（食品科学专业论文）BLACTOGLOBULIN致敏性降低的免疫学机制.pdf

1 3 5 临床表现3 1 3 6 参断4 1 4b l g 过敏的研究进展5 1 4 1 概述一5 1 4 2b 一1 9 的结构5 1 4 3 生物功能一6 1 4 4b 1 9 的致敏性7 1 5 降低b l g 致敏性的方法8 1 5 1 热处理8 1 5 2 酶水解一9 1 5 3 高压处理9 1 5 4 其他方法1 0 1 6 食物过敏的动物模型1 0 1 6 1 试验动物种类l0 1 6 2 免疫途径l1 1 6 3 牛奶过敏模型1 l 1 7b 1 9 致敏性降低的免疫学评价方法1 2 1 7 1e l i s a 检测方法1 2 1 7 2 其他检测方法1 3 2 材料与方法1 4 2 1 试验仪器和化学试剂1 4 2 i 1 试验仪器1 4 2 1 2 主要试剂与原料1 4 2 2 试验方法15 2 2 1 检测方法1 5 l i 东北农业大学工学硕十学位论文 2 2 2b 1 9 的提取方法1 7 2 2 3 酶的选择及水解条件的优化1 8 2 2 4 水解降低b 1 9 抗原性的研究1 9 2 2 5 水解降低b 1 9 致敏性的机制2 l 2 2 6 统计分析2 3 3 结果与分析。2 4 3 1 蛋白水解酶的选择2 4 3 1 1 酶活力的测定2 4 3 2 酶的最适水解条件的确定2 4 3 2 1 酶水解的最适温度2 4 3 2 2 酶水解的最适时间2 5 3 2 3 酶水解的最适浓度2 5 3 3 过敏原的制备2 6 3 3 1 根据蛋白分离纯化峰收集b l g 。2 6 3 3 2b c a 试剂盒测定的结果2 8 3 3 3s d s p a g e 分析蛋白纯度结果2 8 3 4 水解对b 1 9 致敏性影响的体液免疫机制2 8 3 4 1b 1 9 水解物灌胃对小鼠致敏性的影响。2 8 3 4 1b 1 9 水解物灌胃对小鼠致敏性的影响2 8 3 5 水解降低b 1 9 致敏性的细胞学机制3 3 3 5 1 细胞因子的测定3 3 3 5 2 细胞亚型的测定3 3 4 讨论3 s 4 1 酶解条件的优化3 5 4 2 水解降低b 1 9 致敏性的机制3 5 4 2 1 水解作用对体外淋巴细胞增殖的影响3 5 4 2 2 水解作用对小鼠血清i g e 量的影响3 6 4 2 3 水解作用对小鼠血浆组胺含量的影响3 6 4 2 4 酶水解物对小鼠脾细胞亚型的影响3 7 4 2 5 酶水解物对细胞因子分泌的影响3 7 5 结沦3 9 致谢4 0 参考文献4 l 攻读硕士学位期间发表的论文5 4 j一 c o n t e n t s c o n t e n t s c b i n e s ea b s t r a c t i e n g l i s ha b s t r a c t i i 1i n t r o d u c t i o n 1 1 1p u r p o s ea n ds i n i f i c a n c e i 1 2m a i nc o n t e n t s 1 1 3c o w sm i l ka l l e r g y 1 1 3 1d e f i n i t i o no fc o w sm i l ka l l e r g y 1 1 3 2c o w sm i l ka l l e r g e n s 2 1 3 3e p i d e m i o l o g yo fc o w sm i l ka l l e r g y 2 1 3 4p a t h o p h y s i o l o g y 3 1 3 5c l i n i c a lm a n i f e s t a t i o n 3 1 3 6d i a g n o s i s 4 1 4r e s e a r c ho nb - i ga l l e r g y 5 1 4 1s u m m a r y 5 1 4 2s t r u c t u r eo f i 1 9 5 1 4 3b i o l o g i c a lf u n c t i o n 6 1 4 4s e n s i t i z a t i o no fb 1 9 7 1 5t h em e t h o dt or e d u c es e n s i t i z a t i o no ff l l g 8 1 5 1h e a tt r e a t m e n t 8 1 5 2e n z y m a t i ch y d r o l y s i s 9 1 5 3h i g h e rp r e s s u r et r e a t m e n t 9 1 5 4o t h e rm e t h o d s 1 0 1 6a n i m a lm o d e lo f f o o da l l e r g y 1 0 1 6 1c a t e g o r yo f e x p e r i m e n t a la n i m a l s 1 0 1 6 2i m m u n i z a t i o nw a y s 11 1 6 3a n i m a lm o d e lo nc o w sm i l ka l l e r g y 11 1 7i m m u n o l o g i c a le v a l u a t i o nm e t h o do nd e c r e a s e db l gs e n s i t i z a t i o n 12 