（食品科学与工程专业论文）磷脂酰丝氨酸的提取及其对大鼠海马神经元的抗氧化研究.pdf

独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如 没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者签名： 私约 导师签字： 学位论文版权使用授权书 、7 ，j ， a f 俩嘞 i 。 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权堂撞可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在 解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 私弘 f 签字日期：2 0 0 7 年岁月；1 日 导师签字：a 7 签字日期：2 0 07 毛厂月彰同 山东师范大学硕! l 学位论文 摘要 近年来，随着人口老龄化的加速，衰老和脑退化引起的一系列疾病己普遍存在 且严重影响老年人的生活能力。对衰老这一重大课题的了解目前仍仅限于一些初步 实验和学说，其中以氧自由基和细胞凋亡学说影响最大，衰老的自由基学说认为氧 自由基导致的细胞凋亡是影响衰老进程的重要原因，但详细的损伤机制还有待探 讨。 海马是学习记忆的关键部位，并且对衰老极为敏感，氧自由基对海马神经元的 损伤是导致记忆下降的重要原因：乙酸佛波酯( p m a ) 是一种肿瘤诱导剂，可以刺 激细胞产生活性氧( r o s ) 自由基，常用来诱导细胞凋亡，但迄今为止并没有诱导 海马神经元凋亡的报道；大量研究表明磷脂酰丝氨酸( p s ) 在提高学习记忆，改善 脑功能，维持和修复神经细胞等方面具有重要作用，但前人主要研究了p s 在体内 环境中的生理功能，采用的都是口服p s 的方式，并未进行细胞水平的研究。 因此本论文以牛脑为原料提取p s ，采用p m a 诱导大鼠海马神经细胞凋亡，首 次在细胞水平上进行了p s 对海马神经元的抗氧化抗凋亡研究。 目的：研究不同浓度的磷脂酰丝氨酸( p s ) 对原代培养的大鼠海马神经元的抗 氧化作用，并对自己提取和s i g m a 公司两种来源的p s 的抗氧化作用进行了比较。 方法：从新鲜牛脑中提取p s ，并采用薄层层析和薄层扫描的方法对其进行了定 性和定量。原代培养大鼠乳鼠海马神经元并用不同浓度p m a 处理不同时间刺激细 胞产生活性氧( r o s ) 诱导细胞凋亡。应用吖啶橙染色激光共聚焦显微镜( l a s e r s c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p e ，l s c m ) 检测细胞旖亡率，倒置荧光相差显微镜检测不 同凋亡时期的细胞形态。磷脂酰丝氨酸外翻实验分析细胞的早、中及晚期凋亡。通 过萘荧光探针实验( n f d s i ) 检测受刺激后细胞内h 2 0 2 的量来验证p s 对海马神 经元的保护作用。 结果：p s 提取方法简单，提取率高，薄层层析分离效果好，样品回收率高。 p m a 诱导细胞凋亡结果显示适宜采用1 0 2 9 lp m a 诱导神经元2 4 h 建立强亡模型。 吖啶橙染色结果显示两种来源的p s 在1 5 和1 5 m g l 浓度下均有明显的抗凋亡作用， 与致凋亡组比较，差异均极显著，但1 5 m g l 的抗凋亡效果更好；而1 5 0 m e ；，l p s 未 发现对细胞有明显保护作用；同浓度下自提的p s 比s i g m a 公司的抑制细胞凋亡情 况稍好。倒置相差显微镜结果也证明1 5 m g lp s 能有效抑制p m a 引起的神经元凋 4 山东师范大学硕士学位论文 亡萘荧光探针实验表明空白对照组细胞探针孵育后未产生荧光现象，1 0 。2 9 ，l p m a 损伤细胞2 4 h 后加入探针显示强烈的荧光，而p m a 损伤前1 5 m g lp s 预保护组荧 光强于空白对照组，但明显比p m a 损伤后的弱。a n n e x i nv f i t c + p i 双染实验能清 楚的检测细胞的早晚期凋亡。 结论； 1 ) 一定浓度的p m a 可以刺激大鼠海马神经元产生r o s 自由基，损伤神经细胞， 本实验采用p m a 刺激建立海马神经元的凋亡模型是稳定可靠的。 2 ) 适当浓度的p s 可以增强海马神经元的抗氧化能力，说明，p s 在细胞水平上可以 起到保护神经细胞的作用，进一步肯定了p s 具有促进学习、增强记忆和改善老年 性疾病的作用。 3 ) 过高浓度的p s 对细胞有一定的毒性。 4 ) 自己提取的p s 比s i g m a 公司的p s 抗神经元氧化作用更明显，证明实验提取分 离的p s 方法可行可靠。 刨新性： 1 ) 提供了一套切实可行的分离动物脑磷脂的薄层层析参数 2 ) 第一次采用p m a 诱导海马神经元的凋亡并取得了最适宜的药物浓度和时间。 j ) 首次在细胞水平上进行了p s 对海马神经元的抗氧化和抗凋亡研究，并取得了理 想的实验结果，为有效的治疗和预防衰老和脑相关疾病提供了一种有效的药物。 