（食品科学与工程专业论文）n酰化低聚壳聚糖的抗氧化性能研究.pdf

上海海洋人学硕十学位论文 n - 酰化低聚壳聚糖抗氧化性能的研究 摘要 甲壳素壳聚糖是自然界唯一的一种碱性多糖，由于其具有良好的生物相容 性，无毒性，可降解性，在食品、农业、化妆品等领域已经有着广泛的应用。低 聚壳聚糖是壳聚糖的降解产物，与壳聚糖相比，它具有很多独特的物理化学性质。 它的结构分子单元中有大量的氨基和羟基，这就决定其具有优良的抗氧化性质， 并且可以进行多种化学改性。 本文合成了一系列取代度不同的n 一琥珀酰低聚壳聚糖( n s c o s ) 、n 一马来酰低 聚壳聚糖( n m c o s ) 和n 一邻苯二甲酰低聚壳聚糖( n p c o s ) ，用红外光谱对其结构 进行表征，并且考察了他们的抗氧化性能，研究了取代度对n 酰化低聚壳聚糖抗 氧化性的影响；合成了两种取代度相同( 0 2 5 和0 4 9 ) 的n s c o s ，n m c o s 和 n p c o s ，并且考察了其抗氧化性能，研究了n 一酰基基团对n 一酰化低聚壳聚糖的抗 氧化性的影响。结果表明： ( 1 ) 随着取代度的增加，n 一琥珀酰低聚壳聚糖对超氧的清除能力大小为 n s c o s b n s c o s a n s c o s c ；对d p p h 的清除能力大小以及还原能力大小依 次为：n s c o s a n s c o s c n s c o s b ，取代度为0 5 7 的n s c o s b 表现出最差 的活性；随着取代度的升高，对羟基的清除能力越低。 ( 2 ) 随着取代度的增加，n 马来酰低聚壳聚糖清除d p p h 的活性以及还原能力增强； 而清除羟基的活性的顺序依次为：n m c o s b n m c o s a n m c o s c ，其中取 代度为o 6 7 的n m c o s b 表现出最强的活性。 ( 3 ) 随着取代度的增加，n 邻苯二甲酰低聚壳聚糖对d p p h 的清除能力以及还原能 力呈逐渐下降趋势；对羟基自由基的清除顺序大小依次为n p c o s b n p c o s a n p c o s c ，n p c o s b 清除羟基自由基的的能力最佳。 ( 4 ) 取代度相同( o 2 5 和0 4 9 ) 的n 琥珀酰低聚壳聚糖、n 马来酰低聚壳聚糖和 n 邻苯二甲酰低聚壳聚糖的还原能力的大小均为：n p c o s 删c o s n s c o s 。 这一结果在低聚壳聚糖的改性及其衍生物抗氧化性能的研究中有着重要的意 义。 本论文揭示了取代度对n 琥珀酰低聚壳聚糖，n 马来酰低聚壳聚糖和n 邻苯 二甲酰低聚壳聚糖的抗氧化性的影响，以及研究了相同取代度时，琥珀酰基，马 来酰基以及邻苯二甲酰基对低聚壳聚糖的抗氧性的影响，分析取代度以及取代基 上海海洋人学硕+ 学位论文 团的结构对n 酰化低聚壳聚糖抗氧化性的影响规律，以期为促进天然多糖的选择 性功能化及拓展它们在生物医药尤其是抗氧化领域的应用提供依据。 关键词低聚壳聚糖，n 酰化，抗氧化性，取代度 上海海洋大学硕士学位论文 a n t i o x i d a n ta c t i v i t i e so fn - a c y lc h i t o s a no l i g o s a c c h a r i d e s a bs t r a c t c h i t i n | c h i t o s a ni st h eo n l yo n ek i n do fa l k a l i n ep o l y s a c c h a r i d e si nn a t u r e c h i t i n a n dc h i t o s a nh a sb e e na p p l i e di nm a n yf i e l ds u c ha sf o o d ，c h e m i c a li n d u s t r y ，a n d a g r i c u l t u r ed u et ot h e i rg o o db i o c o m p a t i b i l i t y , d e g r a d a b i l i t y , l o wt o x i ca n ds p e c i a l p h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e sa n db i o l o g i c a la c t i v i t i e s t h ec h i t o s a no l i g o s a c c h a r i d e sw a s p r o d u c e db yd e g r a d i n gc h i t o s a n ，c o m p a r e dt op a r e n tc h i t o s a n , w h i c hh a v ee x h i b i t e d s o m ep a r t i c u l a rp h y s i o l o g i c a la c t i v i t i e sa n df u n c t i