（食品科学专业论文）一种纤溶酶SPFEⅢ的生物制备、分离纯化及酶学性质研究.pdf

摘要 摘要 血栓栓塞性疾病主要包括脑血栓、心肌梗死、静脉血栓等，是目前临床上死亡率最 高的疾病之一，并且在世界范围内的发病率正逐年上升，因此人们一直都在研制开发新 型的溶血栓药物。本文从亚洲传统发酵食品虾酱中筛选到一株产纤溶酶能力较强的 菌株，由中国典型培养物保藏中心定名为b a c i l l u ss p n o v s k 0 0 6 ( c c t c cn o ：m 2 0 5 0 7 1 ) ，已经证明该菌株能产生四种不同的纤溶酶，本文在优化该菌产酶条件的基础 上，主要对芽孢杆菌b a c i l l u ss p n o v s k 0 0 6 产生的其中一种纤溶酶( s p f e - i i i ) 作了深入 的研究。 首先在摇瓶水平上考察了培养基组成及培养条件对b a c i l l u ss p n o v s k 0 0 6 发酵产纤 溶酶能力的影响，结果表明该菌株产酶最佳的培养基组分为：葡萄糖2 0g l ，胰蛋白胨 3 0g l ，n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 01 5g l ，n a h 2 p 0 4 2 h 2 01 3g l ，m g s 0 4 。7 h 2 00 5g l ，c a c l 2 o 1g l ；最佳培养条件：种龄1 8h ，接种量3 ，发酵周期2 4h ，初始p h 为7 o ，摇床转速 1 8 0r m i n ，发酵温度3 7 0 c ，在此条件下发酵液纤溶活性( 以p l a s m i n 为标准) 高达2 6 3u m l ， 是优化f i i f o 7 0u m l 的3 7 6 倍。 芽孢杆菌b a c i l l u ss p n o v s k 0 0 6 的发酵液经乙醇沉淀、离子交换层析 ( d e a e - s e p h a r o s ec l - 6 b ) 、凝胶过滤层析( s u p e r d e x7 5 ) 后分离纯化出一种电泳纯的纤溶 酶s p f e - i i i ，分子量约为4 2 8k d a ，酶活为7 1u m g ( 以p l a s m i n 为标准) 。s p f e - i i i 对纤维 蛋白原的降解过程为最先降解q 链，其次是丫链，而对p 链的降解最缓慢；利用加热纤维 蛋白平板法研究纤溶酶s p f e - i i i 对纤维蛋白的作用方式，结果发现该酶对纤维蛋白有直 接降解作用，而对纤溶酶原的敏感性较低。 其次研究了纯化后纤溶酶s p f e - i i i 的酶学性质：最适反应温度为3 0 - 4 0 0 c ，最适反 应p h 范围为7 0 - 8 0 ，在4 0 0 c 下保温lh 剩余酶活力约为6 0 ，而在5 0 0 c 保温1h 剩 余酶活力只有3 0 左右，纤溶酶s p f e - i i i 对高温较为敏感。金属离子实验表明：在实验 选择的范围内，除b a 2 + 外其它金属离子对纤溶酶s p f e q l i 纤溶活性均有一定程度的抑制 作用，其中c u 2 + 、m n 2 + 、f e 3 + 和z n 2 + 的抑制作用较强，抑制率为5 0 左右。抑制剂实验 表明：蛋白酶抑制剂对纤溶酶s p f e 4 i i 有不同程度的抑制作用，e d t a 和b 毓基乙醇对 纤溶酶s p f e i i i 都有较强的抑制作用。 最后分别选择了三种人工合成的发光底物d - v a l - l e u - a r g - p n a 、d - v a l - l e u - l y s - p n a 和n - s u c c - a l a - a l a - p r o - - p h e - p n a 与纤溶酶s p f e - i i i 反应。 s p f e 4 i i 对底物 n - s u c c - a l a - a l a - p r o - p h e - p n a 具有最强的专一性，其酰胺水解活性是7 5 7 7a u ，该底物 是胰凝乳蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶的最适底物。对n - - s u c c - a i a - a l a - - p r o - - p h e - p n a 的米氏 常数为0 2 3 9m m o l l ，酶反应转换数砒为4 7 5 5s 一，表明纤溶酶s p f e - i i i 对该底物 的亲和性较好，反应速度较高。 