（高分子化学与物理专业论文）含偶氮键的水凝胶的合成、表征及释药性能研究.pdf

浙江大学硕= l 学位论文 摘要 结肠靶向给药体系是指通过适当方法，使药物口服后在上消化道不释放，完 整运送至回盲肠部位后才通过崩解或蚀解而释放出来，发挥局部或全身治疗作 用。结肠靶向给药体系主要有p h 依赖型、时滞型以及基于偶氮还原酶或糖苷酶 的菌群触发型等。 本研究工作合成了含有偶氮键的d e x t r a n 水凝胶，考察了交联剂含量对水凝 胶各种性质的影响，体外释药实验证明，这种材料具有对偶氮还原酶的敏感性， 可以作为结肠靶向药物控释体系来使用。 首先以d c c ( 二环己基碳二亚胺) 为偶联剂，d m a p ( 4 一二甲氨基吡啶) 做碱催化剂合成了o l s a l a z i n e 乙二醇酯，然后用i p d i 对o l s a l a z i n e 乙二醇酯封端， 得到两端都有活性异氰酸根的中间产物，以此为交联剂与d e x t r a n 上的羟基发生 聚氨酯反应生成水凝胶。红外、核磁等手段证明了这种合成方案的可行性。通过 紫外测定水凝胶降解产物的特征吸收计算出了不同投料比水凝胶的实际交联度。 通过水凝胶在去离子水中的溶胀考察了水凝胶的重要特性一溶胀性，得出了 溶胀性与交联度之间的关系，即平衡溶胀度随着交联度的增加而增大，到达平衡 溶胀度的时问也随着交联度的增加而减少。包载了b s a 的水凝胶在p h = 6 8 的缓 冲溶液及在大鼠盲肠酶液中的释放实验表明：合成的水凝胶在酶液中的释药速率 远远大于在缓冲液中的释放速率，从而证明了水凝胶对偶氮还原酶的敏感性，可 以作为良好的结肠靶向药物控释体系来使用，其释药性能也与交联度有着密切的 联系。环境扫描电镜对水凝胶形貌的表征进一步证明了水凝胶的多孔结构，以及 偶氮还原酶和交联度对降解速率的影响。 关键词：o l s a l a z i n ed e x t r a n 水凝胶溶胀性体外释药偶氮还原酶 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t c o l o n s p e c i f i cd r u gd e l i v e r ys y s t e m ( c d d s ) c a nd e l i v e rb i o a c t i v ec o m p o u n d st o c o l o nw i t h o u tr e l e a s ei nu p p e rg a s t r o i n t e s t i n a l t h ec o n v e n t i o n a lm e t h o d sf o ro b t a i n c d d si n c l u d e ：( 1 ) p h - d e p e n d e n t ；( 2 ) t h ep a s s a g eo ft i m ea n d ( 3 ) e n z y m e - - b a s e d ( h e e n z y m e sf o u n dl o c a l l yi nar e g i o no ft h eg u tb r e a k d o w n ap r o d r u go raf o r m u l a t i o nt o r e l e a s ed r u g ) i nt h i sp a p e r , t h ea z o - c o n t a i n i n gd e x t r a nw a ss y n t h e s i z e da n dc h a r a c t e r i z e d t h e nt h er e l a t i o nb e t w e e nt h ec h a r a c t e ro fh y d r o g e l sa n dc r o s s l i n k i n gd e g r e ew a s s t u d i e d t h eb s ar e l e a s ef r o mh y d r o g e l si nv i t r op r o v e dt h a t ：t h i sh y d r o g e l sa r e s e n s i t i v et oa z o d u c t a s e ，w h i c hc a nb eu s e da sd r u gc a r t i e rf o rc o l o n s p e c i f i cd r u g d e l i v e r ys y s t e m u s i n gd i c y c l o h e x y lc a r b o d i i m i d e ( d c c ) a sc o u p l i n ga g e n t ，n ，n - d i m e t h y l a m i n o p y r i d i n e ( d m a p ) a s b a s e c a t a l y s t ，d i - ( 2 - h y d r o x y e t h y l ) 5 , 5 - a z o d i s a l i c y l