（食品科学专业论文）β呋喃果糖苷酶菌株筛选工艺及酶的应用研究.pdf

摘要 b - 呋喃果糖苷酶广泛地存在于生物界，不同微生物来源的b 一呋喃果糖苷酶的性质不 同。黑曲霉、节杆菌、米曲霉等微生物能够产生b 一呋喃果糖苷酶，其分子由1 - 8 个亚 基所构成，相对分子质量为1 10 0 0 - 4 0 90 0 0 d ，其作用机理是将蔗糖的葡萄糖基与果糖 基的s - o ? 4 ) 糖苷键断裂，生成果糖与葡萄糖。果糖在酶的作用下进一步聚合成功能性 低聚糖。 大豆低聚糖中功能性因子( 棉子糖、水苏糖) 与非功能性因子( 蔗糖) 共存。目前我国 生产的大豆低聚糖产品中功能性低聚糖的含量较低( 3 0 - 4 0 ) 。本研究的目的在于用b 呋 喃果糖苷酶作用于大豆低聚糖，通过酶改性将其中非功能性蔗糖转化为功能性低聚糖， 增加大豆低聚糖中功能因子的含量，提高大豆低聚糖的功能性。 本研究从一株节杆菌b t r t h r o b a c t e rs p 1 0 1 3 7 ) 和一株黑曲霉臼s p e r g i l l u sn i g e r3 7 9 5 ) 中 筛选出高产b 呋喃果糖苷酶的菌株a s p e r g i l l u $ n i g e r3 7 9 5 ，并确定了该菌株的最佳培 养条件为温度2 8 ，时间6 6 - - 7 2 h ，振荡速度为1 5 0 转，分，培养基初始p h 值为6 0 。最 佳培养基成分为；玉米糖化液1 0 b x 、蔗糖3 、蛋白膝o 3 5 、硫酸镁0 0 3 4 、氯化铁 0 0 3 4 ；采用乙醇法浓缩b 呋喃果糖苷酶的粗酶液，浓缩倍数为2 5 倍。b 呋喃果糖 苷酶的特性是：( 1 ) 在温度- - 4 0 时，b ? 呋喃果糖苷酶稳定；( 2 ) b 呋喃果糖苷酶在p h 值 5 - 7 范围内稳定；( 3 ) a g + 对酶有较强的抑制作用，m 矿、z n 2 + 对酶有激活作用，其它金 属离子基本上对酶的活力没有较明显的影响；( 4 ) 采用二次旋转正交回归设计优化b 呋 喃果糖苷酶作用大豆低聚糖的工艺参数，确定了最佳工艺参数条件为酶解温度为3 1 5 、酶反应体系p h 值为6 可、酶用量1 8 9 、酶作用时间为1 5 h 。产品中低聚糖的含量 由原来的3 0 9 8 提高到4 8 6 。 关键词大豆低聚糖；黑曲霉；b 一呋喃果糖苷酶； a b s t r a c t b - f i - u c t o f u r a n o s i d a s ei sa b r o a di nt h eb i o l o g yw o r l d t h ec h a r a c t e ro ft h ee n z y m ef r o m d i f f e r e n tm i c r o b e sw e r ed i f f e r e n t m a n ym i c r o b e ss u c ha sa s p e r g i l l u sn i g e r , a r t h r o b a c t e rs p a n d a s p e r g i l l u so r y z z 记c a np r o d u c e b - f r u c t o f u r a n o s i d a s e t h em o l e c u l e o fb - f r u c t o f u r a n o s i d a s ei sc o n s t i t u t e do f1 - 8s u b u n i t s , w h i c hc o m p a r a t i v eq u a l i t yi s1 10 0 0 - 4 0 9 0 0 0 d t h ea c t i v em e c h a n i s mo fb - f i u c t o f u r a n o s i d a s ei st h a ti tb r e a k st h eb o n do fb ( 1 7 钔o f t h ec a n es u g a r , w h i c hg e n e r a t e sf i - u c t o s ea n dg l u c o s e t h e nm a n yf r u c t o s e sp o l y m e f i z ct h e f i u c t o o l i g o s a c c h a r i d ew i t ht h ee n z y m e s o y b e a no l i g o s a c c h a r k h ：si n c l u d ef u n c t i o n a lf a c t o r s l 伍n o a n ds t a c h y o s e ) a n dn o n - f u n c t i o n a lf a c t o r ( s u c r o s e ) c o m m e r c i a lp r o d u c t sf r o ms o y b e a no l i g o s a c c h a r i d e si nc h i n a m a r k