（微生物学专业论文）甾短杆菌红色突变株选育及其产胆固醇氧化酶稳定条件研究.pdf

摘要 摘要 本实验以产胆固醇氧化酶( c o d ) 箔短杆菌( 口w v 治口c ，p r f “印d g c d c 一8 2 ) 为出发株， 通过超声波辅助n t g 诱变育种，获得红色突变株b r e v i b a c t e r i u ms p d g c c n 2 5 ，该突变 株产酶能力提高了1 4 0 ，c o d 水平达到1 2 1 u m l 。对菌株d g c c n - 2 5 所产的红色物质 采用了高效液相色谱和液质联用色谱研究推测其为红色醇溶性色素，分子量可能为7 9 2 ， 目前尚未见相关研究报道，初步定名为甾杆橘红色素。 优化了d o c c n 2 5 产c o d 发酵工艺，采用正交实验分析调整了产酶培养基及其组成， 得出诱变菌株较适：直：的产酶条件为：胆固醇添加量从3 l 增加到4 l 、酵母膏从8 l 增加到9 l ，皱优化培养基前，c o d 产率提高了2 4 8 ，酶活达到1 5 l u m l 。 研究了d g c c n 2 5 产c o d 的分离纯化工艺。粗提取重点解决发酵液离心后酶活损失 过多的问题，通过在发酵液中添加4 4 ( v ，v ) 的异丙醇，离心后c o d 收率从7 5 升高 到9 2 。精提取组合s e p h a d e xg 2 5 凝胶过滤层析和d e a e s e p h a d e x 离子交换层析相结 合，对粗提取后的酶液迸一步纯化。通过g 一2 5 层析，比酶活达到49 5 u m g ，纯化倍数为 2 5 8 倍；通过d e a e s e p h a d e x 离子交换层析比酶活达到1 3 2 6 u m g ，纯化倍数为2 6 7 倍。 进一步采用g 2 5 层析处理，比酶活达到了1 5 3 l u m g ，初步达到了纯化目的，总收率为 4 1 3 。 酶稳定性研究发现，提取的粗酶液在4 条件下存放，酶活损失较大；纯化后的c o d 在超过4 0 热处理时，稳定性较差；真空冷冻处理时酶活损失。加入稳定助剂酒石酸钾 钠甘露醇有助于提高c o d 的稳定性：4 存放3 5 0 天酶活保持率为7 0 ，而对照组仅为 2 0 ：4 0 热处理3 h ，与对照组相比，酶活保持率从7 0 升高到9 0 ；真空冷冻干燥处 理时酶活损失率为1 0 ，少于对照的3 0 。 关键词：胆固醇氧化酶，甾短杆菌，复合诱变，纯化，稳定性 英文摘要 a b s t r a c t a h i 曲e rp r o d u c e ro fc h o l e s t e r o lo x i d a s e ( c o d ) ，r e dm u t a md g c cn - 2 5 ，w a si s o l a t e d f 而mt l l eb 愆v 曲口c 胞，f “州m u 协td g c d c 8 2m u t a t e db yn t gu n d e ru l t r a s o n i c a t i o n t h e c o d p m d u c t i o no f t h em u t a n td g c c n 一2 5 w a s1 4 0 h i g h e rt h a nt h ei n i t i a ls t r a i n a n dm er e d s u b s t a n c ew a se x t r a c t e da n da n a i y z e d ，n 锄e da s 肌v 舾d c f e ，m 肌c h r y s o i d i n ep i g m e m t h ef e m e n t a t i o nc o n d i t i o nf o rc o dp r o d u c t i o no fm u t a n td g c c n 一2 5w a si m p r o v e db y a d j u s t i n gc h o l e s t e r o lc o n t e n tf 幻m3 l t o4 la n dy e a s te x t m c tf b m8g l t o9 l ，t 1 1 ec o d a c t i v i t yr e a c h e d1 512 u ，m 1 1 1 1 ep 心p a r a t i o no fc o d 舶mam u t a l l td g c c n 一2 5w a ss t u d 疏t h eb r o m 疔e eo fc e l l s w a sa t t a i n e da r e rc e n t r i 挑a t i o nw i t l li s o p r o p a n o l4 4 ( v ，v ) ，m el o s to fc o dr e d u c e df 而m 2 5 t o8 s e p h a d e xg 一2 5g e lc h r o m a t o g r 印h ya n di o n e x