（微生物学专业论文）产喜树碱内生真菌的分离、鉴定及生物学活性研究.pdf

贵州大学硕上学位论文 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。 对本文的研究在做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确 方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名： 炉日期：盟弘 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解贵州大学有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅；本人授权贵州大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 敞作者虢弓舷糊签覆嘉鹊期：学 贵州大学硕士学位论文 摘要 在贵州省喀斯特地区生长的喜树组织中筛选了8 0 多株内生真菌，包括根， 茎，叶和果实。其中地上组织的内生真菌较丰富，种类较多。8 0 多株内生真菌 经过扩大培养，分别将菌丝和发酵液用薄层层析、高效液相色谱、质谱分析，证 明内生真菌株菌株s 1 9 产喜树碱。对s 1 9 进行了形态学研究，s 1 9 的产孢结构、 菌落形态符合镰刀属的分类特征。进一步提取s 1 9 菌株的基因组，对其核糖体基 因居间序列( i t s ) 进行了分析，经聚类分析表明，s 1 9 属于镰刀属的腐皮镰刀 菌种。 对s 1 9 发酵液所产喜树碱的产率进行了分析，结果表明，培养第四天s 1 9 产喜树碱的得率最高，喜树碱的产量为7 4 + 0 4 8t t g 喜树碱g 干菌丝，四天后每 升菌液中喜树碱的含量为8 9 6 士o 3 4 毫克喜树碱。 对s 1 9 所产喜树碱的生物学活性进行了研究。经观察，从s 1 9 菌株中提纯的 喜树碱作用2 4 小时可使非洲绿猴肾细胞( v e r o ) 皱缩，细胞膜呈泡状，细胞从 瓶壁大量脱落；采用荧光染色法( a o e b ) ，对s 1 9 所产喜树碱引起v e t o 细胞 的凋亡率分析证明，作用7 2 小时，细胞的凋亡率为1 3 ，并且s 1 9 喜树碱的作 用剂量和时间与细胞的凋亡率呈线性增加关系。因此s 1 9 菌株提取的喜树碱具有 使非洲绿猴肾细胞调亡的作用。 进一步对s 1 9 喜树碱致前列腺癌细胞凋亡的作用机制进行了研究。采用 c a s p a s e - 3 抗体经w e s t e r nb l o t 分析，表明s 1 9 感染前列腺癌细胞4 8 小时，细 胞总蛋白提取物中呈现c a s p a s e 3 阳性显色条带，分子量3 5 k d 。表明s 1 9 喜树 碱致前列腺癌细胞凋亡的作用机制是通过c a s p a s e - 3 途径实现的。 关键词：喜树碱；内生真菌；核糖体内部转录序列；细胞凋亡 2 贵州大学硕士学位论文 a b s t r a c t at o t a lo f8 0i s o l a t e so fe n d o p h y t i cf u n g iw e r ei s o l a t e df r o mt h ec a m p t o t h e c u a c u m i n a t ei nc a r t a g e n a t e r r i t o r yg u i z h o up r o v i n c ei nt h i ss t u d y t h r o u g hs t e r i l i z i n gt h e s u r f a o 。o ft h et i s s u eo fc a m p t o t h e c ua c u m i n a t e ，w es c l e e f f le n d o p h y t i cf u n g if r o m b r a n c h ，l e a f , f r u i t ，r o o t m o s to ft h e mf r o mu p g r o t m dt i s s u ea r ca b u n d a n ti n k i n d s c o m p o u n dc p tw a si d e n t i f i e db ym e a n so ft l c ，h p l ca n de l e c t r i cs p r a ym a s s s p e c t r o m e t r ym e t h o d s a m o n gt h e8 0s t r a i n se n d o p h y t i cf u n g i ，o n es t r a i ns 1 9p r o d u c e d t h ea n t i e a n c e rd r u gl e a dc o m p o u n dc p t w ed e s c r i b et h ef e a t u r eo fs 1 9b a s e do nt h e m o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so ft h ec o l