1 7 1e l i s a d e t e c t i o nm e t h o d 1 2 1 7 20 t h e rd e t e c t i o nm e t h o d s 1 3 2m a t e r i a la n dm e t h o d 1 4 2 1i n s t r u m e n t sa n dc h e m i c a lr e a g e n t s 1 4 2 1 1i n s t r u m e n t s 1 4 2 1 2m a i nc h e m i c a lr e a g e n t sa n dm a t e r i a l s 1 4 2 2m e t h o d 15 2 2 1d e t e c t i v em e t h o d 15 l 东北农业大学工学硕二t 学位论文 2 2 2e x t r a c t i o no f b 1 9 1 7 2 2 3s e l e c t i o no f e n z y m ea n dt h eo p t i m i t i o no f h y d r o l y s i sc o n d i t i o n s 1 8 2 2 4s t u d yo nt h er e d u c t i o no f l 一l ga n t i g e n i c i t yb yh y d r o l y s i s 19 2 2 5t h e m e c h a n i s mo f t h er e d u c t i o no f 6 一l ga l e r g e n i c i t y b y h y d r o l y s i s 。2 1 2 2 6s t a t i s t i c a la n a l y s i s 2 3 3r e s u l t sa n da n a l y s i s 2 4 3 1t h es e l e c t i o no f p r o t e o l y t i ce n z y m e 2 4 3 1 1d e t e c t i o no f e n z y m a t i ca c t i v i t y 2 4 3 2d e t e r m i n a t i o no f t h eo p t i m a lh y d r o l y s i sc o n d i t i o n so f e n z y m e 2 4 3 2 1t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r eo fe n z y m a t i ch y d r o l y s i s ”2 4 3 2 2t h eo p t i m a lt i m eo f e n z y m a t i ch y d r o l y s i s 2 5 3 2 3t h eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o no fe n z y m a t i ch y d r o l y s i s 2 5 3 3p r e p a r a t i o no fa l l e r g e n 2 6 3 3 1t oc o l l e c tp u r i f i e df l _ l ga c c o r d i n gt op r o t e i np e a k 一2 6 3 3 2t h em e a s u r e dr e s u l to f b c ak i t 2 8 3 3 3t h ea n a l y s i so f p r o t e i np u r i t yb ys d s p a g e “2 8 3 4t h ee f f e c to f h y d r o l y s i so nr e d u c t i o no f a l e r g e n i c i t yo f b l g 2 8 3 4 1t h ee f f e c to f b 1 9h y d r o l y s a t eo nt h es e n s i t i z a t i o no f g a v a g eg r o u p 2 8 3 4 1t h ee f f e c to f f 1 9h y d r o l y s a t eo nt h es e n s i t i z a t i o no f f e e d i n gg r o u p 2 8 3 5t h ec e l l u l a rm e c h a n i s mt or e d u c es e n s i t i z a t i o no f b l gb yh y d r o l y s i s 。