e t sh a v el o wc o n t e n t o ff u n c t i o n a lo h g o s a c c h a r i d e s ，a b o u t3 0 - - 4 0 i tw a si n v e s t i g a t e di n t h i ss t u d yt h a ts o y b e a n o h g o s a c c h a r l d e sw e r ee x t r a c t e d 丘o mt h es o y b e a nw h e y , a n dm o d i f i e d b ye n z y m e s t oi n c r e a s ei t sf u n c t i o n a lo l i g o s a c c h a r i d e s a n a s p e r g i l l u sn i g e rw h i c h 渤p r o d u c eb - f i - u c t o f u r a n o s i d a s e , o fh i g he n z y m a t i ca c t i v i t y w a se x a m i n e df r o mo l l ea r t h r o b a c t e rs pa n do n ea s p e r g i l l u sn i g e r t h eo p t i m u mc u l t u r e c o n d i t i o n sw e r e6 6 7 2 ha t2 8 ，a n dt h ec u l t u r em e d i u mw a s1 0 b xc , o r l ls y r u p ，3 s u c r o s e ， 0 3 5 p e p t o n e ，0 0 3 4 b i t t e rs a l t , i t so r i g i n a lp ai s6 t h ee n z y m es o l u t i o nw a sc o n c e n t r a t e d 2 5t i m e sb ya l c o h 0 1 t h ec h a r a c t c r so fb - f i u c t o f u r a n o s i d a s ea t e ( 1 ) t h eb - f m c t o f u r a n o s i d a s e w a ss t a b l eb e l o w4 0 c ；( 2 ) t h e8 - f m c t o f u r a n o s i d a s ew a ss t a b l eb e t w e e np r i5a n dp h7 ；( 3 ) t h e b - f x u c t o f u r a n o s i d a s ew a sa c t i v a t e db ym 矿+ 、z n 2 * a n di n a c t i v a t e db ya g + ；( 4 ) t h eo p t h n u m e n z y m i cs y n t h e s i so ff r u t u - o l i g o s a c o h a t i d e su s i n gs o y b e a no l i g o s a c c h a r i d e sa sd o n o ra n d a c c e p t e rw a sp hv a l u e 西4 3 1 5 c ( r e a c t i o nt e m p e r a t u r e ) , 1 8 9 ( e n z y m ec o n c e n t r a t i o n ) a n d1 5 h ( r e a c t i o nt i m e ) t h eo h g o s a c c h a r i d e sc o n t e n tw e r ei n c r e a s e df r o m3 0 9 8 t o4 8 6 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得壅韭丛些盘堂或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在 论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：双咐 签字日期：? 叫年i r 月2 歹日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解壅皇垦盎些盘茔有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权盔i 垦盎些盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：j 家附 导师签名：球镯 签字日期：之7 年f 月彩，日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 签字日期：珊6 月萏日 电话： 邮编： 1 绪论 1 绪论 1 1 引言 b 呋喃果糖苷酶( 6 - f r u c t o f u r a n o s i d a s ) 又称蔗糖酶或转化酶，该酶可将蔗糖水解为果 糖和葡萄糖，并在将蔗糖水解为果糖和葡萄糖的同时，使果糖和反应底物蔗糖相结合生 成三糖、四糖等，所以又称为b 果糖苷转移酶。