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复合酶制剂的研制及其在制革浸水中的应用 摘要 污染严重已成为制约制革工业可持续发展的最主要问题，只有 在制革过程中采用清洁技术才能改变制革污染严重的现状。针对常 规浸水方法污染严重、工艺时间长且国内浸水酶制剂依赖进口等问 题，依据浸水的目的和酶的作用原理，本研究通过筛选适合的酶、 表面活性剂和填充剂制备出复合浸水酶制剂，以达到减轻浸水工序 污染严重、工艺时间长等缺陷的目的。 以浸水液中的蛋白质吸光度、羟脯氨酸吸光度、生皮的回软程度、 黄心程度以及浸水后生皮的含水量等作为考察指标，确定蛋白酶在 浸水工序中的最适用量；分别考察杀菌剂p 1 和不同种类表面活性剂 对m 1 蛋白酶浸水效果的影响；将筛选出的表面活性剂、杀菌剂与 m 1 蛋白酶复合制备j p k 1 浸水酶制剂，并考察其应用效果。 以同样的方法分别考察了m 3 蛋白酶、m 2 蛋白酶和m 1 蛋白 酶配合浸水的应用性能，筛选出适合应用于浸水工序的蛋白酶；将 筛选出的m 3 蛋白酶和m 1 蛋白酶按照最佳的配比将其复合制得 f m 2 蛋白酶，分别考察不同种类不同用量下表面活性剂和填充剂对 f m 2 蛋白酶浸水效果的影响。将筛选出的表面活性剂、填充剂与 f m 2 复合制备j p k 2 浸水酶制剂。将制备得的j p k 2 浸水酶制剂在 工厂进行应用实验，通过对浸水皮、浸灰皮和蓝湿皮的观察检测， 考察自制j p k 2 浸水酶制剂的应用效果。 实验结果表明，与传统浸水工艺相比，将蛋白酶应用于黄牛盐 湿皮浸水工序中，有利于提高生皮纤维间蛋白质的溶解速度，缩短 浸水时间，酶用量为2 0 i t g 皮时浸水效果最佳。m 1 蛋白酶和m 3 蛋白酶更适合应用于浸水工序，适当比例的m 1 蛋白酶和m 3 蛋白 酶配合应用于浸水工序中，不但对生皮纤维间蛋白质具有很好的水 解作用，并且对生皮表面皮胶原的损伤较小。当其以6 ：4 的配比制 备成f m 2 蛋白酶应用于浸水工序中，具有较好的浸水作用。采用 o 3 的阴离子表面活性剂y 1 或o 2 的阴离子表面活性剂y - 2 与 f m 2 蛋白酶复合制备酶制剂，将其应用于浸水工序中具有较好的浸 水效果。适当用量的元明粉可作为填充剂用来制备浸水酶制剂。将 筛选出的酶制剂、表面活性剂、填充剂等复合制备出j p k 一2 复合浸 水酶制剂，将其在制革厂进行应用实验，并与大生产的浸水效果进 行比较。实验表明，自制浸水酶j p k 2 浸水酶制剂i 、j p k 2 浸水酶 制剂i i 应用于浸水工序中，对皮坯的脖颈纹、肚边纹等具有很好的 舒展作用，对臀部纤维有较好的分散效果，效果优于大生产，具有 良好的浸水性能。 本研究中将皮革助剂作为添加剂与酶复合，使制备出的复合酶 制剂具有多功能性，使浸水工序的操作简单、易行化。 关键词：蛋白酶，表面活性剂，浸水，酶制剂 i i s y n t h e s i s0 fc o m p o u n de n z y m e sa n d i t sa p p l i c a t i o ni nl e a t h e rs o a k i n g a b s t r a c t s e r i o u sp o ll u t i o ni sac h a r a c t e ro fl e a t h e rp r o c e s s i n g ，a n di th a s r e s t r i c t e dt h es u s t a i n a b l ed e v e l o p m e n to fl e a t h e ri n d u s t r y o n l yt h e c l e a nt e c h n o l o g yc a nc h a n g et h es e r i o u sp o l l u t i o ni nl e a t h e rp r e s e n t s i t u a t i o n t h em e t h o do fp r e p a r i n gak i n do fe n z y m a t i cs o a k i n ga g e n t w i t he n z y m e ，s u r f a c t a n t sa n df i l l e r sw a sa c c o r d i n ga st h ei n t e n t i o na n d p r i n c i p l eo fl e a t h e rs o a k i n gw a sp u tf o r w a r di nt h i sp a p e r ，i no r d e rt o c h a n g et h es h o r t c o m i n g s o ft r a d i t i o n a l s o a k i n gm e t h o d ，s u c h a s p o ll u t i o n ，t i m ea n ds oo n i nt h es t u d y ，t h ed o s a g eo fp r o t e a s ea n dt h ei m p a