（食品科学专业论文）产α半乳糖苷酶乳酸菌的筛选和应用.pdf

浙江大学硕士学位论文中文摘要 中文摘要 舡半乳糖苷酶( q g a l a c t o s i d a s e e c 3 2 1 2 2 ) 是一种外切糖苷酶类，具有特异性 水解低聚糖中的伽半乳糖苷键，广泛应用于大豆加工行业用来消除洳半乳糖苷类 寡糖。本论文从产甜半乳糖苷酶乳酸菌的筛选开始，研究了伐半乳糖苷酶的性质， 乳酸菌的高密度发酵以及产小半乳糖苷酶乳酸菌在豆奶发酵中的应用。论文主要 研究结果如下： ( 1 ) 从发酵乳制品、益生菌制品、泡菜和实验室保藏的乳酸菌株为原始材料 筛选产洳半乳糖苷酶的乳酸菌。通过平板上显色反应作为初筛依据，结合液体培 养复筛，获得l 株产q 半乳糖苷酶酶活较高的菌株，其最大酶活达到1 7 3 5 u m l ， 经生理生化试验初步鉴定为发酵乳杆菌。该发酵乳杆菌a 半乳糖苷酶的最适温度 为5 0 。c ，且5 06 c 保温2 小时，酶活仍保持约6 0 ；最适p h 为5 8 ，在p h 5 0 7 0 时， 酶稳定性良好。 ( 2 ) 对发酵乳杆菌进行了高密度培养，主要研究了发酵乳杆菌生长繁殖的环 境条件( 温度、接种量、起始p h ) 和培养基组成对其生长的影响。优化后确定了 发酵乳杆菌最适生长条件为：起始p h 值为6 0 ，培养温度为3 7 c ，接种量为5 ， 培养时间为1 6 h 1 8 h 。培养基配比为：以m r s 培养基为基础，添加2 0 葡萄糖、 0 5 牛肉膏、0 5 胰酶解酪朊、o 1 玉米浆，其他成分不变；该菌在此优化条 件和增菌培养基中，菌数可达到3 0 5 x 1 0 1 0 c f u m l 。 ( 3 ) 通过研究发酵乳杆菌在豆乳中的生长特性、产酸特性，初步探讨了发酵 乳杆菌酸豆乳的最佳原料配比为：脱脂奶粉4 ，接种量为5 ，乳糖1 ，蔗糖 6 。在此条件下发酵的酸豆乳，酸甜适合、颜色均匀、组织状态较好；其中的 水苏糖和棉籽糖降解率分别到达了7 2 。3 1 和6 8 9 5 关键词：0 【半乳糖苷酶，筛选，发酵乳杆菌，酶学性质，高密度培养，发酵豆乳 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t a b s t r a c t q g a l a c t o s i d a s e ( a d g a l a c t o s i d eg a l a c t o h y d r o l a s ee c 3 2 1 2 2 ) w h i c h i sa l l e x o g l y c o s i d a s et h a ts p e c i a l l yc l e a v e st h et e r m i n a lo fa 16l i n k e dd g a l a c t o s y l r e s i d u e sf r o mo l i g o s a c c h a r i d e s ，t om i n i m i z et h ec o n t e n to ff l a t u l e n c e - c a u s i n g o l i g o s a c c h a r i d e si n t h es o yp r o d u c t s i nt h i s s t u d y ，q g a l a c t o s i d a s e p r o d u c i n g l a c t o b a c i l l u sw a ss c r e e n e d ，t h e nt h ep r o p e r t i e so ft h i se n z y m ew a ss t u d i e d a f t e r t h a t ，w ei n v e s t i g a t e dt h eh i g hc e l ld e n s i t yc u l t u r eo fl a c t o b a c i l l u sa n dt h ea p p l i c a t i o n o f a g a l a c t o s i d a s e p r o d u c i n gl a c t o b a c i l l u si ns o y m l i ky o g h u r t t h ep r i m a r yr e s u l t so f t h i sr e s e