c h a l l g ec h r o m a t o g r 印ha r ea d o p t e d r e s p e c t i v e l yf o r l n h e rp u r i f i c a t i o n a r e rs e p h a d e xg 一2 5g e lp u r i f i e d ，2 5 8 - f b l dp u r i n e dc o d w a so b t a i n e dw i t has p e c m ca c t i v 酊o f4 ，9 5 u ，m g a f t e ri o n e x c h a n g ec h r o m a t o 伊a p h yp 嘶f i e d ， 2 6 7 一f o l dp u r i f i e dc o dw a so b t a i l l e dw i t has p e c i f i ca c t i v i t yo f1 3 2 6 u m g t h e n ，u s e ds e p h a d e x g 一2 5g c l ，a i l d y i e l d e d c o d w i t h a s p e c i f i ca c t i v 时i s1 5 3 lu m g ，m e t o t a ly i e l d i s 4 1 3 t h ec m d ec o d 丘d mm u t a n td g c c n 一2 5s h o w e du 1 1 s t a b l ew h e ni tw a st r e a t e d l j 曲e r _ 【h a n 4 0 ，a c t i v i t y1 0 s to f7 0 a t4 a r e r3 5 0d a y ss t o m g e ，a n de a s yd e n a t u r a l i z a t i o nw h e ni ti s p r e p a r e dt h r o u g hv a c u 啪 丹e e z e d r i e d t h er e s e a r c hs h o w e da d d i n gp o t a s s i 啪 s o d i u i l l t a r t r a t e m a n r o s et ot h ee n z y m es y s t e mi m p r o v i n gm es t a b i l i t yo fc o d ：r e d u c i n ge i l z y m e1 0 s t 厅o m3 0 t o 】o w h e ni tw a s 廿e a t e da t4 0 f o r3 h ，r i s i n ge 1 1 z y m er e c e i v ef 如m2 0 t o7 0 w h e ni tw a ss a v e da t4 f o r3 4 0d a y s ；a n dr e d u c i n ge n z y m el o s t 舶m3 0 t o1 0 w h e ni t 、v a sv a c l 】u mf k e z e d r j e d k e y w o r d s ：c h 0 1 e s t e r o lo x i d a s e ，b r e v i b a c t e r i u ms p ，d l l a l m u t a t i o n ，p u r i f i c a t i o n ，s t a b i l i t y 独创性声明 y 9 6 8 0 3 3 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示诩意。 签名：垒 兰日期：z o 。年月z o 日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 釜喀： 雾亏 导师签名：皇竺 日期：m 年6 月仞日 第一章绪论 1 1 胆固醇氧化酶的应用前景 第一章绪论 胆固醇是是构成动物细胞膜的必需组分。在人体中它主要存在于血浆、肝、肾上腺以 及细胞合成的脂质混合物中，它是动物脂质代谢过程中的重要物质，可调节消化道对脂肪 的吸收，并且是胆汁酸、类固醇激素和维生素d 生物合成的前体物质。血浆中胆固醇的 水平是人体健康状况的重要生理指标，人体的心、脑、血疾病很多都与血液中的胆固醇含 量有关，如动脉粥样硬化、冠心病、胆石症等1 2 】。因此近二十年来，过量胆固醇可能危害 人体健康己成为国际食品医学界的热门话题【j 5 】。 胆固醇氧化酶( c o d ) 是胆固醇代访f 途径第一步反应的关键酶，能专一性的催化胆固 醇转化为胆甾一4 一烯一3 酮( 胆甾烯酮) 和h 2 0 2 卜，见图l l 。目前国际上通用的生物测定 胆固醇的r i c h m o n d 法，便是应用胆固醇氧化酶的这种转化特征，通过比色法定量测定反 应液中h 2 0 z 的含量，从而测定出胆固醇氧化酶酶活力，该法具有简单、高效的特征。