o n 1 1 1 ec h i t o s a no l i g o s a c c h a r i d e sh a s g r e a ta n t i o x i d a n ta c t i v i t yb e c a u s eo ft h e r ea r em a n ya m i n oa n dh y d r o x y lg r o u p si ni t s d g l u c o s a m i n eu n i t s ，w h i c ha l s oi n d i c a t e dt h a tc h i t o s a no l i g o s a c c h a r i d e sm a k ev a r i o u s c h e m i c a lm o d i f i c a t i o n i nt h ep a p e r , as e r i e so fn s u c c i n y lc h i t o s a no l i g o s a c c h a r i d e sf n s c o s ) ，n - m a l e y l c h i t o s a no l i g o s a c c h a r i d e ( n m c o s ) a n d n p h t h a l o y lc h i t o s a no l i g o s a c c h a r i d e s ( n p c o s ) w i t hd i f f e r e n ts u b s t i t u t i n gd e g r e e sw e r ep r e p a r e db yc h e m i c a lm o d i f i c a t i o no fc h i t o s a n o l i g o s a c c h a r i d e t h e i rc h e m i c a ls t r u c t u r e sw e r ec h a r a c t e r i z e db yf t i r d s sw e r e m e a s u r e db ye o n d u c t o m e t r i ct i t r a t i o n 砀ei n f l u e n c eo fs u b s t i t u t i n gd e g r e eo nt h e a n t i o x i d a n ta c t i v i t yo fn - s u c c i n y lc h i t o s a n o l i g o s a c c h a r i d e s ，n - m a l e y l c h i t o s a n o l i g o s a c c h a r i d ea n dn - p h t h a l o y lc h i t o s a no l i g o s a c c h a r i d e sw e r ei n v e s t i g a t e d 1 1 1 e n s u c c i n y l c h i t o s a n o l i g o s a c c h a r i d e s ，n m a l e y l c h i t o s a n o l i g o s a c c h a r i d e a n d n p h t h a l o y l c h i t o s a no l i g o s a c c h a r i d e sw i t ht h es a m e s u b s t i t u t i n gd e g r e e w e r e s y n t h e s i z e dt h r o u g hn - a c y l a t i o n o fc h i t o s a n o l i g o s a c c h a r i d e t h ei n f l u e n c e o f s u b s t i t u t i n gg r o u p so nt h e i ra n t i o x i d a n ta c t i v i t yw a si n v e s t i g a t e d t h em a i nr e s u l t sa r e s h o w na sf o l l o w i n g ： 1 w i mt h ei n c r e a s eo fd s s ，t h eo r d e ro fn s u c c i n y lc h i t o s a no l i g o s a c c h a r i d e s s c a v e n g i n ge f f e c to n0 2 w a sn s c o s b n s c o s a n s c o s c ，t h es c a v e n g i n ge f f e c t o n o hd e c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s i n go fs u b s