3 3 3 5 1d e t e c t i o no f c y t o k i n e 3 3 3 5 2d e t e c t i o no f c e l ls u b t y p e s 3 3 4d i s c u s s i o n 3 5 4 to p t i m i z a t i o no f h y d r o l y s i sc o n d i t i o n s 3 5 4 2t h em e c h a n i s mt or e d u c e db 1 9a l l e r g e n i c i t yb yh y d r o l y s i s 3 5 4 2 ie f f e c to f h y d r o l y s i so nv i t r ol y m p h o c y t ep r o l i f e r a t i o n 3 5 4 2 2e f f e c to f h y d r o l y s i so nm o u s es e r u mi g e 3 6 4 2 3e f f e c to f h y d r o l y s i so nm o u s ep l a s m ah i s t a m i n e 3 6 4 2 4e f f e c to f h y d r o l y s i so nm o u s es p l e e n ss u b t y p e s 3 7 4 2 5e f f e c to f h y d r o l y s i so ns e c r e t i o no f c y t o k i n e 3 7 5c o n c l u s i o n 3 9 a c k n o w l e d g e m e n t 4 0 r e f e r e n c e 4 1 p u b l i s h e dp a p e r sd u r i n gs p e c i a l i z i n gt h ed e g r e eo fm a s t e r 5 4 、jr 研究生独创声明和使用授权书 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 洼；翅遗直墓丝盏噩挂型直魉鲍：奎拦豆窒2 或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位敝作者繇碑髯吼计年多月争日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解 密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 导师签名 压珲翠 日期：弘卢年f 月印日 日期：知内年多月严 摘要 捅斐 牛乳b 一乳球蛋白( b 1 9 ) 是胎儿出生后遇到的第一个外来过敏原，并且它是导致牛乳蛋白 过敏的主要过敏原。酶水解作用可以导致b l g 空间三维结构的变化，但是该酶诱导结构变化 对其致敏性的意义还不清楚。为了探明水解作用对b 一1 9 致敏性或者抗原性的影响，本实验利 用小鼠动物模型研究了水解作用对b 1 9 致敏性的影响。 本研究主要从以下几个方面探讨了水解降低b 1 9 致敏性的机制：脾淋巴细胞增殖实验； e l i s a 方法检测血清和小肠液中的i g e 水平；利用试剂盒检测血浆中组胺水平；还检测了脾淋 巴细胞培养上清中各种细胞因子( i l - 2 ，i l - 4 ，i l - 1 0 ，i f n q ) 水平，脾淋巴细胞表面抗原( c d 4 + ， c d 8 + ，c d 3 + ，c d l 9 + ) 。 脾细胞是主要的淋巴细胞，本试验通过淋巴细胞增殖试验来研究b l g ，和b 一1 9 水解物在体 内免疫调节作用，不h l l c o n a 组数据表明，和b 1 9 水解物以及o v a 组相比，1 3 - 1 9 胄g 够显著刺激 脾淋巴细胞增殖( 分别为p = 0 0 1 ，p = 0 0 0 1 ) ，1 3 - l g 水解物和o v a 相比，差异也是极显著的。 ( 萨o 0 0 2 ) 。并且，j d c o n a 的各组与不h i c o n a 的实验组相比有相同的趋势。例如b 1 9 组和 酶b 1 9 水解物组以及o v a 组相比，差异都显著( 分别为p = 0 0 0 7 ，p = 0 0 01 ) 。除此之外，添加 c o n a 和不添j j i c o n a 实验组相比，整体趋势是不添j j c o n a 组要比添力n c o n a 组有较大的刺激 性( p = o 5 0 8b - i gv sb - l g + c o n a ) 。 使用e l i s a 方法检测了小鼠血清和小肠液i g e 抗体水平，结果表明j 3 1 9 组小鼠血清i g e 水平 要高于b l g 水解物组小鼠，而小肠液中i g e 水平和血清i g e 水平变化趋势一致，但是整体水平 要高于血清。 在本试验中，血浆组胺是通过e l i s a 试剂盒检测的，结果表明，灌胃】3 一l g 组小鼠血浆组胺 水平显著高于酶解b 1 9 组和o v a 组( 分别为p = 0 0 0 2 ，p = 0 0 0 0 ) 。酶解b l g 组血浆组胺水平也显 著高于o v a 组( p = 0 0 0 7 ) 。 本实验还检测了脾淋巴细胞培养上清中t h l 型细胞因子( i l 2 ，i f n y ) 和t h 2 型细胞因子 ( i l - 4 ，i l 1 0 ) 。在脾细胞培养液中加入b 1 9 $ n 1 3 1 9 水解物，和对照组细胞相比，对其细胞因 子分泌水平影响不大，差异不显著。但是，在有c o n a 存在时，b 一1 9 显著的刺激了i l 4 ，i l 1 0 ， i f n - v 的分泌。除此之外，由于b 1 9 的存在，抑制了c o n a n 激的脾细胞中i l 一2 的表达，但是和 空白组相比差异不显著。另一方面，b 1 9 水解物增加t i f n - y 在c o n a n 激的脾细胞中的表达， 但是对其他细胞因子的分泌没有影响。