 直径8 0l l l l l l ，处理菌株置于图中均匀磁场处( a 区) 接受磁场处理。 4 3 方法 4 3 1 磁场对胞内粗酶酶活的影响实验 同第二章的最佳菌株培养和破碎条件，进行磁场处理菌株的培养及胞内粗酶 液的制备。 从c 2 、c 3 和c 4 的胞内粗酶液中，分别吸取1m l 酶液测定蛋白质含量和 酶活力( p h8 0 、3 2 ) ，考察磁场强度对磁处理菌株胞内粗酶的蛋白质浓度和 比酶活的影响。 从t 4 、t 6 、t 2 4 和t 7 2 的胞内粗酶液中，分别吸取1m l 酶液测定蛋白质 含量和酶活力( p h8 o 、3 2 ) ，考察磁场暴露时间对磁场处理菌株胞内粗酶的 比酶活的影响。 上海大学硕士学位论文 4 3 2 磁场a z r 的酶学特性实验 同第三章的制备方法制备磁场盐析纯a z r 。 取c 2 、c 3 和c 4 的盐析a z r 各1m e ( 蛋白质浓度为1 0 0m g m l ) ，在设定 温度、p h 值下进行酶促反应，以最适脱色反应条件下的比酶活为1 0 0 ，计算 c r 、c 3 和c a 的盐析a z r 的相对比酶活。 在最适脱色反应条件下，分别向c r 、c 3 和c a 的盐析a z r 中加入浓度5 o m m o f l 、1 0 0m m o f l 和2 0 0m m o l l 的e d t a ，以不加e d t a 的反应体系的相 对酶活为1 0 0 ，考察h m f 对a z r 抗e d t a 抑制作用的影响。 在最适脱色反应条件下，在c 2 、c 3 、c 4 、t 4 、t 6 、t 2 4 和r 丌2 中的盐析 a z r 中，分别添加1 0 0m m o l ln a d h 或n a d p h ，以不加辅酶的反应体系为对 照，测定不同辅酶条件下的比酶活。 最适脱色反应条件、1 0 0m m o l l n a d h 时，在蛋白质浓度为1 0 0m g m l 的 c 2 、c 3 和c 4 的盐析a z r 反应体系中，分别以摩尔浓度为4 0 - 3 2 0 m o l l 的 a r l 4 为底物，测定不同底物浓度下的酶活力并求出相应的反应初速度儿以底 物浓度的倒数( 1 o 为横坐标，以酶反应的初速度的倒数( 1 v ) 为纵坐标，作出 l i n e w e a v c r - b u r k 图，求得磁场a z r 的米氏常数和最大反应速率皿。 4 4 结果与讨论 4 4 1 磁场强度对酶活力的影响 以菌株b 1 为对照，磁场强度对磁处理菌株胞内粗酶的蛋白质浓度和比酶活 的影响结果如下图4 2 所示： 上海大学硕士学位论文 0 。0 7 0 o1234 磁场强度n 啪 心 海 4 舯磐 河 j 氅 3 0 0 要 ， 图4 2 磁场强度对菌株胞内粗酶的蛋白质浓度和比酶活的影响 图4 2 表明，在2 4 t 的范围内，c 2 、c 3 和c 4 的胞内粗酶的蛋白质浓度 分别较初始菌株b 1 的提高了1 5 3 、1 7 4 和1 7 5 倍，比酶活也分别提高了3 6 9 、 4 6 1 和4 9 2 倍，表明随场强的提高，磁处理菌株胞内粗酶的越m 的脱色活性 增大。 同时，脱色活性与蛋白质含量的上升之间，并非线性相关，说明h m f 对菌 株的作用绝非单纯的增加了a z r 的表达量，而有可能是a z r 酶活性中心受到 影响的结果。 4 4 2 磁场暴露时间对酶活力的影响 以菌株b 1 为对照，磁场暴露时间对磁处理菌株胞内粗酶的比酶活的影响结 果见图4 3 ： 似 吃 们 o 0 o o o 一。n一蜒豁羞 上海大学硕士学位论文 0 1 0 0 0 8 功 e 0 0 6 2 3 、一， 虹 藩n 0 4 羞 o 0 2 0 02 4 0 0 6 0 0 t ( m i n ) 图4 3 磁场暴露时间对磁处理菌株胞内粗酶比酶活的影响 图4 3 表明，1 0t 磁场下暴露4 0 - 7 2 0m i n 后，磁处理菌株胞内粗酶的比酶 活均高于初始菌株b 1 的，但暴露时间过长，会导致比酶活增幅度下降，当磁场 暴露时间为2 4 0n f i n 时，比酶活达到最高的0 0 9 2u m g ，这表明，酶活性随暴露 时间的变化为峰型曲线。 究其原因，可能是过长的h m f 作用会对生物体造成某种损伤效应( 如d n a 的损伤和或染色体畸变) ，从而导致酶活的改变【1 0 4 1 。 4 4 3h m f 对a z r 最适反应温度的影响 以b 1 的a z r 相对酶活为参照，h m f 对磁场盐析a z r 最适脱色反应温度的 影响结果见图4 4 ： 上海大学硕士学位论文 1 厂、 装 、 蜒 鞋 u 柏 山 靛 票2 0 0 1 01 5约为弱加 4 5 t ( ) 图4 4h m f 对磁场盐析a z r 的最适脱色反应温度的影响 图4 4 表明，h m f 作用后，c 2 、c 3 和c 4 的盐析a z r 的酶促反应的最适 反应温度仍为3 2 ，且随着磁场强度的增加，减缓了a z r 在较高温度处相对比 酶活大幅下降的趋势( 以3 2 盐析a z r 的比酶活为1 0 0 ) 。 