关键词：大鼠，海马，神经元，乙酸佛波酯，凋亡，磷脂酰丝氨酸，保护 山东师范大学硕士学位论文 a b s t r a c t i nr e c e n ty e a r s ，a l o n gw i t ht h ea c c e l e r a t e da g i n go ft h e p o p u l a t i o n , a g i n ga n d d e g e n e r a t i o no ft h eb r a i nh a sb e c o m ew i d e s p r e a da n ds e r i o i 塔d i s e a s e sa f f e c t i n gt h e e l d e r l ya b i l i t yo ff i v m g t h em a j o rt o p i co fa g i n gr e s e a r c hi s s t i l ll i m i t e dt os o m e p r e l i m i n a r ye x p e r i m e n t sa n dt h e o r i e s ，o f w h i c ho x y g e nf r e er a d i c a l sa n da p o p t o s i si st h e g r e a t e s ti m p a c t t h ef r e er a d i c a lt h e o r yo fa g i n gc o n s i d e rt h a ta p o p t o s i sc a u s e db y o x y g e nf r e er a d i c a l si st h em a j o r r e a s o na f f e c t i n gt h ea g i n gp r o c e s s ，t h em e c h a n i s mo f t h ei n j u r yr e m a i n st ob ee x p l o r e d h i p p o c a m p n si sak e yc o m p o n e n to fl e a r n i n ga n dm e m o r y , a n di se x t r e m e l y s u s c e p t i b l et oa g i n g , o x y g e nf r e er a d i c a ld a m a g et on e u r o n si nt h eh i p p o c a m p u sw a s i m p o r t a n tr e a s o nf o rt h ed e c r e a s ei nm e m o r yl e a d p m aa sac a n c e ri n d u c e rc a np r o d u c t r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e sb ys t i m u l a t i n gc e l la n db eu s e dt oi n d u c ea p o p t o s i s b u tt h e r ei s n or e p o r t sa b o u th i p p o e a m p a ln e u r o n si n d u c e da p o p t o s i ss of a r al a r g eb o d yo f r e s e a r c h s h o w sp h o s p h a t i d y l s e r i n e 口s ) p l a y s 趣i m p o r t a n tr o l ei nt h ee n h a n c e m e n to fl e a r n i n g a n dm e m o r y , i m p r o v eb r a i nf u n c t i o n , m a i n t e n a n c ea n dr e p a i ro fn e r v ec e l l s h o w e v e r , p r e v i o u si n v s s t i g a t a t o rh a sr e s e a r c h e dp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n so ft h ep si nv i v o ，t h e yd i d n o ts t u d ya tt h ec e l l sl e v e l t h e r e f o r e ，w ee x t r a c t e dp sf r o mf r e s he a r l ei nt h eb r a i n ，u s i n gp m a - i n d u c e d a p o p t o s i si nr a th i p p o c a m p a ln e u r o n s w es t u d i e dt h ea n t i o x i d a n ta n da n t i - a p o p t o