a r c hw e r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) t h el a c t o b a c i l l u sp r o d u c i n g 仅- g a l a c t o s i d a s ew a ss c r e e n e do u tf r o mq u l a ( a t i b e tc h e e s e ) ，p i c k l e dv e g e t a b l e ，l y o p h i l i z e do r g a n i s m se ta 1 t h es t r a i nw a si s o l a t e d b yp r e l i m i n a r ys c r e e n i n gw i t hs e l e c t i o np l a t ea n dr e s c r e e n i n g 、析t hs e l e c t i o nb r o t h c u l t u r e t h es e l e c t e ds t r a i nc a np r o d u c et h em a x i m a lq g a l a c t o s i d a s eo f17 35 u m l ， a n di tw a se l e m e n t a r yi d e n t i f i e da sl a c t o b a c i l l u sf e r m e n t u m t h ef u n d a m e n t a l e n z y m a t i cp r o p e r t i e s o ft h i ss t r a i nw e r ei n v e s t i g a t e dt h a tt h eo p t i m a lp ha n d t e m p e r a t u r eo fq - g a l a c t o s i d a s ep r o d u c e db yl a c t o b a c i l l u s f e r m e n t u mw a sp h 5 8a n d 5 0 r e s p e c t i v e l y t h ea c t i v i t yo fa - g a l a c t o s i d a s ew a ss t a b l ef r o mp h5 0t op h 7 0 ； t h er e s i d u a le n z y m a t i ca c t i v i t yw a sa b o u t6 0 a f t e rb e i n g k e p ta t5 0 。cf o r12 0 m i n ( 2 ) w es t u d i e dt h eh i g hc e l ld e n s i t yc u l t u r eo fl a c t o b a c i l l u sf e r m e n t u m ，a n d d i s c u s s e dt h ee f f e c t so fe n v i r o n m e n tc o n d i t i o n ( t e m p e r a t u r e ，i n o c u l u mv o l u m ea n d i n i t i a lp h ) a n dm e d i u mc o m p o s i t i o n t h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r e ： p h 6 0 ，c u l t u r et e m p e r a t u r e3 7 c ，i n o c u l u mv o l u m e5 t h eo p t i m a lc u l t u r em e d i u m w a sd e t e r m i n e da s ：m r sb r o t h 嬲b a s i cm e d i u m ，w i t ha l la d d i t i o no f2 g l u c o s e ， o 5 b e e fe x t r a c t ，0 5 c a s e i n p e p t o n e ，2 c o r n s y r u t h e a m o u