c t so fd if f e r e n t s u r f a c t a n t so nm lp r o t e a s ei nl e a t h e rs o a k i n gw a sa s c e r t a i nb yt e s t i n g p r o t e i nc o n t e n t ，h y d r o x y p r o l i n ec o n t e n ti nt h ew a s t el i q u o ro fs o a k i n g ， t h ee x t e n to fs o f t n e s sa n dt h ee x t e n to fy e l l o ws t r e a k t h em - 1p r o t e a s e w a su s e di ns o a k i n gw i t hb a c t e r i c i d ep - 1a n dd i f f e r e n ts u r f a c t a n t s ，t h e s o a k i n ge f f e c to fw h i c hw a ss t u d i e d t h ej p k 一1e n z y m ew a sp r e p a r e d b yp 一1 ，s u r f a c t a n ta n dm 一1p r o t e a s e m - 2 p r o t e a s eo r m - - 3 p r o t e a s e w a su s e di n s o a k i n gw i t hm - - 1 p r o t e a s e t h e e f f e c tw a ss t u d i e db yt h es a m em e t h o d t h ef m 一2 p r o t e a s ew a sp r e p a r e db ym - 1p r o t e a s ea n dm - - 3p r o t e a s ew i t ht h eb e s t r a t i o t h ei m p a c t so fd i f f e r e n ts u r f a c t a n t sa n df i l l e r so nf m 一2p r o t e a s e i nl e a t h e r s o a k i n g w e r ea s c e r t a i n e d t h ej p k 一2 s o a k i n ge n z y m e ， p r e p a r e db ys u r f a c t a n t s ，f i l l e ra n dp r o t e a s e ，w a su s e di nt h el e a t h e r p r o d u c t i o np r o c e s s t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tp r o t e a s ew a sa p p l i e di nt h e s o a k i n gp r o c e s so fs a l t i n gc a t t l es k i n i tw a sb e n e f i t e dt oi m p r o v et h e d i s s o l u t i o ns p e e do fp r o t e i na n ds h o r t e nt h es o a k i n gt i m e t h eb e s t a m o u n to fp r o t e a s ei nl e a t h e rs o a k i n gw a s2 0u n i t sp e rg r a ms k i n a p p r o p r i a t ep r o p o r t i o n o fm - 1 p r o t e a s ea n dm - - 3p r o t e a s e c a n i m p r o v et h ed i s s o l u t i o nr a t eo fp r o t e i na n dm i t i g a t et h el e a t h e ri n j u r y i i i t h ef m - 2p r o t e a s ew a sp r e p a r e db yb e t t e rr a t i oo f6 ：4 t h em i x t u r eo f f m 2w i t h0 3 y - 1o r0 2 y - 2h a da ne x c e l l e n te f f e c t i nl e a t h e r s o a k i n g a p p r o p r i a t ea m o u n to fs o d i u ms u l f a t ec a nb eu s e da sf i l l e ri n t h ep r e p a r a t i o no fs o a k i n ge n z y m e t