第十三章生物制品分析概论.ppt

第十四章中药及其制剂分析概论AnalysisofChinesemateriamedicapreparation,主要内容,第一节概述,1,中药及其制剂的分析方法,2,中药指纹图谱研究技术,3,主要重点,第一节概述,中国药典,明代李时珍:本草纲目,晋代葛洪:肘后备急方,汉代张仲景：伤寒论和金匮要略,战国时期：黄帝内经,中医药是中华民族的伟大宝库,中药是我国医药宝库中重要组成部分。,基本概念,一、定义中药制剂是根据药典、制剂规范和其它规定的处方，将中药的原料药物加工制成具有一定规格，可以直接用于防病、治病的药品。注意：中药制剂必须是以中医药基础理论和用药原则为指导制成的单方或复方制剂。中药的成方制剂又称为中成药我国现有35大类、43种剂型共有5000余种中成药。中国药典（2005年版）一部已收载1146种，其中中药材料572种，中药制剂574种，品种数比2000年版药典增加154种，修订453种。,基本概念,一、定义中药现代化研究：系指运用现代的科学技术，研制、开发现代中药制剂，实现能用现代科学技术阐明其药效物质作用机制，能进行集团化种植和大规模生产，并能为国际市场所接受，有国际竞争力的现代中药制剂。,一、中药及其制剂分析的特点,中药是以中医药学理论体系的术语表达其性味、功效和使用规律，并且按中医药学理论指导其临床应用的传统药物。中药制剂分析：以中医药理论为指导，应用现代分析理论和方法，研究中药制剂质量的一门应用科学，是中药学领域中一个重要的组成部分。,中药及其制剂分析的特点,1.化学成分复杂,有效成分难以确定,2.首选君药,贵重药和毒剧药建立分析方法,3.分析时,考虑药材来源与炮制等方面的影响,4.针对不同工艺、剂型和辅料等选择适宜的分析方法和检测项目。,5.杂质来源多途径,针对性地进行控制,6.多指标多成分分析,特点,二、中药及其制剂的分类与质量分析要点,传统剂型：丸、散、膏、丹、酒、汤、茶和锭等。中药现代剂型：口服液、片剂、软胶囊剂、颗粒剂、滴丸、气雾剂和注射剂等。按物态分类：中药材及其炮制品、液体制剂、半固体制剂、固体制剂和气体制剂。,二、中药及其制剂的分类与质量分析要点,（一）中药材及其炮制品：中药制剂的生产原料，是中药生产过程中质量保证和首要环节。质量控制：严格按照执行国家药品规范和中药材炮制规范。（二）液体制剂1.合剂与口服液合剂指药材用水或其他溶剂,采用适宜方法提取制成的口服液体制剂。单剂量灌装者称口服液。,二、中药及其制剂的分类与质量分析要点,质量控制：合剂不得有酸败、异臭、产生气体或其它变质现象。检查项目：相对密度pH装量差异（口服）,二、中药及其制剂的分类与质量分析要点,2.酒剂和酊剂：酒剂：指药材用蒸馏酒提取制成的澄清液体制剂,也可用流浸膏稀释制成。酊剂：药材用规定浓度的乙醇提取或溶解而制成的澄清液体制剂。酊剂可用溶解法、稀释法、浸渍法或渗漉法制备。质量控制：乙醇量的检查,二、中药及其制剂的分类与质量分析要点,3.注射剂指药材经提取、纯化后制成的供注入体内的溶液、乳状液及供临床前配制成溶液的粉末或浓溶液的无菌制剂。分为：注射液注射用无菌粉末注射用浓溶液。质量控制：装量差异澄明度无菌不溶性微粒和pH中药材、有效部位或中间体、注射剂的指纹图谱。（三）半固体制剂1.煎膏剂药材用水煎煮液浓缩,加炼蜜或糖制成的半流体制剂。