b 呋喃果糖苷酶分子由1 8 个亚基所构 成，相对分子质量为i io o o - - 4 0 90 0 0 d ，微生物源酶的相对分子质量比植物来源的大， 生产成本相对低廉，操作简单，容易控制。 低聚果糖( f i u c t o - o h g o s a c c h a r i d 髂，f o s ) 是通过b 啦，1 ) 糖苷键在蔗糖的果糖基上连接 1 句个果糖基而形成的一系列果糖寡聚体，主要包括蔗果三糖( g f 2 ) 、蔗果四糖( g f 3 ) 、蔗 果五糖( g f d 。低聚果糖是一种新型的保健食品，主要通过促进双歧杆菌的增殖而调节 人体肠道内的微生态平衡，从而起到保健作用，是功能性低聚糖中颇具代表性的一种 低聚果糖作为一种甜味剂，有很多优点：它不易被消化，防止产生龋齿和使人增胖，可 超强激活和增殖人体肠道中的双歧杆菌，纠正肠内菌群失调。因此它已成为一种重要的 保健食品“。 大豆低聚糖是功能性低聚糖的一种，作为重要的生理活性物质，大豆低聚糖在营养 与保健、免疫与疾病防治、体内运动及延年益寿等方面备受关注。国内外的许多营养学 家都预言，二十一世纪功能性食品将成为主流。因此，集营养、保健、食疗于一体的功 能性大豆低聚糖类产品的研究成为热点。大豆低聚糖的成分中具有低聚糖生理活性的功 能因子是棉子糖和水苏糖。将大豆低聚糖中的蔗糖转化为低聚糖最佳的方法是将蔗糖转 化为棉子糖和水苏糖。目前国内生产的大豆低聚糖工业产品中蔗糖的含量较高，在颗粒 制品中蔗糖含量可高达4 4 。因此，大豆低聚糖制品的热值相对高于一些精制低聚糖， 如低聚果糖、低聚木糖、低聚麦芽糖等低聚糖。如此高的蔗糖含量限制了大豆低聚糖在 一些功能性食品中使用，尤其是生产一些低热值或无热值的糖尿病人专用食品及减肥食 品【蜘。经大量实验证明，8 呋喃果糖苷酶可以有效地将蔗糖水解成葡萄糖和果糖，并 将果糖转移到蔗糖分子的果糖残基b ( 1 72 ) 糖苷键连接1 也个果糖基，形成蔗果三糖和 蔗果四糖。本试验意在去掉大豆低聚糖粗糖浆中的非功能因子蔗糖，从而提高大豆低聚 糖的功能性，以较低成本开发高品质的低聚糖品种，适应人们的特殊要求，如减肥或糖 尿病人群的需要，具有重要的工业应用价值。 本研究将从已有的菌株中筛选出b 呋喃果糖苷酶的高产菌株，研究确定其产b 呋喃 果糖苷酶的最佳工艺条件，并研究利用b 呋喃果糖苷酶将大豆低聚糖中的蔗糖转化条 件，优化b 呋喃果糖苷酶作用的工艺参数等。 1 1 1 b - 呋喃果糖苷酶的来源 b 呋喃果糖苷酶( e c 3 1 2 2 6 ) 广泛地存在于生物界。据文献报道，植物中的b 呋喃 东北林业大学硕士学位论文 果糖苷酶催化活性很弱，产率低，且受到季节限制，而来自微生物的果糖基转移酶比植 物的催化活性高，且耐高温，可以催化高浓度的蔗糖进行转糖基反应，反应过程受杂菌 污染的机会较少，使用方便。目前，工业上主要是采用微生物果糖基转移酶作用于蔗 糖，进行分子内转移果糖基反应来生产f o s ，或采用微生物内切菊粉酶水解菊粉生产低 聚果糖。具有低聚果糖合成酶活性的微生物包括丝状真菌、酵母菌和细菌。与植物来源 的6 呋喃果糖苷酶不同，多数微生物来源的b 呋喃果糖苷酶往往同时具有转果糖基活性 和水解活性，这些酶既可以转化蔗糖为低聚果糖，又可以催化水解蔗糖和低聚糖进行可 逆反应，使f o s 降解。研究表明，酵母菌的b 呋喃果糖苷酶的水解活性强于丝状真菌 所产生的8 呋喃果糖苷酶的水解活性，不利于低聚果糖的积累嘲。 不同来源的b 呋喃果糖苷酶性质也不相同。能够产生b 呋喃果糖苷酶( e c 3 1 2 2 6 ) 的微生物很多。近年来从霉菌中提取b 呋哺果糖苷酶的研究较多，在霉菌中以曲霉研究 的较多，并在工业生产上使用这种酶合成低聚果糖。s u g i m o t o 7 j 从a s p e r g i l l u ss a t i t o i 中 提取的复合酶，其中就包括8 呋喃果糖萤酶( e c 3 1 ，2 2 6 ) 。c r u z 和p a r i k 在从a s p e r g i l l u s o y z a e 中提取a 半乳糖苷酶( e c 3 2 1 2 2 ) 的同时也发现了活力较强的8 呋喃果糖苷酶 ( e c 3 1 2 2 6 ) 。此外，s m i l e y 和m u 曲e c 等从a s p e r g i l l u sa w a m o r f 8 - 9 】中都提取出了活力 较强的具有转果糖基作用的b 呋喃果糖苷酶( e c 3 1 2 2 6 ) 。- r 业上一般采用微生物酶法 来生产b 呋喃果糖苷酶，杨正茂等“”报道了从米曲霉中提取b 呋喃果糖苷酶并对其进行 分离纯化，同时对该酶作用的最适合条件作了研究。文献“2 1 报道了节杆菌能够产生 b 一呋喃果糖苷酶，并对其发酵条件及培养基组成进行了优化选择。 