t i t u t i n gd e g r e e s ( d s s ) ，t h eo r d e r so ft h e i r s c a v e n g i n g e f f e c to nd p p ha n d r e d u c i n gp o w e r b o t hw e r e ： n s c o s a n s c o s c n s c o s b 2 w i t ht h ei n c r e a s eo fd s s ，t h er e s u l to ft h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t yo fn - m a l e y l i i i 上海海洋人学硕+ 学位论文 c h i t o s a no l i g o s a c c h a r i d es h o w e dt h es c a v e n g i n ge f f e c to nd p p ha n dt h er e d u c i n g p o w e rw e r e a l li n c r e a s e d ；t h eo r d e r so ft h e i r s c a v e n g i n g e f f e c t0 1 1 。o hw a s n m c o s b n m c o s a n m c o s c ，t h en m c o s bs h o w e dt h eb e s ts c a v e n g i n ge f f e c t o n o h 3 w i t ht h ei n c r e a s eo fd s s ，t h eo r d e ro fn p h t h a l o y lc h i t o s a no l i g o s a c c h a r i d e s s c a v e n g i n ge f f e c to n o hw a sn p c o s b n p c o s a n p c o s c ，t h e n p c o s bs h o w e d t h es t r o n g e s ts c a v e n g i n ge f f e c to n o h ，a n dt h e i rs c a v e n g i n ge f f e c to nd p p ha n d r e d u c i n gp o w e r b o t hw e r ed e c r e a s e d 4 t h er e d u d n g p o w e r o fn m a l e y lc h i t o s a n o l i g o s a c c h a r i d e ( n m c o s ) ， n - s u c c i n y l c h i t o s a n o l i g o s a c c h a r i d em s c o s ) a n d n - p h t h a l o y l c h i t o s a n o l i g o s a c c h a r i d e s ( n p c o s ) w i t h t h es a m es u b s t i t u t i n gd e g r e ew e r ee v a l u a t e d t h eo r d e r o ft h e i rr e d u c i n gp o w e rw a sn p c o s n m c o s n s c o s t h a tm a yb er e l a t e dw i t ht h e n p h t h a l o y la c y lh a ss t r o n g e s te l e c t r o n w i t h d r a w i n ge f f e c t i nt h i sp a p e r , t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h es u b s t i t u t i n gd e g r e eo fn - s u c c i n y l c h i t o s a no l i g o s a c c h a r i d e s ，n - m a l e y lc h i t o s a no l i g o s a c c h a r i d ea n dn - p h t h a l o y le h i t o s a n o l i g o s a c c h a r i d e sa n dt h e i ra n t i o x i d a n ta c t i v i t i e sw a sf i r s tr e p o r t e d t h e nt h ei n f l u e n c eo f s u b s t i t u t i n gg r o u p o f n s u e c i n y l c h i t o s a no l i g o s