a t e w a s s y n t h e s i z e d a n dt h e ni p d ir e a c t e dw i t hd i 一( 2 一h y d r o x y e t h y l ) 5 , 5 - a z o d i s a l i c y l a t e ；t h e i s o c y a n a t eo ft h i sp r o d u c t i o nc a nr e a c ta sc r o s s l i n k i n ga g e n tw i t ht h eh y d r o x y lo n d e x t r a nt of o r mh y d r o g e l s m a n ym e t h o d ss u c ha sf t i ra n dn m rm a k eo u tt h e f e a s i b i l i t yo f t h i ss y n t h e s i s t h ed e t e r m i n eo fs w e l l i n gb e h a v i o ro fh y d r o g e l sd e m o n s t r a t e dt h er e l a t i o n b e t w e e nc r o s s l i n k i n gd e g r e ea n dt h em a xs w e l l i n gr a t i o t h es t u d yo nb s ar e l e a s e f r o mh y d r o g e l si np b sa n dr c c r mi n d i c a t e dt h es e n s i t i v i t yo ft h eh y d r o g e l st o a z o r e d u c t a s e ，w h i c hi l l u s t r a t e dt h a t t h i sh y d r o g e l sc a l l b eu s e da sc a r r i e r sf o r c o l o n - s p e c i f i cd r u gd e l i v e r ys y s t e m t h es e mp h o t o g r a p ho fs w e l l i n ga n dd e g r a d a t e d h y d r o g e l si n d i c a t e dt h ep o r o u ss t r u c t u r eo fh y d r o g e l sa n dt h ef a c t o r si n f l u e n c e d h y d r o g e l s d e g r e a d a t i o n k e y w o r d s ：o l s a l a z i n e d e x t r a n h y d r o g e l s w e l l i n gb e h a v i o ra z o r e d u c t a s e 新江犬学硕：卜学位沧文 第一章文献综述 第一节结肠靶向给药体系 1 1 1 概述 大肠全长约1 5 m ，由盲肠、结肠和直肠构成。结肠由回盲瓣起止于直肠，介 于盲肠于直肠之问，长约i 3 m 。根据位置，可将结肠分为升结肠( 长约1 2 2 0 c m ) 、 横结肠( 长约4 0 5 0 c m ) 、降结肠( 长约2 5 3 0 c m ) 和乙状结肠( 长约2 5 4 0 c m ) ( 图1 1 ) 。 图1 1 肠道的生理结构 所谓的靶向是定位于病灶所在的部位。结肠靶向给药体系，即药物经口服给 药后在上消化道不释放，在回盲部才开始崩解或蚀解并释放出来，从而使药物在 人体大肠发挥局部或全身治疗作用1 。近年来，结肠靶向给药体系的研究受到了 越来越多的关注，该领域的迅速发展主要是基于以下几个原因：( 1 ) 有些药物容易 被胃酸破坏或者被胰酶代谢从而失去治疗作用，而药物在结肠则不受这些影响， 把这些药物制成结肠靶向给药系统可以增加其生物利用度。( 2 ) 口服蛋白多肽类药 物往往在被吸收前即被胃肠道内众多的蛋白酶水解而失去活性。结肠靶向给药无 疑为蛋白多肽类药物的口服给药提供了一个最佳的吸收场所。( 3 ) 在夜间发作的哮 喘、心绞痛、关节炎等疾病的治疗中，药物在结肠缓慢释放，将发挥长效作用。 浙江大学硕二l 学位论文 ( 4 ) 治疗结肠疾病如便秘、溃疡性结肠炎、出血性结肠炎、c r o h n 症以及结肠直肠 癌等，药物在病变区直接释放将更有效。( 5 ) 杀肠虫药和结肠诊断试剂的结肠靶向 释放可以减少剂量和副作用2 。 结肠之所以能成为靶向给药系统的首选器官，还源于其在药物吸收方面的特 点：( 1 ) 对于常规药物，因为结肠粘膜的结构特点，水和电解质通过快速而特异的 双向离子通道主动转运而被吸收，药物的吸收主要通过细胞间扩散而吸收。结肠 l l 4 , 肠等部位有更多的吸收特异部位。( 2 ) 对于蛋白多肽类药物来说，结肠比胃和 小肠的蛋白降解酶少且结肠转运时间较长，所以结肠是蛋白多肽类药物口服给药 的最佳部位。