关键词：芽孢杆菌：液体发酵优化；纤溶酶s p f e i i i ；纯化；酶学性质；纤溶机理 a b s t r a c t a b s t r a c t t h ei n c i d e n c eo ft h r o m b o t i cd i s o r d e ri n c l u d i n gc e r e b r a ls t r o k e ，m y o c a r d i a li n f a r c t i o n ，a n d v e n o u st h r o m b o e m b o l i s ma r er a p i d l yi n c r e a s i n gt h r o u g h o u tt h ew o r l d at r e m e n d o u sa m o u n t o fr e s e a r c hh a sb e e nd o n ei nt h ea r e ao fp r e v e n t i o na n dt h et r e a t m e n to ft h ed i s e a s e s a n e x t r a c e l l a rf i b r i n o l y t i cs t r a i n ，i s o l a t e df r o mf e r m e n t e ds h r i m pp a s t e ，ap o p u l a rs e a s o n i n gi n a s i a nc o u n t r i e s ，w a ss h o w nt oh a v eas t r o n gf i b r i n o l y t i ca c t i v i t y i tw a sn a m e da sb a c i l l u ss p n o v s k 0 0 6b yc c t c c t h es t r a i nw a sp r o v e dt op r o d u c ef o u rf i b r i n o l y t i ci s o e n z y m e s i n t h i ss t u d y , o n ef i b r i n o l y t i ce n z y m e ( s p f e 4 i i ) f r o mb a c i l l u ss p n o v s k 0 0 6w a si n t e n s i v e l y i n v e s t i g a t e d t h em e d i u mc o m p o s i t i o na n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sf o rf i b r i n o l y t i ce n z y m ep r o d u c t i o n w e r eo p t i m i z e di nt h er e s e a r c h t h em a x i m a ly i e l do ff i b r i n o l y t i ce n z y m e ( 2 6 3u m l ) c o u l d b eo b t a i n e di nt h em e d i u mw i t hc o n c e n t r a t i o n so f2 0g lg l u c o s e ，3 0 # lt r y p t o n e ，15g l n a 2 h p 0 4 。1 2 h 2 0 ，1 3g ln a h 2 p 0 4 。2 h 2 0 ，0 5 叽m g s 0 4 7 h 2 0 ，0 1g lc a c l 2 ，r e s p e c t i v e l y , u n d e rt h eo p t i m i z e dc u l t i v a t i o nc o n d i t i o n so fp h7 0 ，r o t a t i o ns p e e d18 0r m i na n di n o c u l a t i o n s i z e3 i n5 0m lo fc u l t u r em e d i u mi n2 5 0m ls h a k ef l a s k sa t3 7 0 cf o r2 4h t h ef i b f i n o l y t i c e n z y m ep r o d u c t i o no fb a c i l l u ss p n o v s k 0 0 6w a s3 7 6t i m e so ft h ec o n t r 0 1 a f i b r i n o l y t i ce n z y m e ( s p f e - i i i ) w h i c hp r o d u c e df r o mb a c i l l u ss p n o v s k 0 0 6 ，w a s i s o l a t e du s i n gac o m b i n a t i o no fe t h a n o lp r e c i p i t a t i o n ，d e a e - - s e p h a r o s ec l - 6 bi o ne x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y ，a n ds u p e r d e x7 5g e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y t h ep u r i f i e