o n ya n dc o n i d i ao ft h ef u n g u s t h es 1 9w a s b e l o n g e dt of u s a r i u mf a m i l y t o t a ld n aw a si s o l a t e df t o mt h em y c e l i a lm a s s t h o u g h a m p l i f i c a t i o na n dc l o n e ，w eg i v et h ef i n a la l i g n m e n t s 1 9b e l o n g st ot h es p e c i eo f f u s a r l u ms o l a n i ，t h r o u g hi n d i f i c a t i o no f f e a t u r ea n dm o l e c u l a rm e t h o d s t h ec u l t u r e dh y p h aw a sm o v e dt ol i q u i dp d aa n dc u l t u r e da t2 9 c t h em a x i m u m y i e l do f c a m p t o t h e e i nw a s7 4 士o 4 8 u g l go f d r yc e l lm a s so nd a y4i ns h a k ef l a s k s t h e m a x i m u m # o l do fc a m p t o t h e e i nw a s8 9 6 士0 3 4 m gi np e rl i t e rl i q u i df i | i l g a lc u l t u r eo n d a y 5 w eh a v er e s e a r c h e dc p tf r o ms 1 9f o rc e l l s a f t e r2 4h o u r s ，t h et y p i c a la p o p t o t i c m a n i f e s t a t i o n so b s e r v e di na d h e r e n tc e l l s i n c l u d i n gc e l ls h r i n k a g ea n dm e m b r a n e b l e b b i n gw e r ee v a l u a t e d s ow eg n a a st h ec p tc a l lm a k et h ev e i oc e l l sa p o p t o t i s e d f r a g m e n t a t i o no fc e l ln u c l e ii nr e s p o n s et oc a m p t o t h e c i nt r e a t m e n t c e l l sw e r es t a i n e d w i t ha o e b t h ea p o p o t o s i sr a t ew e r e1 3 t i m ea n dc o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n ta p o p t o t i c r a t i oi nv e r oc e l l sf o l l o w i n gi n c u b a t i o nw i t hc a m p o t h e c i n t oi n v e s t i g a t et h e a p o p t o t i cm e c h a n i s m s ，w eu s e da n t i b o d yc a s p a s e 一3 f o r w e s t e n b l o ta f t e re x t r a c t i n gt h ee x p r e s s i o np r o t e i nf r o mp c 3c e l l sw h i c ht r e a t e dw i t h c p ti n4 8h o u r s t h ec a s p a s e 3a b o u t3 5 k dd i dh a v eas i g n i f i c a n te x p r e s s i o ni n w e s t e n b l o ta s s a y s ow ec a nc o n c l u d e dt h a ta l x r p t o t i cm e e h a n i s n 鸭o fc f tf r o ms 1 9 t op c 3c e l l sf o ra p o p t o s i sw a sf o l l o wt h ew a yo f c a s p a s e - 3 k e yw o r d s ：c p t e n d o p h y t i cf u n g i ；f r s ；a p o p t o s i s ； 3 贵州大学硕士学位论文 1 前言 1 1 喜树植物内生真菌的有益次生代谢产物 根据内共生理论，内生真菌可能产生与宿主相同或相似的次生代谢产物，而 药用植物是中药的重要来源，因此药用植物的内生真菌可能产生与中药相同或相 似的化合物( 刘芸，2 0 0 5 ) 。