t i cr o l e o f p so nh i p p o c a m p a ln e l n o i 坞f o rt h ef i r s tt i m e o b j e t i v e ：t os t u d yt h ea n t i o x i d a n te f f e c to fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fp so n p r i m a r yc u l t u r e dr a th i p p o e a m p a lh e r o n sa n dc o m p a r et h ea n t i o x i d a t i o no f t w o k i n d sp s f r o ms e l fe x t r a c t sa n ds i g m a m e t h o d s ：w ee x t r a c t e dp sf r o mf r e s he a r l ei nt h eb r a i n , a n da l s od e t e r m i n e dt h e n a t u r ea n dt h ea m o u n t sb yt h i n l a y e r c l l l - o m a t o 铲a p l l i c ( t l c ) a n db yt h i n l a y e r c h r o m a t o f a p h j cs c a n n e r w ec u l t u r e dp r i m a r yn e o n a t a lr a th i p p o e a m p a ln e l l r o n s ，p m a w i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n sa td i f f e r e n tt i m e sc a l lp r o d u c er e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) w h i c hc a ni n d u c ea p o p t o s i sb ys t i m u l a t e dc e l l s t h ea p o p t o s i sr a to fc e l l sa f t e r 6 山东师范大学硕1 学位论文 f i d m eo r a n g e ( a o ) s t a i n i n gw a sd e t e c t e db yc o n f o c a l ，i n v e r t e df l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p ew a su s e dt od e t e c ta p o p t o t i cc e l l sp e r i o d e a r l ya n dl a t ea p o p t o t i cc e l l sc a n b ed e t e c t e db ye x p e r i m e n t a lp sv a l g u s n f d s 1w a su s e dt od e t e c tt h eh 2 0 2c o n t e n to f c e l l sa f t e rs t i m u l a t i n g ，a n dt e s t e dt h ep r o t e c t i v ee f f e c to f p so i lh i p p o c a m p a ln e u r o n s r e s u l t s ：i tw a ss i m p l ea n dh a dl l i g he x t r a c t i o nr a t ea n dh i g hs a m p l er e c o v e r yi nt h i s m e t h o db yt h i n - l a y e rc h r o m a t o f a p i l i c p m a i n d u c e da p o p t o s i sr e s u l t ss h o w e dt h a ti ti s s u i t a b l ef o rt h ee s t a b l i s h m e n to fn e u r o n a la p o p t o s i sm o d e li nt h ec o n c e n t r a t i o no fl 酽g ，l a n dt h et i m ef o r2 4 h b o t hp si nt h ec o n c e n t r a t i o no f1 s m # la n d1 5 m g 几a l lh a d o b “o u sa n t i - a p o p t o t i ce f f e c t s ，t h ed i f f e r e n c e sw a ss i g n i f i c a n tc o m p a r e dw i t h1 0 。