h ej p k 一2 s o a k i n ge n z y m ew a s p r e p a r e db yp r o t e a s e ，s u r f a n ta n df i l l e r t h ej p k 一2s o a k i n ge n z y m ew a s u s e di nt h et a n n e r yl e a t h e rp r o c e s s t h ep i l o tr e s u l ts h o w e dt h a tt h e j p k 2s o a k i n ge n z y m eia n dj p k 2s o a k i n ge n z y m ei ih a de x c e l l e n t s t r e t c he f f e c tt ow r i n k l e so fn e c ka n db e l l y a tt h es a m et i m e t h e yh a v e ag o o dd i s p e r s i o ne f f e c to fb u t t o c k t h er e s u l to fs o a k i n gi se x c e l l e n t i nt h i ss t u d y t h el e a t h e ra u x i l i a r ya n de n z y m ew e r ep r e p a r e da sa v e r s a t i l i t ys o a k i n ge n z y m e ，w h i c hi m p r o v e dt h er e s u l to fs o a k i n g k e y w o r d s ：p r o t e a s e ，s u r f a c t a n t ，s o a k i n g ，e n z y m e i v 符号说明 v 阴离子表面活性剂1 阴离子表面活性剂2 非离子表面活性剂1 非离子表面活性剂2 两性表面活性剂1 蛋白酶1 蛋白酶2 蛋白酶3 复合酶1 复合酶2 复合酶- 3 自制浸水酶制剂1 自制浸水酶制剂2 杀菌剂p 1 m i n u t e ，分钟 h o u r ，小时 1 2 2 d之，2o乏。出小q k k m m m m m m舭胍胍主h 复合酶制剂的研制及其在制革浸水中的应用 原创性声明及关于学位论文使用授权的声明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究做出 重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：奶臃鲷日期： 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解陕西科技大学有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权陕西科技大学可以将本学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学 位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供 信息服务。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：趁亟荦淖师签名日期趔乒型丑 复合酶制剂的研制及其在制革浸水中的应用 1 前言 原料皮在防腐、贮存和运输过程中都会不同程度地失去水分，原料皮失水后其胶原 纤维将会粘接在一起，这将给水介质中化学材料向皮内的渗透作用及均匀作用带来困难。 因此制革的第一个工序就是浸水，它可使失水的原料皮充分吸收水分，达到鲜皮状态， 为后续工序的化学处理打下良好的基础。浸水效果的好坏会直接影响到皮革生产的后续 操作l l 】。浸水的目的如下： ( 1 ) 除去原料皮上的污物和防腐剂； ( 2 ) 溶解原料皮中可溶性蛋白质如纤维间质、细胞间质等，有助于水的渗透及后工序 材料对胶原纤维的均匀作用，使皮革柔软、丰满f ：】； ( 3 ) 使原料皮纤维结构和含水量基本上恢复到鲜皮状态； ( 4 ) 攻击表皮结构，削弱皮下组织，为后工序的处理工作做准备f ，卅。 传统浸水方法较为简单，直接用水对原料皮进行浸泡，浸水时间较长，特别是处理 干板皮时，水份更不易渗透，往往达不到理想的效果。虽然提高浸水温度可以促进浸水 过程，但长时间、高温浸水会使皮质受到严重损失，从而影响成革的质量和性能。现代 浸水工艺中，特别是对于生皮的快速浸水通常要加入一些材料来促进浸水过程，缩短浸 水时间，使浸水更容易达到理想的效果。这类材料被应用于浸水过程后，可促进浸水过 程、增加浸水均匀性、缩短浸水时间，并且有利于皮内非胶原成分的去除、保护皮质等， 通常称这类材料为浸水助剂。浸水助剂的使用对浸水过程、浸水效果以及浸水废液对环 境的影响都有着举足轻重的作用。 1 1 浸水助剂简介 1 1 1 浸水助剂的分类 所谓浸水助剂是指浸水时，可快速而且均匀地使原料皮恢复至鲜皮状态的材料。