ds p f e 4 i it h a t h a sam o l e c u l a rw e i g h to f4 2 8k d aw a sa s s e s s e dh o m o g e n e o u sb ys d s - p a g e t h es p e c i f i c a c t i v i t yw a sd e t e r m i n e dt ob e7 1u m gu s i n gp l a s m i na sas t a n d a r d s p f e 4 i ie f f e c t i v e l y d e g r a d e df i b n nc l o t sb yd k e c tf i b r i n o l y s i s d u r i n gt h ed e g r a d a t i o np r o c e s so ff i b r i n o g e n ， c t - s u b u n i t so ff i b r i n o g e nw e r ec l e a v e df i r s t ，f o l l o w e db ys l o w e rr e l e a s eo ft h et - c h a i n s 1 3 - c h a i n sw e r er e s i s t a n tt ot h ee n z y m ed i g e s t i o n t h ee n z y m eh a da l lo p t i m a lp ho f7 0 - 8 0 i th a da no p t i m a lr e a c t i o nt e m p e r a t u r eo f 3 0 0 c - 4 0 0 c ，a n dk e p t6 0 a n d3 0 o ft h ei n i t i a la c t i v i t ya f t e rh e a t i n ga t4 0 0 ca n d5 0 0 cf o r1 h o u r i na d d i t i o n ，b a r i u mi o ns t i m u l a t e dt h ee n z y m ea c t i v i t yw h e r e a sz n 2 + ，c a 2 + ，f e 3 + ，m n 2 + a n dc u 2 + c a u s e dd e a c t i v a t i o n s p f e - h iw a sc o m p l e t e l yi n h i b i t e de i t h e rb y1 0m m o l le d t a o r1m m o l l2 - - m e r c a p t o e t h a n 0 1 t h ef i b f i n o l y t i ca c t i v i t yw a sp a r t i a l l yi n h i b i t e db yo t h e r p r o t e a s ei n h i b i t o r s p f e 4 i ih a dt h eh i g h e s ta f f i n i t yf o rn - s u c c - a l a - a l a - p r o - - p h e - p n a ，w h i c hi saw e l l - k n o w n s u b s t r a t ef o rs u b t i l i s i no rc h y m o t r y p s i n s p f e - i i ia l s od e g r a d e dd - v a l - l e u - l y s - p n a ( f o r p l a s m i n ) h o w e v e r , i ts h o w e dal o w e ra c t i v i t y f o rd - v a l - l e u - a r g - p n a ( f o rk a u i k r e i n ) c o m p a r e d w i t ho t h e r i n v e s t i g a t e df i b r i n o l ”i ce n z y m e s k ma n d f o r s u c c - a l a _ a l a 干r o 平h e 呻n aw e r e0 2 3 9m m o l la n d4 7 5 5s 叫，r e s p e c t i v e l y 江南大学硕i ：学位论文 i nc o n c l u s i o n ，s p f e 4 i i ，an e wt y p eo ff i b r i n o l y t i ce n z y m e ，h a ss o m ep o t e n t i a lf o rp r a c t i c a l a p p l i c a t i o na sas o u r c eo ff u n c t i o n a lf o o