质量控制：相对密度不溶物检查,二、中药及其制剂的分类与质量分析要点,2.散剂指药材或药材提取物经粉碎、均匀混合制成的粉末状制剂，分为内服散剂和外用散剂。质量控制：外观均匀度装量差异水分3.颗粒剂药材提取物与适宜的辅料或药材细粉制成具有一定粒度的颗粒状制剂,分为可溶性颗粒、混悬颗粒和泡腾颗粒。质量控制：粒度水分溶化性装量差异微生物限度4.片剂指药材提取物、药材提取物加药材细粉或药材细粉与适宜辅料均匀压制或用其他适宜方法制成的圆片状或异形状的制剂。质量控制：重量差异崩解时限,二、中药及其制剂的分类与质量分析要点,取供试品适量置光滑纸上，平铺约5cm2，将其表面压平，在亮处观察，应呈现均匀的色泽，无花纹、色斑,二、中药及其制剂的分类与质量分析要点,5.胶囊剂指药材用适宜方法加工后，加入适宜辅料填充于空心胶囊或密封于软质囊材中的制剂，可分为硬胶囊、软胶囊和肠溶胶囊。质量控制：装量差异崩解时限和微生物限度检查（五）气体制剂气雾剂和喷雾剂气雾剂：药材提取物、药材细粉与适宜的抛射剂共同封装在具有特制阀门装置的耐压容器中，使用时借助抛射剂的压力将内容物喷出呈雾状、泡沫状或其他形态的制剂。喷雾剂：不含抛射剂，借助手动泵的压力或其他方法将内容物以雾状等形态喷出。质量控制：非定量阀门气雾剂：喷射速率和喷出总量的检查；定量阀门气雾剂：每瓶总揿次、每揿喷量或每揿主药含量检查。,三、中药及其制剂中待测成分的提取分离与纯化方法,利用溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解度的不同，使物质从一种溶剂转移到另一种溶剂中，将测定组分提取出来的方法。主要用于液体制剂中待测组分的提取分离，多用有机溶剂将其萃取出来，以便分析。,二、中药及其制剂的分类与质量分析要点,用于皂苷类,正丁醇,氯仿,乙醚、石油醚,醋酸乙酯,（1）萃取溶剂的选择.,用于生物碱类,用于黄酮类,用于挥发油,二、中药及其制剂的分类与质量分析要点,（2）水相pH的选择,酸性成分比其pKa低12个pH单位,比其pKa高12个pH单位碱性成分,二、中药及其制剂的分类与质量分析要点,（3）仪器和提取次数,（4）酒剂和酊剂先挥去乙醇,（5）防止和消除乳化,分液漏斗,鉴别1次,含量测定34次,样品置溶剂里，室温下浸泡一段时间的提取方法,二、中药及其制剂的分类与质量分析要点,亲脂性,亲水性,石油醚苯氯仿乙醚乙酸乙酯丙酮乙醇甲醇水,样品置有机溶剂中加热回流的提取方法,通过更换溶剂，使提取更完全,样品置有机溶剂中加热，蒸发的溶剂经冷凝流回样品管的提取方法,适用于具挥发性的可随水蒸气蒸出的组分的测定,麻黄碱、槟榔碱、丹皮酚、挥发油,超声波振荡器（超声波清洗器）,简便省时提取率高,利用超声波的助溶作用进行提取,原理超声波在液体中以疏密相间的形式向物体辐射，出现“空化”现象（气泡的形成、产生及破裂现象），形成超过1000个大气压的冲击力。,（SFE法）,当压力和温度超过气体的临界点时所形成的单一相态,气体,超临界流体,气体,T压力,T压力,SFE工艺流程,超临界流体萃取与化学法萃取相比有以下突出的优点：,（1）它具有与液体相似的密度，因而具有与液体相似的较强的溶解能力；,（2）溶质在流体中的扩散系数与气体相似，具有传质快，提取时间短的优点；,（3）超临界流体的表面张力为零，易渗透到样品中，带走测定组分；,（4）超临界流体在通常状态下为气体，萃取后溶剂可立即变成气体而逸