4 4 4h m f 对a z r 最适脱色反应p h 的影响 以b 1 的a z r 相对酶活为参照，h m f 对磁场盐析a z r 最适脱色反应p h 的 影响结果见图4 5 ： 上海大学硕士学位论文 1 0 0 集 v 崾 豁 羞4 0 靛 婴约 0 5 o6 07 08 09 0 p h 图4 5h m f 对磁场盐析a z r 的最适脱色反应p h 的影响 如图4 5 所示，经h m f 处理后，c 2 、c 3 和c 4 的盐析a z r 的酶促反应的 最适反应p h 仍为8 0 ，且随着磁场强度的增加，h m f 能有效减缓a z r 在最适 p h 外的剧烈下降( 以p h8 0 盐析a z r 的比酶活为1 0 0 ) 4 4 5h m f 对a z r 抗e d t a 抑制作用的影响 h m f 处理菌株a z r 抗e d t a 抑制作用的结果见表4 1 ： 表4 1h m f 对a z r 抗e d t a 抑制作用的影响 表4 1 表明，在相同的条件下，当e d t a 浓度为1 0 0m m o l l 和2 0 0m m o l l 时，4t a z r 的相对比酶活分别比无e d t a 时提高了3 1 2 6 和3 9 6 8 ，表明4t 较2t 和3t 的h m f 更能提高磁场a z r 抗e d t a 抑制的能力。 4 1 上海大学硕士学位论文 究其原因，可能是h m f 改变了a z r 活力中心的顺磁性过渡金属离子的存 在状态【1 0 5 1 ，致使e d t a 的螯合能力下降，从而使a z r 产生了抗e d t a 抑制的能 力。 4 4 6h m f 对a z r 电子供体依赖性的影响 磁场处理条件对a z r 电子供体的依赖性影响结果见表4 2 ： 表4 2 磁场处理条件对a z r 辅酶依赖性的影响 表4 2 显示，当存在n a d h 时，h m f 处理菌株的a z r 表现出最大脱色活力， 表明a z r 的脱色仍然以n a d h 为最佳的电子供体；同时，磁处理菌株的a z r 利用n a d h 的能力也大为提高，是初始菌株b 1 的4 - - 8 倍。 表4 2 也显示，h m f 处理后菌株的a z r 也具备了利用n a d p h 为电子供体 的能力。 比较不同场强与暴露时间的处理，菌株的a z r 利用n a d h 和n a d p h 的效 率比值呈现一定差异( n a d h ：n a d p h ) ：1 2 6 、2 7 3 和2 2 5 ( 2 4 t ) ，3 8 5 、4 2 4 、 3 8 3 和3 5 0 ( 1 0t ，4 0 - - 7 2 0m i n ) ，预示着磁场强度和暴露时问对a z r 电子供 体的依赖性的改变机理存在一定差异，这将进一步进行研究。 4 2 上海大学硕士学位论文 4 4 7h m f 对a z r 酶反应动力学的影响 c 2 、c 3 和c a 的盐析a z r 的l i n e w e a v e r - b u r k 曲线如图4 6 所示： 之 r 之 - 气f c o 。o 0 。0 50 。0 10o 0 150 0 2 0o 0 2 5 i 0 之 f - o 0o 0 0 50 0 100 0 150 0 2 0o 0 2 5 1 佑 图4 6c 2 、c 3 和c a 的盐析a z r 的l i n e w e a v e r - b u r k 曲线 根据图4 6 ，计算c 2 、c 3 和c a 的盐析a z r 的对a r l 4 的脱色反应的动力 学常数，结果列于表4 3 ： 4 3 8 6 4 2 o 8 6 4 2 1 1 1 1 1 o o o o 上海大学硕士学位论文 表4 3 表明，c 2 、1 2 3 和c a 的值分别为1 4 6m m o l l 、0 9 0m m o l l 和o 5 8 m m o l l ，都低于初始菌株的b 1 的3 9 9m m o g l 。 由于岛表示的是酶和底物之间的亲和能力( 值越大，酶和底物的亲和能 力越弱，反之亦然) ，因此实验中值的降低，表明了磁场作用强化了a z r 对 底物a r l 4 染料的亲和能力；同时，随着磁场强度的增强，值几乎呈线性下 降，从2t 开始，每增加1t 的场强，值下降约为原来的1 2 ，表明随磁场强 度的增加，a z r 与染料底物之间的亲和能力更强。 4 5 小结 ( 1 ) 磁处理菌株胞内粗酶的比酶活受磁场强度与暴露时间的影响并不相同， 前者随场强的增加而逐步提高，分别为初始菌株b 1 的3 6 9 、4 6 1 和4 9 2 倍( 2 4t ) ，而后者随处理时间的增加呈现出峰型变化( 1 0t ，4 0 - - , 7 2 0m i n ) ，当暴露 时间为2 4 0m i n 时，比酶活达到最高值0 0 9 2u m g ： ( 2 ) h m f 作用并未改变菌株a z r 的最适反应温度和p h ( 3 2 和8 0 ) ，但 能有效减缓a z r 在最适区外相对比酶活大幅下降的趋势( 以最适条件下a z r 的 比酶活为1 0