g l p m a g r o p e ，b u tt h eg r o p eo f1 5 m g lw a s m o r ee f f e c t i v e ；h o w e v e r , t h ec o n c e n t r a t i o no f 1 5 0 m # lh a d1 1 oa p p a r e n tp r o t e c t i v ee f f e c to i lc e l l s ；i nt h es a m ec o n c e n t r a t i o n , p sw h i c h w a se x t r a c t e db yo u r s e l v e sw a ss o m e w h a tb e t t e ri nt h ei n h i b i t i o no fa p o p t o s i st h a nt h e s i g m a s t h er e s u l tu s i n gi n v e r t e df l u o r e s c e n c em i c r o s c o p ea l s ot e s t i f i e dt h a tt h eg r o p e o f1 5 m # lp sc a ne f f e c t i v e l yi n h i b i tn e u r o n a la p o p t o s i sc a u s e db yp m a i nt h en f d s 一1 e x p e r i m e n t ，c o n t r o lg r o u p d i dn o ts h o wf l u o r e s c e n tp h e n o m e n o na f t e ra d d i n gt h e f l u o r e s c e n tp r o b e ；t h eg r o u pi n j l 埘e d2 4h o u r sb yp m a , w h e r e a s ，s h o w e ds t r o n g f l u o r e s c e n t ；a n dt h eg r o u pw a sp r o t e c t e db y1 5 m g lp sb e f o r ep m ai n j u r yh a ds t r o n g e r f l u o r e s c e n tt h a nc o n t r o lg r o u p b u to b v i o u s l yw e a k e rt h a np m ai n j u r i c d a n n e x i n v - f i t ca n dp ie x p e r i m e n tc a nd c t e c t a de a r l ya n dl a t ea p o p t o s i so f c e l l sc l e a r l y c o n c l u s i o n ： 1 ) p m a a tac 盯t a i nc o n c e n t r a t i o nc a np r o d u c er o sf r e er a d i c a lo x i d a t i o na n di n j u r yr a t h i p p o c a m p a ll l c u r o l l sb ys t i m u l a t i n gi l e r v ec e l l s i nt h i ss t u d y , i ti sr e l i a b l et oe s t a b l i s h p m a - i n d u c e da p o p t o s i sm o d e li nh i p p o c a m p a lr l e u r o n s 2 ) p sa tac e r t a i nc o n c e n t r a t i o nc a l li n c m a s et h ea b i l i t yo fa n t i o x i d a n ti nh i p p o c a m p a l n e u r o n s i tc a nb ec o n c l u d e dt h a tp sc a np m t e c tt h en e t v ec e l l si nt h ec e l ll e v e l ；f u r t h e r i ti sa f f i r m e dt h a tt i mp sw i l lp r o m o t el e a r n i n g ，e n h a n c em e m o r ya n di m p r o v et h er o l eo f a g e - r e l a t e dd i s e a s e s 3 1i nt h es a m ec o n c e n t r a t i o n , t h ep sw h i c hw a se x t r a c t e db yo