出，易达到浓集的目的；,（6）CO2价格便宜，纯度高，容易取得，且在生产过程中循环使用，从而降低成本；,（5）CO2是一种不活泼的气体,萃取过程不发生化学反应,且属于不燃性气体,无味、无臭、无毒，故安全性好；,（7）该技术易与其他仪器联用实现自动化,1、,萃取法,利用药物与杂质溶解性能的不同进行分离,（1）保留测定组分在柱上，洗去杂质，再用适当溶剂洗下组分,（2）保留杂质于柱上,第二节中药及其制剂的分析方法,提取纯化,第二节中药及其制剂的分析方法,一、取样与样品的保存多采取估计取样,即将整批中药抽出一部分具有代表性的供试样品进行分析、观察，得出规律性“估计”的一种方法。二、中药及其制剂的鉴别根据中药材、中药制剂的性状、组织学特征以及所含化学成分的理化性质，采用一定的分析方法来判断该中药材及其制剂的真伪。,二、中药及其制剂的鉴别,鉴别内容性状鉴别显微鉴别理化鉴别(-)性状鉴别利用其外观、形状及感观性质等特征作为真伪鉴别的依据。药材及其炮制品的形状、大小、色泽、表面特征、质地，折断面特征以及气味等中药制制的外观及内容物的形状、颜色，气味等性状鉴别是评价药材及其制剂质量的一项重要指标。,鉴定有临床疗效的已知成分,黄连小檗碱（抗菌消炎）麻黄麻黄碱（支气管哮喘）乌头乌头碱（毒性）洋地黄强心苷（强心）延胡索延胡索乙素（镇痛）,（含生药粉制剂）,丸剂、片剂、胶囊剂、散剂,快速，简便，覆盖面大,二、中药及其制剂的鉴别,（二）显微鉴别利用显微镜来观察药材及含药材粉末的中成药的组织构造、细胞形状以及化合物的特征，以鉴别中药的真伪。分为：1）显微组织鉴别法2）显微化学反应鉴别法皂苷类：显色反应泡沫试验溶血试验香豆素类：颜色反应荧光反应显微鉴别：明显，易查见,1、水牛角浓缩粉,2、麝香,3、珍珠,4、朱砂,5、雄黄,6、黄连,7、栀子,8、郁金,9、黄芩,安宫牛黄丸,二、中药及其制剂的鉴别,（三）理化鉴别根据中药及其制剂中所含主要化学成分的理化性质，采用物理、化学或物理化学的方法进行鉴别，从而判断其真伪。1）显微化学反应2）微量升华法3）颜色反应与沉淀反应法4）荧光法与分光光度法5）色谱鉴别法,抗干扰能力差,显色、荧光,TLC法应用最多（Rf、颜色、荧光）,GC法适用于含挥发性成分的药物,HPLC法常与含量测定同时进行,阴、阳对照法,阳性对照将要鉴别的药材按制剂工艺处理，再按鉴别方法提取的溶液,阴性对照把制剂中要鉴别的药材除去，用剩下的各味药按制剂工艺处理，再按鉴别方法提取的溶液,OOOOOOOOOO,例,阳性对照,阴性对照,样品,大补阴丸黄柏的TLC法鉴别,例,二、中药及其制剂的鉴别,薄层色谱法（1）供试液的制备（2）色谱条件的选择1）固定相的选择2）展开系统选择3）系统适用性（3）对照物的选择,1）薄层板的选择,硅胶G板（可加0.3%-0.5%CMC-Na）多用,氧化铝板常用于生物碱类药物,聚酰胺板常用于黄酮类及酚类药物,纤维素板常用于氨基酸类药物,2）展开系统的选择,突出主斑点，有利于主斑点的分析比较理想的Rf值:0.2-0.8通用展开系统:1)无水乙醇-苯(1:4)2)苯-氯仿(1:3)3)丙酮-甲醇(1:1)选择原则:先用无水乙醇-苯(1:4)展开,如Rf值0.8则用苯-氯仿(1:3)如Rf值0.3则用丙酮-甲醇(1:1),3）系统适用性,用供试品和对照品对实验条件进行试验和调整,应达到规定的检测灵敏度,分离度和重复性要求。