根 据浸水助剂的主要成分，浸水助剂可分为以下几类： ( 1 ) 碱性材料，如纯碱、烧碱、氨水、多硫化钠等； ( 2 ) 酸性材料，如甲酸、乙酸、乳酸、硫酸氢钠等： ( 3 ) 中性盐，如氯化钠、硫酸钠等； ( 4 ) 表面活性剂，主要是非离子和阴离子表面活性剂； ( 5 ) 浸水酶制剂，如碱性蛋白酶和脂肪酶等； ( 6 ) 杀菌防腐剂； ( 7 ) 其他材料，如尿素、双氰胺、磺酸盐等。 陕西科技大学硕士学位论文 1 1 2 浸水助剂的作用机理 浸水助剂已成为制革过程中不可缺少的使用材料【2 】，不同种类的浸水助剂，其作用 机理也大不相同。根据上述浸水助剂在浸水工序中所起到的作用，其作用机理分述如下。 a 酸性材料和碱性材料 原料皮在酸性或碱性水溶液中都会发生膨胀，充水度很大。在浸水过程中，使用酸 性材料或碱性材料，可使浸水浴的p h 值偏离生皮的等电点，从而使原料皮具有更大的 充水性，加速浸水过程。此外，浴液p h 值的变化，可对细菌的生长、繁殖起到一定的 抑制作用。但浴液的p h 值不能太高或太低，否则，原料皮会因过度充水而发生肿胀( 过 度膨胀) 。 b 中性盐材料 中性盐是电解质，有较强的亲水性。中性盐特别是食盐，可以溶解生皮中的白蛋白 和球蛋白，使已粘结的胶原纤维松散开来，从而加速浸水过程。需要注意的是，中性盐 用量过大会使生皮脱水而不利于充水。 c 表面活性剂 在浸水浴中加入表面活性剂，一方面可以降低水的表面张力，使水分尽快渗入原料 皮内；另一方面，能够乳化生皮的油脂，促进可溶性蛋白质( 如自蛋白、球蛋白等非胶原 蛋白质) 的溶解，从而加速生皮充水。 d 浸水酶制剂 在浸水浴中加入酶制剂，可以通过酶制剂水解脂肪的作用，清除原料皮外水子向生 皮内渗透的障碍，促进原料皮外水分子向原料皮内的渗透；可以通过蛋白酶对非胶原成 分的水解作用，有效地除去生皮胶原纤维之间的白蛋白、球蛋白及蛋白多糖( 如硫酸皮 质素) 等，使已粘结的胶原纤维得到分离和松散。 f 杀菌防腐剂 为了加速浸水过程，往往需采取提高浸水温度和延长浸水时间等措施，因此容易使 细菌得到繁殖，对浸水效果造成影响。而在浸水浴中加入杀菌防腐剂，可以通过在细菌 生长的缓慢期内杀灭浸水浴中的细菌而抑制细菌的繁殖速度，从而确保浸水操作的正常 进行。 1 2 浸水助剂的现状 1 2 1 酸性、碱性材料和中性盐 制革工业污染已成为我国所面临的环境污染问题的主要因素之一，如何减少制革业 对环境的污染一直是国内外研究的热点问题之一。在浸水工序中使用的大量化工材料， 如酸、碱、盐等【5 j ，只有一部分被原料皮吸收利用，而另一部分则进入废水中造成污染， 2 复合酶制剂的研制及其在制革浸水中的应用 使环境污染问题日益突出【6 】。其中碱类助剂会降低毛被质量，也可使皮板膨胀；中性盐的 使用效果不理想且会造成废水中含盐量过高，加重环境污染，因此该类材料作为浸水助剂 的使用率已明显下降。 1 2 2 表面活性剂 表面活性剂作为浸水助剂，使用方便、副作用小。目前国内使用的浸水助剂以阴离 子型表面活性剂和非离子型表面活性剂较多 7 1 。从实际应用效果来看，非离子型表面活性 剂的浸水效果优于阴离子型表面活性剂。在浸水过程中也可使用阳离子表面活性剂，但主 要利用其杀菌防腐功能。表面活性剂类浸水助剂可应用于各次浸水中，一般用量为原皮重 的0 3 1 o 【8 l 。 国内传统的表面活性剂类的浸水助剂产品主要是j f c 、环烷酸钠、渗透剂t 和拉开 粉等几种。国外产品较多，如拜耳公司的c i s m o l l a nb h 、巴斯夫公司的m o l l e s c a lb w 和 e u s a p o no d 、德国c a r p e t e x 公司的特鲁帮n j 浸水助剂等。 表面活性剂作为浸水助剂在加速浸水、提高浸水效果的同时也增加了制革废水的化 学耗氧量c o d ，带来一系列的环境污染问题： ( 1 ) 一些表面活性剂的使用使皮中带有少量的有害成分，如一些季铵盐的阳离子型表 面活性剂会具有一定的毒性 9 1 。2 0 0 4 年欧洲国家对制革中所使用的含酚的表面活性剂如 有壬基酚构成的表面活性剂( n p e o ，n p e s ) 采取了严格控锘1 1 0 l ； ( 2 ) 表面活性剂活性微生物的分解问题，即通称的生物降解问题。用于制革生产中的 一些表面活性剂的生物降解性不够理想，对生态环境造成了一定的污染，如阳离子表面 活性剂季铵盐被用作表面活性剂、络合剂和杀菌剂，它们仅有部分可被生物降解。含有 这类表面活性剂的废水，流入江河，将造成江河的污染。据一些资料报道，某些表面活 性剂，在其含量相当低的情况下，就能导致江河中鱼类的死亡。如烷基酚聚氧乙烯醚类 非离子表面活性剂在降解过程中产生的酚，对鱼类和水生物都会产生伤害1 1 1 1 。 1 2 3 酶制剂 酶是由活体细胞产生的，具有催化作用的特殊蛋白质。酶催化作用的主要特点是：具 有专一性、高效性，所需作用条件缓和，本身无毒，作用过程中一般也不会产生其它有毒物 质。酶的种类繁多、来源广泛，从动植物组织和微生物中都可以提取或分泌、发酵产生酶。 工业用酶主要来自微生物如各种细菌和霉菌。从酶作用的对象来看，制革中主要使用的酶 是蛋白酶、胰酶和脂肪酶【1 2 】，其大都属于水解酶f 1 3 】： 蛋白酶：可以作用于纤维间质等非胶原成分，有效地水解、去除皮内的白蛋白、球 蛋白和蛋白多糖。