d sa n dn e wt h e r a p e u t i ca g e n t st ot r e a tt h r o m b o s i s k e y w o r d s ：b a c i l l u ss p n o v s k 0 0 6 ；l i q u i df e r m e n t a t i o n ；f i b r i n o l y t i ce n z y m e ( s p f e - i i i ) ； p u r i f i c a t i o n ；c h a r a c t e r i z a t i o n ；f i b r i n o l y t i cm e c h a n i s m r r t 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名： 诎 日 期： 丝窒! 显】 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 导师签名： 垄l 生垂趁盟鲨12 主圣鲢日_ 飙趟。匿：2 第一章绪论 1 1 血栓、血栓栓塞性疾病 第一章绪论 血栓栓塞性疾病是一类严重危害人类健康和生命的常见病与多发病，急性心肌梗死 ( a c u t em y o c a r d i a li n f a r c t i o n ，a m i ) 等血栓塞性疾病的致残和致死率都非常高，是引起人 类死亡的三大疾病之一，据世界卫生组织( w h o ) 统计，由血栓栓塞性疾病导致的死亡已 占全球总死亡的2 9 t 。 血栓是指在活体的心脏和血管内血液凝固而形成的凝块，血栓形成所必需的条件 是：血管壁改变、血流变化和血液性质的改变【2 】。而血管内皮损伤，造成深层的胶原纤 维( 特别是i 型和i i i 型) 和弹力纤维暴露时即可形成血栓【3 1 。血栓病系由血栓引起的血管腔 的狭窄与闭塞，发生主要脏器如脑、心、肺等的缺血性病变和梗塞，从而引起相应机能 障碍的一类疾病，是临床上常见而重要的疾病【4 】。 血液中包含着对立统一的两个系统：凝血系统和溶血系统。这两个系统的相互制约， 既保证血液在血管中畅通无阻，又保证一旦血管壁破损能够及时堵漏。然而在某种因素 影响下，血液中凝血系统和溶血系统之间的平衡失调导致血液凝固形成血栓，从而发生 各种血栓性疾病。血栓栓塞性疾病按形成的部位主要有3 种：冠状动脉疾病形成血栓， 主要是指急性心肌梗塞；脑血管疾病形成血栓，即脑血栓中风；末梢动静脉疾病形 成血栓，即脉管栓塞【5 1 。按照组成和形成的机制不同，又可分为红色血栓、白色血栓、 混合血栓三种。 1 2 凝血途径、血栓形成机理 凝血过程由是一系列凝血因子参与的复杂的生理过程，是复杂的酶促反应，以凝血 酶生成为中心，以纤维蛋白形成而告终。已知参与凝血过程的凝血因子有1 3 个，其本 质均为蛋白质，而且多数是蛋白酶( 原) 。大多数凝血因子都是在肝脏中合成后分泌到血 浆中。目前凝血因子的主要特征和在凝血中的作用基本上己经阐明1 6 】。 凝血酶是一个专一性很强的丝氨酸蛋白酶，不仅血浆中只有纤维蛋白原是它的特异 性底物，而且凝血酶还只限于降解纤维蛋白原中q 链上的精( 1 6 ) 甘( 1 7 ) 之间的键和p 链 上精( 1 4 ) - 甘( 1 5 ) 之间的键，此二键均在n 末端。当将血浆中纤维蛋白原分子的血纤肽 a ( 即c c 链上第1 6 1 7 氨基酸残基断裂后释出的1 6 肽) 和血纤肽b ( 即b 链上第1 4 - 1 5 氨基 酸残基断裂后释出的1 4 肽) 片段释出后，就有血纤维蛋白单体生成。纤维蛋白单体聚合 后，再经凝血因子v i i i a 转酞胺反应和c a 2 + 的作用，就生成交联的、不溶的、纤维蛋白 多聚体【刀。 江南大学硕十学位论文 血管损伤组织因子 a d p 图l - l 血栓形成示意图 f i g 1 - 1m e c h a n i s m o ft h r o m b o s i sf o r m i n g 凝血过程分内源性凝血、外源性凝血及共同凝血途径，最终形成凝血酶，催化纤维 蛋白原向纤维蛋白单体、聚合体转变。如图1 一l 所示：当血管内皮损伤，皮下组织暴露， 血小板就粘附在受损或破裂的血管表面。从而引起血小板聚集和释放出肾上腺紧张素 ( a d t ) ，5 掘色胺( 5 - - h t ) 、肾上腺素和血小板第3 因子( p f - 3 ) 。外源性凝血系统是由组织 损伤时释放的组织因子的启动而被启动；内源性凝血系统则是由各凝血因子的激活而被 启动。血液凝固时产生的凝血酶一方面促使血小板产生前列腺素g 2 ( p g g 2 ) 、前列腺素 h 2 ( p g h 2 ) 、血栓烷素a 2 ( t x a 2 ) ，使血小板大量聚集，形成血小板堵塞物，另一方面使 纤维蛋白原变成纤维蛋白，连接在血小板之间形成血栓。血小板的激活和凝血系统的激 活相辅相成，血小板为凝血因子的激活提供了场所而促进凝血反应；凝血系统产生凝血 酶及纤维蛋白有利于血小板聚集。这一系列的过程造成血栓的形成【6 ，7 1 。 