1 1 21 3 呋喃果糖苷酶的作用机理 不同来源的b 呋喃果糖苷酶反应机理不同，多数微生物来源b 呋喃果糖苷酶能独立 作用于底物。1 9 7 2 年，d i c k e r s o n 【1 3 1 首先提出了c l a v i c e p sp u r p u r e a 果糖基转移酶催化形 成异蔗果三糖型低聚果糖反应机理： f 2 71 g + f 2 71 g 一? f 2 76 g l ? 2 f + g f 2 71 g + f 2 76 g t ? 2 f l - ? f 2 71 f 2 76 g 1 72 f + g 式中数字代表糖基上c 原子位置序号，短箭头代表糖苷键连接方向，反应是可逆 的，如f 2 76 g l 在蔗果三糖及其四聚体合成中同时作为果糖分子的供体和受体参与反 应。 1 9 8 0 年，g u p t a 和b h a t i a 等提出了f u s a r i u mo x y s p o m m8 - 呋喃果糖苷酶作用机理： 果糖首先从供体转移到果糖化核苷酸桥上，进而转移到受体蔗糖上形成g f 2 ，g f 4 是最 高级的葡果聚糖。a s p e r g i l l u sn i g e r 和a u r e o b a s i d i u ms p 果糖基转移酶具有相同的作用机 理【1 4 】： g f n + g f n ? g r 1 + g f 。+ t ( n = 1 码) 蔗糖分别作为供体和受体，g f 4 是最高级的低聚果糖。 d u a n 1 5 】等以a s p e r g i l l u sj a p o n i c a s6 - 呋喃果糖苷酶为依据对上述机理提出了一个修 1 绪论 饰模型：产物葡萄糖并不抑制蔗果三糖和蔗果四糖合成，而底物蔗糖和蔗果四糖的水解 反应对该反应具有抑制作用，尤其是出芽短梗霉和黑曲霉b 呋喃果糖苷酶对底物具有很 强空间结构特异性，它能选择性地将蔗糖分子的果糖基团转移到另一蔗糖分子的1 - o h 呋喃糖苷键上形成1 蔗果三糖型f o s 。 有些微生物b 一呋哺果糖苷酶具有与上述不同的合成机制。b a c i l l u sm a c e r a n sb 呋喃 果糖苷酶能够有选择地合成g f 4 ，反应过程为： g f + g f ? g f 2 + g g f 2 + g f ? g f 3 + g g f 3 + g f ? g f 4 + g 当蔗糖、蔗果三糖和蔗果四糖共同存在时，蔗果三糖和蔗果四糖是最佳受体，而蔗 糖分子不易得到果糖基【1 6 1 。 1 1 3 微生物源1 3 呋喃果糖苷酶的生产 碳是构成菌体的重要元素，是微生物生长的能量来源，还可作为某些微生物酶的诱 导剂。不同微生物源b 呋哺果糖苷酶生产所需碳源不同，蔗糖是大多数产b 呋喃果糖苷 酶的微生物的最佳碳源。c h e n l l 7 1 等以a s p e r g i l l u sj a p o n i c a 为出发菌株，研究了不同碳源 对b 呋喃果糖苷酶产量的影响，发现蔗糖最有利于茵体生长和产酶。葡萄糖、果糖、半 乳糖、麦芽糖、玉米淀粉等可促进微生物的生长，但产酶量较低，产酶水平仅为蔗糖的 1 1 8 。而乳糖、可溶性淀粉和肌醇不利于a s p e r g i l l u sj a p o n i c u s 的生长。a s p e r g i l l u s n i g e ri m l 3 0 3 3 8 6 在以蔗糖为碳源的培养基上主要产生胞内b 呋喃果糖苷酶，而以菊粉为 碳源时，产生胞内和胞外两种b 呋喃果糖苷酶【1 8 l 。t h e r r n o u s c u sa u r a n t i a c u s 生长和产酶 的最佳碳源是蔗糖和果糖，菊粉对其生长及产酶没有明显的影响【1 9 1 。蔗糖也是b a c i l l u s m a c e r a n s 产b 呋喃果糖苷酶生产的最好碳源，其次是甘油、可溶性淀粉和菊粉。在以葡 萄糖为碳源的培养基上，a s p e r g i l l u sf o e t i d u s 不产生b 呋喃果糖苷酶，但添加0 2 蔗糖 会诱导b - 呋喃果糖苷酶产生【2 0 l 。蔗糖为最佳碳源的主要原因可能是b 呋喃果糖苷酶能 够催化b 一2 ，1 糖苷键断裂，并将果糖基转移到b 呋喃果糖基末端1 2 ”。a c e t o b a c t e r d i a z o t r o p h i c u s 产的b - 呋喃果糖苷酶是胞外酶，甘露醇是该酶生产的最佳碳源，葡萄糖、 果糖、蔗糖、甘油和山梨醇也可促进胞外8 呋喃果糖苷酶产生，由于该酶不为蔗糖所诱 导，在培养基中没有果聚糖产生，有利于酶的提取【2 2 1 。r a j o k a i 捌发现以农产品加工副产 物小麦麸皮作碳源，a s p e r g i l l u sn i g e r8 - 呋喃果糖苷酶的产量明显高于蔗糖，由于麸皮中 还原糖含量少，不存在代谢阻遏现象，因此对8 呋喃果糖苷酶的大规模工业化生产更有 利。另外，玉米芯也可以促进b 呋哺果糖苷酶的生产。 氮源也是影响微生物生长和酶产量的因素之一。