根据这一观点，药用植物内生真菌一直是近年来筛 选一些重要医用药物的理想途径，特别是生产成本高、价格昂贵或其它途径不易 得到的药物。近年来在植物内生真菌中发现的有益次生代谢产物的结构类型主要 有：萜类、黄酮类、异香豆素类、醌类、生物碱类、苯并呋喃类、多肽类、甾体 化合物等( 宋云龙，2 0 0 5 ) 。内生真菌可产生与宿主相同或相似的活性物质，但 更容易从内生真菌中筛选到新化合物。研究显示从内生真菌中分离的5 1 生物活 性物质是新化合物( 张永杰，2 0 0 2 ) 。 对植物内生菌的定义_ 直争议较多，b a c o n 和w h i t e ( 张集慧，1 9 9 9 ) 作出了 一个较普遍接受的定义：植物内生菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活 于健康植物组织内部或细胞间隙、不引起植物产生明显病症的微生物。植物与其 内生菌构成了稳定的共生关系。植物茎和叶的化石提供的证据表明，植物与其内 生菌之间的内生关系早在高等植物出现在地球上的时候就已存在了( 陈连庆， 1 9 9 9 ) 。在植物与内生菌长期的协同进化，建立了独特的遗传与代谢关系( 王梅 霞，2 0 0 3 ) 。由于植物与内生菌相互间基因交换的结果，使内生菌具有产生某些 与植物相同或相似化合物的能力，因此，可作为天然活性物质的重要来源( 王梅 霞，2 0 0 3 ) 。地球上有数十万种植物，每一种都有一种或多种内生菌与之共生， 但只有几百种植物的内生菌被较为全面的研究过。因此，从大量未研究过的植物 中发现新内生菌种的机率较高( 郭仕平，2 0 0 4 ) 。而新物种通常都会有新的功能 基因，新基因又意味着新的天然产物( 李雪玲，2 0 0 4 ) 。研究表明，近来发现的 新的生物活性物质有5 1 分离自内生菌的新物种，而仅有3 8 来自土壤微生物( 曾 松荣，2 0 0 4 ) 。最容易分离到的内生菌是真菌和细菌( 史央，2 0 0 2 ) 。 1 2 国内外分离内生真菌的种类及其生物活性物质 药用植物内生真菌的多样性全世界现已发现6 9 0 0 0 多种真菌，而且每年还以 1 0 0 0 余种的新种递增，保守估计全世界真菌总数可达1 5 0 万余种( 马玉超，2 0 0 3 ) 。 4 贵州大学硕士学位论文 从目前已经研究过的植物来看，未发现没有分离到内生真菌的，因此可以推断内 生真菌在植物体内是普遍存在的( 姜广策，2 0 0 0 ) 。抗癌药物紫杉醇被发现后， 2 0 0 3 年，陈毅坚等从云南红豆杉树皮和枝条中分离得n 5 2 株内生真菌，其中有1 9 株经t l c ，h p l c 分析产紫杉醇，产量在万分之一以上的有8 株( 辛小燕，1 9 9 8 ) 。 刘晓兰等研究了东北红豆杉中树状多节孢( 我国新记录属) h q d 3 3 的发酵工艺，初 期培养产生的紫杉醇量为5 1 0 6 1 2 5 7 u g l ，后经几年的菌种选育和发酵工艺条 件研究，现产量达4 4 8 5 2 u g l 。j a m ut a w i 等从印度西海岸假柴龙树分离得n 1 株内生真菌( 徐成东，2 0 0 2 ) 。半合成培养基中，9 6 d , 时摇床培养，干菌丝最大 产生的喜树碱是0 5 7 5 + - 0 0 3 1 m g l o o g 在生物反应器4 8 d , 时培养，干菌丝最大 产生的喜树碱是4 9 6 + 一0 7 3 m g 1 0 0 9 ( 梅文莉，2 0 0 6 ) 。张集慧等从红豆杉内 生真菌一粘帚霉属真菌菌丝体中分离出3 种化合物，并已经进行了结构的鉴定 郭波等从云南长春花植株中分离出2 1 株真菌，其中有4 株产长春新碱类似物，它 们分属于镰刀菌属( f u s a r j u m ) 、交链孢属( a i t e m a r i a ) 和无孢菌群( m y c e l i a s t e r i l i a ) 等( 梅文莉，2 0 0 6 ) 。李海燕等从桃儿七植株共分离得j ! u 2 8 株真菌， 其中，有2 株产鬼臼毒素类似物，它们分属于青霉属( p e n i c i l l i u r a ) 和交链孢属 ( a l t e m a r i a ) ( 邱明华，1 9 9 7 ) 。王梅霞等用常规组织分离法从银杏中分离获得 了3 3 株内生真菌，其中有1 株能明显的产生银杏黄酮类化合物( 苏应娟，1 9 9 5 ) 。 张玲琪等从云南美登木的老树叶中分离筛选出球毛壳菌，从该菌的发酵产物中提 取出抗癌活性物质球毛壳甲素a ，这表明，植物内生真菌不但能产生与宿主相同 或相似的抗癌活性物质，有些还能产生与宿主植物不同的活性成分( 罗文英， 1 9 9 7 ) 。并且，姜广策等从几种南海红树林分离到的内生真菌中筛选出l 株内生 真菌( n o 1 0 4 3 ) ，初步鉴定表明该菌与灰黄青霉菌没有亲缘关系，但是该菌为灰 黄青霉素的产生菌，产量还很高( 张虹，2 0 0 3 ) 。可见，筛选是多方面的，不仅 仅是局限于与宿主相同或相似的生理活性成分( m j a c o b ，2 0 0 0 ) 。