有许多疾病的发生都与血栓的不正常形成密切相关，诸如动脉粥样硬化、高血脂症、 糖尿病、系统性红斑狼疮、肝病、肾病以及恶性肿瘤之类严重危害人类身体健康的病症。 在与血栓相关的各类疾病中，血栓栓塞性疾病最为致命。血栓栓塞性疾病是涉及到血液 和循环系统的疾病，其病残率和病死率均比较高。常见的有冠状动脉疾病形成血栓而引 起的心肌梗塞或心绞痛；脑血管疾病形成血栓，即脑血栓中风；肺动脉栓塞引起肺梗塞 或急性肺源心脏病；肢体动脉血栓形成和栓塞引起肢端疼痛或坏死；肢体静脉血栓形成 引起局部水肿和疼痛；其他脏器的动脉栓塞引起该脏器的梗塞等；全身毛细血管内发生 弥漫性血栓，形成独特的疾病，即散播性血管内凝血【8 】。 1 3 纤溶系统 在人和哺乳动物的血液中存在纤溶系统。体内纤溶系统是一种平衡调节器，由体内 2 第一章绪论 的纤溶作用和抗纤溶作用来保持这种平衡，以免因失去这种平衡而导致疾病的发生。它 担任溶解血栓和防止出血与保护伤口的双重作用。传统的纤溶系统由4 种成分构成，即 纤溶酶原( p l a s m i n o g e n ，p i g ) 、纤溶酶( p l a s m i n ) 、纤溶酶原激活齐l j ( p l a s m i n o g e na c t i v a t o r ， p a ) 和纤溶酶原激活剂抑制物( p l a s m i n o g c na c t i v a t o ri n h i b i t o r ，p a i ) 。 1 3 1 纤溶酶原( p l a s m i n o g e n ，p i g ) 纤溶酶原又称纤维蛋白溶解酶原或血浆素原，是由肝、肾、骨髓和嗜酸性粒细胞等 组织合成的一种单链糖蛋白，分子量为8 6k d a ，以无活性的酶原形式存在于血液中，其 血浆浓度为1 0 0r a g l - 2 0 0m g l ，半衰期为5 0h 。纤溶酶原含有7 9 0 个氨基酸残基和2 4 个二硫键，其n - 端l y s 7 7 - a r 9 5 6 0 区有5 个饼环结构。其中前4 个饼环区结构称为 a n g i o s t a t i n l 9 1 ，具有抑制血管内皮细胞增殖的能力，又称血管生成抑制因子。每个饼环 区又由3 对二硫键维持其空间结构。c a n 发现其第5 个饼环区抑制血管内皮细胞增殖的 能力更强于血管生成抑制因子【1 0 l 。这5 个饼环区与血管生长因子共同调节包括血管内皮 增殖、迁移和分化、细胞外基质的降解、血管腔形成和毛细血管网成熟等一系列复杂过 程【1 1 1 。 1 3 2 纤溶酶( p l a s m i n ) 纤溶酶又称纤维蛋白溶解酶或血浆素，是由纤溶酶原在其激活物的作用下转变而成 的具有纤溶活性的双链结构丝氨酸蛋白水解酶，其作用是使纤维蛋白和纤维蛋白原肽链 中l y s - a r g 之间的肽键裂解( 如图1 - 2 ) ，使其被分割成许多可溶性的小肽，这些降解物还 具有一定的抗凝作用。纤溶酶还可以分解凝血因子v 、x l l 、a c t h 、生长 因子和胰岛素等物质。纤溶酶是这一系统中的关键物质。体内该酶的激活剂和激活物抑 制剂的活性高低，对于维持血液凝固与纤溶过程动态平衡的意义重大。 h 。n _ 三革精氨酸缬氨酸工! 三斗c o o h 1一ss一 c o o h 淞叫h ， h 。n _ 二兰= ；三 k 氨瞍缬氨矗n 【 二坠a h 1一ss_j 图1 - 2 纤溶酶原的激活示意图 f i g 1 - 2a c t i v a t i o no fp l a s m i n o g e n 1 3 3 纤溶酶原激活剂( p l a s m i n o g e na c t i v a t o r , p a ) 内源性的p a 主要有两种：组织性纤溶酶原激活剂和尿激酶型纤溶酶原激活剂。 ( 1 ) 组织性纤溶酶原激活剂 t - p a 最初是从子宫组织分离的，其后发现其存在于几乎所有组织和血管内皮。t - p a 3 江南人学硕上学位论文 是体内纤溶系统的关键成分，它对维持机体内纤溶和凝血系统的平衡，防止血栓形成起 到重要作用。 ( 2 ) 尿激酶型纤溶酶原激活剂 尿激酶首先是从人尿中纯化得到的一种丝氨酸蛋白酶。随后在血浆、血管内皮细胞、 巨噬细胞、肾细胞和多种肿瘤细胞中均发现有尿激酶样活性物质。 1 3 4 纤溶酶原激活剂抑制物( p l a s m i n o g e na c t i v a t o ri n h i b i t o r , p a l ) 正常人血浆中存在许多种能抑制纤溶酶原激活物的物质，如a 2 - - m g 、蛋白酶c 抑制 物、蛋白酶连接酶抑制素( p n i ) 、富组氨酸糖蛋白和a t - m - 肝素复合物等。但较有特异 性的是下列物质：对t - p a ，u k 均有抑制作用的p a i l 、u k 的抑制剂p a i - 2 、补体c i 抑制物。除此之外，正常血浆中还有多种非特异性纤溶酶抑制剂，其中，a 2 航纤溶酶 ( a n t i p l a s m i n ，a 2 - a p ) ，是由肝脏合成或释放的单链糖蛋白，血浆浓度为5 0m g l 。它能 与纤溶酶形成1 ：1 的复合物使其失活。 