a c c h a r i d e s ，n m a l e y lc h i t o s a n o l i g o s a c c h a r i d ea n dn p h t h a l o y lc h i t o s a no l i g o s a c c h a r i d e so nt h e i rr e d u c i n gp o w e r w e r er e s e a r c h e d t h er e s e a r c hw o u l db eh e l p f u lt op r o v i d et h e o r e t i c a lb a s i sf o rf u r t h e r s t u d yo fc h e m i c a lm o d i f i c a t i o n o fc h i t o s a no l i g o s a c c h a r i d ea n dt h e i ra n t i o x i d a n t a c t i v i t y k e yw o r d sc h i t o s a no l i g o s a c c h a r i d e ，n a c y l a t i o nc h i t o s a no l i g o s a c c h a r i d e ， a n t i o x i d a n t ，s u b s t i t u t i n gd e g r e e 1 v 上海海洋大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位 论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除 文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集 体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我 对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：驰强嘞 日期：砂加年弓月扩 日 上海海洋大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允 许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 口 ，在年解密后适用本版权书。 本学位论文属于 不保密吖 学位论文作者签名：懒缸 f i 期：砂o 年多月罗日 指导教师签名彦3 、7 辱 f i 期：加户年弓月黟日 上海海洋大学硕士学位论文 第一章引言 甲壳素是自然界广泛存在的一种可再生资源，每年生物合成量多达1 0 0 亿吨， 目前容易直接获取的资源量中最多的是海洋节肢动物的虾蟹外壳，每年收集量在 几十万吨。甲壳素和脱乙酰基后的壳聚糖均属带有氨基的线性生物大分子生物多 糖，具有独特的理化特性和生物学功能，有别于作为能量来源的淀粉和植物结构 支持物的纤维素。 甲壳素又名甲壳质、几丁质，其化学名称为( 1 ，4 ) 2 乙酰氨基2 脱氧1 3d 葡聚糖，它是通过1 3 ( 1 ，4 ) 糖苷键相连的线性生物高分子，相对分子质量从几 十万到几百万。它脱乙酰后的产物是壳聚糖，又名甲壳胺或可溶性甲壳质，其化 学名称为( 1 ，4 ) 2 氨基1 3 d 葡聚糖。1 8 1 1 年，法国科学家b r a c o n n o t 从蘑菇中 首次分离出甲壳素【l 】。1 8 5 9 年，r o u g e t 在把甲壳素与氢氧化钾浓溶液中共煮得到 壳聚糖 2 】。限于当时的测试手段和条件，在近1 0 0 多年的时间里对壳聚糖的研究发 展缓慢。直至2 0 世纪5 0 年代以来，对甲壳素、壳聚糖的研究才变得活跃起来。 采用了多种方法对甲壳素、壳聚糖进行了结构确认，分子量大小的测定以及制取 工艺对其结构的影响等研究。对甲壳素和壳聚糖进行化学改性，可以拓宽甲壳素 和壳聚糖的应用领域。通过化学改性可在甲壳素和壳聚糖分子中的重复单元上引 入不同基团，这些基团的引入，不仅可以改善其溶解性能，更重要的是不同基团 的引入可赋予甲壳素和壳聚糖更多的功能。其中，壳聚糖酰化是壳聚糖化学改性 的一种有效手段。目前，甲壳素壳聚糖及其衍生化的研究和应用已成为当今世界 多糖研究领域的一个热点，有上千家研科院所和大专院校从事甲壳素和壳聚糖相 关的研究和开发工作，近几年平均每年约有8 0 0 篇甲壳素和壳聚糖研究论文，尤 其是s c i 论文呈逐年增长态势，全球关于甲壳素和壳聚糖的大型专题研讨会每两 年都会举行一次。迄今为止，已召开十次甲壳素壳聚糖国际会议，甲壳素和壳聚 糖及其衍生物已在废水处理、食品工业、纺织、化工、日用化学品、农业、组织 工程和医药等方面得到了应用。 上海海洋人学硕+ 学位论文 第一章壳聚糖及其衍生物的应用的研究 2 1 概述 甲壳素是由n - 乙酰一2 一脱氧d - 葡萄糖以d l ，4 糖苷键形成的多糖，其结构式 为： 回睦 自然界中存在的甲壳素相对分子量在1 0 0 万以上，一般为白色无定型固体。 