n to fl a c t o b a c i l l u s f e r m e n t u mw a su pt o3 0 5 x 1 0 c f u m lf o r1 6 1 8h o u r sb a s e do nt h ea b o v ec o n d i t i o n s ( 3 ) i tw a st h ef i r s tt i m ei nd o m e s t i c st ou s el a c t o b a c i l l u sf e r m e n t u m p r o d u c i n g a g a l a c t o s i d a s et of e r m e n ts o y m i l k a f t e rt h eg r o w t ha n da c i dp r o d u c t i o n c h a r a c t e r i s t i c so ft h es t r a i nw e r ei n v e s t i g a t e d ，t h eb e s tf o r m u l aw a sp r e l i m i n a r i l y o p t i m i z e dw i t ho r t h o g o n a le x p e r i m e n t ，w h i c hc o n s i s t e do f4 d e f f a t ym i l kp o w d e r , 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t 5 i n o c u l u mv o l u m e ，1 l a c t o s ea n d 6 s u g a r t h ep r o d u c e ds o y m i l ky o g u r tw a s o f p u r ew h i t ec o l o ru s t e r ，f i n ea n ds m o o t ht e x t u r e ，g o o dp a l a t a b i l i t y ；a n dt h eu t i l i z a t i o n r a t i oo fs t a c h y o s ea n dr a f f i n o s ew a s7 2 31 a n d6 6 8 5 r e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：n g a l a c t o s i d a s e ，s c r e e n i n g ，l a c t o b a c i l l u sf e r m e n t u m ，e n z y m a t i c p r o p e r t i e s ，h i g hc e l ld e n s i t yc u l t u r e ，s o y m i l ky o g h u r t 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝姿盘堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：斟雩b 签字日期：2 0 0 9 年6 月7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝姿态堂有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝姿盘堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： o t 雪厉 签字日期：2 0 0 9 年6 月c i 日 导师签名： 签字日粳易毋年历月日 浙江大学硕士学位论文 致谢 致谢 本论文是在导师何国庆教授的悉心指导下完成的，从论文选题、方案设计、 试验实施到论文的最终完成，融入了导师的智慧和辛劳。导师渊博的学识、敏锐 的洞察力、富于开拓性的思维和孜孜不倦的敬业精神深深激励着我，启发着我， 使我受益匪浅。在此，谨向导师致以崇高的敬意和衷心的感谢! 感谢导师两年来 对我的培养和教诲! 在攻读硕士学位期间，教研组的陈启和副教授、阮晖副教授对我的课题研究 计划、研究工作的具体实施，以及在试验过程中碰到的困惑，提出了许多宝贵的 意见和建议，特此表达我衷心的感谢! 