雠蛋誓纛c 睡疆聋 | 上l 一l l 4 珥 第一章绪论 a 2 - a p 来保持纤溶系统的平衡。纤溶作用是纤溶酶原参与的众多生理和病理过程的基础。 纤溶酶原是纤溶系统的重要成分，在各个生理与病理过程中发挥着举足轻重的调节作 用。纤溶酶原被激活产生纤溶酶的过程是纤溶作用、细胞迁移、细胞外基质降解等多种 生物过程的关键步骤。纤溶酶原激活剂分直接和间接两类，属直接激活剂的有t - p a 和 u - p a ，是自体细胞产生和分泌的。间接的激活剂是由细菌产生的链激酶和葡激酶等。另 外，在纤溶系统中纤溶的底物为纤维蛋白。而纤维蛋白的前体为可溶性的纤维蛋白原。 它在凝血酶的催化作用下形成纤维蛋白。纤维蛋白的积累也是一些疾病发生的一种标 志。如各种血栓病，脑中风，老年痴呆等【1 3 1 4 】。 纤溶酶原在p a 的作用下转变成纤溶酶，纤溶酶将血块上不溶的纤维蛋白降解为可 溶性的产物，从而使血栓溶解。纤溶酶对纤维蛋白的降解与它对纤维蛋白原的降解过程 相似。纤溶酶对纤维蛋白原的降解是逐步进行的。人纤维蛋白原被纤溶酶水解释放出片 断a 、b 、c ，生成具有活性的片断x ；后者进一步被水解生成无凝血活性的片断y 和 d ，片断y 再进而被水解成片断e 和d ( 女f l 图1 3 ) 。所以这些片断统称为纤维蛋白( 原) 降 解产物( f i b r i n o g c nd e g r a d a t i o np r o d u c t ，f o p ) 。纤溶酶就是通过对纤维蛋白的降解来治疗 血栓栓塞性疾病。 1 4 血栓栓塞性疾病的治疗 根据血栓的形成机制以及血小板、凝血酶等因子在血栓形成中的作用，对血栓的治 疗方法可分为预防血栓形成和去除血栓两大类。其中前者又分为抗血小板、抗血栓两类； 后者又分为手术除栓和药物除栓两类。 在临床上较常用的治疗方法主要有三种【1 5 叫凡第一，外科手术，这是去除血栓最迅 速直接的方法，开始于2 0 世纪3 0 年代的法国，5 0 年代流行于美国，这种方法要求条件 复杂，费用昂贵，而且手术后易再栓塞，目前已经较少使用。第二，保守疗法，即给患 者长期服用阿司匹林等药物，除了阿司匹林，较常用的还有肝素。近年来，对医用水蛭 素的研究表明，水蛭素与凝血酶专一结合，无毒性，很少有其它副作用，是一种新型的 抗栓药。这种方法通常与其它方法结合作为辅助治疗。第三，溶栓疗法，即服用或注射 溶栓剂使血管开通，与保守治疗法相比，溶栓疗法治疗后的死亡率显著降低，而且费用 比外科手术低得多。这是目前治疗血栓栓塞性疾病最为有效而且可靠的手段，因此，世 界各国都致力于溶栓药物的研究开发。 1 5 纤溶酶类溶栓剂的应用 溶栓疗法是早期急性心肌梗塞和其它血栓栓塞性心血管疾病的有效治疗方法，其主 要是通过药物溶解血栓中的主要基质血纤维蛋白，或激活血液中无活性的血浆纤溶酶 原，形成有活性的纤溶酶来催化血纤维蛋白的水解，使血栓溶解，血管再通。溶栓疗法 被誉为2 0 世纪心脑血管学方面的十大发现之一【l 引，受到各国的高度重视【l 9 】。 纤溶酶与溶血栓密切相关，纤溶酶在人体内含量少，又难提纯，所以临床治疗中常 用纤溶酶原激活剂和纤溶酶作为外来物增强纤溶作用。因此纤溶酶原激活剂和纤溶酶的 5 江南人学硕j 二学位论文 研究占有重要地位【删。 国内外已正式批准临床使用的主要溶栓剂有：链激酶( s t r e p t o k i n a s e ，s k ) t 2 1 ，勿、尿 激酶( u r o k i n a s e - t y p ep l a s m i n o g e na c t i v a t o r , u k ，u - p a ) 、重组组织型纤溶酶原激活剂 ( r e c o m b i n a n tt i s s u e - t y p ep l a m i n o g e na c t i v a t o r , r t 姒) 1 2 3 1 、对一甲氧苯甲酰纤溶酶原链激酶激 活剂复合物( a n i s o y l a t e dp l a s m i n o g e ns t r e p t o k i n a s ea c t i v a t o rc o m p l e x ，a p s a c ) 和重组链激 酶( r e c o m b i n a n ts t r e p t o k i n a s e r - - s k ) 。s k 和u k 常称为第一代溶剂，它们没有纤维蛋白的 特异性：t - p a 、r t - p a 、a p s a c 和r - s k 称为第二代溶栓剂，有纤维蛋白的特异性。 1 5 1 链激酶( s t r e p t o k i n a s e ，s l o s k 是1 9 3 3 年发现的，1 9 5 5 年最早用于临床。它是从d - 溶血性链球菌培养液中提 取的一种非酶单链蛋白，分子质量为4 8k d a 。2 0 世纪6 0 年代起，s k 已用于抢救急性 心肌梗死等患者，至今仍为常用的溶栓药物之一【2 1 1 。目前已用基因工程技术制备重组链 激酶( r s k ) 。