甲壳素不溶于水，稀酸，浓碱和一般有机试剂，可溶于浓盐酸、硫酸、磷酸等， 但同时会发生主链降解。根据甲壳素结晶单元中分子链的不同排序存在三种不同 的多形态结构，分别为a ，p 和丫三种构型。仅甲壳素的分子链是反方向平行排列 的，p 甲壳素的分子链是平行排列，丫甲壳素则是由三条分子链组成，其中两条同 向，一条反向。自然界存在的甲壳素多为0 【型【3 】，p 和y 在适当的条件下转化为a 型【4 】。 壳聚糖，又名壳多糖、聚氨基葡萄糖等，是甲壳素的脱乙酰产物，即p 1 ，4 2 氨基2 脱氧d 葡萄糖，其结构式如下： 国。悟。喻协 c 矗h 壳聚糖也存在多晶结构，一般为白色或灰色固体，其相对分子量因原料和制 备方法不同而有数十万至数百万，通常把2 氨基2 脱氧葡萄糖单元占大分子中所 含单元总数的百分比称为脱乙酰度，它是壳聚糖性质的重要表征参数之一【5 1 。不溶 于水和碱溶液，可溶于稀得盐酸、硝酸等无机酸和大多数有机酸，不溶于稀的硫 2 上海海洋人学硕+ 学位论文 酸、磷酸。在稀酸中，壳聚糖的主链也会缓慢水解，溶液黏度逐渐降低。 2 2 甲壳素壳聚糖化学修饰及应用 从分子结构上来看，甲壳素壳聚糖分子结构中有大量的氨基和羟基，化学性质 很活泼，可以发生酰化、醚化、烷化、酯化等化学性质形成不同性能的衍生物。 2 2 1 酰化改性及其应用 甲壳素壳聚糖的酰化反应是甲壳素壳聚糖化学改性中研究最早也是最多的 一种反应。甲壳素壳聚糖可通过与酰氯或酸酐的反应，在大分子链上导入不同相 对分子质量的脂肪族或芳香族酰基。酰化反应既可在羟基位上反应( o 酰化) 生 成酯，也可在氨基上反应生成酰胺【4 】。酰基的引入可以破坏甲壳素壳聚糖及其衍 生物大分子间氢键，改变其晶态结构，使得产物在一般的常用有机溶剂中的溶解 性大大改善。 已报道的酰化反应实施方法有十余种之多，各个方法的差别主要在于使用试 剂和催化剂的不同。通常的酰化试剂为酸酐或酰氯。酰化壳聚糖可应用于化妆品 方面，如3 ，4 ，5 三甲氧基苯甲酰甲壳素能吸收紫外线，因此可做为防晒护肤品 的添加剂【6 】；在医药方面，甲酰化和乙酰化物的混合物可制成可吸收手术缝合线、 医药纺布【7 】双乙酰化甲壳素具有良好的抗凝血性能【8 】；n 乙酰化甲壳素可塑模 成型为硬性接触透镜，由于具有良好的透氧性和促进伤口愈合的特性，可作为发 炎和受伤眼睛的辅助治疗 9 】；丁酰化壳聚糖膜能下调兔眼滤过性手术后增殖细胞核 抗原在成纤维细胞中的表达，有效抑制纤维组织增生、抗组织瘢痕形成【1 。马来松 酰化壳聚糖可作为药物缓释剂的载体【l l 】。n 琥珀酰化壳聚糖可用作抗肿瘤药物的 靶向载体【1 2 】。壳聚糖乙酰化甲壳素材料与许旺细胞在体外具有良好的相容性【”】。 在环境分析方面，酰化壳聚糖可制成多孔微粒用作分子筛或液相色谱载体，分离 不同分子量的葡萄糖或氨基酸；并且可以制成胶状物用于酶的固定和凝胶色谱载 体【1 4 】。此外，酰化壳聚糖还具有良好的抗菌抑菌效果【l5 1 。 2 2 2 烷基化反应及其应用 烷基化反应可以在甲壳素的羟基上( o 烷基化) ，也可在壳聚糖的氨基上进行 ( n 烷基化) ，以n 烷基化较易发生。甲壳素碱是甲壳素烷基化反应的中间产物， 通常是由甲壳素与浓n a o h 溶液在低温下反应制得，甲壳素碱再与卤代烃或硫酸 酯反应生成烷基化产物1 6 】。用甲壳素碱与氯乙烷在高压釜下反应制得的乙酰甲壳 3 上海海洋大学硕士学位论文 素可用于控制释放毛果坛菜碱的缓释胶囊。n 烷基化壳聚糖衍生物的合成，通常 是采取醛与壳聚糖中的n h 2 反应生成希夫碱，然后用n a b h 3 c n 或n 扭h 4 还原得 目标产物【l7 1 。用该方法引进甲基、乙基、丙基或芳香化合物的衍生物，对各种金 属离子有很好的吸附和螯合能力，在污水处理方面有广泛的应用前景【l 酤1 9 】。烷基 化壳聚糖可用于化妆品中，如双二羟正丙基壳聚糖能与阴离子洗涤剂相容，适于 洗发香波水【2 叫；缩水甘油三甲胺卤化物与壳聚糖反应所得到的阴离子聚合物，用 于洗发水波中，可以使头发柔滑【2 1 1 。烷基化壳聚糖还可以用于医学方面，例如烷 基化壳聚糖具有良好的抗凝血性能【2 2 1 ；甲基化壳聚糖碘化物对草蓝无阳性菌抗菌 作用很吲2 3 1 。烷基化壳聚糖对载药膜的释放行为有良好的效果【2 4 1 。 2 2 3 醚化反应及应用 甲壳素壳聚糖的羟基和羟基试剂反应生产醚，如甲基醚、乙基醚、羟乙基醚、 羟甲基醚等。甲壳素与聚氧乙烯反应生成的醚化物在化妆品方面有广泛的应用前 景。羧甲基壳聚糖具有良好的吸湿保湿性，能使化妆品有润滑和保湿的作用【2 5 】； o 羧甲基壳聚糖可作为保水剂代替透明质酸【2 q ；n 羧甲基壳聚糖用于化妆品中， 可有效辅助皮肤过敏【2 3 1 。在环境保护方面，羧甲基壳聚糖可用于金属离子的提取 与回收，n 一羧甲基壳聚糖能够螯合过渡金属离子【2 7 】；o n 羧甲基壳聚糖可以纯化 水【2 8 】。醚化壳聚糖对印染废水的脱色有良好的效果【2 9 1 。在食品工业中，羧甲基甲 壳素可作保鲜剂，如6 o 羧甲基壳聚糖与植酸复配，添加适量的亚硫酸钠、异维生 素c 钠盐，能防止荔枝或水产品的褐色突变【3 0 1 。