这些结果说明，b 1 9 水解物不但能够抑制脾细胞增殖， 还对细胞因子的分泌有调节作用。 创新点： 对水解作用对b 1 9 致敏性的影响进行了系统的研究。利用b 一1 9 作为致敏原，b a l b c d , 鼠为 动物模型，研究血清i g e ，血浆组胺水平，细胞因子水平，细胞表面抗原，解释了水解作用降 低b 1 9 致敏性的免疫学机制，为信号转导、体液免疫等进一步研究过敏降低机制提供了参考。 关键词b 1 9 ：水解；过敏 0j a b s t r a c t t h ei m m u n o l o g i c a lm e c h a n i s m so ft h er e d u c t i o no f a l l e r g e n i c i t yo fb - - l a c t o g l o b u l i n a b s t r a c t b o v i n e1 3 - 1 a c t o g l o b u l i n ( 1 3 l g ) i so n eo ft h ef i r s tf o r e i g na n t i g e n se n c o u n t e r e db yan e w b o r n c h i l d ，a n di ti st h em a j o ra l l e r g e nc a u s i n gc o w sm i l ka l l e r g y h y d r o l y s i sc a nc a u s ec h a n g e st ot h e p r o t e i ns t r u c t u r e ，b u tt h es i g n i f i c a n c eo fh y d r o l y s i s - i n d u c e dc h a n g e sf o ri m m u n o g e n i c i t yo r a l l e r g e n i c i t yi sn o tk n o w n t oc l a r i f yh o wh y d r o l y s i sa f f e c t sa l l e r g e n i c i t ya n di m m u n o g e n i c i t y ， t h es e n s i t i z a t i o no f1 3 - l gb ye n z y m a t i ch y d r o l y s i sw a se v a l u a t e di n t h i sp a p e ru s i n gt h em o u s e m o d e l t h i ss t u d ye x p l o r e dt h em e c h a n i s mt or e d u c et h es e n s i t i z a t i o no fh y d r o l y s i s1 3 - l gb yt h e f o l l o w i n ga s p e c t s ：s p l e e n sl y m p h o c y t ep r o l i f e r a t i o nt e s t ；i g el e v e l si ns 豇 u ma n di n t e s t i n a lt r a c t s b ye l i s am e t h o d ；d e t e r m i n a t i o no fp l a s m ah i s t a m i n el e v e l su s i n gk i t s ；v a r i o u sc y t o k i n e si nt h e s u p e m a t a n t so fs p l e e nc e l l s ( i l - 2 ，i l 4 ，i l 1 0 ，i f q - t ) ，s p l e e nl y m p h o c y t es u r f a c ea n t i g e n ( c d 4 + ， c d 8 + ，c d 3 + ，c d19 + ) s p l e e n sw e r et h em a i nl y m p h o c y t e ，a n dt h i sa r t i c l er e s e a r c h e di m m u n o m o d u l a t i n ge f f e c to f b l g a n de n z y m a t i ch y d r o l y s i s 3 - l g i nv i t r ob ym e a s u r i n gt h e i ri m p a c t so nl y m p h o c y t e p r o l i f e r a t i o nw h i c hw e r ee x p r e s s e da sas t i m u l a t i o ni n d e x ( s i ) a n dw a se v a l u a t e dw i t ha n dw i t h o u t s u b o p t i m a lc o n c e n t r a t i o n ( 0 5m g m 1 ) o fc o n a ( f i g2 ) t h er e s u l t so fa b s e n c ec o n as h o w e dt h a t b - l gc o u l ds i g n i f i c