u r s e l v e si sb e t t e ri nt h e i n h i b i t i o no fa p o p t o s i st h a nt h es i g m a7 s t h i se x p e r i m e n tp r o v e st h a tt h em e t h o di s f e a s i b l ea n dr e l i a b l et oe x t r a c ta n ds e p a r a tp s 7 坐查堑蔓查兰堡主兰垡堡壅 i n n o v a t i v e ： 1 ) w ep r o v i d e dap r a c t i c a ls e p a r a t i o np a r a m e t e r so f b r a i np h o s p h o l i p i db y t l c - 2 ) w ea d o p t e dp m a - i n d u c e da p o p t o s i si nh i p p o c a m p a ln e u r o n sf o rt h ef i r s tt i m ea n d a c q u i r e dt h em o s ta p p r o p r i a t ed r u gc o n c e n t r a t i o n a n dt i m e 3 、w eh a v es t u d i e dt h ea n t i o x i d a n ta n da n t i a p o p t o t i c o fp h o s p h a t i d ) 7 l s e r i n eo n h i p p o c a m p a ln e u r o n si nt h ec e l l sl e v e la n da c h i e v e dt h ed e s i r e dr e s u l t s ，w h i c hc a l l p r o v i d e da ne f f e c t i v ed r u gf b r 仃e a l i n ga n dp r e v e n t i n gt h ea g i n ga n db r a i nr e l a t e d d i s e n s e s 8 k e yw o r d s ：r a t ，h i p p o c a m p a l ，n e u r o n ，p m a ，a p o p t o s i s p s p r o t e c t 山东师范大学硕士掌位论文 常用缩略语表 9 山东师范大学碘1 0 学位论文 第一章综述 1 1 神经细胞的抗氧化研究 近年来，随着人口老龄化的加速，衰老和脑退化引起的如阿尔茨海默症( a l z h e i m e r sd i s e a s e ，a d ，老年性痴呆症) 等中枢神经系统( c e n t r a ln e r v o u ss y s t e m ，c n s ) 疾病越来越多的影响老年人的健康和生活。衰老的一个著名理论是把衰老的速度归 结为累积的自由基损伤，该学说认为氧自由基导致的细胞凋亡是影响衰老进程的重 要原因，而大量研究也证明衰老、脑缺血缺氧等急慢性脑损伤过程中脑组织产生的 氧自由基( 矿、h 2 0 z 、o h 等) 明显增多。 中枢神经系统对自由基高度敏感，神经元即神经细胞是神经系统结构和功能的 基本单位，神经元损伤后极难再生，而且由于脑组织中含高浓度不饱和脂肪酸、儿 茶酚胺和高水平的氧化代谢，是氧自由基最易侵袭的靶器官，而脑内保护性抗氧化 酶和非酶性自由基清除剂含量却很低，使脑组织很容易被自由基损伤，因而脑的退 化在衰老中尤为重要。所以对神经细胞抗自由基氧化方面的研究一直是学术界的研 究热点。 1 1 1 海马神经元的研究热点 海马是学习记忆的关键部位，并且对衰老极为敏感，大量研究结果表赐海马与， 许多变性疾病如早老年性痴呆、癫痫、脑缺血缺氧损伤和兴奋性氨基酸损伤等的病 理相关联【】。中枢神经系统不同部位特殊类型神经元的丧失是各种衰老疾病的病 理特征，细胞凋亡及其辅助因子介质可能在许多神经退行性疾病中均发挥一定作 用，已证实老年性痴呆与1 3 一淀粉样蛋白( b a m y l o i d ) 代谢失调而致其在脑内沉积有 关，进而导致海马神经元丢失。 1 1 1 1 海马的结构 海马( h i p p o c a m p a l ) 是中枢神经系统的重要结构，由海马、齿状回和下托组成， 属于古皮质( 如图1 1 ，图1 2 ) 。胚胎时期，海马结构位于大脑半球内侧，相当于海 马沟下方及脉络裂上方的区域。随着大脑的颞叶的发育，上述二裂皆被卷入颞叶的 前下方，于是海马结构相当于从空室孔处延伸至侧脑室下脚项部之间的一个弓状皮 质区。海马前端较宽，表面有室管膜，膜的深面是一层白质，白质的纤维向后内方 聚集，形成海马伞，向后续于穹隆脚。齿状回是一条狭长的皮质带，除内侧面外皆 1 0 山东师范大学硕士学位论文 被海马所包绕。在内侧的游离面上有许多横沟，形如齿状，故此而得名。齿状回的 内侧面位于海马沟和海马伞之间，海马伞的游离缘直接延续于其上方的脉络层，软 膜和血管就延膜络裂凸入侧脑室内形成膜络层，覆盖十海马表面。