（3）对照物的选择1）对照品对照法：采用制剂中某味药材所含有效成分（或指标性成分）的对照品制备成标准对照品溶液，与供试品溶液与阴性对照品溶液点于同一薄层板上，展开，显色后，比较与对照溶液相同Rf值位置上有无同一颜色的斑点，阴性对照液在该处无斑点。2）对照药材对照法：把制剂中某药味的对照药材制成对照溶液，与供试品溶液同法操作进行对照。,3）阳性对照法把制剂中要鉴别的药味，按制剂工艺的制备方法处理，以和制剂相同的比例，条件、方法提取，所得的提取液称为该药味的阳性对照液（使用较少）。4）阴性对照法把制剂处方中要鉴别的某味药除去剩余的各药材按制剂工艺同法处理所得的提取液。（4）显色与检视方法在日光下显色的，直接观察；无颜色，喷显色剂；在荧光灯或GF254板上展开后，在荧光下观察。（5）测定方法1）鉴别2）限度检查例：复方丹参片中丹参和冰片的鉴别方法,三、中药及其制剂的杂质检查,水分总灰分和酸不溶性灰分重金属砷盐残留农药,主要项目,杂质来源及检查意义,水分结块、霉变或有效成分水解,灰分控制药物本身及泥土、沙石等无机杂质,砷盐剧毒，常由除草剂、杀虫剂或化肥引入,重金属环境污染和使用农药引入,残留农药有毒,有机氯和有机磷农药,（一）水分测定法,固体制剂水分高：制剂结块，霉变，有效成分分解（降解）四种方法：烘干法甲苯法减压干燥法气相色谱法烘干法：适用：不含或少含挥发性成分的药品甲苯法：适用：含挥发性成分的药品原理：利用水分可与甲苯在69.3共沸蒸出,收集馏出液,待分层后由刻度管测定所含水分。,（一）水分测定法,减压干燥法适用：含有挥发性成分的贵重药品干燥剂：五氧化二磷气相色谱法适用：范围广，不受是否含有挥发性成分，水分含量多少的影响。简便快速，灵敏度高。,(二)总灰分和酸不溶性灰分的测定,1.总灰分:指药材或制剂经加热炽灼灰化后残留的无机物包括:药物本身所含无机盐外,泥土,砂石等外表粘附的无机杂质2.酸不溶性灰分取上述所得灰分,在坩埚中小心加入稀盐酸约10ml，用表面皿覆盖坩埚，置水浴上加热min，表面皿用热水ml冲洗，洗液并入坩埚中，用无灰滤纸滤过，坩埚内的残渣用水洗于滤纸上，并洗涤至洗液不显氯化物反应为止。滤渣连同滤纸移置同一坩埚中，干燥，炽灼至恒重，即得酸不溶性灰分的量。,酸不溶性灰分的测定,总灰分的测定,干法破坏（ChP）,湿法破坏（USP）,(四)砷盐检查法,砷盐：除草剂、杀虫剂和化学肥料检查法：古蔡法二乙基二硫代氨基甲酸银前处理:碱熔融法破坏,碱融法破坏湿法破坏,(五)农药残留量测定法,来源:减少病虫害,喷洒农药,残存在药材中分类:1)有机氯类:六六六滴滴涕五氯硝基苯等2)有机磷类:对硫磷甲基对硫磷乐果氧化乐果甲胺磷敌敌畏3)拟除虫菊酯类:氯氰菊酯氰戊菊酯溴氰菊酯其它:氨基甲酸酯类二硫代氨基甲酸酯类无机农药苯氧羧酸类除草剂,四、中药及其制剂的含量测定,中药及制剂中含有众多类别的化学成分，成分复杂，加之大多数有效成分尚不十分清楚，其药材应该是多种化学成分协同作用的结果。根据中医药理论，选择相关有效成分或有效成分群，建立含量测定项目和方法，对控制药品质量，保证药材批间差异或制剂的相对稳定性，仍然具有重要的意义。