a n t l ys t i m u l a t el y m p h o c y t ep r o l i f e r a t i o nt h a ne n z y m a t i ch y d r o l y s i s1 3 一l ga sw e l l a so v a ( p = o o1 ，p = o 0 0 0r e s p e c t i v e l y ) ，t h er e s u l to fc o m p a r i n ge n z y m a t i ch y d r o l y s i s1 3 - l gt o o v aa l s os h o w e do b v i o u sd i f f e r e n c e0 = o 0 0 2 ) f u r t h e r m o r e ，t h ec o n ap r e s e n tg r o u ph a dt h e s a m et r e n dw i t ht h ea b s e n c eg r o u p t h e1 3 - l gg r o u ps h o w e ds i g n i f i c a n td i f f e r e n c et oe n z y m a t i c h y d r o l y s i s3 - l ga sw e l la so v a ( p = 0 0 0 7 ，p = o 0 01 ，r e s p e c t i v e l y ) b u tw i t h o u to b v i o u sd i f f e r e n c e c o m p a r e dt oe n z y m a t i ch y d r o l y s i s1 3 - l g ( 1 0 = o 0 61 ) b e s i d e s t h ew h o l et r e n db e t w e e na b s e n c e c o n aa n dp r e s e n tc o r t aw a st h a tt h ea b s e n c ec o n ag r o u ps h o w e dal o w e rs t i m u l a t i o nt h a n p r e s e n tc o n ag r o u p ，b u tt h ed i f f e r e n c ew a sn o ts i g n i f i c a n t0 = o 5 0 83 - i gv s1 3 - l g + c o n a ) e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) m e t h o d sw e r ed e v e l o p e dt oq u a n t i f yt h e a n t i b o d yl e v e li nb a l b cm o u s eb yg a v a g eo f3 - l ga n de n z y m a t i ch y d r o l y s i s1 3 - l g 、们t hd o s a g e so f lo m g m l ，lo m g m l ，r e s p e c t i v e l y t h es e r u mi g el e v e li nb l gg r o u pa n di n t e s t i n a lf l u i ds a m p l e s w e r eh i g h e rt h a nt h o s ei ne n z y m a t i ch y d r o l y s i sg r o u p ，b u tt h et o t a li g el e v e li ni n t e s t i n a lf l u i d s a m p l e si sh i g h e rt h a ns e r u mi g e p l a s m ah i s t a m i n el e v e l sw e r ed e t e r m i n e db ya ne l i s ak i ta n dt h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e h i s t a m i n el e v e lo fm i c ec h a l l e n g e di n t r a g a s t r i c a l l yw i t h3 - l gs h o w e ds i g n i f i c a n th i g hl e v e lt h a n e n z y m a t i ch y d r o l y s i s1 3 - l ga n do v a0 = 0 0 0 2 ，p = 0 0 0 0 ，r e s p e c t i v e l y ) ( f i g4 ) t h eh i s t a m i n e l e v e l so fe n z y m a t i ch y d r o l y s i s3 - l ga l s os h o w e ds i g n i f i c a n th i g hl e v e lt h a no v a ( p = o 0 0 7 ) t h i sp a p e ra l s oe x a m i n e dt h es e c r e t i o no