酵母浸膏是a s p e r g i l l u sj a p o m c u s 和 a u r e o b a s i d i u m 阳池l a s 生长和产酶的最佳氮源，而乳清和麦芽浸膏则不利于微生物生 长和b - 呋喃果糖苷酶的产生。有机氮源有利于t h e r m o a s c u sa u r a n t c a c u s 和a s p e r g i l l u s n i g e r 菌体生长及6 呋喃果糖苷酶产生，其中玉米浆最佳【1 9 捌；对于b a c i l l u sm a c e r a n s ， 东北林业大学硕士学位论文 0 5 氯化铵、1 多聚蛋白胨和l 酵母膏是产生b 呋喃果糖苷酶的最佳氮源，如果以无 机铵盐为氮源时，培养基的p h 会迅速下降，必须添加缓冲液进行调整才有利于微生物 的正常生长i “i 。 无机盐和金属离子对8 呋喃果糖苷酶生产也具有影响。j u n g l 2 5 l 等人发现培养基中添 加适当的n a n 0 3 、k 2 h p 0 4 和m g s 0 4 - 7 h 2 0 会促进微生物细胞的生长，有利于酶的产 生。磷酸盐是重要的缓冲剂，硝酸盐也可作为无机氮源，m 9 2 + 则会促进真菌细胞壁的合 成。而c a z + ，c 0 2 ，l i + 对酶活性也具有一定的激活作用，但更有效的激活剂还未被发 现。重金属离子如c u 2 + 、a g 、h 矿及p b 2 + 对b 呋喃果糖苷酶生产具有明显的抑制作 用，有时a g 和h g + 甚至会完全抑制6 - 呋喃果糖苷酶的产生 1 2 大豆低聚糖的理化性质和生理功能 ， 大豆低聚糖( s o y b e a n0 1 i g o s a c c h a r i d e s ) 是从大豆籽粒中提取出的可溶性寡糖的总称。 其主要成分是蔗糖( s u c r o s e ) 、棉子糖( r a f f i n o s e ) 、水苏糖( s t a c h y o s e ) 。 这类低聚糖广泛存在于各种植物中，以豆科植物的含量居多，除大豆外，豇豆、扁 豆、豌豆、绿豆和花生等中均存在。研究表明，大豆在未成熟期间几乎不含低聚糖，只 有到了成熟期后，其含量才会显著增加，但随着种子的发芽而逐渐减少。采收后的大豆 即使在低于1 5 、相对湿度6 0 以下的阴凉条件下贮藏，其水苏糖和棉子糖的含量也 会减少 2 6 - 2 7 1 。 大豆低聚糖的成分中具有低聚糖生理活性的功能因子是棉子搪和水苏糖。大豆低聚 糖中的蔗糖转化为低聚糖最佳的方法是将蔗糖转化为棉子糖和水苏糖。大豆低聚糖作为 一种新型的保健食品，具有改善人体内微生态环境、改善血脂代谢、防治便秘和腹泻、 提高人体免疫力等生理功能l 硐。另外，低聚糖还具有低甜度、低热量的特点，因此是二 十一世纪瞩目的营养、保健、功能性甜味剂，可以作为糖尿病人等特殊人群的专用食品 添加剂。 液态的大豆低聚糖为淡黄色、呈透明黏稠状；固体产品为淡黄色粉末，极易溶于 水。其吸湿性和保湿性比蔗糖小，但优于果葡糖浆，水分活性接近蔗糖【2 9 1 。大豆低聚糖 能溶于低分子烯醇，但不溶于非极性有机溶剂，其稳定性较高，即使在1 4 0 c 高温或在 p h 值3 的酸性条件下加热，或经发酵处理，仍保持其稳定性【划。此外，大豆低聚糖的甜 度较低，为蔗糖的7 0 。其热仅是蔗糖热能的5 0 | 3 ”，且安全无毒性。水苏糖溶于 水，不溶于乙醚、乙醇等有机溶剂。有弱甜味，甜度比蔗糖低，能量值更低。纯晶体水 苏糖为带4 个结晶水的片状物，溶点1 0 1 ，在真空中1 1 5 失水，无水衣苏糖的熔点 为1 6 7 - 1 7 0 c ，水苏糖的保湿性和吸湿性均小于蔗糖但高于果葡糖浆，渗透压接近蔗 糖，且没有还原性。棉籽糖不吸湿，但在高湿情况下易溶，与蔗糖共用时能抑制蔗糖可 能出现的结晶析出现象。棉籽糖分子中的5 个结晶水，在加热时易失去一部分或全部失 去。脱水棉籽糖易吸收周围水分恢复成原来的带水状态1 3 2 1 。 1 绪论 1 2 1 促进双歧杆菌增殖 低聚糖作为促进双歧杆菌增殖因子，具有能够使人体内双歧杆菌增殖的作用，因此 可以改善人体内的微生态环境。 大多数的肠道菌群对低聚糖的利用都比较差，而双歧杆菌能利用大多数的低聚糖。 母乳喂养的婴儿肠道中双歧杆菌数量最多，这都归功于人奶中的低聚半乳糖。人体摄入 低聚糖后，普通型低聚糖被人体吸收，对肠道内双歧杆菌有增殖作用；功能性低聚糖被 人体摄入后不被小肠吸收而直接进入大肠内优先为双歧杆菌所利用，是一类性能良好的 双歧杆菌增殖因子f 3 3 刮。 另外，人体试验表明，双歧杆菌的增殖抑制了有害细菌如产气荚膜梭状芽孢杆菌的 生长。每天摄入2 1 0 9 低聚糖持续数周后，肠道内的双歧杆菌活菌数平均增加7 5 倍， 而气荚膜梭状芽孢杆菌总数减少了8 1 ；对于某些品种的低聚糖所产生的乳酸菌素数量 也增加1 砣倍，而产气荚膜梭状芽孢杆菌素的数量则减少0 0 5 加0 6 倍。 1 2 2 抑制腹泻，防止便秘 服用功能性低聚果糖或双歧杆菌活性制品均可降低病原菌的量，故对腹泻有防治作 用。让6 个排便不良的老年人每天摄入8 o g 低聚果糖，8 d 后所有情况恢复正常。h o t t a 等嘲让1 5 个1 月龄一1 5 岁的患有严重小儿腹泻的婴儿和儿童，每天服用3 9 含1 0 x 1 0 1 0 短双歧杆菌，g 的活菌制品，3 一d 后所有患者大便次数明显减少，并且大便外观也不像 腹泻时那样稀溏。