是水解蛋白质肽键的一类酶的总称。按水解多肽的方式，可将蛋白酶 分为内肽酶和外肽酶两类。内肽酶将蛋白质分子内部切断，形成分子量较小的胨。外肽 酶从蛋白质分子的游离氨基或羧基的末端逐个将肽键一一水解，而游离出氨基酸，前者 3 陕西科技大学硕士学位论文 为氨基肽酶，后者为羧基肽酶。工业生产上应用的蛋白酶，主要是内肽酶。其广泛地存 在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中【1 4 1 。在准备工段中使用蛋白酶，可以有效消 除原料皮中不必要的元素和非胶原蛋白纤维，从而得到具有更高物理性能的轻革【1 5 1 。 胰酶：可以促进蛋白质的水解。主要含有胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶、胰凝乳 蛋白酶等。胰酶能将蛋白质转化为肽和氨基酸，将淀粉转化为胡精和糖。 脂肪酶：对油脂分子有水解作用，可以将脂肪水解为脂肪酸和甘油。脂肪酶能够起 到水解脂肪，促进水渗透的作用【1 6 1 。迄今为止，脂肪酶在酶制剂产品中占据着重要的位 置，涵盖了整个酶制剂市场的6 0 6 5 【1 7 】。脂肪酶可用于浸水过程以除去油污；也可 通过预涂脂肪酶达到除去油污的目的。 绿色环保是酶在制革工业中应用的鲜明特点。酶处理工艺作为生化技术在制革加工 中的应用具有广阔的发展前景【1 1 1 。在整个制革加工过程中，酶制剂可以在准备工段中的 浸水、脱脂、脱毛、浸灰以及软化工序上得到应用。在皮革鞣制之前对其进行酶处理， 有选择性地溶解部分蛋白质成分，可以达到使皮革柔软的目的【1 9 1 。酶制剂是可完全生物 降解的蛋白质，它的使用不会对环境造成危险，并且可减少污染化学材料( 如表面活性 剂) 大约3 0 的使用量，还能改善其它化学材料在皮上的吸收及渗透作用，有效减少废 水中污染物的含量，降低b o d 和c o d 指标 2 0 1 。 目前，国内外的许多科研院所在研究制革清洁工艺时，都把酶制剂的应用列入其中， 以取代或部分取代污染严重的化工材料，取得了较好的效果。将酶制剂应用于浸水工序 中，其优点为：能去除原料皮中大部分纤维间质；能较大程度地疏松皮垢、减少粒面皱 纹；能大大缩短浸水时间；增加浸水的均匀性；能够改善浸水化工材料的渗透和膨胀作 用；可以减少成革血管痕和肥纹的产生1 2 0 。作为生物催化剂，其在具体使用中表现为用 量少、效率高。因此，加入浸水酶制剂后，很多原料皮的浸水过程在4 ，- - 6 h 内即可完成 【2 2 】。据报道：酶法浸水皮板回鲜快、洁净度高，充水度高，对纤维松散作用强，易揭里 去肉f 2 3 j 。 国外在较早时候就开始研制与开发制革专用酶制剂，他们根据制革的需要，对酶进 行适当的改性，降低其活性，增加其渗透性和在皮内作用的均匀性，拓宽其使用的p h 值和温度范围，使酶制剂在较低的温度下就有较好的作用，提高了酶制剂作用的效果和 操作的安全性。如俄罗斯的k o c h e t o v a , s p 已研究并申请了中性蛋白酶使用于制革浸水中 的专利 2 4 1 ；西班牙的r p a l o p 等人 2 5 j 及英国制革技术中心的v l a d d y 等人1 2 6 1 分别研究了脂 肪酶和蛋白酶在浸水时所表现出的脱脂作用；英国的m t a z o n 等人 2 7 1 研究了纤维素复合 酶在浸水工段中去除原皮污物的作用；美国农业部东部地区研究中心和印度制革研究中 心等研究机构也在进行制革酶技术的研究开发工作 2 。一j q 。目前国外已有浸水专用酶制剂， 如n o w o 公司的n o w o l a s es g 、德瑞公司的e r h a z y mc 、希伦赛勒赫公司的a g i n t a np r 、 4 复台酶制荆的研制及其在制革浸水中的应用 汤普勒公司的t r u p ym s 等。他们的主要成分都是碱性蛋白酶，对非胶原蛋白有报好的 去除效果l 。 尽管国内制革工作者早己认识到浸水酶制剂的优越性，但皮革浸水酶制剂的研究、 开发工作却相对薄弱，可供皮革制造者选择用于原料皮的酶制剂较少 。上世纪九十年代 初缪建1 3 4 1 研究了蛋白酶在山羊皮浸水中的应用，结果表明蛋白酶的使用可明显缩短山羊 皮的浸水时间。九十年代后期西北轻工业学院的卢行芳9 ”研究了2 7 0 9 蛋白酶在黄牛皮浸 水中的应用，试验结果表明利用2 7 0 9 蛋白酶作为生产黄牛软鞋面革的浸水助剂，不仅可 以缩短浸水时间，而且可以减轻黄牛皮颈部皱纹，提高得革率，使坯草粒面细致，革身丰 满、柔软。 研究者所在课题组对几种酶制剂在制革浸水工序的使用效果进行了研究- 州1 。实验 中，以浸水废液中的蛋白质含量、羟脯氨酸含量、浸水生皮的柔软度、黄心程度以及溜 毛出现时间等为指标，比较了酶浸水与无酶浸水之间的差异：考察了酶制剂种类与浸水 效果之间的关系。试验结果表明：几种酶制剂都能够显著提高生皮问质蛋白的溶解速度， 缩短浸水时间；不同酶制剂的浸水应用效果存在着较大的差异m l 。试验中还发现，浸水 时加入酶制剂，可显著提高溶解生皮间质蛋白的速度，缩短浸水时自j ；并且可以大大地 提高去除脂肪物质的效果。浸水酶制剂浸水后生皮的垂直切片图如图卜1 所示： ，j ，。 