感谢同门师兄师姐弟刘彩琴、张强、王伟、 王金玲、张洪波、郭钦、张伟、李青青、朱承亮、穆琳、王风平、朱东升、章海 峰等博士和硕士的关心和帮助。 感谢为我成长费心尽力的父母，我所取得的成绩与他们多年来的谆谆教诲和 无微不至的关怀密不可分。 叶雪飞 2 0 0 8 年5 月2 日 浙江大学硕士学位论文第1 章文献综述 1 1a 半乳糖苷酶 第1 章文献综述 旷半乳糖苷酶( e c 3 2 1 2 2 ，q d g a l a c t o s i d a s e ) ，最初是从管底酵母( b o t t o m y e a s t ) 中分离出来的，由于可以分解蜜二糖而称之为蜜二糖酶。通过对各种碳 水化合物为基质的蜜二糖酶特性的研究，发现以具有0 l d 半乳糖苷结构的碳水化 合物为该酶的主要作用对象，因此蜜二糖酶被命名为旺一半乳糖苷酶。a 一半乳糖苷 酶能水解含半乳糖的低聚糖、半乳糖苷聚糖，半乳糖脂等中的非还原性末端中的 q d 半乳糖苷。它们广泛存在于微生物、植物、动物中【2 】。糖苷酶的纯化特性已 有很多报道，它们的特性相差明显。 现今对仅一半乳糖苷酶的研究表明，该酶在饲料、制糖、食品、医药工业等领 域具有广泛的应用前景。国外从6 0 年代即开始从微生物中筛选产旷半乳糖苷酶的 菌种、并对c 【一半乳糖苷酶进行纯化及性质的研究【3 1 。我国于7 0 年代后期开始进行 微生物产旷半乳糖苷酶及酶性质的研究【4 1 ，现已筛选出不少产q 一半乳糖苷酶活性 高的微生物，并进行了广泛深入的研究，尤其在酶制剂的制备和食品工业的应用 方面，已取得很大进展。 1 2 微生物缸半乳糖苷酶的研究进展 1 2 1 产伍半乳糖苷酶的微生物 很多微生物能产q 一半乳糖苷酶。很早就发现酵母菌、乳酸菌和曲霉的一些种 能产生q 一半乳糖苷酶。以后又相继发现了较多的细菌，如假单孢杆菌、产气气杆 菌、大肠杆菌和梭状芽孢杆菌等。其中乳酸菌中能产生仅一半乳糖苷酶的有：乳杆 菌、乳链球菌、双歧杆菌、植物乳杆菌等。目前发现的部分产q 一半乳糖苷酶微生 物见表1 1 。 伍一半乳糖苷酶在微生物中的生理功能是水解培养基或者自然环境中的寡糖 和多糖中的半乳糖，产生菌体生长需要的碳源，如半乳糖、葡萄糖和甘露糖等。 浙江大学硕士学位论文 第l 章文献综述 表1 1 昏半乳糖苷酶的微生物源i s - s q t a b i el 1a g a l a c t o s i d a s e sp r o d u c i n gm i c r o o r g a n i s m s - -v o r g a n i s m s r e f e r e n c e a e r o b a c t e ra e r o g e n e s h o g n e s s a n db a t t l e y ，19 5 7 a s p e r g i l l u sa w a m o r i g o u k a , e ta l ，19 9 7 a s p e r g i l l u s f l a v i p e s n u r t e na n dh a k a n ，2 0 0 3 a s p e r g i l l u s f i c u u mn r r l3 1 3 5z a p a t e r ，e ta 1 ，19 9 0 a s p e r g i l l u sn i g e r a d e m a r ke ta 1 ，2 0 01 a s p e r g i l l u so r y z a e c r u za n dp a r k ，19 8 2 a s p e r g i l l u st a m a r i ic i v a s ，e la 1 ，19 8 4 ( a ) ( b ) a z o t o b a c t e rv i n e l a n d i i w o n g ，19 9 0 c e p h a l o s p o r i u ms p z a p r o m e t o v aa n du l e z o ，19 81 c o r t i c i u mr o l f s i i k a j ia n dy o s h i h a r a , 19 7 2 g i b b e r e l l a f u f i k u r o i m u l i m a n ia n dr a m l i n g a m ，19 9 5 h u m i c o l as