另外，在医药方面，羧甲基壳聚 糖能够有效的诱导细胞毒性巨噬细胞；n 羧甲基壳聚糖能够抑制口腔细菌【3 u ；羧 甲基壳聚糖可促进双歧杆菌的增殖，抑制大肠杆菌及引起肠内感染的一些其他细 胞的生成【3 2 1 。o n 羧甲基壳聚糖与双醛试剂交联形成凝胶，可作创口贴，止血剂 【3 3 1 ；羧甲基壳聚糖能有效抑制癌细胞的增殖能力和体外转移能力。6 一o 一硫酸羧甲 基甲壳素对黑色素瘤有明显的抑制作用；羧甲基壳聚糖能抗心律失常【3 卅；羧甲基 壳聚糖可作为半抗原助剂和载体，使机体产生半抗原的特异性抗体【3 5 】：交联羧甲 基壳聚糖具有两性离子交换能力【3 6 】；羟丙基甲壳素或羟丙基壳聚糖溶于水，可代 替甲基纤维素制备人工泪液，该制剂能保护角膜，预防感染，而且无刺激性，残 留部分可以由泪液中的溶菌醉降解【3 7 。o - 羧甲基壳聚糖还可作为固定酶的载体， 如固定d 一葡萄糖异构酶，溶菌酶等。若将可防治癌细胞生长的天门冬酰胺酶固定 上去，有可能成为医治白血病的新型药物【3 8 1 。利用n ，o 羧甲基壳聚糖与亚铁离子 络合的基本特性，可以用于治疗缺铁性贫血，因为人体对羧甲基壳聚糖壳聚搪一 亚铁络合物的吸收远远大于传统的f c s 0 4 药物，这方面的研究以期为开发天然生物 4 上海海洋大学硕士学位论文 补铁制剂开辟新途径p 9 1 。 2 2 4 季铵盐反应及应用 壳聚糖分子上存在大量的游离氨基，很容易制备成季铵盐。季铵盐可以作为 重金属的选择吸附剂、相转移催化剂、絮凝剂，抗菌剂和离子交换剂。壳聚糖季 铵盐有两种形式：一种是季铵盐基团直接连在c 2 上；另一种是一个低分子季铵盐 连在- n h 2 上。如用缩水甘油三甲基氯化铵对壳聚糖进行化学结构修饰，可在壳聚 糖分子中引进季铵盐基团，制得壳聚糖季铵盐。 与壳聚糖的烷基化反应相同，壳聚糖季铵盐反应也主要发生在壳聚糖分子中 亲核中心位的氨基上。在壳聚糖分子中引入位阻大、水合能力强的季铵盐基团， 能大大削弱壳聚糖分子间的氢键，提高壳聚糖在水中的溶解性。并且壳聚糖季铵 盐除直接溶于水外，还能与某些有机溶剂以任意比例混合，如许晨将1 0 的壳聚 糖羟丙基三甲氯化按溶液与乙醇、丙二醇、甘油以任意比例混合，均未观察到沉 淀或浑浊现象发生【4 0 1 。季铵盐壳聚糖有很多优良的性质。如羟丙基三甲基氮化胺 与壳聚糖反应制得的壳聚糖季胺盐，与椰油酰胺，甜菜碱的配位性良好，可用作 阳离子表面活性剂【4 1 1 ；以盐酸三甲胺、环氧氯丙烷和壳聚糖制备的季铵盐对碳钢 模拟海水体系具有良好的缓蚀效果【4 2 1 。季铵盐壳聚糖对金黄色葡萄球菌有良好 的抗菌性【4 3 】；壳聚糖季铵盐可作为一种新的生物材料，具有做为基因递送载体的 潜质【删。此外，壳聚糖季铵盐克服了壳聚糖本身的溶解性差的缺点，在生理条件 下也能很好地溶解，在生物相容性、抗菌性、吸湿保湿等性能方面均明显优于壳 聚糖【4 5 1 。 2 2 5 席夫碱的反应及应用 壳聚糖上的氨基可以与醛酮发生席夫碱反应，生成相应的醛亚胺和酮亚胺多 糖。可用此反应来保护游离n h 2 ，在羟基上引入其它基团；或用硼氢化钠还原得到 n 2 取代的多糖。这种还原物对水解反应不敏感，有聚两性电解质的性质。据报道， 戊二醛与壳聚糖上氨基发生席夫反应，再与酶形成席夫碱【4 6 1 ，制得的固定化酶活 力高，可固定0 【半乳酸苷酶、葡萄糖淀粉酶、o 葡萄糖昔酶等【47 1 。壳聚糖席夫碱 配合物还可做为化学反应的催化剂【4 引。壳聚糖季铵盐对啤酒污水有良好的絮凝作 用【4 9 1 。基于壳聚糖席夫碱类衍生物修饰电极可以测定食品中的亚硝酸根离子【5 0 】。 利用席夫碱反应可以把还原性碳水化合物作为支链连接到壳聚糖的氨基n 上，形成 n 支链的水溶性产物。 5 上海海洋大学硕士学位论文 2 2 6 交联反应及应用 甲壳素与壳聚糖的交联反应通常是在双官能团的醛或酸酐等交联剂的作用下 进行。戊二醛作交联剂时，反应能在均相条件下及宽p h 范围内，于室温进行，因 而被普遍使用。在医药方面，壳聚糖与戊二醛交联的产物采用交联固定化工艺制 备成微球或微囊，可作为药物缓释剂1 5 1 】。 除上述化学改性外，甲壳素和壳聚糖还可以进行氧化、水解、接枝共聚等化 学改性，制备出多种特殊功能的衍生物。 2 3 与本研究有关的甲壳素壳聚糖及其衍生物的研究进展 n 酰基壳聚糖的n 取代基结构和取代度对其性能有重要的的影响，对于含饱 和脂肪链的n 酰基壳聚糖，其n 酰基脂肪链的长度及取代度是决定其生物功能、 生物降解性以及对某些癌细胞选择性聚集的重要因素。 n 酰化壳聚糖不同于壳聚糖只能溶于酸性水溶液，具有更大的实用性，可作 为化妆品的保湿剂，过渡金属离子螯合剂、酶的固定剂和缓释药物载体等【5 2 。5 3 1 。 生物学结果表明，水溶性n 琥珀酰壳聚糖具有低毒性，体内半衰期长，体内降解 速度慢，并能选择性的蓄积于肿瘤组织，是一种优良的抗肿瘤药物的靶向载体【5 4 1 。 n 酰化壳聚糖具有良好的抑菌抗菌效果，且具有良好的吸湿保湿性【5 5 1 。另外，n 酰化衍生物还可以制备纳米球【5 6 1 。 2 4 本论文的主要内容 l 、对低聚壳聚糖进行酰化改性，制得一系列n 琥珀酰、n 马来酰、n 邻苯二甲酰 低聚壳聚糖n 酰化衍生物，用红外对其结构进行表征，测定其取代度和分子量。 