此外，结肠内水分易被吸收，且药物滞留的时间较长，故吸收剂在 结肠中易形成较高浓度，有利于促进蛋白多肽药物的吸收3 。 与传统给药体系相比，结肠靶向给药体系具有增加药物的生物利用度、解决 酶屏障问题、提高局部药物浓度、降低全身毒副作用等，这使其成为近年来的研 究热点。 1 1 。2 结肠靶向绘药体系的分类 1 1 2 1 时滞型 研究表明，尽管胃排空的时间极不规则，胃部的p h 、分泌液的性质和体积 以及粘膜均会对药物的释放和吸收产生重要的影响；但是小肠段物质的运转时间 相对要恒定的多，通常为3 4 小时。基于此，设计出了时滞型结肠靶向系统， 确保药物在离开胃部3 4 小时后开始释放。如使用疏水性聚合物包衣的t i m e c l o c k 系统4 。n i w a 等将胶囊壳用e c 包衣，在胶壳底部打数个直径约为4 0 0 9 m 的微孔，内填物下层为溶胀层低取代羟丙基纤维素，上层为药库层。此胶囊服用 后随着体液的渗入，胶囊内渗透压增大最后导致胶囊破裂，药物即被释放。通过 调节e c 囊壳的厚度，控制时滞为6 小时，可实现结肠靶向释药5 。但是胃排空 速度因人而异，个体差异较大，因此利用时滞设计口服结肠靶向给药体系有一定 的局限性。 1 1 2 2p t i 敏感型 通常消化道中胃的p h i l 0 9 1 5 ，小肠为6 0 6 8 ，结肠为6 5 7 5 。利用在高p h 环 境下才溶解的聚合物包衣，可使药物在较低p h 环境下的胃、小肠部位不释放， 从而实现结肠靶向给药。这类聚合物主要有e u d r a g i t l 和s ，也可以将两种以上的 浙江大学硕= 学位论文 这类聚合物按一定比例同时使用渊节药物释放，表1 1 列出了一些治疗结肠炎的 包衣膜材料。z s h u 等制备t p h 敏感型的柠檬酸盐交联的壳聚糖，考察了包载 r i b o f 】a v i n 的这种水凝胶在肠液中的释放情况6 。l i n g y u nc h e n 等制各了戊二醛交联 表1 1商品化的用于肠炎药物的聚合物包衣膜材料 的羧甲基壳聚糖水凝胶，实验表明牛血清白蛋白在这种水凝胶中的释放具有p h 敏感性7 。但是，p h 值在肠腔中并非呈梯度变化，而且健康人群中肠腔的p h 值往 往高于肠炎病患者的肠腔p h 值。j f a l l i n g b o r 9 8 等人研究发现，在六个u c 病人中， 肠腔p h 值变化非常大。一些病人结肠部位的p h 值分布为5 0 7 0 ，另一些却非常 低，p h 值仅为2 _ 3 、2 9 或3 4 。所以单纯依靠p h 差异设计的结肠定位给药体系可 能导致药物不能到达结肠或根本不释药，难以实现结肠定位给药。 1 1 2 3 菌群触发型 人体胃肠道的细菌构成了一个巨大而复杂的生态系统，其中胃内细菌很少， 近端小肠细菌类型和数量与胃内相似，沿小肠向回肠末端延伸细菌数量不断增 加。在结肠部位，细菌数量激增，以厌氧菌为主。其中对于结肠靶向给药体系最 有意义的是偶氮还原酶和b - 糖苷酶。利用这些只在结肠部位特有的微生物产生的 酶作用下降解的聚合物实现结肠靶向释药的给药系统称为菌群触发型结肠靶向 浙江大学硕= | = 学位论文 给药体系，常用的材料有偶氮类聚合物和果胶。偶氮类聚合物含有氮氮双键，在 结肠菌群产生的偶氮还原酶的作用下双键断裂，聚合物降解；果胶为一种酸性多 糖，结肠内菌群产生的p 一糖苷酶可特异性降解这一大分子物质。 这类聚合物由于相应酶的缺乏在胃、小肠中不能被降解，因此可保护药物通 过药物和小肠。这类制剂的结肠定位能力较前两类强，因此受到了越来越多的关 注。 1 1 2 4 其他类型 主要包括压力控制结肠靶向给药体系9 和结肠黏附给药系统。或者是将上述 几种释放类型相结合的结肠靶向给药体系，如按照p h 及时滞双敏设计的多层膜 球结构的药物传输系统，见图1 2 ； 0 m c o 蜀w 晡f 蕾 l i i i 1 0 t 聃哪m 腓 ， “岍 1 w t 黼_ 一 曩m i n i 图1 2p h 及时间双敏的惰性微球 1 1 3 菌群触发型结肠靶向给药体系 结肠靶向给药体系中的菌群触发型主要是基于以下几种结肠部位特有的酶： 水解酶、偶氨还原酶。 1 , 1 3 1 水解酶 在肠炎疾病的靶向性药物释放中，常利用酶的水解来释放出活性药物。氨基 酸、葡萄糖和环糊精等连接体都已经制各并进行了动物实验( 少数进行了临床实 验) 。一些文献对水解前体药物进行的靶向释放作了综述1 叫。 环糊精( c y d s ) 是环状的齐聚糖，包含6 8 个葡萄糖单元，通过结肠细菌的 作用分解成小分子的葡萄糖。由于环糊精的体积以及亲水性，使得在胃肠消化道 很少吸收，到达大肠部位时才降解，可作为下消化道药物的载体。旺一，p 一和7 环糊 精与药物脱氢皮质醇连接的化合物可作为潜在的结肠靶向前体药他，1 3 。根据不同 浙江大学硕士学位论文 类型的环糊精前体药物的水解速率，可以设计出不同释放速率的肠道传输系统。 图1 3 是脱氢皮质醇丁二酸酯环糊精的结构以及释放出脱氢皮质醇和脱氢皮 质醇，2 】一半丁二酸酯。通过患有肠道炎症的动物实验证明，该前体药比脱氢皮质 醇消炎效果更显著，并且减少了副作用1 4 。 