p ( i n t r a c e l l u l a r ) k o t w a l ，e ta 1 ，19 9 9 ( a ) m o r t i e r e l l av i n a c e a f u j i m o t o ，2 0 0 3 ( a ) ( b ) m o n a s c u sp i l o s u s w o n g ，e ta 1 ，19 8 6 p y c n o p o r u sc i n n a b a r i n u s o h t a k a r ae ta 1 ，l9 8 4 r h i z o p u so l i g o s p o r u sb e i ，e ta 1 ，2 0 0 3 s c o p u l a r i o p s i s m c k a y ，19 9 1 t r i c h o d e r m ar e e s e i e n e y s k a y a ，e ta 1 ，19 9 9 t r i c h o d e r m ar e e s e ir u t c 一3 0 m a r c o l l e s ，e la 1 ，19 9 6 t r i c h o d e r m ar e e s e ir u tc - 3 0 z e i l i n g e r ，p ta ，19 9 3 p e n i c i l l i u ms p w a n g ，e ta 1 ，2 0 0 4 p e n i c i l l i u mp u r p u r o g e n u m s h i b u y a ，e la 1 ，19 9 8 p e n i c i l l i u ms i m p l i c i s s i m u m l u o n t e r i ，e ta 1 ，19 9 8 b a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h i l u s d e l e n t e ，e ta 1 ，19 7 4 b a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h i l u s g o t e ，e ta 1 ，2 0 0 4 b a c t e r o i d e so v a t u s g h e r a r d i n i ，e ta 1 ，19 8 5 b a c t e r o i d e s f r a g i l i s b e r g ，e ta 1 ，19 8 0 b i f i d o b a c t e r i u ma d o l e s c e n t i s l e d e r e ta 正19 9 9 b i f i d o b a c t e r i u mb r e v e2 0 3 x i a om ，2 0 0 0 c a r n o b a c t e r i u mp i s c i c o l a c o o m b sa n db r e n c h l e y , 2 0 01 c l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n sd u r a n c ea n ds k u r a , 19 8 5 d i p l o c o c c u sp n e u m o n i a e l iy tp ，口f 19 6 3 ， 浙江大学硕士学位论文第1 章文献综述 o r g a n i s m s r e f e f e n c e ec o l i e c o l ik i 2 l a c t o b a c i l l u ss p l a c t o b a c i l l u s f e r m e n t u m m i c r o c o c c u s p s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s p s e u d o a l t e r o m o n a ss p r h o d o t h e r m u sm a r i n u s s a c c h a r o m y c e sc a r l s b e r g e n s i s s t r e p t o c o c c u sm u t a n s t h e r