这 使的胆固醇氧化酶在临床检测血清胆固醇含量方面具有了重要意义，如今胆固醇氧化酶已 成为一种广泛应用的i 临床检测用酶i l 。 ，、r 一。二这夕、兀 f a df a d h c h o l e s t e i d u n i 2 0 2 o ： 嘶叫目6 1 o 合o d 分o l - 图1 1 胆同醇氧化酶催化胆阎醇转变为胆甾4 烯一3 一酮示意图 f i g 1 1c h 0 1 e s t e r o lo x i d a s ec a t a l y s e sc h o l e s t e 呻l t oc h o l e s t 4 - e n - 3 - o n e 胆固醇氧化酶在食品、药品生产、保健品【1 川引、生物农药 m 1 ”、环境等方 面都有极广泛的运用。胆固醇氧化酶的开发利用有着重要的意义。 1 2 微生物产胆固醇氧化酶研究 微生物产胆固醇氧化酶研究概述： 自从1 9 4 8 年t u m t tg e 首次发现灰暗诺卡氏菌产生胆固醇氧化酶以来，已经报道了 有多种微生物能够产生胆固醇氧化酶( e c l 1 3 6 ) 。表1 1 介绍了几种能够产胆固醇氧化酶 的不同微生物【32 0 奶 。 江南大学硕士学位论文 野生菌的产酶能力在3 0 0 u l ( 发酵液) 左右，不能满足工业生产要求；另外，野生 菌产生胆固醇氧化酶必需要由底物诱导，而胆固醇不溶于水，难以在水相培养基中均匀地、 稳定地分散。同时给胆固醇氧化酶的发酵、分离、应用都带来了困难。所以，学者们直 在对菌种进行改造并优化发酵条件，以提高菌种产酶活力、胆固醇氧化酶的分离纯化及应 用。 1 9 8 7 年，台湾的“uw e n h s i u l l g l 2 4 】等人对诱导型产胆固醇氧化酶的节杆菌 a n l l r o b a c t e rs i m p l e x 进行紫外诱变处理，结果获得组成型突变株，大大简化了发酵操作。 1 9 9 2 年，e i tj o s e p h 等人研究了红球菌月 o 踟c c 淞s p 产胆固醇氧化酶的发酵工艺， 发现己酸对提高酶活有明显的诱导作用【2 ”。 本实验室研究人员，韩振芳和陈亮对从土壤中筛选出来的一株产胆固醇氧化酶( c 0 d ) 甾短杆菌，并进行了紫外诱变、亚硝基胍诱变和硫酸二甲酯等一系列诱变处理，获得一株 突变株，产酶方式由部分分泌型转变成完全分泌型，c o d 发酵单位提高到3 8 0 u 几【2 ”。 季文明等人采用6 0 c o 诱变处理菌株，获得了产酶达到在0 5 0 0 u m 1 的突变株 ( b ，v f 6 口c f p ，f “啪s p d g c d c 8 2 ) 【2 8 1 。 表l - l 产胆固醇氧化酶的微生物 t 曲1 1t | l em i c r o b eo f p m d u c t i o nc h o l e s t e r o lo x i d a s e 微生物产胆固醇氧化酶分离提取研究进展 第一章绪论 1 9 7 3 年，r i c h m o n 水9 】首次以胆固醇为唯一碳源的培养基中培养诺卡氏菌n c i b l 0 5 5 4 后，从细胞中分离到胆固醇氧化酶，并建立了用此酶作为测定血浆中胆固醇的酶学分析方 法，促进了对胆固醇氧化酶的研究的开展。 1 9 7 3 年，u w a j i m a 采用硫酸铵盐析，d e a e c e l l u l o s e 、羟基磷灰石、s e p h a d e xg 7 5 层析方法，在硫酸铵溶液中制得胆固醇氧化酶结晶。 】9 9 8 年，n o r j y u k id o u k y u 采用盐析、d e a e c e l l u l o s ed e 5 2 离子交换、丁醇- t o y o p e a r l 6 5 0 s 疏水层析、s e p h a d e xg 1 0 0 凝胶过滤，通过假单胞杆菌s ps t 2 0 0 发酵制备胆固醇氧 化酶，总收率2 0 ，比酶活1 5 2 u m g ，纯化倍数达到3 6 倍。 2 0 0 1 年，m 丁a b a t a b a e iy 等人【3 l 】利用链霉菌发酵，通过盐析，d e a e - s e p h a r o s e ( p h a r l l l a c i a ) 层析( 1 0 m m ，p h 8 5 磷酸缓冲液平衡) ，最终得到比酶活2 3 u m g 的纯 酶。 2 0 0 2 年，牛天贵【3 2 】，利用马红球菌4 2 发酵，采用阴离子树脂、c m c e l l u l o s e 、超滤 浓缩、s e p h a d e xg 7 5 四个步骤分离纯化胆固醇氧化酶，酶比活为：5 2 7 u m g ，提纯倍数为 1 2 9 倍 2 0 0 3 年，r j t av a m a ，s a n j a y n e n e 【3 3 】，利用链霉菌n c i m 2 4 2 l 发酵，采用硫酸铵盐析， 纤维素膜超滤，得到】4 2 u m g 的胆固醇氧化酶，收率达到9 0 。 