,四、中药及其制剂的含量测定,中国药典中药制剂含量测定所占比例版本%19771.4819855.3119908.73199512.81200062.09（HPLC36%TLCS24%GC3%),四、中药及其制剂的含量测定,测定项目的选定原则,首选君药及贵重药、剧毒药建立含量测定方法2其次考虑臣药及其他味药3有效成分明确的，可选有效成分4成分类别清楚的，可测某一类总成分的含量,四、中药及其制剂的含量测定,测定项目的选定原则,5检测成分应归属某单一药味6检测成分应与中医用药的功能主治相近7确无法含量测定的，可测定浸出物含量,重量分析法容量分析法,特点A、准确度、精密度高B、抗干扰能力差,UV法比色法,特点A、灵敏度高B、简便、快速C、精密度稍低D、干扰多,芦丁,黄芩苷,小檗碱,丹皮酚,四、中药及其制剂的含量测定,含量测定常用方法：（一）法.色谱条件的选择2.供试品溶液的制备3.测定方法的选择,RP-HPLC,PIC,反离子氢氧化四丁基铵,色谱柱ODS,RP-PIC,反离子烷基磺酸盐无机阴离子,外标法和内标法,四、中药及其制剂的含量测定,离子对色谱法（PIC）极性流动相中加入离子对试剂，与被分析离子生成中性离子对，从而增加在非极性固定相中的溶解度，使分配系数增大。,四、中药及其制剂的含量测定,2000年版中国药典（2000年版）HPLC法品种,品种数量HPLC数量占总数%534（药材）5410.11458（成药）4810.48978（总数）10220.59,（四）中药及其制剂的含量测定,含量测定常用方法：(二)法）用于测定含挥发油及其他挥发性成分的含量）含水量及含醇量的测定,四、中药及其制剂的含量测定,实验条件的选择（）固定相的选择（）柱温（）载气（）检测器的选择（）其它条件的选择测定方法（）内标法（）外标法,四、中药及其制剂的含量测定,含量测定常用方法：（三）法用一定波长的光照在薄层板上，对薄层色谱中吸收紫外光和可见光的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点进行扫描将扫描得到的图谱及积分数据用于鉴别，检查或含量测定的一种方法。,测定薄层板上斑点对单色光的吸收或反射的强度而进行定量的方法,特点：A、分离效果好B、适用于无法用UV、HPLC法测定的组分C、准确度、精密度低于HPLC,2000年版中国药典（2000年版）薄层扫描法品种,品种数量TLCS数量占总数%534（药材）203.74458（成药）326.99978（总数）5210.73,（1）薄层色谱条件,分离好不拖尾,（2）检测方法,吸收测定法荧光测定法,反射法透射法,（3）扫描方式,单波长双波长,线性扫描法锯齿扫描法,外标法内标法,（4）散射参数SX,薄层板的散射使,Kubelka-Munk方程,（1）薄层板均匀、平整,（2）点样量准确,（4）显色剂均匀、适当,（5）保护斑点用相同大小洁净玻璃盖住薄层板，并用透明胶纸封住边缘，以起固定和隔绝空气作用,（3）斑点应完全分离，不拖尾,外标法（两点校正法）,应用实例-小青龙合剂,处方麻黄125g桂枝125g白芍125g干姜125五味子125g细辛62g甘草(蜜炙)法半夏188gNOTES：合剂是在传统汤剂基础上改进后的一种新剂型,生物碱,桂皮醛,芍药甙,挥发油,三萜皂甙,应用实例-小青龙合剂,制法以上八味，细辛、桂枝提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器收集，药渣与白芍、麻黄、五味子、甘草加水煎煮至味尽，合并煎液，滤过，滤液和蒸馏后的水溶液合并，浓缩至约1000ml。