m o m y c e sl a n u g i n o s u s t h e r m o t o g an e a p o l i t a n a5 0 6 8 t h e r m u ss p s t r a i nt 2 s h e i n i na n dc r o c k e r ，l9 6l l i l j e s t r o ma n dl i l j e s t r o m ，19 8 7 m i t a l ，e ta 1 ，1 9 7 3 g a r r o ，e ta 1 ，19 9 6 ( a ) ( b ) a k i b aa n dh o r i k o s h i ，1 9 7 8 h a s h i m o t o e ta 1 ，1 9 9 1 b a k u n i n a ，e ta 1 ，19 9 8 g o m e s ，e ta 1 ，2 0 0 0 l a z o ，1 9 7 7 r u s s e l l ，e la 1 ，1 9 9 2 p u c h a r t ，e ta 1 ，2 0 01 d u f f a u d e ta 1 。1 9 9 7 i s h i g u r o ，e ta 1 ，2 0 0 1 1 2 2 微生物心半乳糖苷酶的生理生化特性 1 2 2 10 【半乳糖苷酶的作用方式与基质特异性 一般的研究认为0 【半乳糖苷酶的作用方式是断裂非还原性末端的a d 半乳 糖苷键，产生一分子的值。半乳糖，但从9 0 年代以来的研究表明，有些微生物q 半 乳糖苷酶还能水解其侧连基团是叶半乳糖苷键连接的杂多糖。同时还发现同一种 微生物的几种a 半乳糖苷酶的作用方式不一样。 r e o ik a n e k o 【5 2 】在研究彳印p 删刀淞n i g e r5 1 6 1 均a 半乳糖苷酶的作用基质特异 性时发现，粗酶液能分解对硝基苯基q 半乳糖( p n p g a l ) 、蜜二糖。将粗酶液先 用硫酸铵沉淀，然后经d e a e 纤维素柱和s p s e p h a d e xc 5 0 柱和亲和色谱柱进行 纯化得到一种a 半乳糖苷酶，它能水解p n p g a l ，但不能水解蜜二糖。这一方面 说明此酶至少存在二种同工酶，另一方面说明不同的0 【半乳糖苷酶具有不同的基 质特异性。在以甘露半乳低聚糖作底物的酶解研究中发现，以甘露糖为骨架的低 聚糖中还原性末端( 3 t 半乳糖能够被裂解下来。如m m 率( g a l ) ，还原性末端甘露 糖m 木上连接的半乳糖g a l f i 色够被裂解下来。这与以前只认为水解非还原性末端 的q 半乳糖键的看法有所不同。 啤酒酵母【4 7 1 含有一种旺d 半乳糖苷酶( 蜜二糖酶) ，它有较宽的最适p h 范围， 浙江大学硕士学位论文 第1 章文献综述 对大多数底物来讲p h 4 5 为最理想，它分别以1 0 0 ：1 2 3 ：3 3 的比例水解蜜二糖、苯基 - q d 半乳糖苷和甲基a 半乳糖苷。牛链球菌的0 【d 半乳糖苷酶很容易催化二 o a d 一半乳糖基甘油和0 【d ( 1 _ 6 ) 连接的半乳糖基低聚糖的水解1 4 。 e l i n al u o n t e r i t 5 3 1 在研究p e n i c i l l i u ms i m p l i c i s s i m u m 的a 半乳糖苷酶酶基质特 异性时发现，ps i m p l i c i s s i m u m 能产生3 种0 【半乳糖苷酶：a g li 、a g l i i 、 a g l i i i ，这3 种酶的最佳底物是棉籽糖。a g li 能将蜜二糖中的8 7 c t 半乳糖苷键 断裂，能将棉籽糖中9 5 的0 t 半乳糖苷键断裂，对毛蕊花四糖的降解，只能断裂 3 5 的0 t 半乳糖苷键；a g li i i 酶对蜜二糖、棉籽糖、毛蕊花四糖等棉籽糖家族低 聚糖中的q 半乳糖苷键的断裂达9 0 一1 0 0 ；对a g l i i 而言，它对蜜二糖、和棉籽 糖家族低聚糖的旺半乳糖苷键的断裂能力明显要弱。进一步研究表明，a g li i i 对棉籽糖家族低聚糖的链的长度不敏感。 1 2 2 2 伐半乳糖苷酶的物理及化学结构 q 半乳糖苷酶与其它的糖苷酶一样都是糖蛋白。对葡酒色被孢霉的0 【半乳糖 苷酶结晶的研究指出【蚓：在结晶酶中含中性糖1 0 8 ，d 葡萄糖胺2 7 ，是一种 糖蛋白。