我国药用植物 资源丰富，有记载的药用植物1 1 0 2 0 种，隶属2 3 1 3 属、3 8 3 科，约占药资源总数的 8 7 。但目前能进行人工栽培的药用植物仅4 0 0 多种，绝大多数的药用资源来源于 野生种类。尤其是近年来，人类对药物特别是天然药源药物的需求量剧增( d s i v a s u n d a r ak u m a r a ，2 0 0 4 ) ，在经济利益的驱使下，使一些药用植物资源被掠夺式采 挖，加上乱垦滥伐、过度放牧和其它原因，造成一些野生药用植物丧失了合适的 贵州大学硕士学位论文 生长环境和正常的繁育能力，不少野生种类的蕴藏量急剧下降，甚至濒临灭绝， 同时也造成了一些药物价格昂贵、供不应求，为了解决某些药用植物生长缓慢、 资源紧张等因素带来的药源紧张和生态破坏问题，许多药用植物已被开展内生真 菌研究，主要研究方向为从这些药用植物内生真菌中发现与宿主相同或相似的药 物，以及新的活性化合物，或者内生真菌对宿主的有益作用方面( s c h u l z b 1 9 9 3 ) 。这些工作主要集中在我国和泰国。据不完全统计，除了分离出产生紫 杉醇内生真菌的药用植物外，至少有1 3 4 种的药用植物被研究过内生真菌。己从 4 4 科8 2 种药用植物中分离出大量内生真菌，并将这些内生真菌在5 种不同培养基 的菌落形态照片和生物活性测定结果公布在互联网上( js f i e r l ea ，1 9 9 3 ) 。 1 3 喜树碱的结构及喜树碱的药理作用机制 c h l 田ic p t 峙构置囊性譬序 1 3 1 喜树碱的结构 ( 图1 ) 通常认为，喜树碱类化合物a 、e 环是最重要的药效团，但e 环结构保守： 为了提高活性、改善药代动力学行为，多在a 环进行结构改造( w a n gjf ，2 0 0 0 ) 。 1 3 2 喜树碱的药理作用机制： 喜树为珙桐科乔木植物，中国特有植物，其次生代谢产物喜树碱、羟基喜树碱 类物质是拓朴异构酶i 的专属性抑制剂( h u a n gyj ，2 0 0 1 ) 。拓扑异构酶是生物体 内广泛存在的一类必需酶，参与d n a 复制、转录、重组、修复等所有关键的核内 过程( w i l s o nd ，1 9 9 5 ) 。该类酶通过调节超螺旋、连锁、去连锁以及核酸解节 ( u n k n o t r i n g ) 作用，影响d n a 拓扑结构。因此，明确该酶的体内功能，理解它们 发挥作用的分子机制，不仅对基础研究，而且对探讨它们作为抗癌药靶酶的作用 都是很重要的。近年来，已有许多化合物显示具有干扰原核或真核拓扑异构酶的 活性，其中少数高活性化合物已用于治疗癌症，并且显示了很好的治疗潜力。已 知拓扑异构酶主要有2 大类：拓扑异构酶i ( t o p o i s o m e r a s ei ，t o p oi ) 与拓扑异 构酶l i ( t o p o i s o m e r a s ei i ，t o p oi ) 。其中t o p oi i 与多药耐药( m d r ) 有关。随着 6 贵州大学硕士学位论文 t o p oi 特异性抑制剂喜树碱及其类似物在临床中广泛应用，作用于t o p oi 的抑制 剂越来越受到人们的重视。目前美国国家癌症研究所( n c i ) 药物机制分析电脑网 络系统已将t o p oi 抑制剂列为重点研究的6 大类抗肿瘤药物之一。最近的研究表 明，c p t 并非通过抑制t o p ol 的催化活性而起到杀死癌细胞的作用，而是通过与 t o p oid n a 可裂解复合物( c l e a v a b l ec o m p l e x ) 可逆结合，形成c 阡t o p oi d n a 三元复合物，从而稳定了可裂解复合物，形成“路障”( r o a db l o c k e r ) ，使复制 叉( r e p l i c a t i o nf o r k ) 不能进行下去，从而导致细胞的死亡( 李铭刚，2 0 0 3 ) 。然 而c p t 并不能在t o p oi 的所有切割位点捕获可裂解复合物( 李桂玲，2 0 0 1 ) 。c p t 诱导的复合物除具有t o p oi 切割位点的共性即一1 位为t 外，还具有碱基偏好性。 c p t 强烈倾向于捕获+ l 位为g 的t o p oi 的切割位点( jr i v o r ylp ，1 9 9 5 ) 。更换寡 聚核苷+ 1 位的碱基试验表明，当十1 位是g 时，诱导切割的活性最大，t 时最小，a ， c 居中( c h a v a nsp ，2 0 0 4 ) 。因此，c p t 很可能与该碱基作用。7 一c h ：c l l o ， 1 1 0 c h ：o - c p t 的交联试验进一步表明c p t 与切割位点+ 1 位的碱基( 最好是g ) 相互 作用( ap g o r y c k ipd ，1 9 9 9 ) 。这一切都表明，c p t 通过与t o p oi 裂解复合物中 的d n a 断裂位点处的残基相互作用而使复合物稳定( r o t hj ，1 9 8 6 ) 。 1 4 凋亡过程 喜树碱并且是迄今为止发现的唯一专门通过抑制拓扑异构酶i ( t o p oi ) 发挥 细胞毒性的天然植物活性成分，使细胞内染色体复制时受阻，尤其针对复制较快 的癌细胞( 杨显志，2 0 0 4 ) 。