p 睁5 u 争2 m r 口p 0 5 u 一 a _ c y d o 叫”g a 协c o n j 0 9 瑚 l 图1 3 脱氢皮质醇丁二酸酯- - 环糊精的结构以及释放出脱氢皮质醇和脱氢皮质醇- 2 1 - 半丁 二酸酯 另一种聚合物是葡聚糖。与环糊精相比，这类聚合物中葡萄糖单元的数量更 多，在上消化道相对稳定些，而且在下消化道菌群产生的葡聚糖酶作用下更容易 酶解。从结构上看，葡聚糖上含有大量的羟基，这些羟基使药物易于连接到聚合 物上。一种简单的连接方法是在药物上的羧基与葡聚糖上的羟基反应。如果药物 上没有羧基，则可连接一小分子如丁二酸、戊二酸等1 5 ，。图1 ，4 为葡聚糖莳体药 的一个例子。从药物动力学数据来看，这种前体药对老鼠下消化道炎症具有抗炎 作用”。 n = 2 琥珀酸盐 n = 3 戊二醛 图1 4d e x t r a n 前体药的结构r ：药物，在本实验中为与c - 2 1 羟基位置相连的皮质类固醇 浙江大学硕二b 学位论文 虽然在正常条件下，肠道微菌群的组成和数量保持恒定，但结肠的条件和疾 病状态也可能明显改变结肠微菌群。食物因素不影响微菌群的组成，但当感染性 疾病口服抗菌素后，结肠微菌群会发生很大改变，可明显影响依赖细菌降解释放 药物的结肠靶向给药体系的释药性能。许多药物传输体系依赖于糖苷酶和多糖的 水解，从而控制药物在胃肠道的不同部位的释放。通常，在u c 病患者中这些糖 苷酶的种类及活性和健康者的相当，并不会因病而改变，但对于c d 病患者来说， 相对于健康者糖苷酶的活性却会降低。相对来晓，肠道中偶氮还原酶的活性比较 稳定。 1 1 3 2 偶氮还原酶 由于结肠处所特有的偶氮还原酶的作用，使偶氮聚合物成为一种应用前景十 分广阔的、高定位性的潜在的结肠靶向药物释放载体。自从p a r k i n s o n 和k u m o r 小组在偶氮聚合物作为结肠靶向药物释放载体方向进行了先驱性的工作之后”， 人们已经合成了许多偶氮聚合物。偶氮聚合物作为结肠靶向给药体系也发展出了 很多种类，主要可以分为两类：( 1 ) 前体药；( 2 ) 易于酶解的赋性剂，主要包括包衣 膜和水凝胶。 ( 1 ) 前体药 结肠靶向聚合物前体药就是药物通过偶氮键和聚合物载体键接所合成的药 物( 图1 5 ) 。基于这种机理，结构如1 6 ，1 7 的偶氮类结肠靶向前体药物被制备出 来。 m e r a p e 埔ta t m 图1 ，5 聚台物靶向前体药结构示意图 柳氮磺胺吡啶( s u l f a s a l a g i v e ，s a s p ) 在l 临床上是磺胺类药物中治疗结肠炎最有 效的药物，s a s p 在结肠处的代谢过程中，偶氮键被偶氮还原酶断裂，产生磺胺 吡啶和5 氨基水杨酸，经研究发现对结肠炎有疗效的是5 氨基水杨酸”。因此， 6 浙江大学碘：l 学位论文 到目前为止文献报道的靶向偶氮聚合物前体药仅限于5 一氨基水杨酸和偶氮聚合 物键接的前药。为了使磺胺吡啶不在小肠吸收从而消除这种药物的副作用， b r o w n 及其同事合成水杨酸钠5 位上的偶氮键与聚合物相连的聚合物前药，这种 药能较好的减轻鼠和猪结肠炎的炎症”。s c h a c h t 等合成了几种前药，发现5 a s a 的释放和聚合物的骨架有关2 0 ( 图1 6 ) 。 b p 2 d e x t r a no rp o l y ( n - ( 2 一h y d r o x y e t h y l ) 一d l a s p a r t a m i d e ) n = 1 0 r 5 图1 6s c h a c h t 合成的偶氨聚合物前体药 j u n y i n gl a i 等合成t o l s a l a z i n e 与p e g 相连作主链的偶氮高分子前体药物( 图 1 7 ) ，通过调节p e g 的分子量控制聚合物的降解速率，达到5 a s a 的控制释放。 o l s a l a z i n e 的降解产物是无毒的5 一a s a ，可以避免由磺胺毗啶引起的毒副作用2 1 。 + o c h 2 c h 2 0 0 c 【 h 。刊刊o o h c o o c h 2 c h 2 0 0 c c h 2 c h 2 c o o j c h 2 c i - 1 2 0 _ | - n o c c h 2 c h 2 c o 上 图1 7p e g o l s a l a z i n e 偶氮共聚物的结构 ( 2 ) 水凝胶体系 水凝胶可以在外界刺激如p h 值、周围液体环境的离子强度、温度、特殊溶 质的存在以及外加的电场或磁场作用下产生从溶胀性、网络结构、渗透性到机械 强度等多方面的变化。并且由于水凝胶特殊的多孔结构，使其拥有极低的表面能， 具有良好的生物相容性，不易引起蛋白质、细胞的吸附。因为以上特性，这种刺 激响应性的水凝胶在分离、生物传感器、药物控释和组织工程方面都有广泛的应 用。含有偶氮键的水凝胶，由于结合了水凝胶自身的特点和偶氮键结肠靶向定位 作用强的优点，更加成为结肠靶向给药体系研究中的热点。 k o p e c e k j 、组制各了含偶氮键的p h 敏感高分子药物传输体系；他们还制备了 一系列含偶氮键的高分子水凝胶体系。