本实验室研究人员季文明l ”】，从甾短杆菌( 8 w v 拍钟f e ，f “ms p d g c d c 一8 2 ) 发酵上清 液中，通过硫酸铵盐析，d e a e 5 2 纯化，得到比酶活为1 28 u m 2 的胆固醇氧化酶，收率 达到6 2 。 胆固醇氧化酶的性质： 1 3 本文研究内容 由于菌种产生明显退化，产酶回落到o 5 u m l ：提取分离工艺还存在一定问题，比酶 活不够高。针对这些问题，确定研究内容如下： 1 、进一步采用诱变育种的手段，筛选甾短杆菌产胆固醇氧化酶的组成型突变株，以 解除胆固醇作为诱导物的限制性因素，同时筛选甾短杆菌产胆固醇氧化酶( c o d ) 的高产 菌株，以利于提取纯化及应用。 2 、针对工业化生产c o d 的实际要求，进一步优化分离纯化技术路线。在粗提取方面， 需要优化c 0 d 粗提取： 艺，重点解决发酵液离心后酶活损失过多的问题，考察不同饱和 度的硫酸铵对盐析结果的影自。对酶精提工艺和条件进行研究，争取纯化后的c o d 比酶 活达到1 5 u n 碹。 3 、对诱变菌株( d g c c n 一2 5 ) 产c o d 的稳定性初步研究，考察不同温度下的c o d 热稳 定性、不同的稳定剂对酶保存稳定性的影响，以及真空冷冻干燥过程中，不同的稳定剂对 c o d 稳定性的影响，以利于c 0 d 的推广应用。 江南大学硕士学位论文 第二章超声波辅助亚硝基胍诱变提高c o d 酶产率 甾短杆菌( 召陀v f 6 c f p ，f “ms p d g c d c - 8 2 ) 为本实验室自筛保藏菌株，本实验室研究人员 采用过紫外线、亚硝基胍、6 0 c o 等一系列诱变方法处理【2 8 】，目前产c o d 活力为o 5 u m o l l 。 本实验继续采用诱变育种的方法，进一步提高产c 0 d 活力，并选育组成型突变株。 2 1 材料与方法 2 1 1 实验材料 菌种： 甾短杆菌( b 卯v f 6 口c 招，f “埘s p d g c d c 一8 2 ) 为本实验室自筛保藏菌株 主要实验仪器： h 6 6 m c 型超声仪无锡超声设备有限公司 h p “0 0 高效液相色谱仪c l s ，2 0 0 m m ，5 岬a 百l e m 公司高效液相色谱仪 w a t e r sp l a t f o mz m d4 0 0 0 质谱仪 美国w a t e r s 公司 主要试剂： 亚硝基胍( n t g ) ( a r ) 辣根过氧化物酶( b r ) 德国f l u l ( a 公司 上海双向西巴斯科技发展有限公司 培养基： 完全培养基( l ) ：牛肉膏3 ，蛋白胨1 0 ，n a c l5 ，琼脂2 0 ，蒸馏水l l ，p h 7 5 选择培养基a ( g l ) ：w 1 ，酵母膏o 6 ，n a c l l ，琼脂2 0 ，蒸馏水ll ，p h 7 5 选择培养基b ( 叽) ：选择培养基a ，灭菌后添加显色法胆固醇氧化酶检测液a 液4 0 m l ，p h 7 5 选择培养基c ( g ，l ) ：选择培养基a ，溴百里酚蓝o 0 4 ，p h 7 5 发酵培养基( l ) ：胆固醇3 ，酵母膏8 ，n a c l l ，c h 3 c o o n h 42 ， k 2h p 0 40 2 ， m g s 0 4 7 h 2 00 0 5 ， f e s 0 4 7 h 2 0o 叭，c a c l 2o 1 ，吐温- 8 03 m 1 ，蒸馏水1l ，p h 7 5 胆周醇氧化酶检测液： 溶液a ( 4 一氨基一安替比林，1 m m o 儿；苯酚，6 m m o l l ；叠氮钠，o 2 9 l ；过氧化物酶， 5 0 0 0 u l ；磷酸钾缓冲液，2 5 m m 0 1 l ，p h 7 ，5 ) ：溶液b ( 胆固醇，8 2 6 m m 1 ；t r i t o nx 一1 0 0 ， 4 | 2 6 ： 异丙醇为溶剂) 第二二章超声波辅助硝肇觚晤变提高c o d 酶产率 2 1 2 实验方法 2 1 。2 。l 一般方法 胆固醇氧化酶活的测定： 胆固醇氧化酶酶活测定采用比色法，其原理是：胆固醇在c o d 的催化下分解成一分 子的胆甾4 烯3 酮和分子的h 2 0 2 ，h 2 0 2 在过氧化物酶的作用下分解，可使4 一氨基一安替 比林与苯酚形成亚醌类呈红色的化合物，它在5 0 0 n m 处有最大吸收峰通过测量反应液 在5 0 0 n m 处的吸光值，可定量测定胆固醇的氧化量，从而计算出胆固醇氧化酶的酶活单位。 3 m l 溶液a ，】5 0 ”l 溶液b ，5 0 儿l 酶液，3 7 ，反应5 分钟，沸水浴3 分钟，于5 0 0 n m 测吸光值。酶活( u m 1 ) = 1 6 8 3 2 a 5 0 0 。 菌体量的测定： 0 2 m l 发酵液加入5 m i ，o 2 5 m o i ，l 的h c j 溶液中，振荡均匀，与此同时5 6 0 1 1 i t l 处测 吸光度( 0 3 0 6 之内) ，菌体量( l ) 由o d 5 6 0 与吸光度- 菌体干重标准曲线( 菌体量= 2 5 0 ( o d 5 6 0 0 10 8 5 - o 0 2 2 6 ) = 2 7 】2 5 0 d 5 6 0 - 5 ，6 5g l ) 求出。 