j 一 。 ， 7 o 。一蕾” - 、 ，。 r 。 i t 、 、 ， 。 、。 一弘 j 、 “ n t 图1 1 浸水酶制荆浸水后生皮的垂直切片4 0 0 f i g i lv e r t i c a ls e c t i o n o f s k i na f t e rs o a k i n g w i t hs o a k i n ge n z y m e 1 3 浸水助剂的发展趋势 根据浸水工序的需要，开发既具有良好的回湿性，又具有乳化、分散纤维、去除皮内 非胶原蛋白以及杀菌防腐等综合性能，并且不会造成新的污染，能被生物降解的的多功能 陕西科技大学硕士学位论文 浸水助剂，已成为国内外开发浸水助剂产品的目标。笔者认为，制革浸水助剂的发展趋势 主要在以下两个方面： 1 3 1 表面活性剂类浸水助剂 在制革工业不断发展的同时，开发和应用那些既对环境无污染或少污染，又能够节 能、省时等降低生产成本的新材料、新工艺和新技术，是制革工业可持续发展的关键， 也是目前国内外研究的热点之一f ，删1 。制革工业中使用的表面活性剂类浸水助剂主要是 阴离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂，相对地，阳离子型和两性表面活性剂的应用 则较少。随着经济的发展和人民生活水平的提高，对新型皮革的需求越来越大，对制革助 剂也提出了更高的要求。用于制革工业的表面活性剂作为表面活性剂工业的一个发展点， 对其进行开发和研究将进一步受到重视。从其使用方向来看，将有以下几个发展方向： a 开发对环境无害，更加环保的表面活性剂类浸水助剂 制革用表面活性剂的环保性主要在两方面：一是要求表面活性剂本身生物降解性能 好、作用温和；二是要求表面活性剂在使用过程中能促进其它材料的渗透、吸收和固定， 降低制革工业的污染。如可裂解型、反应型生物表面活性剂等 4 2 1 。此类浸水助剂的研发， 将有利于绿色制革的发展。 b 将复配技术应用于表面活性剂类浸水助剂 表面活性剂复配技术在我国还相对落后，所以加强这方面的基础及应用技术的研究 将会为制革用表面活性剂类浸水助剂的应用打开一片新的天地。复配时，应注意表面活 性剂的配伍性能，如非离子表面活性剂与其它表面活性剂具有优良配伍性能，能产生良好 的协同效应，从而达到较佳的浸水效果。 c 开发多功能或具有特殊功能的表面活性剂类浸水助剂 表面活性剂与皮革的渗透、结合贯穿于制革工艺的始终，表面活性剂的作用要求能 温和地进行。因此要求表面活性剂具有耐硬水、耐电解质、耐酸碱稳定性的特点，可以 在多个制革工序使用；在表面活性剂上引入不同的特征基团，从而能同时赋予皮革多种性 能等特村，】。目前，制革浸水工艺中所使用的表面活性剂主要以阴离子型和非离子型的居 多，而高级烷基胺盐和季铵盐类的阳离子表面活性剂，两性表面活性剂的应用较少。随着 经济的发展和人们生活水平的提高，对新型皮革制品的需求必将对皮革助剂提出更高的 要求。研制开发新一代表面活性剂，特别是在制革浸水等工段中更多地使用阳离子表面活 性剂和两性表面活性剂将成为制革用表面活性剂开发的一个重点方向。 1 3 2 浸水酶制剂 绿色环保是酶制剂在制革工业中应用的鲜明特点。酶处理工艺作为生化技术在制革 加工中的应用具有广阔的发展前景m 】。作为制革中的清洁工艺，酶处理可以有效地降低 制革废水中的污染物质嗍。据相关资料报道：利用酶既能分解肽键、又能产生新键的特 6 复合酶制剂的研制及其在制革浸水中的应用 点，可以开发酶法鞣革的新领域7 】。将拥有不同性能的酶制剂作为助剂应用于浸水等 准备工段，也将是制革工业发展的新趋势： a 改善酶制剂的性能 浸水酶制剂在使用时对制革工艺条件的控制要求较高，要求严格控制用量、温度和 p h 值，并要求与其同时使用的其他材料对酶制剂无抑制作用。因此对于一些品质较差、 防腐较差的原料皮必须慎用。若能通过基因改性手段，对酶制剂进行改良，使其具有良 好的储藏稳定性、较高的处理效率、较宽的活性处理领域和更高的处理质量，则可更好 地应用于各类原料皮的浸水工艺。 b 拓宽浸水酶制剂开发领域 目前，制革用浸水酶多采用蛋白酶、脂肪酶删，随着酶制剂工业技术的发展，制革浸 水中酶制剂的开发领域将不只局限于蛋白酶、脂肪酶等。可将其它具有特殊作用的酶制 剂应用于浸水工序中。例如，把可去除原料皮上粪便的纤维素酶和木聚糖酶使用到浸水 工段中 4 9 1 ，从而达到去除原料皮上污物的作用。 c 酶制剂的复配技术 常规浸水工艺中多使用单一的酶制剂与盐、酸、碱、表面活性剂等助剂配合使用。 如果尝试将碱性蛋白酶、碱性脂肪酶和表面活性剂等助剂以适当的比例配伍构成浸水酶 制剂，或者通过多种功能酶制剂的复配以实现多道工艺的一浴处理，不仅有助于纤维间 质的除去，而且可以提高皮革的加工效率，节省浸水工段的用水。并且通过多种酶之间 的协同作用，还可挥酶制剂的最优性能。美国的t a n c o u sj j 等人 5 0 1 ，将表面活性剂配合 蛋白酶使用于制革浸水中，试验发现，此工艺可减少原料皮的硬心，使粒面更加清洁。 其浸水时间是传统浸水工序的5 5 ，并且明显减少了后续脱毛工序中硫化物的使用。 由于酶制剂本身无毒，其作用效率高，用量少，合理地选择和正确地使用酶制剂不仅 可以减少准备工段中一些污染材料的使用，缩短处理时间，更重要的是可以明显改善各工 序的处理效果，最终可以提高成革的质量和性能。