卜托是指位十海 马回皮质和海马之间的过渡区域，相当于海马旁回的上部。 图1 1 大鼠海马冠状组织切片 图1 2 大鼠海马的不同位置切片 山东师范大学硕士学位论文 按细胞学特征和纤维联系一般将海马本部分为c a l c a 2 、c a 3 、c a 4 4 个区。c a i 区含有小锥体细胞，c a 2 区含有大量的轴突。c a 3 区含有苔藓状纤维。c a 4 区含有大 锥体细胞。按细胞构筑学又分为5 个亚层：多形细胞层、锥体细胞层、辐射层、腔 隙层和分子层，但其主要细胞是锥体细胞。 海马结构除有一个规律、复杂的板层细胞结构外，尚有一套完整的突触传导通 路。来自内嗅区的神经冲动经齿状回的颗粒细胞的轴突，与c a 3 和c a 4 区的锥体细 胞的树突棘形成突触联系。到达c a 3 区锥体细胞的冲动，通过s e h a f f e r 倾l j 突传递至t j c a t 区锥体细胞，然后通过脑下脚和穹窿海马伞到大脑皮层下结构。在这条通路中，c a 3 区的锥体细胞起着一个关键性桥梁作用，它能够通过穹窿和穿通通路接受和发放神 经冲动。因此，此传导系统的完整对于各类学习记忆的建立至关重要。损毁这些通 路的完整性，必将导致海马功能的障碍。 1 1 1 2 海马生理功能研究进展 1 9 5 7 年，米尔纳、潘菲尔德和斯科特维尔观察了海马在记忆中的作用，他们初 步观察了两侧海马损伤后病人记忆的丧失情况。根据观察断定，在直接印象痕迹的 保持和再现中，海马结构起着重要的作用。 海马与人类的记忆关系密切。现有的研究资料表明，在学习记忆过程中，海马 各区均有突触传递的习得性突触效应长时程增强产生，它既能较长时间保持，又能 与习得行为相应地迅速变更一消退和再形成，这符合记忆的保持和具有可塑性的特 征。 大量研究证明了人类和动物的学习、情景记忆、空伺记忆能力及行为的改变与 海马结构的异常有关。a d 典型的病理特征是神经元内出现神经纤维缠结( n f t ) ， 细胞外有淀粉样蛋白沉积的老年斑( s p ) 和特定脑区选择性神经元数丢失，这些损 伤主要位于前脑基底部、海马和大脑皮质。氧自由基对海马神经元的损伤是记忆下 降的重要原因。衰老病人会出现认知障碍和海马萎缩等症状【凋，进一步的研究证明 海马的萎缩是由于出现了衰老性神经元缺失，并且呈年龄依赖性【9 1 0 1 ，这种年龄依 赖的缺失还可能与衰老大鼠胶质细胞源性神经营养因子缺乏有关【l o l ，慢性应激导致 海马神经生长因子( n g f ) m r n a 表达降低【1 1 1 ，加速了衰老的进程。 p a r k 等【1 2 】发现激素可以抑制a b 对大鼠海马神经元的神经毒性，而且雄性激素比 1 2 山东帅范人学硕i ：学位论文 雌性激素有更好的保护作用。在对神经病学【l3 1 的研究中发现，整个海马齿状凹部分 细胞均有凋亡，但左侧海马的细胞凋亡要高于右侧。脑组织或细胞暴露于c o , p 可造 成组织缺氧而使细胞凋亡，但c o 在细胞内的作用靶细胞和途径知之甚少，t o f i g h i a 等【4 i 对大鼠海马神经元和人胶质细胞d 3 8 4 进行了研究发现暴露于8 0 c 0 和2 0 0 2 的低氧环境中4 8 h ，细胞凋亡指标明显，凋亡信号转导过程中是c a s p a s e s 蛋白水解酶 和钙蛋白酶共同起作用实现的。 2 0 0 3 年纽约大学和哈佛大学的神经科学家们【1 5 】通过研究猿猴海马区神经元的 活动，揭示了大脑是如何发送信号形成新的联想记忆的。研究人员通过用电极监控 猿猴大脑中执行联想学习任务的海马区的个体神经元的电活动检查了联系记忆形 成的神经相关性，这些神经和行为数据通过动力估测运算法则分析。实验结果显示 神经元与新联想记忆的最初形成有关，并可能参与了最终长期记忆形成中的联想的 储存。该研究结果是证明海马区与学习相关的可塑性的迄今为止最直接的证据。 英国科学家最近研究发现，大脑海马区受损的人除记忆力不好之外，想象能力 也会变差。海马区受损者被要求想象某件具体事情时( 如未来的一次朋友聚会) ， 他们自己无法在大脑中形成具体形象，取而代之的是一堆分离的图像碎片。研究人 员认为，这可能是因为海马区负责为大脑提供构建各类形象的环境。 因此，原代培养大鼠海马神经元，可为探讨一些疾病的发病机制以及研究药物 和各种代谢过多或缺失对细胞生长、发育、分化等各方面的影响提供细胞模型。 1 1 2 神经细胞的凋亡诱导 细胞凋亡( a p o p t o s i s ) 又叫细胞程序性死亡( p r o g r a m m e dc e l ld e a t h ，p c d ) 。 是细胞在特定环境下的主动自杀过程，凋亡常是单个细胞发生一系列超微结构的变 化。凋亡的特征为细胞首先变圆，随即与周围细胞脱离，胞膜起泡失去微绒毛，胞 浆浓缩，内质网扩张呈泡状并与细胞膜融合，核染色质密度增高，聚集在核膜周边 ( 周边化，m a r g i n a t i o n ) ，核仁裂解，进而胞膜内陷，自行分割成多个外有膜包裹、 内含物不外溢的凋亡小体。细胞坏死为细胞成群死亡并伴有炎性反应，特征为细胞 膜破裂，失去离子转运能力，细胞肿胀和降解( 如图l 一3 细胞凋亡与坏死的比较) 。 