胆固醇测定： 取0 2 m 1 发酵液于4 m l 的离心管中，加入3 8 m 1 无水乙醇，l o ，o o o r m i n ，离心3 分钟， 各取1 0 m 1 上清液转移到相应的试管中，取o 0 8 m m l 胆固醇工作液1 o m l 转移到第二个试 管中，用作标准；取1 om i 乙醇加入到第三个试管中，用作空白，向3 个试管中缓慢加入 1 0 m l 的硫磷铁试剂，轻轻振荡均匀置室温3 0 分钟，所生颜色在一小时内稳定，将上述各 试管中的有色溶液于5 5 0 n m 下进行比色测定，作记录。胆固醇( m m 1 ) = a # d # + a 镕”1 6 突变株红色物质提取与全波长扫描分析： 取发酵液1 0 0 m l ，5 0 0 0 “m i n 离心1 0 m i n 取菌体，菌体悬浮于3 0 m 1p h 7 o ，o 0 5 m 磷酸 钾缓冲液，超声处理，( 2 0 0 w ，5 0 k h z ，间歇处理，每次5 m j n ，其间停l m i n ) 。超声4 次 后，8 0 一m i n 离心取上清，加入2 0 m l 甲醇振荡均匀，静置2 h ，8 0 0 0 m i n 离心1 0 m i n ， 取上清，水浴蒸二f ，溶解于5 0 m 1 甲醇溶液，8 0 0 0 r m i n 离心l o m i n ，取上清。 突变株红色物质色谱分析： 样品处理方法同突变株红色物质提取与全波长扫描分析方法，吸取1 0 u l ，高效液相色 谱进样分析，色谱条件为：无水甲醇洗脱，2 8 0 n m 处检测洗脱峰。或液质联用色谱进样分 析，液质联用分析时，高效液相色谱条件为：无水甲醇洗脱，2 8 0 n m 处检测洗脱峰。 江南大学硕士学位论文 2 1 2 2 诱变处理条件与步骤 出发菌株生长曲线的绘制： 配制液体种子培养基1 0 0 0 m 1 分装于2 0 瓶2 5 0 m l 三角瓶中，分别接种一环固体培养基 中菌落于其中，3 0 培养。每2 h 测定一次两瓶菌体细胞浓度，取平均值，测定1 0 次，绘 制菌体生长曲线。 出发菌种活化处理： 出发菌种经斜面活化2 4 h ，转接至液体种子培养基，装液量为2 5 0 m l 的三角瓶装5 0 m l 培养液，3 0 ，2 2 0 “m i n ，培养1 2 h ，至对数生长期中后期。取菌悬液5 m l ，5 0 0 0 r m i n ，离 心1 5 m i n ，弃去上清，菌体用无菌p h 6 o 磷酸缓冲液洗涤，振荡均匀，5 0 0 0 r m i n ，离心1 5 m i n ， 弃去上清，重复两次。配制成原体积菌悬液。 诱交步骤： 超声波作为物理诱变剂，是辅助的诱变手段，化学诱变剂n t g 为主要诱变手段，需 要考察菌浓度，处理时间、温度相同的条件下，超声波、n t g 、超声波辅助n t g 对菌种 致死率的影响。以选择使致死率较强的诱变处理方案。 1 ) 超声波诱变处理出发菌株：取活化处理后的菌悬液3 0 m l ，平均分装于六只试管，一 只作对照，另五只采用超声波( 2 0 0 w ，5 0 k h z ) 处理，每次超声照射5 m i n ，中间停l m i n 。间 歇处理1 、2 、3 、4 、5 、6 次，处理后，稀释涂布于种子培养基中，3 0 ，培养2 4 h ，计 数，计算致死率。 2 ) n t g 诱变处理出发菌株：取活化处理后的菌悬液3 0 m l ，平均分装于六只试管，一只 作对照，另五只采用n t g ( 1 m g m 1 ) 处理，在诱变处理5 、1 0 、1 5 、2 0 、2 5 、3 0 分钟时， 分别取出一只试管，取0 ，5 m l 菌悬液，稀释l o o 倍，终止诱变，再稀释至适当浓度后涂平 板，3 0 ，2 4 h 培养，待形成明显菌落后计数，计算致死率。 3 ) 复合诱变处理出发菌株：取6 只试管，各分装已活化处理后的菌悬液5 m l ，诱变处 理，诱变条件为：冰水浴中，超声( 2 0 0 w ，5 0 k h z ，每次5 m i n ，间歇1 m i n ) 辅助n t g ( 1 m m 1 ) 诱变处理菌悬液，超声间歇处理1 、2 、3 、4 、5 、6 次。每次超声照射后，取1 只试管诱 变处理菌液，取0 5 m 1 菌悬液，稀释1 0 0 倍， 照与处理菌按相同稀释度涂布种子培养基中， 计算致死率。 终止诱变，再稀释至适当浓度后涂平板，对 3 0 ，2 4 h 培养，待形成明显菌落后计数， 致死率的选择： 诱变育种中，致死率是一个关键因素。本实验中采用化学诱变剂结合超声波诱变，选 择终致死率为9 0 。 第二章超声波辅助弧硝基胍诱变提高c o d 酶产率 初筛： 设计了三种专用的筛子：1 ) 透明圈法。在选择培养基a 上，接种诱变处理过的菌株， 经完全培养后，以菌落周围的透明圈大小为考察因素，选择突变株透l 矧翌比出发菌株大的 单菌落，采用发酵培养基考察c o d 产率。2 ) 加酶显色法。