此类抗癌药疗效高，抗瘤谱广( w a g e n a a rm m ，2 0 0 0 ) 。 更重要的是，由于多种肿瘤细胞，特别是结肠癌、宫颈癌、卵巢癌等的t o p oi 含量大大高于正常组织，尤其在s 期肿瘤细胞中活性大幅提高，因此抑$ 0 t o p oi 的药物可以选择性抑制增殖期肿瘤细胞d n a 复制，具有较好的选择性( h z o uwx ， 2 0 0 0 ) 。染色体复制受阻作为凋亡信号诱导下游基凼的活化，如c a s p a s e 家族等 进一步促进凋亡( l ijy ，1 9 9 8 ) 。细胞凋亡机理：1 9 7 2 年k e r r 等三位科学家首次 提出了细胞凋亡的概念( 黄量，1 9 8 8 ) 。细胞凋亡( a p o p t o s i s ) 又称为程序性细 胞死亡( p r o g r a 胁e dc e l ld e a t h ，p c d ) ，是在内源性或外源性刺激下发生的生 理性细胞死亡，是细胞固有的主动消亡机制，是在进化上高度保守的细胞自杀， 是细胞的自稳平衡机制( jf a e t hsh ，1 9 9 7 ) 。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞 凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程；它并不是病理条件下，自体损伤的一 贵州大学硕士学位论文 种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程( 陈抗亨，1 9 9 4 ) 。 细胞发生凋亡时，就像树叶或花的自然凋落一样。细胞散在的、逐个地从正常组 织中死亡和消失，机体无炎症反应。坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引 起细胞无序变化的死亡过程( 甘烦远，1 9 9 4 ) 。表现为细胞胀大，胞膜破裂，细胞 内容物外溢，核变化较慢，d n a 降解不充分，引起局部严重的炎症反应( 邱德 有，1 9 8 4 ) 。 1 4 1 细胞凋亡的过程 细胞凋亡的过程大致可分为以下几个阶段： 接受凋亡信号一凋亡调控分子问的相互作用一蛋白水解酶的活化一进入连续反 应过程( s t i e r l ea ，1 9 9 3 ) 。 1 4 1 1 凋亡的启动阶段 细胞凋亡的启动是细胞在感受到相应的信号刺激后胞内一系列控制开关的 开启或关闭( 郭波，1 9 9 8 ) ，不同的外界因素启动凋亡的方式不同，所引起的信号 转导也不相同，客观上说对细胞凋亡过程中信号传递系统的认识还是不全面的， 目前比较清楚的通路主要有( k i m d k ，2 0 0 0 ) ： 1 ) 细胞凋亡的膜受体通路( g o l s t e i n p ，1 9 9 7 ) f a s 受体( f a s l i g a n d ，f a s t , ) 和肿瘤坏死因子( t u m o m e c r o s e f a c t o r , t n f ) 等死亡受 体介导的天冬氨酸特异半胱氨酸蛋白酶( c y s t e i n e a s p a r t a t e s p e c i f i c p r o t e a s e ， c a s p a s ) 激活途径。与c a s p a s e 活化有关的细胞表面受体主要是t n f 神经生长因子 ( n e r v e g r o w t h f a c t o r , n g f ) 受体家族成员；与死亡受体的配体主要有f a s l 、t n f 、 肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体( ( t u m o m e c r o s i s ( t n f ) 一r e l a t e da p o p t o s i s i n d u c i n g l i g a n d ，t r a i l ) 等( 0 m a rs ，1 9 8 7 ) 。受体与这些配体结合后，可使这些蛋白寡 聚化形成传递信号的活性形式一三聚体，f a s 和肿瘤坏死因子受体( r u m o r n e c r o s i s f a c t o r l e c c p t o r ，t n f r ) 等通过死亡结构域( d e a t h d o m a i n ，d d ) 诱导具有同源d d 的 f a s 相关死亡域蛋白( f a s a s s o c i a t e d w i t h d e a t h d o m a i n p r o t e i n ，f a d d ) 募集，f a d d 和c a s p a s e - 8 酶原形成一个死亡诱导信号复合物( d e a t h i n d u c i n gs i g n a l i n gc o m p l e x ， d i s c ) ，进一步水解c a s p a s e - 8 酶原使其被激活( o t m a rs ，1 9 8 7 ) 。 