s k 不能直接活化纤溶酶原，其激活纤溶酶原( p i g ) 的机制是间接的，首先， s k 与p i g 按1 ：1 的比例结合形成复合物( s k - - p i g ) ，该复合物中p i g 的构型发生变化，然 后该复合物结合于纤维蛋白表面和游离状态下的p i g ，生成纤溶酶( p l a s m i n ) 。s k 的优点 是有效、价廉，缺点是有抗原性、可降解血纤维蛋白原而引起出血，副作用大等1 2 2 。 1 5 2 尿激酶( u r o k i n a s e ，u k ，u - p a ) 目前，临床上使用的u k 是从人尿或肾细胞组织培养液中提取的一种丝氨酸蛋白酶， 可以直接裂解纤溶酶原的精( 5 6 0 ) - 缬( 5 6 1 ) f a j 肽键，使无活性纤溶酶原生成有活性的纤溶 酶。u - - p a 在1 9 6 1 最早用于临床。u - - p a 呈双链型，由二硫键维系。u - p a 存在两种形式， 一种为高分子质量尿激酶( 订帆l 张) ，含4 1 1 个氨基酸，分子质量为5 4k d a ：另一种 为低分子质量尿激酶( l m w - u - p a ) ，含2 7 6 个氨基酸，分子质量为3 2k d a 。u - p a 的半衰 期只有7 1 8m i n ，溶栓持续时间短，易引起出血等不良反应，对陈旧血栓疗效差【6 】。 1 6 纤溶酶类溶栓剂的研究与开发 现有的溶栓药物疗效肯定，明显降低了a m i 患者的死亡率和致残率，但还存在许 多缺陷，主要表现在初始再灌注延迟或失败、出血等不良反应，以及再梗死等问题播】， 而且大多数现有溶栓药物价格昂贵，因此，研制高效、快速、防止再栓塞及减低出血等 不良反应的新型溶栓药物的需求迫切。全球每年所需溶栓剂的潜在市场约2 0 亿美元瞄1 。 溶栓药物的研究开发相当活跃，己成为生物工程和生物医学领域的一个研究热点。 一方面，对现有溶栓药物进行改造，以提高其特异性和溶栓效果；另一方面，从不同生 物体中寻找新型的、相对廉价有效的溶栓剂。 1 6 1 溶栓剂的主要来源 溶栓剂有动物、植物、微生物三大来源。其中动物来源的溶栓剂有蛋白质c 【2 7 l 、蚯 蚓溶纤酶【2 8 】、蛇毒纤溶酶【2 9 。3 2 1 和吸血蝙蝠d s p a ( d e s m o d u ss a l i v a r yp a ) t 3 3 1 。植物来源的 6 第一章绪论 有蒲黄溶纤酣蚓。微生物是纤溶酶的重要来源，如细菌、真菌、放线斟3 5 1 和藻类 3 6 , 3 7 】。 微生物种类多、繁殖快、容易培养、来源丰富、生产周期短、成本低、不受地域限 制，具有广阔的前景，所以使用微生物产溶栓剂具有广阔的前景，除早期发现的溶血链 球菌( s t r e p t o c o c c u sh e m o l y t i c u s ) 产链激酶( s t r e p t o k i n a s e ，s k ) 和金黄色葡萄球菌 ( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ) 产葡激酶( s t a p h 3 7 l o k i n a s e ，s a i o 外，又陆续发现一些菌株产纤溶活 性物质。法国学者于1 9 9 6 年报道从链霉菌( s t r e p t o m y c e ss p ) 发酵液中分离纯化得到了具 有纤溶活性的蛋白酶1 3 s ，印度r r c h i t t e 于2 0 0 0 年也报道从链霉菌( s t r e p c o m y c e s m e g a s p o r u s ) 分离到纤维蛋白专一性很强的纤溶酶，并就产酶条件作了进一步的优化【3 9 1 。 中国协和医科大学于1 9 9 9 和2 0 0 1 年从云南土壤中筛选到产多种纤溶活性成分的链霉菌 1 4 0 ，4 1 1 ，并分离出了其中的单肽链蛋白酶c g w - 3 和s w - 1 。c g w - 3 不仅具有直接降解纤 维蛋白的作用，而且能够激活纤溶酶原。链霉菌产生并分泌多种蛋白水解酶，其中相当 一部分属于丝氨酸蛋白酶，而人血液中的纤溶酶及纤溶酶原激活剂也均属于丝氨酸蛋白 酶。因此，有可能从链霉菌中筛选到合适的溶栓药物。还有报道从白色假丝酵母( c a n d i d a a l b i c a n s ) 1 4 2 1 ，镰抱菌( f u s a r i u mo x y s p o r u m ) 4 3 1 发酵物中分离出纤溶酶。 更令人感兴趣的是，近年来在东方传统发酵食品中发现有产纤溶活性物质的微生 物，它们主要是芽孢杆菌类微生物，如表1 一l 所示，这些发酵食品主要来自日本、韩国- 和中国。 