因此，从制革清洁工艺开发的角度来看， 酶制剂产品具有广阔的应用前景。 制革准备工段是整个制革过程中污染的主要来源之一。以牛皮为例，据统计在制革 准备阶段，b o d 值为整个生产阶段的8 0 ，c o d 值为整个生产阶段的7 0 ，盐量为8 5 ， 固体悬浮物为6 0 ，所以对准备工段污染的控制尤为重要【钉侧。所以，合理地选择浸水 助剂，在制革过程中尤为重要，而研发性能优越的浸水助剂将会成为皮革化学品研究中 的重点方向之一。 1 4 论文选题的目的和意义 随着皮革工业在我国的迅速发展，中国已经成为世界皮革工业的制造中心和贸易中 7 陕西科技大学硕士学位论文 心。而在制革工业不断发展的今天，如何在提高革制品质量的同时，减少制革业对环境 的污染，已成为我国皮革工业所要解决的关键问题。因此，能够节能、省时并降低生产 成本的新材料、新工艺和新技术，是制革工业可持续发展的关键，也是目前国内外研究 的热点之一。 本课题进行了复合制革浸水酶制剂的研制及其应用。在制备制革浸水酶制剂的时候， 根据浸水的目的，选取适当种类的酶来达到去除部分蛋白质、脂肪、纤维间质的目的； 为了提高复合酶制剂的应用性能，使其具有多功能性，研究中将选取适当的杀菌剂、表 面活性剂等皮革助剂作为添加剂来制备复合酶制剂；为了使制备的复合酶制剂具有良好 的贮存稳定性，可以加入一些酶保护剂。将这种复合浸水酶制剂应用于制革工艺中，克 服传统浸水工艺时间长、效果不明显、容易产生浸水过度等一些负面影响，减少了化工 材料的使用量，减轻制革准备工段对环境的污染程度。使皮中纤维间质容易去除，使皮 回软快、充分，缩短浸水时间，并将使皮的得革率提高。为适应我国皮革工业的二次创 业以及目前国内； i - n 革酶制剂的发展现状，新型酶制剂的研制意义重大，有着不可估量 的应用前景。 1 5 本课题研究的主要内容 ( 1 ) 最适浸水酶用量的优选：将不同用量的蛋白酶应用于制革浸水工序中，对酶处理 后的坯革、废液进行检测，结合生皮的处理效果。确定适用于浸水工序的最适酶用量。 ( 2 ) 添加剂的优选：考察不同种类添加剂对酶的活力及应用效果、储存稳定性等方面 的影响，选取合适的添加剂。 ( 3 ) 填充剂的优选：考察不同种类的填充剂对酶制剂应用效果、储存稳定性等方面的 影响。 ( 4 ) 复合浸水酶制剂的制备：采用单因素试验设计法优化复合酶制剂的制备条件，将 优选的酶和添加剂、填充剂进行复合，制备复合酶制剂，并将其应用于制革浸水中。以 酶处理后坯革纤维间的纤维结构蛋白质和非纤维结构蛋白质的溶解情况、废液中的各组 分的含量、生皮的处理效果等作为考察指标，得到具有使用方便、性能优越、稳定等特 点的复合酶制剂。 ( 5 ) 复合浸水酶制剂的应用：将复合浸水酶制剂应用于制革厂大生产的浸水工序中， 考察其应用效果。 8 复合酶制剂的研制及其在制革浸水中的应用 2 , i p k 1 复合酶制剂的制备 2 1 主要试剂和仪器设备 2 1 1 主要试剂 试剂名称规格 黄牛盐湿皮工业品 m 1 蛋白酶工业品 m 2 蛋白酶工业品 m 3 蛋白酶工业品 对二甲氨基苯甲醛a r 高氯酸a r 氯胺ta r 三氯乙酸 a r 干酪素 a r 酪氨酸a r 磷酸二氢钾a r 磷酸氢二钠a r 2 1 2 主要仪器设备 仪器名称型号 分光光度计7 2 2 型 五滚鼓转鼓d j d 3 5 0 型 可调式移液器4 0 2 7 6 8 0 电热恒温干燥箱d h g 1 0 1 a 1 b 电热恒温水浴锅t d a 一8 0 0 2 型 低速离心机l d 5 2 a 型 电子天平 b s 3 2 3 s 2 2 实验方法 2 2 1 标准曲线的建立 产地 西安友谊制革厂 陕西酶工程研究所 海宁市金潮实业有限公司 广州众缘有限公司 天津市科密欧化学试剂开发中心 天津市东方化工厂 天津市科密欧化学试剂开发中心 上海山浦化工有限公司 中国医药公司北京公司 西安化学试剂厂 天津市天河化学试剂厂 西安化学试剂厂 产地 上海精密科学仪器有限公司 江苏无锡东北塘矿山机械厂 热电( 上海) 仪器有限公司 上海经济区沈荡中新电器厂 北京化玻联医疗器械有限公司 北京医用离心机厂 北京赛多里斯仪器系统有限公司 a 试剂的配制嗍 1 ) 福林试剂配制 在2 0 0 0 m l 磨1 ：3 回流装置的烧瓶内，依次加入钨酸钠1 0 0 9 ，钼酸钠2 5 9 ，蒸馏水 7 0 0 m l ，8 5 的磷酸5 0 m l ，浓盐酸1 0 0 m l ，全部加好后装上冷凝器，以小火沸腾回流 9 陕西科技大学硕士学位论文 1 0 h ，取下冷凝器后加入硫酸锂5 0 9 ，蒸馏水5 0 m l ，混匀后再加入溴水数滴，煮沸约1 5 m i n ， 以除去多余的溴，此时溶液呈黄色( 如仍有绿色则再加几滴溴水，再煮沸以除去过量的 溴) 。冷却后加蒸馏水将此液稀释到1 0 0 0 m l 。混合均匀用玻砂漏斗过滤，滤液应呈金黄 色，贮于棕色试剂瓶中，严防灰尘落入。本试剂可长期保存。使用时按l ：2 稀释。 2 ) 0 5 5 m o l l 碳酸钠溶液 称取无水碳酸钠5 8 3 9 ，溶于10 0 0 m l 蒸馏水中。 