在选择培养基b ，接种诱变处 理过的菌株经完全培养后，观察菌落周围的红色明显和透明圈较大的单菌落，选择红色明 显和透明圈大的突变株，采用发酵培养基考察c o d 产率。3 ) p h 指示剂法。在选择培养 基c 上，接种诱变处理过的菌株经完全培养后，观察菌落周围的颜色变化和透明圈大小， 选择颜色变化明显和透明圈大的突变株，采用发酵培养基考察c o d 产率。 复筛： 以初筛的菌种为出发菌种，接种于完全培养基，3 0 ，2 4 h 培养后，接种于发酵培养 基中，3 7 ，3 6 h 培养，检测其发酵酶活。确定其突变类型。具体如下： 采用试管培养：配制发酵培养基，分装于( 1 5 m 1 ) 小试管中，灭菌。将初筛后的菌种， 接一环于对应的发酵培养基的试管中，以硅胶塞封闭，固定于摇床上。于2 2 0 r m i n ，3 7 摇床培养，3 6 h 。检测胆固醇氧化酶活力，酶活较高则保留菌种，作进步复筛。 2 2 结果与讨论 2 2 1 甾短杆菌d g c d c 一8 2 诱变条件研究 出发菌株一步生长曲线： 按2 1 2 2 实验方法作甾短杆菌一步生长曲线，如图2 1 ，由图可以看出培养1 2 h 后 菌体已经生长到对数生长期末期。 o 7 0 6 型o5 装 蝥o4 目 昌o 3 蓦 。o 2 0l 0 1 0152 02 5 图2 1 出发菌株一步生长曲线 f i g2 - 1t h eo n e - s t e pg m 、v t hc u r v eo f i n a u g u r a ls t a r i n s 7 江南大学硕= l 学位论文 诱变方法的选择： 为选择较优的诱变方法，以致死率为指标，考察了超声波、亚硝基胍以及超声波联合 亚硝基胍三种手段处理甾短杆菌的效果，其致死率随处理时间的变化曲线见图2 2 。由此 可见，三种诱变手段的致死率随时间延长而增大，其中复合诱变强度最高，所以为了获得 较好的诱变效果，选取超声波联合亚硝基胍作为诱变方案。 琶 褂 碌 旃 1 0 0 6 0 2 0 o 01 02 03 04 05 0 时间( i n ) 超声波诱变致死率- 亚硝基胍诱变致死率复合诱变致死率 图2 2 不同诱变方法处理出发菌种致死率 f i 9 2 - 2t h ed e a t hr a t eo fi n a u g u r a ls t 撕n sb yd i 髓r e n tm e a n s 筛选筛子的确定： 诱变育种的筛选过程中最关键的是建立简单、准确、高效的初筛筛子。本实验为了筛 选产胆固醇氧化酶的甾短杆菌高产菌株，考察了透明圈法、指示剂法、加酶显色法三种筛 子，见图2 3 、2 4 ，经过实验发现，加酶显色法因为要在培养基灭菌后加入含有辣根过氧 化物酶的a 液，难以控制无菌，同时考虑到经济节约的原因，决定不采用。观察透明圈平 皿，发现菌落周围的透明圈已很明显，用来做初筛的筛子已经足够。观察指示剂法平皿， 发现其颜色变化和透明圈都很明显，为了使初筛筛子简单，决定采用透明圈法作为初筛的 筛子。 第二章超声波辅助亚硝麟胍诱变提高c o d 酶，批率 图2 _ 3 突变株谢落透l 川剐 f 1 92 3t h e 廿a n s p a r e n tc l r c l e 。fn l u t a n t 图2 4 突变株指示剂透明圈 f 培2 4t h e 廿a n s p a r e n tm d l c a t o rc l r c 】eo f m u t a n t 诱变剂量的确定： 采用业硝基胍和超声波联合处理( 方法见212 ) ，以 致死率为考察指标，实验结果见图2 - 2 。当j l 嘲j 基胍浓度为1 m g m l ，超声处理3 5 m j n 时，致死率为9 0 。敲确定复合诱变的条件为亚硝基胍i m g m l ，2 0 0 w ，5 0 k h z 超声强度， 处理3 5 m i n 。 2 2 2 甾短杆菌产c o d 高产菌株筛选 高产c o d 突变株初筛： 按2122 诱变方法，处理出发菌株，观察透明圈，选择f j2 0 0 个透明闺较大的单菌落 以其作为进一步复筛用菌株。 高产c o d 突变株复筛： 选取j | j f 筛获得的2 0 0 株单菌落，按2l22 复筛方法，摇管发酵筛选产c 0 d 高产菌株 表2 1 中列出部分产酶量提高较l 蝈显的菌株。 表2 1 突变株复筛结果 t a b2 - 1r c s u l to f t h em u t a l l ts e l e c ta g a l n 江南大学硕士学位论文 从表2 1 可以看出，突变菌株产酶水平均有很大提高，其中2 5 ”菌种产酶活力最高，增 加了1 4 0 ，比产酶率提高了1 2 7 。超声波与亚硝基胍复合诱变育种的突变机理可能在于： 超声波作用时产生空化作用，瞬间产生高温高压，空穴湮灭时产生大量氧自由基、离子， 发生复杂的声化学反应，能作用于微生物的遗传物质，引起突变【3 4 q ”，亚硝基胍作用于菌体 遗传物质，引起突变【3 8 划】；同时。这样超声波照射时的生物学效应与亚硝基胍协同作用， 产生了更强的突变效果，提高了高产菌株的筛选得率。