r e r m e 等报道伽，德国产的“o m n i f l o r s ”是一种含长双歧杆菌， 厶g a s s e r i 乳杆菌和大肠杆菌的冻干生物制品，它能有效地平衡胃肠道的微生物菌群，有 利于肠胃失调者治疗。此外，许多研究者认为母乳喂养的婴儿比代乳品喂养儿健康，是 由于前者肠道内双歧杆菌处于绝对优势地位( 几乎占总菌数的9 9 ) ，而后者中占5 0 或 更少 因为功能性低聚果糖的摄入促进了肠道内双歧杆菌的增殖，相应增加了短链脂肪 酸、乙酸、乳酸的分泌量，因而刺激了肠的蠕动和通过渗透压增加粪便水分，从而防止 便秘的发生。在人体试验中，每天摄入3 0 1 0 0 9 低聚糖，一周内就有明显的抗便秘效 果，但对严重便秘患者，低聚糖的治疗效果不明显。 1 2 3 降低血清胆固醇 通过摄入功能性低聚果糖可以使血清胆固醇的量明显下降。每天摄入6 - 1 2 9 低聚果 糖持续2 周至3 个月，可减少血清胆固醇2 0 - 5 0 m l 。研究表明，乳酸菌( 包括双歧杆菌) 能减少血清胆固醇总量，抑制血清胆固醇生长，增加女性血中h d l ( 高密度脂蛋白即固 酵) 在整个胆固醇中的比重。h i d a k a 认为，血清胆固醇的减少是由于肠道微生物菌群平 衡变化引起的，g i l l i l a n d 等的体外试验表明人体存在的1 2 种嗜酸乳杆菌可吸收胆固 醇，嗜酸乳杆菌2 0 5 6 菌株可抑制小肠壁对胆固醇微胞的吸收。此外，双歧杆菌代谢产 生烟酸的能力与血清胆固醇水平的降低也有一定关系。有人认为，双歧杆菌通过抑制人 体内活化的t 细菌，控制新形成低密度脂蛋白接受器，起到降低血清胆固醇含量的作 东北林业大学硕士学位论文 用。对小鼠的试验结果认为，双歧杆菌通过影响b 羟基b 甲基戊二酸单羧辅酶a 还原 酶的活性，控制胆固醇的合成而降低血清胆固醇的含量【3 7 1 。 1 2 4 改善血脂代谢 功能性低聚糖属于低分子量水溶性膳食纤维，因此具有改善血脂的作用l 。由于人 体内的消化酶基本上只能降解a 1 ，4 糖苷键，而低聚糖分子问是以b 1 ，2 糖苷键。因此低 聚糖与葡萄糖、果糖等单糖相比，在消化系统中较稳定，很难被人体消化吸收，所提供 的热量值就很低或没有，故可在低能量的食品中发挥作用，以最大限度地满足那些喜爱 甜食但又不能食用甜食的人( 如糖尿病人、肥胖病患者等) 的需要。 1 2 5 增强机体免疫能力 动物试验表明，双歧杆菌在肠道内大量繁殖具有提高机体免疫功能和抗癌的作用。 究其原因在于，双歧杆菌细胞、细胞壁成分和胞外分泌物可增强免疫细胞的活性，从而 促使肠道免疫球蛋白a 0 9 a ) 浆细胞的产生，杀灭侵入体内的细菌和病毒，防止疾病的发 生及恶化。另外，试验发现某些功能性低聚糖还有预防和治疗乳糖消化不良，改善肠道 对矿物元素吸收的作用。例如：促进对钙质的吸收实验表明，服用低聚木糖后，大鼠对 钙的消化吸收率提高2 3 ，体内钙的保留率提高2 1 m 。 1 2 6 保护肝功能 摄入功能性低聚果糖或双歧杆菌可以减少有毒代谢物形成，从而减少了肝脏分解毒 素的负担。给一个6 9 岁患有肝炎和便秘病的老年病人，每天服用3 0 9 的大豆低聚糖， 5 d 后其肝昏迷和便秘症状都有所缓解。m u t i n g 等报道，对两组试验对象，一组是1 2 个 患慢性肝炎或肝硬化、无高血压的患者，另一组是1 2 个有严重高血压的肝硬化患者， 同时给他们口服含大量双歧杆菌的发酵乳，持续8 0 d ，结果这两组患者的血清和尿中有 毒代谢物降至健康人或接近健康入的水平，食欲增加，蛋白耐受性增强，体重平均增加 2 6 k g 。 1 2 7 低龋齿性 龋齿主要是变异链球菌等将糖转化为水不溶性葡聚糖，并吸附于牙齿表面形成牙 垢，口腔中的产酸菌附着于牙垢上发酵产酸，使牙齿的无机物溶解，导致龋齿的发生。 低聚果糖不能被变异链球菌等利用作为能源，该菌产生的葡萄糖转移酶不能将低聚果糖 转化为不溶性和粘着性的葡聚糖。另外，口腔产酸菌从低聚果糖生成的乳酸亦远低于从 蔗糖转化生成的酸。因此，低聚果糖有预防龋齿的功能。 1 2 8 有改善皮肤过敏的作用 日本甜菜制糖等几家企业联合做出的研究发现，大豆中所含的低聚糖有改善过敏性 皮炎的作用。3 1 名患者的饮用试验证明，皮肤的瘙痒有所减轻。试验选择3 1 名1 7 - 3 6 岁患者，给予他们内服大豆低聚糖粉末3 9 ，每天2 次，时间为3 个月。试验结果表明， 有7 0 患者的皮肤瘙痒有所减轻，有9 0 原来因瘙痒无法入睡的患者症状得到了改善 1 绪论 经过采用“皮肤症状范围数值化”的s c o r a d 技术测验，也证实了患者症状减轻，而 且血液中嗜酸粒细胞数量减少了2 0 ，回到基本正常的范围“1 。 1 2 9 抗衰老作用 促使人体肠道内双歧杆菌数量增多的方法有两种：一种是直接口服双歧杆菌的微生 态调节剂；一种是服用能促进双歧杆菌在肠道内增殖的物质。但是口服双歧杆菌制剂要 受到许多条件限制，特别是双歧杆菌是厌氧菌，对氧极为敏感，而且营养要求特殊，易 受氧气、光线、水分、p h 值、温度等影响而死亡。另外，口服活茵制剂还会受到胃酸 和胆汁的影响，使活菌数量减少。