2 ) 细胞色素c 释放和c a s p a s e s 激活的生物化学途经 细胞色素c ( c y t o c h r o m e c ，c y t o c ) 从线粒体释放是细胞凋亡的关键步骤 贵州大学硕士学位论文 ( g r e e n d r ，1 9 9 8 ) 。释放到细胞浆的c y t o c 在d a t p 存在的条件下能与凋亡相关因 子1 ( a p o p t o t i cp r o t e a s ea c t i v a t i n gf a c t o r - 1 ，a p a f 1 ) 结合，使其形成多聚体，并促 使c a s p a s e 一9 与其结合形成凋亡小体，c a s p a s e 一9 被激活，被激活的c a s p a s e 一9 能激活其它的c a s p a s e 如c a s p a s e 一3 等，从而诱导细胞凋亡( 郑珍贵，1 9 9 6 ) 。此 外，线粒体还释放凋亡诱导因子，如诱导凋亡因子( a p o p t o s i si n d u c i n gf a c t o r ， a i f ) ，参与激活c a s p a s e ( 范容秀，1 9 8 9 ) 。 1 4 1 2 凋亡的执行 细胞凋亡的过程实际上是c a s p a s e 不可逆有限水解底物的级联放大反应过 程。 c a s p a s e 的活化是有顺序的多步水解的过程，c a s p a s e 分子各异，但是它们 活化的过程相似。首先在c a s p a s e 前体的n 一端前肽和大亚基之间的特定位点被 水解去除n 一端i j i 肽，然后再在大小亚基之间切割释放大小亚基，由大亚基和小 亚基组成异源二聚体，再由两个二聚体形成有活性的四聚体。去除n 一端前肽是 c a s p a s e 的活化的第一步，也足必须的，但是c a s p a s e 一9 的活化不需要去除n 一 端前肽，c a s p a s e 活化基本有两种机制，即同源活化和异源活化。发生同源活化 的c a s p a s e 又被称为启动c a s p a s e ( i n i t i a t o rc a s p a s e ) ，包括c a s p a s e - 8 ，- 1 0 ， - 9 ，诱导凋亡后，起始c a s p a s e 通过连接子( a d a p t o r ) 被募集到特定的起始活 化复合体，形成同源二聚体构像改变，导致同源分子之间的酶切i 面自身活化，通 常c a s p a s e 一8 ，1 0 ，2 介导死亡受体通路的细胞凋亡，分别被募集到f a s 和t n f r l 死亡受体复合物，而c a s p a s e 一9 参与线粒体通路的细胞凋亡，则被募集到c y t o c da t p a p a f 一1 组成的凋亡体( a p o p t o s o m e ) 。被异源活化的c a s p a s e 又称为执 行c a s p a s e ( e x e c u t i o n e rc a s p a s e ) ，包括c a s p a s e 一3 ，一6 ，一7 。执行c a s p a s e 不象启动c a s p a s e ，不能被募集到或结合起始活化复合体，它们必须依赖启动 c a s p a s e 才能活化( w i l l a m c e 等，1 9 9 9 ) 。 1 4 2c a s p a s e 的效应机制 凋亡细胞的特征性表现，包括d n a 裂解为2 0 0 b p 左右的片段，染色质浓缩， 细胞膜活化，细胞皱缩，最后形成由细胞膜包裹的凋亡小体，然后，这些凋亡小 体被其它细胞所吞噬，这一过程大约经历3 0 - 6 0 分钟，c a s p a s e 引起上述细胞凋 亡相关变化的全过程尚不完全清楚，但至少包括以下三种机制： 9 贵州大学硕学位论文 1 4 2 1 凋亡抑制物 正常活细胞因为核酸酶处于无活性状态，而不出现d n a 断裂，这是由于核 酸酶和抑制物结合在一起。c a s p a s e 可以裂解抑制物，核酸酶即可激活，引起d n a 片段化( f r a g m e n t a t i o n ) 。 1 4 2 2 破坏细胞结构 c a s p a s e 可直接破坏细胞结构，如裂解核纤层，导致细胞染色质的固缩。 1 4 2 3 调节蛋白丧失功能 c a s p a s e 可作用于几种与细胞骨架调节有关的酶或蛋白，改变细胞结构。其 中包括凝胶原蛋白( g e l s i n ) 、聚合粘附激酶( f o c a la d h e s i o nk i n a s e ，f a k ) 、 p 2 1 活化激酶a ( p a k a ) 等。 除此之外，c a s p a s e 还能灭活或下调与d n a 修复有关的酶、m r n a 剪切蛋白和 d n a 交联蛋白。由于d n a 的作用，这些蛋白功能被抑制，使细胞的增殖与复制受 阻并发生凋亡。 1 4 3 细胞凋亡的调节 细胞凋亡受到严格调控。 1 4 3 1 凋亡抑制分子： 迄今为止，已发现多种凋亡抑制分子，包括p 3 5 ，细胞因子应答修饰物a ( c y t o o k i n er e s p o n s em o d i f i e ra ，c r m a ) ，细胞凋亡抑制因子( i n h i b i t o ro f a p o p t o s i s ，l a p s ) f l i c e 抑制蛋白( f a d d l i k ei c ei n h i b i t o r yp r o t e i n s ，f l i p s ) 以及b c l 一2 家族的凋亡抑制分子。 