将纯化的0 【半乳糖苷酶用凝胶电泳显示的是均一带，用考马斯亮蓝和 s c h i f 碱染色，同样证明了a 一半乳糖苷酶是一种糖蛋白。同时用另一种方法也证明 了0 【半乳糖苷酶是一种糖蛋白：将产0 【半乳糖苷酶的细胞放在1 4 c 的果糖溶液中培 养，再将所产生仅半乳糖苷酶进行凝胶电泳。1 4 c 标记的酶显示出一个单一的放 射性带，再将放射性的酶用一种p r o n a s e 的酶进行充分水解，通过s e p h a d e xg 2 5 柱分离，进一步证明仅半乳糖苷酶是由蛋白质和糖两部分组成。从q 半乳糖苷酶 这种糖肽分离下来的糖进一步分析，这种连接于多肽上的糖基是由6 8 个单糖组 成的。它们是甘露糖和乙酞葡萄糖胺，并且甘露糖和乙酞葡萄糖胺的比例大约是 2 8 ：1 。 在研究此低聚糖与蛋白质的连接方式时，通过弱碱和强碱在n a b i - h 存在的条 件下进行水解等一系列处理后，发现q 半乳糖苷酶中的蛋白质和糖苷的连接方式 是通过低聚糖中的乙酞葡萄糖胺和蛋白质中的天冬氨酸残基相连接的。不同种的 微生物产生的同一种酶具有几种不同的催化特性，这主要是和蛋白质的结构有 关，而蛋白质的结构是由肽链的氨基酸序列决定的。在几种微生物产生的a 半乳 糖苷酶的n 末端氨基酸序列也证实了这一点。研究表明，尸s i m p l i c i s s i m u m l 5 3 】的 4 浙江大学硕士学位论文第1 章文献综述 a o l m 的n 末端氨基酸序列- 与m v i n a c e a 5 4 和s c a r l s b e r g i e n s i s 4 7 1 的a 半乳糖苷酶 n 末端氨基酸序列具有高度的相似性，而a g li i o 勺n 末端氨基酸序列与其它几种 q 半乳糖苷酶的n 末端氨基酸序列相似性很小。n 末端氨基酸序列高度相似的几 种酶它们作用底物的特异性相同，而n 末端氨基酸序列相似性很小的几种酶其作 用底物的特异性相差很大。 1 2 2 3a 半乳糖苷酶的最佳作用条件与酸稳定性 0 【半乳糖苷酶的活性可用蜜二糖及棉籽糖，也可利用对硝基苯酚0 【d 半乳糖 毗喃糖苷作为底物来测定。不同的微生物产生的l i t 半乳糖苷酶的最适p h 和温度的 范围各不相同。一般细菌分泌酶的最适p h 范围在6 5 7 5 之间，最适温度在 3 7 c 4 0 。c 1 5 5 1 ；丝状真菌及酵母分泌的0 【半乳糖苷酶的最适温度范围比细菌要高， 一般在5 0 c 一6 0 c 之间，p h 范围变化很大，在4 5 8 0 之间【1 4 - 1 5 1 。一般来说，同一 种微生物产生的粗酶和将其纯化后的酶的作用最适温度几乎相同，但其热稳定性 有差异。另外，同一种微生物在不同的培养基上生长时其产a 一半乳糖苷酶的热稳 定性和p h 稳定性也不一样。 r i c h a r d 5 6 1 等人对黑曲霉在不同培养基上生长产生 的半乳糖苷酶的性质进行研究，发现黑曲霉在麸皮和米糠上生长产生的0 【半乳 糖苷酶的最佳酶作用条件是：p h5 0 ，温度5 0 c ，在3 54 c 5 0 。c 两种酶都稳定， 在超过5 0 c 时，在米糠的培养基上的0 【半乳糖苷酶的稳定性要高些，6 0 。c 时，在 麸皮为培养基的伐半乳糖苷酶的活力损失5 5 ，而以米糠为培养基的仅半乳糖苷 酶活力只损失1 4 。 1 2 3n 半乳糖苷酶的应用 1 2 3 1 在医疗方面的应用 a 半乳糖苷酶对医学界带来兴趣，主要是因为它在人体内的一些生化过程中 起着重要作用。现已查明人体如果缺乏半乳糖苷酶，就会引起所谓的法布里氏病 ( f a b r y sd i s e a s e ) 5 7 1 。这种病是由于分子水平的变异引起的，是一种糖代谢缺陷遗 传病。所谓酶法治疗，就是以医疗为目的应用半乳糖苷酶。0 【半乳糖苷酶还是一 种可结合于特异血型红细胞的酶，在人体血液中，血液b 细胞是含有半乳糖苷， 纯化的咖啡豆半乳糖苷酶能转化b 细胞为o 细胞【5 8 1 ，半乳糖是这个反应中释放出 的唯一糖，人细胞可释放出大约3x 1 0 6 个分子半乳糖。通过此酶的作用不仅了 解到b 细胞活性的决定因子，而且也可估计抗原部位的数目。细菌及放线菌分泌 浙江大学硕士学位论文第i 章文献综述 的仅半乳糖苷酶也有此作用，但丝状真菌分泌的酶则无此功能。 1 2 3 2 在多糖结构改善上的应用 半乳糖存在于多种杂多糖如瓜尔豆胶、刺槐胶等中，最富含半乳糖的低聚糖 是半乳甘露聚糖，在瓜尔豆胶中含3 8 4 0 的0 t 一半乳糖，在洋槐豆胶中含 2 2 2 4 。