但是这些对大豆低聚糖来说却很容易克服。人体试验 表明，摄入大豆低聚糖可促进双歧杆菌增殖。这是由于人体内缺乏分解大豆低聚糖中棉 籽糖和水苏糖的消化酶，即a d 半乳糖苷酶，所以大豆低聚糖可以不经消化吸收直接达 到大肠内为双歧杆菌所利用，是双歧杆菌的有效增殖因子。因此，如果以促进人体肠道 内固有的双歧杆菌生长繁殖为目的，采取服用能促进双歧杆菌增殖的物质如大豆低聚 糖，使双歧杆菌数量增加，远比服用活菌制剂方便得多1 4 】。 1 3 国内外研究动态及研究的目的意义 1 3 1 国内外研究动态 低聚果糖主要由蔗果二糖、蔗果三糖和蔗果四糖组成。工业上一般以蔗糖为原料， 利用微生物所产生的b 呋喃果糖苷酶，通过果糖基转移反应生产低聚果糖。低聚果糖工 业化生产成功的基础之一是高产b 呋喃果糖苷酶菌株的获得，产酶菌株的微生物学特性 和酶学特性也极大地影响酶反应的催化效率。能够产生b 呋喃果糖苷酶的微生物很多， 主要包括细菌、真菌和酵母等【捌，工业化生产主要以真菌b 呋喃果糖苷酶为主1 4 3 州。 1 9 8 8 年i - i i r a y a m a 等1 4 习研究了黑曲霉中8 呋喃果糖苷酶的性质，利用离子交换色谱 和凝胶过滤色谱分离提纯了该酶，并用聚焦色谱测定该酶的纯度和等电点。1 9 9 0 年 f u j i t a 等 4 6 1 用d e a e - t o y o p e a r l6 5 0 m 柱和b u t y l - t o y o p e a r l6 5 0 m 柱分离该酶得到了三个 同工酶。以上诸位学者在b 呋喃果糖苷酶分离纯化的基础上，对该酶的分子量、最适 p h 值、最适温度等酶的性质也进行了研究。 由于低聚糖具有在食品、医药及饲料添加剂等方面应用的极大潜力，国外对低聚糖 的研究比较深入，工业化程度较高，尤其日本，这方面的研究和生产起步最早，产量最 大。二十世纪八十年代，日本推出了以蔗糖为主要原料利用微生物酶作用大规模生产低 聚果糖的方法，由于低聚果糖所具有的特殊的物理化学性能和生理功能，掺有此低聚果 糖的食品和保健品越来越受到人们的青睐，在一些发达国家均有大规模的生产，在我 国，近年来低聚果糖也逐渐成为人们消费的热点。现在日本已经成为全球大豆低聚糖产 业化规模最大的国家。但就全球范围而言，美国利用水苏耱的开发力度最大，程度最 深，因而其在美国市场的应用范围也最为广泛。 我国对大豆低聚糖的研究和开发是伴随着大豆分离蛋白生产技术在我国的引进开始 东北林业大学硕士学位论文 的。在这一领域起步较晚但发展很快，从1 9 9 6 年开始投入生产，到1 9 9 8 年底生产能力 已达3 万吨，实际产量1 万吨。1 9 9 8 年黑龙江省天菊集团建立了日处理8 0 0 吨大豆乳清 全套生产线，年产大豆低聚糖2 2 8 0 吨。目前该公司产品只有一种白色粉末产品，市场 价格为8 0 元l ( g ，产品的纯度低，其中棉子糖和水苏糖含量为3 0 - 3 5 ，其余为蔗糖和 糊精。因此该产品的热值较高，功能效果低。目前山东i 临沂山松、黑龙江哈高科也进行 了批量生产。现已有大豆低聚糖粉末、糖浆、冲剂、系列饮料等保健食品。 目前国内生产大豆低聚糖主要采用超滤、反渗透、电渗析方法从大豆乳清中分离大 豆低聚糖，糖浆中加入赋形剂后喷雾干燥制得粉末状产品m 。国外的产品有糖浆、颗 粒、粉状，产品纯度有普通和精制大豆低聚糖。在工业产品中蔗糖的含量较高，在颗粒 制品中蔗糖含量可高达4 4 。因此，大豆低聚糖制品的热值相对高于一些精制低聚糖如 低聚果糖、低聚木糖、低聚麦芽糖等低聚糖，如此高的蔗糖含量限制了大豆低聚糖在一 些功能性食品中使用，尤其是生产一些低热值或无热值的糖尿病人专用食品及减肥食 品。而精制大豆低聚糖采用柱色谱法分离，生产成本较高，产品价格较高，不适合大规 模生产。 1 3 ，2 研究的目的和意义 低聚果糖所具有的独特的营养功能己被诸多研究证实并为大众所接受，因此对低聚 果糖生产及微生物果糖基转移酶的研究方兴未艾。功能性低聚糖的研究是当今食品科学 与工程研究领域的前沿，被誉为二十一世纪食品工业的先导。由于低聚糖来源及糖基转 移酶的催化特性等原因，功能性低聚糖中都有葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等副产物的存在， 大大降低了功能性低聚糖的生理功能。因此，功能性低聚糖的分离纯化已经成为厂家亟 待解决的问题。大豆低聚糖中蔗糖含量可高达4 4 。因此，大豆低聚糖热值相对高于一 些精制低聚糖，如低聚果糖、低聚木糖和低聚异麦芽糖等，如此高的蔗糖含量限制了大 豆低聚糖在一些功能性食品中使用，特别是在低热值或无热值的糖尿病人专用食品及减 肥食品的使用。目前国内生产大豆低聚糖主要采用超滤、反渗透、电渗析方法从大豆乳 清中分离大豆低聚糖，糖浆中加入赋形剂后喷雾干燥制成粉末状产品或颗粒制品。采用 柱色谱分离法精制大豆低聚糖，生产成本较高，而且浪费了蔗糖资源，易造成环境污 染。 大豆低聚糖的成分中具有低聚糖生理活性的功能因子是棉子糖和水苏糖。将大豆低 聚糖中的蔗糖转化为低聚糖最佳的方法是将蔗糖转化为棉子糖和水苏糖。经大量实验证 明，b 呋喃果糖苷酶可以有效地将蔗糖水解成葡萄糖和果糖，并将果糖转移到蔗糖分子 的果糖残基b - ( i ? 