可诱导细胞凋亡的f 司素很多，例如：细胞营养因子的缺失l ：致凋亡刚f 如： b 一淀粉蛋白、肿瘤坏死冈f ( t n f ) 、糖皮质激素( g c ) 或谷氨酸( g l u ) 等的存在； 活性氧的刺激如：h 2 0 2 、o 。、o h 和n o ：抗癌制剂的使用以及其它多种物雕性、 山东师范人学坝i 学位沦文 化学性、生物性因素的存在。 正 图1 3 细胞凋亡与细胞坏死的比较 瞻 1 1 2 1 致凋亡因子 1 ) b 一淀粉样蛋白与神经毒 9 0 年代初，y a n k n e r 等首先观察到较高浓度的a d 能引起神经元退化和死亡，并 证实引起毒性的必需结构是其2 5 3 5 位的氨基酸序列( a 1 3 2 5 3 5 ) 。a 1 3 来自一分子量 更大的p 淀粉样前体蛋白( p a m y l o i dp r e c u r s o r p r o t e i n ，a p p ) 。a s h a l lf 研究发t 见a 1 3 是各种原因诱发a d 的共同通路，是a d 形成和发展的关键因素【 1 。a d 的神经毒性涉 及到复杂的分子机制，主要包括促进自由基的形成、破坏细胞内f i _ 勺c a 2 + 稳态l 博1 ，降 低k + 通道的功能 ，增强致炎细胞因子引起的炎症反应，兴奋性氨基酸的毒性增加 和补体的激活。 正常状况下，自由基产生和消除的速率维持着一种动态平衡，a p 肽段等因素诱 发的氧化应激可打破此平衡2 0 t 2 1 。有研究证明a p 2 卜3 5 的毒性作用致使a d 大鼠脑 组织产生一系列活性氧( r o s ) ，过多的r o s 使蛋白质结构氧化受损，导致多种酶活 力下降甚至失活。此后m a c c i o n i1 2 4 1 等也发现a p 诱导的自由基损伤敛神经细胞凋亡町 能是a d 瘸邢现象的最终结局。 2 ) 肿瘤坏死因子一0 【( t n f 一0 【) 4 山东师范大学硕士学位论文 细菌脂多糖( l p s ) 可刺激心肌梗塞( m i ) 患者产生t n f - a ，砷舢也可能产生 少量t n f - n 。在人胚胎原代神经元培养中发现，t n f - o t 有增强n 甲基d - f 冬氨酸 ( n m d a ) 受体介导的神经毒性作用【2 5 l ，且对人神经元细胞h n 3 3 1 有细胞毒作用。 大鼠神经细胞培养中，n 晒吨通过作用于a 占间接发挥了细胞毒性而引起神经元的损 伤。直接将t n f - u 注射到小鼠小脑，可引起普遍性损伤。t n f a 还可增强谷氨酸对 中枢神经系统的神经毒性作用。t n f a 可诱导大鼠视觉神经的损伤【捌 3 ) 一氧化氮( n 0 ) 与神经毒 一氧化氮( n o ) 是一种自由基，具有单个未配对电子，化学性质非常活泼， 可与分子氧形成氧自由基和过氧化氢。它在细胞信息传递、细胞防御和损伤过程中 可通过不同的途径诱导众多细胞的凋亡f 2 7 】，细胞内源性和外源性n o 的增加可导致 细胞凋亡，其原因可能是对d n a 的直接损伤而导致细胞凋亡。 在人的中枢神经系统，砷a s 是产生n o 的主要细胞，i l - 1 1 3 是一个关键性因子， 可直接刺激人a s 产生n o 。实验也证明白细胞介素处理过的a s 能产生足够量的n o ， 而造成神经细胞损伤i 捌。m i 产生的n o 具有细胞毒性作用，它可能参与神经损伤及 神经退行性疾病的病理过程。n o 合酶抑制剂或能抑制m i 活性的物质均可减轻m i 介 导的神经元损伤。利用硝普钠( s o d i u mn i t r o p r u s s i d e , s n p ) 作为n o 的外援性供体可 通过阻滞细胞于g o g t 期显著抑制细胞凋亡。另夕b s l , , r p 产生的n o 能直接杀伤培养中 的人类胚胎皮层神经元炎症条件下，脑内的胶质细胞可以表达诱生型一氧化氮合酶 ( i n d u c i b l en o s ，i n o s ) ，产生大量n o ，导致神经元坏死或凋亡近来研究者【2 9 , 3 0 l 发现n o 是神经系统中一种重要的逆行递质。一般情况下，持续与低水平的n o 或过 氧亚硝酸盐接触引起神经元凋亡，而短暂与高水平的n o 或过氧亚硝酸盐接触则引 起神经元坏死f ，l 】 4 ) 糖皮质激素( g o ) g c 是应激情况下分泌的类固醇激素( s t e r o i dh o r m o n e ) ，g c 的最主要功能是调 节机体对应激的能量反应，并可影响纽胞承受凋亡的能力【3 2 1 。皮质酮 ( c o r t i c o s t c r o n e ，c o r t ) 是大鼠肾上腺分泌的主要g c ，人类分泌的g c 中最重要的是 皮质醇( c o r t i s 0 1 ) ，地塞米松( d e x a m e t h a s o n e 。d e x ) 及甲基强的松龙 ( m e t h y p r e d n i s o l o n e ，m p ) 是基础及临床研究中常用的人工合成的g c 。 山东师范大学硕士学位论文 g c 能够提高海马神经元对死亡的敏感性。