这种复合诱变方法目前很少见相关 报道，本实验室研究人员汪建军等曾采用超声波与亚硝基胍联合诱变的手段处理乳酸脱氢 酶生产菌 4 2 1 ，获得了较好的诱变效果。本实验采用超声波辅助亚硝基胍诱变育种，取得了 良好的诱变效果，产酶活力比出发菌株提高了1 4 0 。通过重复实验验证，2 5 4 菌株产酶能 力较稳定，进一步实验中以2 5 4 菌株做分析鉴定。 2 2 3 突变株生理生化鉴别与遗传稳定性研究 甾短杆菌诱变谱系： 出发菌株己通过紫外线、亚硝基胍、”c o 等一系列诱变方法处理，突变株产酶能力均 获得不同程度的提高 2 甜，结果如表2 2 。分析菌株的诱变谱系可以看出，随着突变菌株产 酶活力的提高，继续采用单因素诱变方法取得的突变效果有限，这可能是多次诱变后，这 些诱变方法能达到的突变效果接近极限，较难筛选出正突变更高的菌株，需要选用新的诱 变方法来提高菌株产酶活力。 表2 2 甾短杆菌诱变谱系 1 、a b2 - 2t h ep e d i g r e eo f b 胛v f 6 口c f p r i 姗s p 突变菌株的生理生化鉴定： 通过筛选得到的菌株与出发菌株相比，菌落形态特征有了很大变化。出发菌株生长前 期为乳白色菌落，边缘整齐，表面光滑、潮湿，后期颜色转变为棕黄色。2 5 4 突变株生长期 均为鲜红色，菌落边缘整齐，表面光滑、潮湿，见图2 5 、2 6 。 第二章超声波辅助硝蛙胍诱变提高c o d 酶产率 图2 6 发株菌落 f l g2 6f 1 9 u r eo fi n a u g u m ls t a n n s 阁2 5 突变株蕊落 f 1 9 2 5f i g u r eo f m u t a n ts t a r m s 为鉴定其突变类型选择了部分特征培养慕进行，e 理生化鉴定，从表2 3q - 一可以看出， 与出发菌株棚比，突变株的生理生化特征没有i 删显变化，日前可以确定其突变为产酶提高 型和1 抒落颜色变化的形态突变型，该砸产酶菌株目前没有见到公开报道，故命名为 b r e v z 6 “c ，g r ，“ms dd g c c n 一2 5 。 表2 3 突变株生理生化鉴定 t a b2 3i d e n t l 母o f t h em u t a n t + 为i 0 _ i j 或p 日i ，为1 、 i j j 或引性 诱变菌株遗传稳定性实验： 从表2 4 可以看f 1 ，该诱变菌种经过八次传代接种后，每次发酵水平相差不大，故可 以得出结论，该1 ：| ；f 种遗传稳定性较稳定。 表2 4d g c c n 一2 5 遗传稳定性实验 1 、a b2 - 4h e r e d j t a r ys t a b t ye x p e n m e n to f d g c c n - 2 5 江南大学硕士学位论文 2 2 4d g c c n 一2 5 与出发株发酵特性比较 为了考察诱变菌株与出发菌株发酵产酶过程的不同，将它们分别采用采用发酵培养基 发酵，检测c o d 产率变化，同时测定发酵液菌体浓度、残胆固醇的变化，结果见图2 7 、 2 8 、2 9 。 。 ” 发酵蔷问( h ) 6 。” 一一出发菌株发酵残胆固醇一一诱变菌株发酵残胆固醇 图2 7d g c d c 一8 2 与d g c c n 一2 5 发酵胆固醇比较 t 曲2 7c o m p a r eo ff e r m e n t a t i o nc h o l e s t e m l b e t w e e nd g c d c _ 8 2a n dd g c c n 2 5 5 4 33 3 蚓 垃2 魍 。2 0 发酵筹间( h ) 6 。8 。 + 出发菌株菌体量一一诱变菌株菌体量 图2 8d g c d c 8 2 与d g c c n 一2 5 发酵菌体量比较 f i g2 8b i o m a s sp r o d u c e df r o md g c c n 一2 5a n dt h ei n i t i a ls i r a i n 比较图2 - 7 至2 9 可以看出，突变株与出发菌株相比，产酶高峰提前约6 h ，产酶强度 o 5 o 5 o 5 0 3 2 2 1 1 3 ) 。 ： m备一趴回型甜肇*鄂。 第二市趟声波辅助弧硝基胍诱变提商c o 【) 酶产率 提高约1 4 0 ，干菌体量到略有提高，到3 6 h 产酶高峰时发酵液残胆固醇含量下降约o 6 9 l 。 这表明诱变菌株的产酶特性发生改变，菌体量略有增多，菌株产c o d 活力提高，利用胆 固醇的效率提高。 ：。9 姜 藿” 发酵时间( h ) 一出发菌株产c 0 d 酶活一一诱变菌株产c 0 d 酶活 图2 9d g c d c - 8 2 与d g c c n 2 5 发酵产c o d 比较 f i g2 9c o i n p a r eo f p r o d u c t i o nc o db e t w e e nd g c d c 8 2a n dd g c c n - 2 5 2 2 5d g c c n _ 2 5 所产红色素的初步分析 研究中，发现突变株( b 旭v i 6 口c 地，m 印d g c c n 2 5 ) 菌落颜色变化与发酵产c 0 d 有 关联( 见表2 5 ) 。