通过改变共聚物的组成可以方便地调节高 分子水凝胶的性质( 图1 8 ) 。 扣斗。_ 一 一 浙江火学硕= l ：学位论文 阁1 8 k o p e e e k 台成的含偶氮键的水凝胶示意图 m o o t e r d 、组也制备了一系列含偶氮键的水凝胶，并系统的研究了高分子体系 的亲疏水性与微生物降解特性之间的关系。体内外实验结果：只有具有较高亲水 性的共聚物可在较短的时问内降解；在结肠环境中溶胀度最大的高分子体系，降 图1 9 d o n g w a n g 等合成的含m a - a z o - n h 2 的水凝胶示意图 浙江大学硼二 二学位论文 解的速率最快。m a r i s 等合成了由菊粉的甲基丙烯酸酯( m a i n ) 、偶氮芳香化 合物以及甲基丙烯酸羟乙酯或者甲基丙烯酸组成的水凝胶，研究表明其溶胀性受 m a 一1 n 以及偶氮键含量的影响，而且在以脱氢皮质( 甾) 醇为药物模型的释放实验 中显示了同样的趋势2 2 。d o n gw a n g 等也合成了一系列由含偶氮键的化合物 ( m a a z o - n h 2 ) 组成的水凝胶，并考察了其体外降解性能”( 图1 9 ) 。 ( 3 ) 聚合物包衣 众所周知，多糖可延缓药物在胃肠道的释放，更重要的是天然多糖在生物相 容性、细胞控制降解、无毒、应用安全上有潜在的优势；而且其化学结构可以比 较容易的改变以形成新的生物学特性如形成致密膜等。因此常常被用作结肠靶向 给药体系。表1 2 给出了一些可以在下消化道实现靶向的口服多糖体系，其中一 些已经应用于临床试验。 表1 2 用于结肠靶向给药体系的聚多糖 在上消化道控制药物释放的另一种方法是用混合型的膜，这种膜由聚多糖和 非水溶性的聚合物组成，如乙基纤维素、壳聚糖或凝胶化的羟丙基纤维素 ( h p m c ) 等。 9 浙江大学琐士学位论文 第二节源于天然高分子的水凝胶在c d d s 中的应用 1 2 1 水凝胶概述 水凝胶可以在外界刺激如p h 值、周围液体环境的离子强度、温度、特殊溶 质的存在以及外加的电场或磁场作用下产生从溶胀性、网络结构、渗透性到机械 强度等多方面的变化。水凝胶可用于大分子稀溶液( 如蛋白质、多糖) 的浓缩和 分离、化学发动机的设计、化学反应的控制、记忆元件开关、传感器和力化学转 换器等；在生物医学领域可用于药物控制释放的载体、活性物质( 如生长因子、 酶、基因等) 的包埋。 水凝胶自身的特性和结肠靶向给药体系的需要，使水凝胶成为结肠靶向给药 体系的重要形式。制备高分子水凝胶的材料可以是天然的也可以是合成的。合成 的高分子能精确的控制其结构和功能，且可选择的范围比较广泛。但是由于其合 成高分子必须严格控制材料中混杂的未反应的单体、残留引发剂和小分子副产物 等，可能会引起生物的不相容性和药物的不良相互作用。与合成高分子相比，天 然高分子尤其是聚多糖作为制造水凝胶的首选材料，最重要的是因为其生物相容 性、细胞控制降解、无毒、应用安全上有潜在的优势4 4 ；其次，聚多糖的化学结 构可以比较容易的改变以形成新的生物学特性”。 1 2 2 作为水凝胶骨架材料的天然高分子 1 2 2 1 纤维素 纤维素是自然界中含量最丰富的聚多糖，含d 葡萄糖单元；纤维素链没有支 链，其葡萄糖单元间以d ( 1 4 ) 糖苷键相连( 图1 1 0 ) 。这种连接方式使纤维素的 长链呈伸展构象并用氢键互相结合成不溶的纤维。纤维素及其改性产物常常被用 作药物辅料来使用，常见的有乙基纤维素，羟乙基纤维素，羟丙基纤维素以及羟 丙甲基纤维素，纤维索醋酸酯，乙腈基纤维素等。近年来，作为天然高分子中非 常重要的种类，以纤维素及其改性产物为骨架的水凝胶的研究发展非常迅速。 羧甲基纤维素可以通过p a s s e r i n i 年l u g i 反应形成水凝胶来达到控制释放的目 的“。以各种纤维素及其改性产物为基体的互穿网络聚合物也可以作为药物控释 或者金属离子吸附的用途使用，如：羟丙基纤维素( h p c ) 、乙腈基纤维素、羟乙 基纤维素( h e c ) 、纤维素醋酸酯与甲基丙烯酰胺、n ，n 。二亚甲基二丙烯酰胺辐射 交联可形成凝胶”。此外，纤维素及其改性产物常常与其他聚合物共混制得水凝 1 0 浙江大学硪。l 二学位论文 胶，可以获得p h 敏感的特性“。 0 c h 2 0 h o 0 纤维二耱基 图1 1 0 纤维素一部分结构 1 2 2 2 壳聚糖 甲壳素是自然界中含量第二丰富的聚多糖，仅次于纤维素，主要来源于虾、 龙虾、磷虾和蟹等动物的壳。壳聚糖由甲壳素脱乙酰化而来，壳聚糖分子内和分 子问的氢键决定了其严格的结晶结构，也决定了壳聚糖在有机溶剂中的溶解性有 限( 图1 1 1 ) 。而壳聚糖中既含有羟基有含有氨基，可以对其进行多种改性使以 壳聚糖为基体的水凝胶获得新的性质。 溉。庶影0 m 、 图1 1 1 ( a ) 甲壳素结构( b ) 壳聚糙结构 ( 1 ) 酰化反应： 壳聚糖的酰化是化学改性研究最早的一种反应，即引入不同分子量的腊肪或 芳香族酰基。酰化壳聚糖反应通常发生在氨基上，但是反应并不能完全选择性的 1j 浙江大学硕士学位论文 发生在氨基上，也会发生0 一酰基化反应”。n 一酰化反应，一是用于壳聚糖氨基的 保护，便于进行0 衍生化反应；二是有些n 一酰化衍生物对某些癌细胞有选择性 聚合作用，有作为抗癌药物的前景；三是所得产物在有机溶剂中的溶解度大大改 善。 ( 2 ) 羧基化反应： 羧甲基化壳聚糖由壳聚糖和氯代烷基酸或乙醛酸在强碱性条件下反应制得， 羧甲基化反应同时发生在羟基和氨基上，得到的是n ，0 羧甲基壳聚糖。引入羧 基后，一方面羧甲基壳聚糖是壳聚糖经羧甲基化后最重要的一类壳聚糖衍生物之 一，是分子链上含有阳离子( n h + 3 ) 和阴离子( 一c o o h 一) 基团的两性电解质聚合物， 具有良好的水溶性、成膜性和良好的吸水保水性能：更重要的是加入交联剂后可 以制得p h 敏感性的水凝胶材料7 f 1 0 。 ( 3 ) 其他可以增大壳聚糖溶解性的反应： 壳聚糖的碱性溶液与环氧乙烷或2 一氯乙醇反应可得到羟乙基化衍生物：甲 壳素和壳聚糖的羟基可与烃基化试剂反应生成醚，如甲基醚、乙基醚、卞基醚、 羟乙基醚、氰乙基醚、羟甲基醚等等：壳聚糖在n a o h 的异丙醇溶液中可与含不 同碳链长度的卤代烷作用，生成乙基、丁基、辛基和十六烷基壳聚糖等。这些方 法都可以改善其溶解性或者赋予壳聚糖新的特性5 1 。 1 2 2 3 葡聚糖 结肠部位存在着一种特殊的可以降解葡聚糖的酶，由细菌产生。以葡聚糖为 骨架的结肠靶向水凝胶的定向释放机理是：在胃和小肠中，凝胶保持着完整的形 态不释放药物；到达结肠后，在结肠处细菌释放出的葡聚糖酶作用于水凝胶，葡 聚糖中的糖苷键断裂，使水凝胶降解，引起药物的释放。通过对葡聚糖进行化学 改性来得到特殊性质和应用的研究已有很多。b r o n s t e d 和h o v g a a r d 用h d i ( 正己 烷二异氰酸酯) 交联葡聚糖制水凝胶5 2 ；e d m a n 等人在水体系中在葡聚糖上接上 缩水甘油基丙烯酸酯，然后再用n ，n 一二亚甲基二丙稀酰胺作为额外的引发剂进行 自由基聚合制得水凝胶”：葡聚糖还可以通过引入乙烯基改性，具体方法是葡聚 糖与丙烯酸溴化物和丙烯酸钠一起连续反应，或者在室温下在d m s o q b 使甲基丙 烯酸缩水甘油酯与葡聚糖发生酯交换反应生成取代度可控的产物5 4 4 6 。 近年来，羧基化的葡聚糖水凝胶的研究非常广泛，因为羧基化的葡聚糖的水 浙江大学硕士学位论文 凝胶的溶胀度对p h 的依赖更加敏感。水凝胶的溶胀性随着p h 值的改变而变化， 保护蛋白质、多肽类药物在上消化道中免受酶解的作用，通过在结肠部位的充分 溶胀和降解加强药物的释放。 1 2 2 4 菊粉 菊粉是来源于植物如菊苣的多分散的聚多糖，主要由b ( 2 1 ) d 一果糖单元组 成，而且在大多数果糖链的还原端有葡萄糖单元。b 一( 2 1 ) 键在人体消化道的体液 环境中没有显著的水解，但是结肠部位的细菌可以使菊粉溶胀”。因此，菊粉被 用作结肠靶向释药体系的选择。菊粉可以通过多种化学改性制成包括水凝胶在内 的很多重要的生物可降解化合物，其改性可以有中性修饰改性，阴阳离子改性等。 第三节水凝胶的制各 1 3 1 化学法合成水凝胶 1 3 1 1 自由基聚合交联 化学交联水凝胶可以通过低分子量的单体在交联剂的存在下发生自由基聚 合制备，例如聚甲基丙烯酸羟乙酉b ( p h e m a ) ，是一种非常熟悉和经常被使用的 水凝胶体系，这种水凝胶是h e m a 在合适交联剂的存在下聚合。用相似的步骤， 一系列其他体系的水凝胶也可以合成出来。水凝胶的性质，如溶胀性可以通过交 联剂的量来调节，此外，还可以通过添加功能单体使水凝胶获得刺激响应性质。 除去乙烯基单体可以用作自由基聚合之外，引入可聚合基团的水溶性的高分子衍 生物也可以用作制各水凝胶。包括壳聚糖在内的许多天然高分子水凝胶都可咀通 过这种方法制备5 8 。 1 , 3 1 2 官能团之间的化学交联 水溶性高分子之所以拥有可溶性，是因为某些官能团的存在( 主要是 - o h ，- c o o h ，- n i l 2 ) ，而且这些官能团还可以作为形成水凝胶的基础。高分子链之 间共价键可通过官能团间的反应建立，如：羧胺反应、o h n h 2 的二异氰酸酯反 应以及席夫碱反应等。 ( j ) 醛基交联 含有羟基的水浴性高分子可以用戊二醛交联，反应条件相当剧烈：低p h 值， 高温，甲醇淬火等；相反的，含有氨基的高分子可以在温和的条件下进行相同的 浙江大学砸二l 学位沦文 反应，形成所谓的席夫碱。大多数天然聚多糖如壳聚糖、葡聚糖、纤维素以及菊 粉等都含有羟基或者羧基，也成为这些天然高分子利用戊二醛交联制各水凝胶的 基础5 9 , 6 0 ( 图1 1 2 ) 。 图1 1 2 戊二醛作交联剂与羟基或羧基发生反应的机理 ( 2 ) 加成反应交联 r 水溶性高分子可以通过与双官能团交联剂发生加成反应转变为水凝胶。例 如，葡聚糖与1 ，6 一环己基二异氰酸酯，1 ，6 二环己基溴或者其他反应物均可发生 交联“。交联网络的性质可以很容易的通过调整溶解的聚合物的浓度和加入的交 联剂的量来控制。交联反应最好在有机溶剂中进行因为水同样可以和交联剂发生 反应。此外，由于交联剂通常来说都有剧毒，所以反应结束后凝胶需要经过完全 的萃取以除去痕量未反应的交联剂。药理活性的物质尤其是蛋白质类药物可以通 过水凝胶的溶胀作用吸附至交联网络的网孔中，由于高分子链之间的交联非常稳 固，药物的完全降解只能发生在聚合物骨架崩解之后，所以能够实现缓释的目的。 ( 3 ) 缩合反应交联 羟基和氨基与羧酸及其衍生物之间的缩合反应在合成聚酯和聚酰胺方面有 着广泛的应用，同样，这种反应也可以应用在水凝胶的制备方面。其中最有效的 水溶性高分子的胺类交联剂是e d c 。f e i j e n 等描述了用e d c 锘i j 备海藻酸盐水凝胶 的过程6 2 ，制得的水凝胶作为抗菌蛋白质的输送载体。为了使海藻酸盐离子交联 水凝胶获得更好的机械性能，m o o n e y 等, 用e d c 共价键交联海藻酸盐和p e g 接枝 二元胺，其机械性能更可以通过p e g 二元胺的量以及p e g 的分子量来调控“。 c r e s c e z i 等阐述了通过p a s s e r i n i 缩聚法和u g i 缩聚法合成水凝胶的过程，” ( 图1 1 3 ) 。在p a s s e r i n i 缩聚反应中羧酸和醛( 或酮) 与异氰化物反应生成一( 酰 氨基) 氨基化合物，这一反应可以在弱酸性水环境中在室温下进行，得到的水凝 1 4 h 州 n 且 伽小。惝 、人 h r h n h水足h矿。i f 一 一 h 心 旷h 砌 踟 。址 ，、，i o k 浙江大学砸一l 学位论文 胶在交联键中含有酯键，可以在p h i 9 5 时发生降解；而u g i 缩合形成的水凝胶 在交联键中含有胺键。 图1 1 3 p a s s e r i n i 及u g i 反应示意图 ( 4 ) 高能辐射交联 高能辐射交联，主要包括伽马射线和电子流，可以使接入乙烯基官能团的水 溶性高分子衍生物形成水凝胶：也可以通过单官能度的丙烯酸盐以及合适的交联 剂在辐射引发的条件下制各。聚乙烯醇6 6 、聚乙二醇6 7 以及聚丙烯酸6 8 是最为人 熟知的可用高能辐射聚合的高分子。形成的水凝胶的性质尤其是溶胀性和渗透 性，与高分子的浓度以及辐射的剂量有关。一般来说，交联程度随着高分子浓度 和辐射剂量的增大而增大。高能辐射引发交联反应制备水凝胶的优点是反应可以 在温和的水环境下进行( 室温、生理p h 值) ；此外，有毒的交联剂的使用可以 避免。但是，生物活性物质的包载只能在制备之后进行，因为高能辐射可能破坏 生物活性物质。 1 3 2 物理法合成水凝胶 近年来，物理法合成水凝胶受到了越来越多的关注。最主要的原因是应用交 联剂交联水凝胶应尽量避免，因为交联剂不仅能破坏包载物质的完整性，本身也 常常是在应用之前必须从水凝胶中清除的有毒物质。物理方法制备水凝胶主要有 离子相互作用交联、结晶化作用交联、利用氢键作用的交联以及两性嵌段或接枝 共聚物的交联和蛋白质相互作用制备水凝胶等，其中对于天然高分子来说，应用 最为广泛的是离子相互作用交联。 陷 h k 唧。 o 足 一 怕 。； 一 鲫旧c c 心 艘c 圳 ，c 嵋 刺 州 雎m 融 附 娅刚 勉 髓 雕 浙江大学硕士学位论文 海藻酸盐是最为人熟知的能用离子相互作用交联的天然高分子。海藻酸盐是 种含有甘露糖和葡萄糖酸基的聚多糖，可以用钙离子交联。反应可以在室温和 生理口h 值环境下进行。海藻酸盐的水凝胶主要用作活性细胞的包载以及蛋白质 的释放”。有趣的是，在螯合物的作用下海藻酸盐中的钙离子可以被除掉，从而 引起水凝胶的分解。聚阳离子可以通过阴离子交联，壳聚糖是由b 一( 1 4 ) 一氨基葡 萄糖单元组成的生物活性高分子，用磷酸甘油酯的二钠盐交联壳聚糖可以获得壳 聚糖基的水凝胶，在这种盐的存在下，壳聚糖溶液在室温下保持液态而升温后迅 速变成凝胶，溶液向凝胶转变的温度对这壳聚糖脱乙酰化程度的增加而降低7 0 。 除了金属离子可以交联阴离子高分子制备水凝胶外，聚阳离子和聚阴离子也 可以通过络合得到水凝胶。壳聚糖与聚阴离子如聚右旋糖苷硫酸盐、聚磷酸等可 以通过离子交联形成水凝胶。这种壳聚糖基的水凝胶微球可以用来包载阿霉素， 在细胞毒素作用下的体外降解实验中表现出了最小程度的暴释以及良好的持久 性”。 第四节结肠靶向水凝胶的结构性能与释药表征方法 1 4 1 结构性能的表征 水凝胶的三维网络结构极其复杂，由于其中包含的水分，又使得许多传统的 表征手段难以实施。因此，水凝胶网络与水的作用，在p h 值、温度、电场等的 刺激下发生体积相变，水凝胶的结构发生了怎样的变化，目前还难以通过仪器表 征直接得知 傅立叶红外光谱( f n r ) 、核磁共振波谱( n m r t ) 、紫外可见光谱( u v v i s ) 用于 表征干态水凝胶的结构，可以表征共混体系或i p n 是否形成新的化学键7 2 。通过 一些基团特征峰的漂移以及吸收峰的强弱变化，可以确定i p n 中两种高分子链间 是否有氢键形成。红外、核磁共振波谱n m r 及紫外可见光谱u v v i s 皆可用于表 征水凝胶高分子链的结构。 电子显微镜可以表征水凝胶的微观结构、表面形态。电子显微镜的放大倍数 可高达几十万倍，能够观察尺寸为1 u m 甚至更小的颗粒，是直接观察高分子微 观结构的主要手段。在电镜法中，通常采用扫描电镜( s e m ) ，通过对样品的喷金， 观察样品表面或者断面的形貌。