3 ) 1 0 0 9 l 三氯醋酸溶液 称取三氯醋酸1 0 0 9 ，溶于1 0 0 0 m l 蒸馏水中。 4 ) 缓冲溶液 ( 1 ) 0 0 2 m o l l 磷酸缓冲溶液( p l q 7 2 ) a 液刈2 m o l l n a h 2 p 0 4 2 h 2 0 溶液：称取n a h 2 p 0 4 2 h 2 0 3 1 2 9 ，以水定容到 1 0 0 0 m l 。 b 液一2 m o l l n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 溶液：称取n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 7 1 7 9 ，以水定容至 1 0 0 0 m l 。 取a 溶液2 8 m l ，b 液7 2 m l 。 ( 2 ) 硼砂氢氧化钠缓冲液( p h 值1o 0 ) a 液：称取硼砂1 9 9 ，以水定容至1 0 0 0 m l 。 b 液：称取氢氧化钠8 9 ，以水定容至1 0 0 0 m l 。 取a 液5 0 m l ，b 液4 3 m l ，以水定容至2 0 0 m l 。 测定时只需根据酶种类的不同，选配上述缓冲液之一即可。 b 标准曲线的制作 为了确定酪氨酸量与吸光度( o d 值) 的对应关系，需要事先以不同浓度的酪氨酸标准 溶液与福林试剂反应显色，测定其吸光度，绘出标准曲线。 1 11 0 0 i t g m l 酪氨酸标准溶液的配制 准确称取在1 0 5 。c 烘干至恒重的酪氨酸o 1 0 0 0 9 ，用o 1 m o l l h c l 溶液溶解，移入 1 0 0 m l 容量瓶中，并以0 1 m o l l h c l 稀释至标线，即得l m g m l 的酪氨酸溶液。保存于 冰箱中，用时吸取1 0 m l 此液于1 0 0 m l 容量瓶中，以o 1 m o l l h c l 稀释至标线，即得 1 0 0 t t g m l 酪氨酸的标准溶液。 2 ) 不同浓度的酪氨酸标准溶液的配制 取干燥试管7 支，编号后按表所示的量，用刻度移液管加入酪氨酸标准溶液和蒸馏 水，即配成六种不同浓度的酪氨酸溶液的标准系列，见表2 1 。 i o 复合酶制剂的研制及其在制革浸水中的应用 表2 - 1 酪氨酸标准系列的制备 t a b 2 - 1p r e p a r a t i o no f s t a n d a r ds e r i e sl i q u o ro f t y r o s i n 3 ) 测定 吸取上述不同浓度的酪氨酸标准溶液各l m l ，于干燥试管中( 每种浓度都做平行实 验) ，分别加入0 5 5 m o l l 碳酸钠5 m l 和福林试剂l m l ，摇匀，再置4 0 c 恒温水浴中， 显色l o m i n 。在分光光度计上用6 8 0 n m 波长，以零号管中的溶液( 即酪氨酸的浓度为零) 作零点，测定各管中溶液的吸光度( 平行两份之差不得超过o 0 1 ) 。以吸光度值为纵坐 标，酪氨酸浓度( p g m l ) 为横坐标，作一标准曲线，此线应该通过零点。 2 2 2m 1 蛋白酶活力的测定 a 样液制备及测定 1 ) 底物的制备【”j 测定中性、碱性蛋白酶活力可配制2 酪素溶液。称取酪素2 9 ，按不同酶种加适量 0 5 m o l l 氢氧化钠溶液湿润片刻，再加与待测酶种相应的少许缓冲溶液，在沸水浴中加 热到完全溶解，冷却后用精密p h 试纸检查。调节溶液的p h 值到该酶反应的最适p h 值， 然后用相应的缓冲溶液定容至l o o m l ，置于4 c 的冰箱中保存，超过5 天应另行配制。 2 ) 待测酶液的制备 准确称取酶粉2 9 ，以少量与该酶种相应的缓冲溶液溶解，并用玻棒捣研，将上层液 小心倾人l o o m l 容量瓶中，余渣部分加入上述缓冲液。如此反复捣研3 - 4 次，最后全 部移入容量瓶中，用上述缓冲溶液定容至标线，摇匀。根据酶的活力，吸出一定量，用 上述缓冲液稀释至适当倍数待用。 3 ) 测定步骤 将底物在4 0 ( 2 恒温水浴中预热3 一5 m i n ，取干燥试管3 支编号后加入待测酶液l m l 。 放入4 0 ( 2 水浴中预热3 - - 5 m i n 后，按表2 2 的顺序加入各种溶液。 加入三氯醋酸以后立即摇匀，在常温下放置5 m i n ，以干滤纸滤入干燥试管中，分别 吸取滤液l m l 于事先标好号的对照试管中，在加入0 5 5 m o l l 碳酸钠溶液5 m l ，福林试 陕西科技大学硕士学位论文 剂l m l ，摇匀后置4 0 ( 2 水浴中显色1 0 m i n ，以对照管为空白，在分光光度计( 或光电比色 计) 上测定吸光度。 表2 - 2 蛋白酶活力测定时的溶液加入顺序 t a b 2 2a d d i n go r d e ro fl i q u o rd u r i n gt h em e n s u r a t i n gt h ea c t i v i t yo fp r o t e a s e 4 ) 计算 根据定义，在一定条件下l g 酶粉，每分钟水解酪蛋白产生的酪氨酸的微克数称为酶 的活力，以g 表示。 酶粉活力= 警( ( 2 - 1 ) 式中：