表l - 1 发酵食品中的纤溶酶 t a b i - 1f i b r i n o l y t i ce n z y m ef r o mf e r m e n t e df o o d s 食品名称 产地 特征纤溶酶类型 n a n o 【“4 5 1日本 芽孢杆菌发酵豆类食品胞内丝氨酸蛋白酶 t o f u y o m j 日本发酵豆类食品 豆奶凝乳酶( s m c e ) c h u n g k o o k - j a n g m j 韩国 发酵大豆调味品碱性丝氨酸蛋白酶( c k ) d e o n - j a n g l 4 韩国发酵豆类食品碱性丝氨酸蛋白酶 s k i p j a c ks h i o k a r a 【4 卅 日本研制鱼类发酵食品碱性胰岛素类丝氨酸蛋白酶 k i m c h i h j韩国蔬菜发酵食品芽孢杆菌属蛋白酶 d r m i l l a r i e l l am e l l a i 刈 中国可食用的甜蘑菇中性金属蛋白酶 曳豉口l 】中国高盐发酵大豆食品丝氨酸蛋白酶 虫卞酱【5 2 】中国高盐发酵虾酱中性蛋白酶 1 6 2 微生物发酵法产纤溶酶的研究进展 现有的微生物产纤溶酶的发酵方法主要有固态培养基发酵和液态培养基发酵。其 中，固态发酵操作简单、周期短、成本低；液态发酵则易于控制和改变各种培养条件， 且酶的产率较高，质量较好，产品回收率较高。 例咖生产纳豆激酶的传统方式是固体发酵，生理盐水浸提。因为产率低、劳动强度 大，目前已较少见。现普遍研究的是液体发酵，在菌种筛选、发酵条件优化方面已有不 少文献报道。李荣萍等 5 3 1 筛选得到产n k 菌株b s u b t i l i sh w - 1 2 并对其液体发酵条件进 7 江南大学硕十学位论文 行了优化，发现最适碳源为大豆胰蛋白陈【5 4 】；钟青萍掣”】从同本纳豆中筛选得到产纳豆 菌并考察了其抗菌活性；董明盛等1 5 6 j 及杨艳燕等【了玎分别从我国的豆豉中筛选得到产纳豆 激酶枯草杆菌株；彭勇等【5 1 】从豆豉中筛选得到的产纳豆激酶枯草芽孢杆菌株还具有较高 的淀粉酶活性，研究发酵条件后发现其最适碳源是可溶性淀粉或糊精【5 8 1 ；陈波掣5 9 】则从 康定大雪山顶的枯草中筛选得到产纳豆激酶菌株。谢秋玲等唧】则对纳豆激酶深层液体发 酵条件进行了优化，得到了迄今文献报道的游离培养最高酶活：7 0 0i u m l q 。姚劲挺等 【6 i j 则研究了微胶囊固定化发酵，在鼓泡培养条件下，发酵液酶活达2 0 5 0i u m l _ 。 随着纳豆激酶分子生物学研究的进展，目前已有众多克隆纳豆激酶基因并在大肠杆 菌或枯草杆菌中表达的研究报道【6 2 彤】。虽然这类研究的目的是提高纳豆激酶产量，但由 于转基因生产蛋白质还有一些有待解决的问题，目前还未见振奋人心的成果。不过刘北 域等【6 2 】采用的表达宿主为碱性蛋白酶缺陷型工程菌，因此发酵液中与纳豆激酶性质相近 的杂蛋白少，对后续分离纯化极为有利，前景较好。 河南绿十字生物工程研究所的阎家麒等惭1 从自制豆豉中筛选出一株在发酵产物中 产生纤溶活性蛋白酶的枯草芽孢杆菌。接种到5l 发酵液中，得到的豆豉纤溶酶总活力 为1 5 5 x 1 0 6i u 。南京农业大学董明盛等【6 7 】从豆豉中分离得到产纤溶酶的枯草芽孢杆菌， 在优化条件下，发酵液酶活达到6 8 3 3i u m l 。中国科学院韩润林等【6 8 】也从豆豉中分离 到一株枯草杆菌( h l - 0 8 6 ) ，具有较高的纤溶酶活性，精制后比活达到了9 8 0 0i u m g ，活 性回收率为6 3 8 。四川大学彭勇【5 l 】等从豆豉中首次筛选到一株具有纤溶活性的解淀粉 芽孢杆菌，经过发酵条件的优化该菌产生的纤溶活性可达到8 2 0i u m l 并且具有良好体 外溶栓效果。吴思方等【6 9 】从豆豉中筛选到一株具有纤溶活性的枯草芽孢杆菌h g d l 0 7 ， 经发酵条件优化该纤溶酶活性达到3 6 3 4i u m l 。齐海萍掣7 0 1 从豆豉中筛选出一株芽孢 杆菌，其纤溶酶活性达到1 2 3 0 1 2 5 6i u m l 。 1 6 3 纤溶酶活性检测方法的研究状况 常见的纤溶酶的测定方法【7 1 1 包括：纤维蛋白平板法、纤维蛋白块溶解时间法、微量 稀释法、酶联免疫吸附法、四肤底物法。 ( 1 ) 纤维蛋白平板法 纤维蛋白平板法是参照u k 或t - - p a 的测活方法建立的，也是最早用于纤溶酶活性测 定的方法之一。参照a s 仃u p ( 1 9 5 2 ) 的方法【7 2 】改进，以凝血酶和纤维蛋白原作用制成人工 血栓平板，用溶解面积表示纤溶活性。本法最常用，但易受孵育时间影响，因此对恒温 时间的控制十分重要。另外在测量的过程中也有一定的误差，且平板制作和点样的技术 十分关键。 ( 2 ) 纤维蛋白块溶解时间法( c l t 法) 【7 2 】 纤溶酶、t - - p a 、u k 等溶血栓物质都以此方法来测定活性1 7 3 1 。从纤维蛋白形成开始 计时，随着反应液混浊，有气泡上升到液面，到气泡冒出停时，作为纤维蛋白熔解时间 ( c l t ) 。以u k 作为标准品，以c l t 对n k 浓度的对数作图。该方法比平板法糨捷，但 精度不够，且不适合多个样品的同时测定。 第一章绪论 ( 3 ) 微量稀释法1 7 5 j 该法是纤维蛋白平板法的改进7 6 1 ，纤维形成初始，在6 5 5n m 处的吸光值最大，随 着纤溶酶的加入，纤维蛋白溶解，吸光值下降，吸光值的减少同浓度成线性关系。该方 法可同时测多个样品，操作简便、快捷，样品消耗小，成本低，可信度高。但是反应开 始时小孔内血栓的吸光值需在o 2 以上，这样人工血栓的调制就对t 6 5 5 值的影响大大减 少。 ( 4 ) 酶联免疫吸附法( e l