s i n h e ek i m 等人用扫描电镜观察了d e x t r a n 甲 1 6 浙江大学硕二| 学位论文 基丙烯酸水凝胶溶胀前后的形貌，以及不同取代度的水凝胶的形貌，得到了有明 显区别的照片7 3 。常温差热分析方法( d s c ) p 7 - 用于表征水凝胶的结晶结构，低温 d s c 常用于分析计算水凝胶中水的状态和含量。 溶胀度的测试是水凝胶性能测试中最为常用的手段，水凝胶的溶胀性质、保 水性质、温度及p h 响应性质基本都是根据测试其溶胀度的改变来进行的。 借助现代的表征手段，将水凝胶的宏观性能与微观结构相结合，传统的理论 基础如f l o r y 凝胶理论与非线性科学中的分形理论相联合，可以更好更深入的研 究水凝胶的结构性能及应用。 1 4 2b s a 在水凝胶中的体外释药评价 生物降解型结肠靶向给药体系中偶氮前体药物或偶氮聚合物构成的制剂的 释药性能评价，均需在一定p h 条件和偶氮降解酶的存在下，在无氧条件下即在 c 0 2 培养箱或通c 0 2 或n 2 气流下进行孵育试验或溶出试验。其降解机理一般如 图1 1 4 所示，偶氮键在偶氮还原酶作用下先还原成肼，然后再进一步还原成氨 基。 a z o r e d u c t a s e 图1 1 4 偶氨键在偶氮降解酶中的降解 偶氮还原酶可以从新鲜的人粪便中培养获得，k h n u m 小组用培养的人粪便对 结肠释药包衣膜一线型偶氮聚氨酯进行了体外的偶氮还原酶降解实验7 4 , 7 5o 这种 酶液的收集方法为：新鲜的人粪便在n 2 氛围中用厌氧介质( g e n e r a la n a e r o b i c m e d i u m g a m ) 稀释2 0 0 0 0 倍，在3 7 。c 下培养一天。然后将制备好的偶氮聚氨酯 培养在酶液中，实验结果表明，培养的偶氮还原酶无法将偶氮键还原成氨基，而 是还原成肼基。这可能是由于聚氨酯疏水性太强，使偶氮还原酶的还原作用差。 但药物可以通过包衣膜的溶胀扩散到环境介质中。 更多的科研工作者是利用大鼠盲肠液培养偶氮还原酶，取与人结肠道部位相 似偶氮酶及活性的大鼠盲肠内容物培育或在溶出肠液中直接加入大鼠盲肠内容 物进行溶出实验，并与未加者进行对照实验。实验前处死大鼠取其盲肠内容物或 将内容物冰冻保存备用，一般在含酶的释放介质中，药物的释放明显加快，以此 证明了该制剂的结肠靶向性。在b r o w n 等人的工作中，在s d 大鼠盲肠液中加 浙江大学硕士学位论文 入一d 葡萄糖和苄基紫精，无氧环境下将水溶性的聚合物前体药置于酶液中降解 “。实验结果证明在此酶液中，偶氮键降解，并且苄基紫精作为氧化还原电子转 移剂加快了偶氮键的还原。k o p e c e k 小组在大鼠盲肠酶液中加入6 一葡萄糖磷酸 酯、还原型辅酶】i 、苄基紫精以及6 葡萄糖磷酸酯脱氢酶，对生物粘附性n ( 2 羟丙基) 甲基丙稀酰胺共聚物进行了体外降解”。实验发现，偶氮键的降解速率 快，并且随着苄基紫精浓度的增大而加快：当苄基紫精浓度稳定时，偶氮键的降 解速率随盲肠液中细胞浓度的增大而增大。 以上讨论的一些体外试验方法，不能完全反应胃肠道内的动态环境和生理条 件，e t i e n n es c h a c h t 等设计的采用人大肠微生物模拟系统( s i m u l a t e dh u m a n i n t e s t i n a lm i c r o b i a le c o s y s t e m ，s h i m e ) 则是目前较为理想的评估生物降解口服结 肠靶向给药体系的体外模型7 8 。该系统由5 个室组成，各室之间通过泵相连，按 一定的时间顺序加入含有淀粉、果胶木聚糖和阿拉伯胶半乳聚糖的介质，各室依 次模拟十二指肠、空肠、回肠、盲肠和升结肠、横结肠和降结肠。用该模型评价 5 一氨基水杨酸前体药物时可在模拟盲肠和结肠部位观察前体药物的降解现象。 第五节课题的提出 从近年来结肠靶向药物释放体系的研究发展来看，如果新的释药系统相对于 现有的药物更加有效并且确实能降低副作用的话，具有非常诱人的前景。在这些 释药系统中，含有偶氮键的化合物引起了广泛的兴趣。因为相对于p h 敏感或者 温敏性的材料来说，基于结肠部位特有的偶氮还原酶而发展起来的偶氮化合物在 药物控释方面靶向性更强，具有更好的定位效果。但是，最初针对偶氮化合物的 研究主要集中在柳氮磺胺吡啶作为与聚合物基体通过化学键相连，形成前体药。 这种前体药完全降解后会产生毒副作用较大的磺胺吡啶。因此，目前的研究逐渐 转向其他含有偶氮键的芳香组化合物，o l s a l a z i n e 就是其中的一种。o l s a l a z i n e 完 全降解的产物是没有毒副作用的5 一氨基水杨酸，可以作为一种前体药物安全的使 用。同时，o l s a l a z i n e 具有含四个官能团的结构，通过化学改性可以与高聚物链 连接做前体药物或者作为交联剂交联其他聚合物链使用。 而天然高分子尤其是聚多糖在生物相容性、细胞控制降解以及无毒、应用安 全上有潜在的优势，而且聚多糖的化学结构可以比较容易的改变以形成新的生物 浙江大学硕= 学位论文 学特性。因此用天然高分子作为结肠靶向给药体系屡见报道。其中因为在结肠部 位有一种特异性的酶一糖苷酶，可以针对d e x t r a n 中的糖苷键进行特异性降解， 所以d e x