2 、考察n 酰化壳聚糖的抗氧化性，包括对超氧、羟基、d p p h 的清除能力以及还 原能力。 3 、对比不同取代度的n 酰化低聚壳聚糖的抗氧化性能以及相同取代度、不同酰基 取代基团n 酰化壳聚糖之间的抗氧化性能，研究取代度以及取代基结构对n 酰化 低聚壳聚糖抗氧化性的影响。 2 5 本论文选题的目的和意义 自由基是带有未成对电子的分子或离子，具有很高的反应活性。生物体内在 6 上海海洋大学硕士学位论文 自身的新陈代谢中会产生大量的活性氧自由基。正常情况下，体内氧自由基的产 生和清除是平衡的。一旦失衡，就会通过生物分子的脂质过氧化、蛋白质的变性、 酶的失活等过程伤害机体，导致衰老、肿瘤、炎症、癌变等严重疾病。及时清除 体内过剩的氧自由基，就能有效地预防、减轻或消除相关病症。利用抗氧化剂延 缓或降低人体因氧化而受到的危害，是一条十分重要的预防途径。作为具有优异 生理活性的天然多糖，壳聚糖及其衍生物的抗氧化作用也日益受到了广泛的关注。 低聚壳聚糖酰化反应是研究最多也是最早的低聚壳聚糖衍生物。n 酰化低聚 壳聚糖由于分子结构中引进亲水性c o o 基团，其水溶性得到改善，且其紧密的晶 体结构遭到破坏，这有助于改善壳聚糖的理化性质，同样有利于抗氧化。n 酰基 壳聚糖的n 取代基结构和取代度对其性能有重要的的影响，对于含饱和的脂肪的 n 酰基壳聚糖，其n 酰基脂肪链的长度及取代度是决定其生物功能、生物降解性 以及对某些癌细胞选择性聚集的重要因素。 本文通过制备一系列不同取代度的三种n 酰化壳聚糖，通过研究其抗氧化活 性，包括对超氧阴离子，羟基自由基，d p p h 的清除能力和还原能力，分析取代度 以及取代基团的结构对n 酰化低聚壳聚糖抗氧化性的影响规律，以期为促进天然 多糖的选择性功能化及拓展它们在生物医药尤其是抗氧化领域的应用提供依据。 7 上海海洋大学硕士学位论文 第二章不同取代度n - 琥珀酰低聚壳聚糖抗氧化性研究 3 1 概述 低聚壳聚糖是壳聚糖的降解产物，其结构单元中有大量羟基和氨基，具有潜 在的自由基清除活性。从低聚壳聚糖的结构特点来看，其不仅具有多个反应位点 ( c 2 n h 2 、c 3 和c 6 o h ) 与自由基发生反应，同时其独特的阳离子特性( - n h 2 ) 以及n h 2 具有很强的对金属离子的螯合能力，可从多种途径来参与抗氧化过程。 可以预见低聚壳聚糖及其衍生物将是一类比其他天然多糖、多酚和和黄酮类物质 更为有效的抗氧化剂。 3 2 实验部分 3 2 1 材料与仪器 低聚壳聚糖，购自浙江金壳生物化学有限公司( 凝胶色谱测定其分子量为5 0 0 0 d a ) 。 鲁米诺，d p p h ，购自s i g m a 公司。 其余试剂均为分析纯，购自上海化学试剂公司。 抗氧化测试所需溶液由二次蒸馏水配制。 i f f m d 型流动注射式化学发光仪，西安瑞迈电子科技有限公司。 7 9 3 型恒温磁力搅拌器，上海司乐仪器有限公司。 d e l t a 3 2 0 s 型p h 计，梅特勒托利多仪器上海有限公司。 3 2 2 壳聚糖衍生物的制备及表征 参照文献【5 7 】并稍做改进，将5 og 低聚壳聚糖溶于1 0 0m l 水中，然后转移到 一个细颈瓶中，把若干琥珀酸酐溶解于5 0m l 丙酮中，在室温下，3 0m i n 中内缓 慢加到细颈瓶中，然后在4 0 温度下反应4h ，反应完毕后，冷却至室温，用过 量的丙酮沉淀，过滤，产物用丙酮反复洗涤，最后产物在4 0 真空干燥2 4h ，得 到白色的n 琥珀酰低聚壳聚糖。控制其他条件不变，通过改变琥珀酸酐的投入量 8 上海海洋大学硕士学位论文 制备取代度不同的n 琥珀酰低聚壳聚糖。 红外光谱在e q u n o x 5 5 傅立叶红外- 拉曼光谱仪上进行，采用k l r 压片法制 样，测定波数范围为5 0 0 - 4 0 0 0c l l l ，分辨率为o 8c m 1 。 3 2 3 取代度的测定 准确称量n 一琥珀酰低聚壳聚糖o 1 0 0 0g 置5 0 0m l 烧杯内，准确加入o 1 0 3 8 m o l lh c l 标准溶液2 0 0 0m l 溶解样品，再加入去离子水2 0 0m l 稀释、混匀，用 0 4 6 8 5m o l l n a o h 标准溶液返滴，测定电导率值。做电导率一氢氧化钠体积关系图， 添加趋势线，求其回归方程，从而计算n 琥珀酰低聚壳聚糖的取代度【5 8 】。 3 2 4 对超氧阴离子自由基0 2 。的清除 用p h = 1 0 2 0 的0 5m o l l n a e c 0 3 - n a h c 0 3 缓冲溶液配制浓度为1 5 x 1 0 。3m o l l 的鲁米诺溶液，用1 1 0 弓m o l l 的盐酸配制浓度为o 1m o l l 的邻苯三酚储备液， 使用前用去离子水稀释至1 x 1 0 4m o l l 。以缓冲液作为溶剂，配制成不同浓度的样 品溶液。用流动注射化学发光分析仪依次测定从稀到浓的样品溶液，读出峰面积。 清除率= ( - - a i ) 舢x 1 0 0 。式中为空白溶液峰面积；a i 为样品溶液峰面积 1 5 9 o 经s o d ，过氧化氢酶及甘露醇检测，该体系产生的自由基为超氧阴离子0 2 。 