法半夏、甘姜照流浸膏剂项下渗漉法，用70%乙醇作溶剂，浸渍24小时后进行渗漉，漉液浓缩，与上述药液合并，静置，滤过，滤液浓缩至1000ml，加入苯甲酸钠3g与细辛、桂枝挥发油，搅匀，即得。,性状本品为棕黑色的液体；气微香，味甜、微辛。功能与主治解表化饮，止咳平喘。用于风寒水饮，恶寒发热，无汗，喘咳痰稀用法与用量口服，一次10-20ml，一日3次，用时摇匀。,方药分析：君麻黄发汗为君臣桂枝解表为臣佐甘草恐发汗太过,佐以甘草缓之使白芍、干姜、细辛、法半夏、五味子几药合力共为使。可外发汗，内行水，散表里之邪。,汉代张仲景伤寒论小青龙汤近代由重庆桐君阁中药厂该汤剂为合剂本方治疗伤寒表不解，心下有水气，干呕，发热而咳。近代也用于慢性支气管炎，支气管哮喘、肺气肿，均见咳、喘、痰白清稀者。,供试品溶液与阴性对照液的制备：取合剂10ml，石油醚分3次萃取，合并石油萃取液油层，浓缩至1ml，为供试品溶液A；水层用Na2CO3调PH11-12，用氯仿萃取，合并氯仿萃取液，回收氯仿至干，残渣用1ml甲醇溶解，为供试品溶液B；NOTES：阴性对照液如上法同步进行。,1.桂皮醛的鉴别取供试品液A、阴性对照液、桂皮醛对照液（1ug/ml）15ul，点于同一硅胶G板上，环己烷-乙酸乙酯（17：3）展开，晾干，喷2，4二硝基苯肼乙醇T.S，供试品A与对照品在相应位置上显相同的橙色斑点，而阴性对照液无此斑点。,2.细辛挥发油的鉴别取供试品液A、阴性对照液、细辛挥发油对照液（1：10乙醚液）5ul，点于同一硅胶G板上，环己烷展开，晾干，喷10%香草醛浓硫酸T.S，加热至显色，供试品A与对照品在相应位置上显相同的粉红色斑点，而阴性对照液无此斑点。,3.麻黄碱的鉴别取供试品液B，阴性对照液，麻黄碱对照品液（1mg/ml）各5ul，点于同一硅胶G，氯仿-甲醇-浓氨水（20：5：0.5）展开，晾干，喷茚三酮T.S，加热至斑点显色，供试品B与对照品在相应位置上显相同的蓝紫色斑点，而阴性对照液无此斑点。,取合剂5ml，上聚酰胺柱，DW洗脱，洗脱液水浴浓缩至干，用1ml甲醇溶解，为供试品溶液C；聚酰胺柱再用95%乙醇洗脱，弃取洗脱液，用3M氨乙醇液洗脱，收集洗脱液水浴蒸干，1ml甲醇溶解，为供试品溶液D。,4.芍药甙的鉴别取供试品液C、阴性对照液、芍药甙对照液（1mg/ml）10ul，点于同一硅胶G板上，氯仿-乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸-甲酸（8：1：2：0.04）展开，晾干，喷10%硫酸乙醇液，加热至显色，供试品C与对照品在相应位置上显相同的紫色斑点，而阴性对照液无此斑点。,5.甘草酸的鉴别取供试品液D、阴性对照液、甘草酸铵对照液（2mg/ml）2ul，点于同一硅胶G板上，乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-蒸馏水（30：2：2：4）展开，晾干，喷10%硫酸乙醇液，加热至显色，UV灯365nm观察，供试品D与对照品在相应位置上显相同的紫色斑点，而阴性对照液无此斑点。,含量测定,HPLC法测定芍药甙的含量仪器与色谱条件BECKMAN332型高效液相色谱仪163型可变波长紫外检测仪，220nm427型记录及数据处理仪色谱柱为YWGC18流动相乙腈-水（15：85）,标准曲线制备精密称取芍药甙