ft hl ( m - 2 ，i f n 一丫) a n dt h 2 ( i l 4 ，i l 一10 ) c y t o k i n e s b yr e s t i n gs p l e n o c y t e s ，a n dt h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tn a t i v e3 - l ga n de n z y m a t i ch y d r o l y s i s1 3 - 1 9h a d i i 东北农业大学工学硕士学位论文 i i n oe f f e c to nt h es e c r e t i o no f t h l ( i l 2 ，i f n - y ) a n dt h 2 ( i l _ 4 ，i l 1 0 ) c y t o k i n e s ，w h i l en a t i v eb - l g s i g n i f i c a n t l ys t i m u l a t e dt h es e c r e t i o no fi l 一2a n di f n - yw i t hc o n a - i n d u c e ds p l e e n s ，w h e r e a s e n z y m a t i ch y d r o l y s i sb - l gs i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e di f n 吖s e c r e t i o n t h e s e r e s u l t ss u g g e s tt h a t h y d r o l y s i n gt h eb - l gn o to n l ye l i m i n a t e si t si n h i b i t i n ge f f e c to nt h ep r o l i f e r a t i o no fs p l e n o c y t e si n t h ep r e s e n c eo fc o n ab u ta l s om o d i f i e si t se f f e c to nc ”o k i n es e c r e t i o n i n n o v a t i o n t h i sp a p e rs y s t e m i c a l l yd e t e c t e dt h es e r u mi g e ，p l a s m ah i s t a m i n el e v e l s ，c ”o k i n el e v e l sa n d c e l ls u r f a c ea n t i g e n s ，u s i n gb - l ga sa l l e r g e n s ，b a l b cm i c ea sa n i m a lm o d e l ，f i r s t l yf i o mt h e p e r s p e c t i v eo fi m m u n o l o g y , a n de x p l a i n e dt h ei m m u n o l o g i c a lm e c h a n i s mo f l o w e rs e n s i t i z a t i o n o fh y d r o l y s i s3 - l g w h i c hp r o v i d e dr e f e r e n c e sf o rt h es i g n a lt r a n s d u c t i o n ，h u m o r a li m m u n i t ye t c k e y w o r d sb l a c t o g l o b u l i n ；h y d r o l y s i s ；a l l e r g y i i i c a n d i d a t e ：d u a nc u i c u i s p e c i a l i t y ：f o o ds c i e n c e s s u p e r v i s o r ：p r o f h u og u i c h e n g l 引言 l 引言 1 1 研究目的和意义 食物过敏是指机体受到某些食物成分刺激后产生的一种以生理功能紊乱和组织损伤为 主要表现的病理性免疫反应。牛乳是一种营养非常丰富流体食品，但属于易引起过敏反应的 食物之一。引起牛乳过敏的蛋白质主要是b 1 9 、a 乳白蛋白和酪蛋白，其中作为乳清蛋白主要 成分的b 1 9 是主要过敏原。 本研究旨在通过酶水解作用获得低致敏性b 1 9 改性产物，采用免疫学方法从细胞及分子 水平探明b 1 9 水解物产物对血清抗体水平，组胺水平，细胞因子、细胞亚型影响，剖析其致 敏性降低的免疫学原理。通过该课题探讨b 1 9 水解物产物致敏性降低的免疫学机制，揭示1 3 1 9 抗原性及其免疫调节活性的关系，为低致敏性蛋白改性产物的研究提供理论基础，为低致敏 性乳蛋白制品的开发提供技术支持和理论依据。本研究属于低致敏婴儿配方粉的基础理论研 究，最终目的是开发出适合过敏体质婴儿的配方粉。 1 2 主要研究内容 1 采用酶水解方法进行降低b 1 9 抗原性的技术研究，主要是参考本实验室之前的研究， 采用最优的水解方法，包括水解酶、水解的温度、时间等。 2 采用沉淀，离心及分离纯化的方法从乳清粉中分离出主要的过敏原，