3 2 5 对羟基自由基o h 的清除 用p h = 7 4 0 的0 0 5m o l lk h 2 p 0 4 n a o h 缓冲溶液分别配制浓度为6 4 x 1 0 4 m o l l 的鲁米诺溶液、0 0 1 2m o l lh 2 0 2 和o 8m g m l 亚铁氰化钾溶液。以缓冲液 作为溶剂，配制成系列不同浓度的样品溶液。然后用流动注射化学发光分析仪依 次测定从稀到浓的样品溶液，读出峰面积。清除率= ( 一a i ) a o 1 0 0 。a 0 为 空白溶液峰面积；a i 为样品溶液峰面积【5 州。 经s o d ，过氧化氢酶及甘露醇检测，该体系产生的自由基羟基自由基o h 。 3 2 6 对d p p h 自由基的清除 在装有2 0m l 的浓度为l x l 0 4m o l ld p p h 无水乙醇溶液的比色管中，加入 不同浓度的样品溶液2 0m l ，摇匀，3 3 避光静置半小时，在5 1 7n n l 处测量吸光 度a i 。用去离子水代替样品溶液，得吸光度，无水乙醇代替d p p h ，得吸光度 a j 。清除率= 卜一( a i a j ) x 1 0 0 删。 9 上海海洋大学硕士学位论文 3 2 7 还原能力的测定 还原能力根据文献【6 l 】测定并稍做改进。取2 0m l 不同浓度的样品，加入 p h = 6 6 0 的0 2m o l l 磷酸缓冲液1 铁氰化钾溶液各2 5m l ，混匀，5 0 水浴2 0 m i n 后迅速冷却，加入2 5m l1 0 三氯乙酸溶液，混匀后在2 0 0 0r m i n 下离心1 0 m i n ，取上清液2 0m l ，加入2 5m l 去离子水和o 5m l0 1 的三氯化铁溶液， 静置十分钟后在7 0 0i n 处测定吸光度。 3 3 结果与讨论 3 3 1 红外光谱 波馏c m 卅) w a v e m u m b e r ( c m 一) 图3 1c o s 、n s c o s a 、n s c o s b 和n s c o s c 的红外光谱 f i g u r e3 - 1f t i rs p e c t r ao f c o s 、n s c o s a 、n s c o s b a n dn s c o s c 图3 1 是n s c o s a 、n s c o s b 、n s c o s c 和c o s 的红外光谱图。由图可知， n 琥珀酰化低聚壳聚糖与低聚糖壳聚糖的m 图有明显的区别。图中3 4 1 6c n l 。附 近的吸收峰是壳聚糖分子中一o h 和n h 2 的伸缩振动峰，发生琥珀酰化反应后，该 峰变窄，且取代度越高，越向低波数方向位移( n s c o s a 、n s c o s b 和n s c o s c 分别红移到3 3 9 6c l t i ，3 3 9 3c n l ，3 3 8 8e n l 。1 ) ；3 0 3 0 3 3 3 0c 1 t l 。1 处是n h 的伸缩振 动峰，在壳聚糖分子中，由于分子内和分子间的氢键作用，该区没有出现吸收峰， 而发生n 琥珀酰化后，在3 1 0 0c n l 。1 附近有明显的吸收峰。这说明壳聚糖分子中的 1 0 上海海洋人学硕+ 学位论文 - n h 2 发生了酰化反应。2 9 4 0c n l 。1 和2 8 9 0c l n 1 附近的峰分别是c h 和c h 2 的振动 峰，酰化后强度有所增强，也说明在壳聚糖分子中引进了c h 2 。1 4 1 l 锄_ 是羧甲 基的对称振动峰，酰化后强度亦有所增强，说明壳聚糖分子中引进了c o o o 在1 0 3 8 锄以和1 0 7 1g i n - 1 处分别是伯羟基和仲羟基的振动峰，反应前后变化很小，1 2 5 5c n l 以 和1 3 3 0c l n 。1 附近的o h 的变形振动也没有明显的变化，说明壳聚糖分子中的o h 没有参加反应【6 。 壳聚糖琥珀酰衍生物在1 6 5 5c 1 1 1 、1 3 7 8c i i l 。1 附近出现的强吸收峰，1 6 5 5c m 0 是酰胺i 的吸收峰，低聚壳聚糖琥珀酰衍生物的取代度越大，该峰越大；红外图 谱上没有出现1 7 2 0c m 1 附近的吸收峰，说明酰化反应在n 位上【6 2 】；1 3 7 8 c m - 1 是酰 胺i i l 吸收峰【6 3 1 ，这说明了n h c o 的存在，进一步证明了酰化反应发生在- n 位。 3 3 2 对超氧阴离子的清除 零 星s 貅 蘸 o l ，彳一： ；弋夕7 ， ；、三- - e - - 蕊t 3 t 3 6 02468 浓度( 叫) 图3 2c o s 、n s c o s a 、n s c o s b 和n s c o s c 对超氧阴离子的清除 f i g u r e3 - 2s c a v e n g i n ge f f e c t so fc o s ，n s c o s a 、n s c o s ba n dn s c o s co ns u p e r o x i d ea n i o n 图3 2 是低聚壳聚糖及其n 琥珀酰衍生物对0 2 。清除能力的曲线