实验证明1 3 6 1 作用一定时间、一定 浓度的g c 对于体外正常培养条件下的海马神经元，具有促凋亡作用。g c 诱导的海 马神经元死亡是通过猾亡的形式完成的，而且g c 不足或过高都有诱发神经元凋亡的 作用【弘j 7 1 。 有两种类型的肾上腺皮质激素受体( a d r e n o c o r t i c o s t e r o i dr e c e p t o r , a c r ) 可以介 导糖皮质激素的活性，即m r 和g r 。一旦受体与配体结合，m r 和g r 将扮演转录因 子角色，调节基因表达，从而控制包括发育、代谢、记忆、炎症、免疫功能和细胞 死亡等许多生理过程，保持细胞稳态1 3 3 】。g r 的激活可以引起海马细胞的凋亡；相 反m r 的激活可以起到神经保护作用3 8 3 引。a l m e i d a l 4 0 瞎认为，这与它们有不同的能 力影响b c l - 2 基因家族成员表达相关。在大鼠海马区，g r 的激活可提高促凋亡分子 b a x 与抑制凋亡因子b c l - 2 的比率，诱导细胞死亡，而m r 正好相反。 5 ) 谷氨酸( g i u ) g l u 是m i 激活后产生的一类神经毒物质，它是一种是中枢神经系统含量最丰富 的兴奋性氨基酸( e a a ) 。目前认为，神经细胞的缺血缺氧、退行性病变、变性、炎 性损伤等都可能与e a a 的神经毒性有关。有资料表明，大鼠离体海马齿状回突触反 复受到刺激可引起突触前膜的谷氨酸释放增加，突触传递效能也加强，并与突触效 应长时程增强和学习行为密切相关4 。脑缺氧缺血后神经细胞夕t g l u 大量堆积，从 而大量激活n m d a 受体，引起受体介导的钙通道开放，大量钙离子内流，是导致神 经细胞变性、坏死或凋亡的重要原因【4 纠3 1 。缺血性中风、a d 和p d 等中枢神经系统 疾病的发生和发作中会导致谷氨酸过渡释放，产生严重的神经毒性，弓 起神经元的 损伤或死亡。在癫痫发作、脑缺血损伤、脑外伤等疾病的脑损伤过程中谷氨酸起着 内源性神经兴奋性毒性作用，在神经系统内堆积或释放过量是神经细胞损伤的关键 因素i j j 。 6 ) 活性氧自由基( 下部分详述) 1 1 2 2 活性氧引起的神经细胞损伤 活性氧可以引起细胞的直接捌r ：，近年来常被用来建立备种中枢系统的疾瘸模 型。a k s e n o v a “1 等运用氧化损伤建：了老年性痴聚( a l z h e i m e r sd i s e a s e ，a d ) 、帕 金森综合症( p a r k i n s o n sd i s e a s e ，p d ) 、传染性蛋白质病( p r i o nd i s e a s e s ，引起疯牛病 6 山东师范大学硕：l 学位论文 的全新的病原体，能够引起人类的感染) 、亨廷顿舞蹈病( h u n t i n g t o n sd i s e a s e ，h d ) 、 艾滋病痴呆复合症( h i va s s o c i a t e dd e m e n t i a , h a d ，即人类免疫缺陷病毒h i v 相关痴 呆) 等c n s 疾病模型。在诸多凋亡的诱因中，体内代谢或外源性因素产生的自由基 均被证实可诱导细胞凋亡1 4 5 l 。衰老、脑缺血缺氧等急慢性脑损伤过程中脑组织产生 的氧自由基( 0 2 、i - 1 2 0 2 、o h 等) 明显增多，由于脑组织中含高浓度不饱和脂肪酸、 儿茶酚胺和高水平的氧化代谢，是氧自由基最易侵袭的靶器官，而脑内保护性抗氧 化酶和非酶性自由基清除剂含量却很低，使脑组织很容易被自由基损伤e 4 6 l 。所以人 们对神经细胞抗自由基氧化方面的研究一直是学术界的研究热点。 自由基是指独立存在的含有一个或一个以上不配对电子的任何原子或原子团。 由于未成对电子总是有成双成对的趋向，所以自由基很容易发生得到或失去电子的 反应而显示较活泼的化学性质。氧分子可以通过单电子接受反应，依次转化为o ( 超氧阴离子自由基) 、h 2 0 2 ( 过氧化氢) 和o h ( 羟自由基) 等中间代谢产物，由 于这些物质直接或间接来自分子氧，所以称为活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) ， 其中0 2 和o h 统称为氧自由基。 线粒体是体内氧自由基的主要来源之一在生物体内，约有9 0 以上的氧分子 是在线粒体中消耗的，它们大部分被电子传递链所传来的电子还原为水，小部分氧 被电子传递链中漏流出来的电子单价还原，形成超氧阴离子。在正常生理状态下， 大约有1 2 的氧在线粒体内转变为超氧阴离子氧在生物氧化反应的分子过程 中是必需物质，但它具有“双刃”作用。一方面，氧作为呼吸链的终端电子受体参与 产生_ a t p 的氧化磷酸化反应；另一方面，氧可通过一系列的化学反应产生有害的氧 自由基。正常情况下，生物体内的氧自由基和抗氧自由基的酶系统处于平衡状态。 正常状态下，体内的自由基处于动态平衡状态，平衡失调时就会产生疾病。当 体内氧自由基产生蠼多或抗氧自由基能力下降就会打破这种平衡，氧自审基在细胞 内浓度增加。机体衰老时线粒体内的自由基大量增加一方面由于线粒体内电子传递 链功能下降，c o q 部位聚集的电子增多，导致电子漏流增加；另一方面由于衰老细