p 3 5 和c r m a 是广谱凋亡抑制剂( 范容秀，1 9 8 9 ) 。体外研究结果表明p 3 5 以 竞争性结合方式与靶分子形成稳定的具有空间位阻效应的复合体并且抑制 c a s p a s e s 活性( h e r m e k i n g h ，1 9 9 4 ) 。 f l i p s 能抑制f a s t n f r l 介导的细胞凋亡。f l i p s 通过死亡效应结构域( d e a t h e f f e c t o rd o m a i n ，d e d ) 功能区，与f a d d 和c a s p a s e 一8 、1 0 结合，拮抗它们之间 的相互作用，从而抑制c a s p a s e 8 ，1 0 募集到死亡受体复合体和它们的起始化。 i a p s 为一组具有抑制凋亡作用的蛋白质，首先足从杆状病毒基因组克隆到，发 现能够抑制由病毒感染引起的宿主细胞死亡应答( 中草药成分化学l ，1 9 8 1 ) 。有 大约2 0 氨基酸组成的功能区，这对i a p s 抑制凋亡是必需要的，它们主要抑制 o 贵州大学硕士学位论文 c a s p a s e 3 ，一7 ，而不结合它的酶原，对c a s p a s e 则即可以结合活化的，又可结合 酶原，进而抑制细胞凋亡。 l - 4 3 2b c l - 2 家族： 这一家族有众多成员，如m c l 一1 ( m y e l o i dc e l l l e u k e m i a 一1 ，m c l 一1 ) 、n r b 、 a l 、b c l l 、b c l - x 、b a x( b c l 一2 一a s s o c i a t e d x p r o t e i n ) 、 b a k ( b c l 一2 一a n t a g o n i s t k i l l e r ) 、b a d 、b i m 等，它们分别既有抗凋亡作用，也 有促凋亡的作用。多数成员问有两个结构同源区域，在介导成员之间的二聚体化 过程中起重要作用。b c l - 2 成员之问的二聚体化是成员之间功能实现或功能调节 的重要形式( r e e d ，e ta 1 ，1 9 8 7 ) b c l 一2 生理功能是阻遏细胞凋亡，延长细胞寿 命，在一些白血病中b c l 一2 呈过度表达。 b c l 一2 的亚细胞定位已经明确，它在不同的细胞类型可以定位于线粒体、内 质网以及核膜上，并通过阻止线粒体细胞色素c 的释放而发挥抗凋亡作用。此外， b c l 一2 具有保护细胞的功能，b c l - 2 的过度表达可引起细胞核谷胱苷肽( g s h ) 的 积聚，导致核内氧化还原平衡的改变，从而降低了c a s p a s e 的活性。b a x 是b c l 一2 家族中参与细胞凋亡的一个成员，当诱导凋亡时，它从胞液迁移到线粒体和核膜。 有人研究发现，细胞毒性药物诱发凋亡时，核膜b a x 水平的上升与纤层蛋白 ( 1 a m i n ) 及多聚a d p 核糖多聚酶( p a r p ) 两种核蛋白的降解呈正相关。用b a x 寡核苷酸处理的细胞，只能特异地阻断l a m i n 的降解，对p a r p 的降解不起作用。 这种效应的调控机制目前仍然不清楚。 总之，细胞凋亡的调节是非常复杂的，参与的分子也非常多，还有很多不为 我们所知的机理需要我们一步的探索( 高压液相色谱1 ，1 9 8 7 ) 。 1 - 4 4 线粒体与细胞凋亡 线粒体是真核细胞的重要细胞器，是动物细胞生成a t p 的主要地点。线粒体 基质的三羧酸循环酶系通过底物脱氢氧化生成n a d t l 。n a d h 通过线粒体内膜呼吸 链氧化。与此同时，导致跨膜质子移位形成跨膜质子梯度和或跨膜电位。线粒 体内膜上的a t p 合成酶利用跨膜质子梯度能量合成a t p 。合成的a t p 通过线粒体 内膜a d p a t p 载体与细胞质中a d p 交换进入细胞质，参与细胞的各种需能过程。 1 4 4 1 线粒体跨膜电位的耗散与细胞凋亡有密切关系 近年来陆续有报道说明线粒体跨膜电位的耗散早于核酸酶的激活，也早于磷 贵州人学硕士学位论文 酯酰丝氨酸暴露于细胞表面。而一旦线粒体跨膜电位耗散，细胞就会进入不可逆 的凋亡过程。线粒体解联的呼吸链会产生大量活性氧，氧化线粒体内膜上的心磷 脂。实验证明，用解偶联剂m c i c c p 会导致淋巴细胞凋亡。而如果能稳定线粒体 跨膜电位就能防止细胞凋亡。 1 4 4 2 线粒体通透性转变孔道 在细胞凋亡过程中线粒体跨膜电位的耗散主要是由于线粒体内膜的通透性 转变，这是由于生成了动态的由多个蛋白质组成的位于线粒体内膜与外膜接触位 点的通透性转变孔道一一p t 孔道( 黄宗玉，1 9 9 2 ) 。p t 孔道由线粒体各部分的蛋 白质与细胞质中蛋白质联合构成。这包括细胞液蛋白：己精激酶，线粒体外膜蛋 白：外周苯并二嗪( b e n z o d i a z e p i n e ) 受体与电压依赖阴离子通道，线粒体膜问白j 隙蛋白：肌酸激酶，线粒体内膜蛋白：a d p a t p 载体，线粒体基质蛋白：亲环蛋 白d ( c y c l o p h i l i nd ) 等。