2 ) 糖苷键连接1 2 个果糖基，形成蔗果三糖和蔗果四糖。 本研究立足在不引入其它糖的前提下，以大豆低聚糖糖浆制品为原料，采用酶工程 技术，利用微生物产b 呋哺果糖苷酶将大豆低聚糖糖浆制品中的蔗糖转化为了低聚糖。 该方法可降低糖浆制品中蔗糖的含量，提高低聚糖的含量，与柱色谱分离方法相比，生 产成本大大降低，使用酶转化的方法，可将其中6 0 以上的蔗糖转化为低聚糖，使得最 1 绪论 后产品的纯度接近精制大豆低聚糖。 据报道，目前全世界有超过1 9 亿的人患有糖尿病，到2 0 2 5 年将会增长为3 3 亿， 而且随着人口数量的增长、人口的老龄化、城市化的趋势，将会有越来越多的人患上肥 胖症、糖尿病等“贵族病”。精制大豆低聚糖项目所生产的产品可作为糖尿病人的糖 源，所以必定会被人类越来越多的应用。研发的成功有利子糖尿病人和恐褚人群的系列 保健品在国际上有很大的潜在市场，产品出口后有利于出口创汇。 我省及东北地区盛产大豆，进行大豆深加工和综合利用，提高附加值成为大豆开发 的焦点。大豆分离蛋白生产过程中要排放出大量的乳清，而大豆低聚糖恰恰是以生产浓 缩蛋白或大豆分离蛋白的副产物大豆乳清为原料，经一系列处理去除蛋白而得到的透明 液体状糖浆产品。目前我国大豆蛋白生产规模较大的生产厂家就有3 0 多家，生产1 吨 大豆分离蛋白就要排出1 0 吨大豆乳清，而目前我国绝大多数的大豆蛋白生产都没有对 大豆乳清采取治理措施，不但让有用的资源浪费掉，还严重的污染环境。据报导，生产 7 5 吨大豆蛋白所排出的大豆乳清，其b o d 值相当于2 5 句万人口的城市一天的生活污 水。因此，有效地利用和处理好大豆乳清是关系环保和人民健康的重大问题。开发新型 大豆低聚糖产品不仅可以解决大豆乳清的环境污染问题，而且可以变废为宝，达到一举 两得的效果i , t 8 - 4 9 1 。 综上所述，利用微生物酶法对大豆低聚糖进行深加工，提高附加值，降低大豆低聚 糖热值，提高大豆低聚糖的纯度和功能性，增加大豆低聚糖的产品类型，将为我国大豆 低聚糖的生产开辟新的途径。 东北林业大学硕士学位论文 2p 呋喃果糖苷酶高产菌株的筛选 2 1 引言 低聚果糖主要由蔗果二糖、蔗果三糖和蔗果四糖组成。工业上一般以蔗糖为原料， 利用微生物所产生的b 呋喃果糖苷酶，通过果糖基转移反应生产低聚果糖。低聚果糖工 业化生产成功的基础之一是高产8 呋喃果糖苷酶菌株的获得，产酶菌株的微生物学特性 和酶学特性也极大地影响酶反应的催化效率。能够产生b 呋喃果糖苷酶的微生物很多， 主要包括细菌、真菌和酵母等【踟，工业化生产主要以真菌b 呋喃果糖苷酶为主f s ”2 1 。 真菌的分类原则，一般以培养、形态特征为主，生理生化和生态特性为辅；在划分 科、属时，基本以形态为主要依据，有时还须参考生态条件。培养特征包括单个菌落的 生长速度、颜色、表面纹饰、表面质地、有无渗出液及气味等。形态特征包括分生孢子 头的形态、分生孢子排列方式、分生孢子梗着生方式、菌丝有无颜色及有无可溶性色素 等。生理生化特性包括是否产生黑色素，以及对于各种碳源的利用情况瞰5 4 1 。 2 2 材料与仪器 2 2 1 菌种 节杆菌a r t h r o b a c t e r s p 1 0 1 3 7 黑曲霉a s pn i g e r3 7 9 5 2 2 2 仪器 a ic 2 1 0 2 电子天平 7 2 2 s 可见分光光度计 z d 8 5 恒温振荡器 5 0 3 0 - p v l 程控压力蒸汽灭菌器 l d 4 2 a 低速离心机 t d l ，5 台式离心机 d k 9 8 1 型电热恒温水浴锅 j y 9 9 - 2 d 超声波细胞粉碎机 s w a i f d 超净工作台 l c 6 a 高效液相色谱仪 球磨机 d h 6 0 0 0 a 型电热恒温培养箱 d h g 9 2 4 0 型电热恒温鼓风干燥箱 h z q x 1 0 0 震荡培养箱 h z q f 全温震荡培养箱 购自中国工业微生物菌种保藏中心 购自中国工业微生物菌种保藏中心 北京赛多利斯仪器系统有限公司 上海精密科学仪器有限公司 常州国华企业 长春百奥生物仪器有限责任公司 北京医用离心机厂 上海安亭科学仪器厂 天津市泰斯特仪器有限公司 宁波新芝生物科技股份有限公司 苏州安泰空气技术有限公司 美国w a t e r s 公司 南大天尊 天津泰斯特仪器有限公司 上海一恒科技有限公司 哈尔滨东明医疗仪器厂 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 2b 呋喃果糖苷酶高产菌株的筛选 s a m s u n g 2 2 3 药品和试剂 蔗糖、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、琼脂、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化铁、 磷酸氢二钠、柠檬酸等，均为化学纯或分析纯。 葡萄糖( 标准品，s i g m a 公司) 、果糖( 标准品，s i g m a 公司) 、棉子糖( 标准品，s i g m a 公司) 、水苏糖( 标准品，s i g m a 公司) 、蔗果三糖(