1 6 “、1 5 1 “菌落呈粉红色，发酵复筛产酶约为0 8 u m l ，而1 2 0 “、2 5 ”菌株 单菌落颜色分别为橘红色、鲜红色，其发酵复筛产酶约为1 o 、1 2 u m l 。因此推测菌落颜 色与发酵产c o d 有关联，菌落红色越深，发酵产酶越高。为了进一步研究此红色物质， 将出发菌株与诱变菌株发酵产酶结束的菌体按2 1 2 1 高效液相方法处理，采用高效液相系 统进行纯化，分析，结果见图2 1 0 、2 1 1 。 表2 5 突变株菌落颜色与产c o d 比较 t a b 2 - 5c o m p a r eo f t h em u t a n tb e t w e e nc 0 1 0 ra 1 1 dp m d u c i i o nc o d d g c c n 2 5 与出发菌株产色素全波长扫描图： 为了分析菌株产色素特性，进行了菌株产色素全波长扫描分析，实验方法见2 1 2 1 突 江南大学硕士学位论文 变株红色物质提取与全波长扫描分析方法，结果见图2 1 0 。 2 0 02 5 03 0 03 5 04 0 04 5 05 0 0 5 5 06 0 06 5 0 波长( n m ) + d g c c n 一2 5 色素吸光值+ 出发菌株色素吸光值 图2 1 0 出发菌株与d g c c n 一2 5 产色素吸收光谱 f i g 2 - 1 0u v v i sa b s o r p t i o ns p e c t r ao f p i 舯e n to f i n i t i a is t r a i na n dd g c c n 一2 5 由图2 - 1 0 可知，出发株d g c d c 一8 2 与突变株d g c c n 一2 5 产色素在2 8 0 m 处均有最大 吸收峰，由色素提取方法可排除菌体核酸及蛋白质的影响。结合参考文献分析4 3 删这可能 是该色素分子内含有共轭双键结构、环状结构，估计现出红色，并具有紫外吸收。 高效液相色谱分析： 由图2 1 l 、2 - 1 2 可以看出，出发菌株与诱变菌株都产色素，诱变菌株当量菌体色素含 量高于出发菌株，其高效液相色谱图峰面积比值达到1 2 ：l ，推测这可能与诱变处理后， 菌株的代谢途径改变有关。红色物质与产酶正相关，可能为产酶代谢途径中的关联物，诱 变菌株产酶提高的同时，红色物质的积累量也在增多，目前尚未见报道。 1 4 第二币超声波辅助亚硝基胍诱变提商c o d 酶产率 图2 11d g c d c - 8 2 产甾杆橘红色素高效液相色谱圈 f i g2 一1 1h p l cf o rb r e v i b a c t e r i u mc h r y s o i d i n ep i g m e n t o fd g c d c 8 2 图2 1 2d g c c n 2 5 产甾杆橘红色素高效液相色谱图 f i g2 1 2h p l cf o rb r e v i b a c t e r i u mc h r y s o i d i n ep i g m e n to f d g c c n 2 5 红色物质液质联用色谱图： 红色物质经高效液相优化条件后为了进一步研究其分子量，按2 1 _ 2 液质联用方法作 了分子量分析，由图2 1 3 可以得出，该红色物质分子量可能为7 9 2 ，图谱上的分子量条带 江南大学硕士学位论文 显示了溶液中有3 8 5 、4 0 7 、4 3 9 、5 9 0 、7 9 2 一系列条带，而最低的分子量为3 8 5 ，谱带分 析，3 8 5 的二倍加上n a 原子的分子量，减去一个质子的分子量即为7 9 2 ，因此推测该红色 物质分子量可能7 9 2 ，其可能是分子量为3 8 5 的分子的共聚体，中间的分子量条带则可能 是其被打断的分子片断。 2 0 03 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 08 0 0 9 0 01 0 0 0 图2 1 3 甾杆橘红色素液质联用色谱图 f i g 2 - 1 3l c m sf o rb r e v i b a c t e r i u mc h r y s o i d i n ep i g 印e n t o f d g c c n - 2 5 实验考察了d g c c n 一2 5 产红色物质的部分理化性质，发现其溶解于水，乙醇，甲醇， 异丙醇，不溶于氯仿、环己烷、乙醚，色调的p h 稳定好，耐热性强，长时间经阳光直射 可褪色，结晶品溶于水，不受过氧化氢、维生素c 、亚硫酸钠等氧化剂还原剂的影响。 目前据报道的微生物产的红色色素【4 “6 】主要有b 一胡萝h 色素，主要生产菌为盐藻 ( d “ 甜括， 淞日砌d ) ，其相对分子量为5 3 8 。不溶于水，几乎不溶于甲醇、乙醇1 4 “驯：红曲 色素，相对分子量为3 5 4 、3 8 2 ，主要生产菌为红曲霉( 胸 甜c 淞