细胞凋亡与线粒体的结构与功能有着密切的关系。如 果线粒体有大量p t 孔道形成，细胞a t p 浓度很快下降，则在致凋亡的蛋白酶被 活化前细胞就坏死了。而如果p t 孔道的诱导生成是一种比较缓和与持续的状态， 在细胞a t p 浓度下降前专一的蛋白酶被激活；而另一方面1 l r m 的耗散产生的超 氧阴离子则导致细胞死亡。 细胞凋亡是一把双刃剑。一方面是机体发育的正常过程，另一方面如果细 胞凋亡过速，则会导致慢性退行性病变：如果细胞不凋亡就有可能导致癌变或对 化疗的不敏感。进一步研究线粒体在细胞凋亡中的作用，有助于深入了解细胞凋 亡的机制与对疾病的防治( 发酵工艺原理1 ，1 9 9 5 ) 。 1 5 研究的目的和意义 ” 通过表面消毒法和高效液相色谱分析方法，从喜树组织中分离出产生喜树碱 的内生真菌。利用得到的喜树碱诱导非洲绿猴肾细胞系v e r o 和p c 3 细胞凋亡的 作用及其相关凋亡基因的表达。并且讨论该细胞凋亡机制。本论文研究的意义： 虽然我国药用植物种类丰富( w uf a n g - t i n g ，2 0 0 4 ) ，绝大多数为野生种类，但 由于受野生植物资源生长周期长、产量低、不可再生等限制，很难满足人类的需 要( l uj i h u a ，2 0 0 4 ) 。近年来，人类对药物特别是天然药源药物的需求量剧增 ( p r a m o dt j a i n ，1 9 9 8 ) ，在经济利益的驱使下，使一些药用植物资源被掠夺式 采挖，加上乱垦滥伐、过度放牧( l ic j ，1 9 9 4 ) 和其它原因，造成一些野生药用 1 2 贵州大学硕上学位论文 植物丧失了合适的生长环境和正常的繁育能力( s u b h a s hp c h a v a n ，2 0 0 4 ) ，不少 野生种类的蕴藏量急剧下降( p e n gz h a n g h u a ，2 0 0 4 ) ，甚至濒临灭绝，同时也造 成了一些药物价格昂贵( k e i t ha s e i f e r t ，2 0 0 4 ) 、供不应求，为了解决某些药 用植物生长缓慢、资源紧张等因素带来的药源紧张和生态破坏问题( b i a n q i n g q u a n ，2 0 0 4 ) ，许多药用植物已被开展内生真菌研究，主要研究方向为从这 些药用植物内生真菌中发现与宿主相同或相似的药物( g i a c o m od i z a ，1 9 9 9 ) ，以 及新的活性化合物，或者内生真菌对宿主的有益作用方面( d s i v as u n d a r a k u m a r ，2 0 0 4 ) 。这些工作主要集中在我国和泰国( h ，l b a r n e t tb a r r y ，1 9 7 2 ) 。 据不完全统计，除了分离出产生紫杉醇内生真菌的药用植物外，至少有1 3 4 种的 药用植物被研究过内生真菌( h a i y a nl i ，2 0 0 2 ) 。本实验通过对植物内生真菌次 生代谢产物的多样性以及其它优点研究使其有望解决部分药物供不应求的现状 通过对产喜树碱内生真菌的培养，可以产生大量的喜树碱，从而缓解从植物中提 取所引起的环境污染的压力，也进一步为筛选内生真菌提供理论依据。 对喜树碱诱导非洲绿猴肾细胞系y e r o ，p c 3 细胞株凋亡的机制进行初步的 探讨。使喜树碱的致病机制逐渐清晰，利于建立喜树碱作用细胞凋亡的分子模型， 有助于寻求疾病的新疗法。这些研究对治愈或减缓癌症，促进我国医学事业的发 展具有重要的意义。 贵州大学硕士学位论文 2 1 实验材料 2 实验材料与方法 喜树组织( 新生芽的枝、须根、生长良好的果实、完整的叶) ，马铃薯( 马铃薯 来自市场) 培养基；细胞株菌株：非洲绿猴肾细胞株细胞v e t o ，前列腺癌细胞 p c 3 细胞株购自细胞生物所； 2 1 1 试剂： 氯化钠，十二烷基硫酸钠，苯甲磺酞氟，异丙醇，过硫酸铵，甘氨酸。以上 试剂均为国产分析纯级，购白化学试剂公司。标准分子量蛋白应为北京天根生物 有限公司。 t a qd n a 聚合酶、1 0 t a qb u f f e r 、d n t p ( 购自t a k a r a ) 、r n a s ea 、肋d 1i 、 h i n di i i 、t 4 d n a 连接酶、蛋白酶k 均购自宝生物大连( t a k a r a ) 生物技术有限 公司。p m d 一1 8tv e t c o r 购自宝生物大连( t a k a r a ) 生物技术有限公司，质粒提 取试剂盒、u n i o - 1 0 柱式d n a 胶回收试剂盒为o m e g a 公司产品。质粒p m d _ t 1 9 s i m p l e 、大肠杆菌d h s a 、t g l 为本实验室贮藏载体和菌株。引物由上海博亚生物 技术有限公司合成，d n a 碱基序列由上海捷瑞生物技术有限公司测定。 琼脂，硅胶，无水乙醇。 喜树碱标准品购自四川广翰生物试剂公司 抗体：鼠抗人c a s p a s e - 3 单克隆抗体为s a n t a 公司产品。h r p 羊抗鼠i g g ( 华 美) ，h r p 为s a b