它们均以半乳糖残基连接于甘露糖为主链的甘露聚糖上。半乳甘露聚 糖这种多糖具有重大的商品价值，它是一种优良的食品胶，广泛应用于食品、化 工等行业。半乳糖侧链的存在，对半乳甘露聚糖的特性影响很大。刺槐豆树胶、 瓜尔豆胶这两中树胶都以0 d 1 ，4 甘露聚糖为骨架的杂多糖。a 半乳糖基侧链的 多少及位置，决定其在水中的溶解度和凝胶能力。瓜尔豆胶与刺槐胶相比，其胶 凝能力不如刺槐胶，如用q 半乳糖苷酶来进行适当处理，进行改性除去适量侧链 的半乳糖残基而不使甘露聚糖主链断裂，可极大地提高瓜尔豆胶的胶凝能力，从 而提高其商品性5 9 1 。 1 2 3 3 在饲料工业中的应用 早在1 9 5 7 年，就有在饲料中添加酶制剂来改善其营养价值。最近的研究表明， 含豆类饼粕的饲料中，含g t 一半乳糖苷的低聚糖和多聚糖是一种抗营养因子。其中 低聚糖主要是游离的水苏糖、棉籽糖等。多聚糖主要是由a 半乳糖和果胶类似物 组成的大豆、羽扇豆等细胞壁的组成部分，它们形成一个坚硬的网状结构，将营 养物质包裹其中，这也是导致豆粕的利用率不高的原因。在单胃动物的肠道内较 高浓度的此类游离的水溶性低聚糖可能引起食糜滞留，意味着降低家禽对豆饼的 能量利用效果，对营养物的吸收和消化产生不利影响，因为它们的肠道内缺乏0 【 半乳糖苷酶。在单独使用0 【半乳糖苷酶时，能否有效地改善营养效果，迄今为止 的研究结果尚不统一。b r e n e s 6 0 1 添加酶制剂对含有7 0 羽扇豆的日粮对肉鸡生产 性能的影响研究表明，添加a 半乳糖苷酶对生长和饲料利用率有所改善，但差异 不显著，添加纤维素酶制剂无效。在添加果胶酶、q 半乳糖苷酶、蛋白酶时， 其效应明显，增重可提高1 8 ，饲料转化率提高了1 0 ，因此a 半乳糖苷酶被认 为与其它酶共同作用而产生协同效应，从而改善羽扇豆的营养价值。 1 2 3 4 在制糖工业上的应用 棉籽糖是一分子蔗糖以吐1 ，6 糖苷键与半乳糖相连组成的三糖，在a 半乳糖 苷酶的作用下，棉籽糖分解为蔗糖和q 半乳糖，在甜菜制糖工业中，甜菜中含有 6 浙江大学硕士学位论文 第1 章文献综述 0 1 0 1 5 的棉籽糖，虽然量不多，但在制糖中却增加了糖蜜的粘度，阻碍蔗糖 结晶析出，以致产生大量的废糖蜜。棉籽糖本身不能被人利用，因而棉籽糖是甜 菜制糖工业中的一种有害物质，既降低甜菜的产糖率，又降低糖的质量。应用0 【 半乳糖苷酶处理废糖蜜能将阻碍蔗糖结晶的棉籽糖清除，在分解一分子棉籽糖的 同时，还产生一分子的蔗糖。一般用0 【半乳糖苷酶处理甜菜汁或糖蜜，将糖蜜置 于糖蜜稀释罐中稀释到3 0 锤度，然后转入棉籽糖分解槽中，用硫酸调p h ，采用0 【 半乳糖苷酶固相酶反应，棉籽糖的降解率达8 5 ，处理后得糖蜜再用斯蒂芬法提 取蔗糖。用戊二醛固定的反射犁头霉而成的固相酶，可反复使用1 0 0 多次，这样 分解生成的蔗糖和废糖蜜中的原来所含有的蔗糖都能提取出来。这种工艺称为 “无废糖蜜制糖法”【6 1 1 。甜菜上半部因含棉籽糖过多，往往不能利用而废弃，采 用酶法制糖后，则能充分利用。酶法制糖可使蔗糖粒状结晶的均匀性、色泽和纯 度改进。由于酶法制糖产糖率提高，糖蜜含量降低因而煮糖率亦就提高，使单位 蔗糖产量的耗煤降低约1 0 。酶法制糖与斯蒂芬法制糖相结合，糖蜜中含蔗糖减 少，石灰石的消耗也减少约1 0 。且因煮糖率的提高及蔗糖结晶时间的缩短，使 甜菜加工能力和设备周转率有很大提高。现在许多国家均采用此法生产。 1 2 3 5 在豆类制品加工上的应用 大豆中含有一定量的0 【半乳糖苷低聚糖，如水苏糖( 4 呦，棉籽糖( 1 ) 和毛蕊 花糖( o 6 ) ，这些糖都是游离的。在利用大豆生产豆浆或用大豆生产代乳粉时， 这类低聚糖不易被消化吸收，且易引起肠道胀气等肠道不适的不良反应。如采用 含蔗糖酶的0 【半乳糖酶处理，这些半乳糖苷低聚糖被水解成半乳糖、葡萄糖、果 糖等，就可以有效地解决这一问题，减轻这些低聚糖在大肠内发酵而引起的肠道 不适。利用真菌的0 【半乳糖苷酶处理豆乳中的低聚糖已取得成功。在非洲的尼日 利亚的农村和城镇由于动物蛋白的短缺及价格很贵，在许多家庭中豇e ( v i g n a u n g u i c u l a t a ) 作为唯一的最重要的膳食蛋白来源，如同大豆一样，豇豆中含有棉籽 糖家族低聚糖，最高含量可达5 6 ，它的难消化性，易诱导肠道胀气，这种缺 陷很长时间以来就已经被认识到。高含量的这种低聚糖妨碍了它的可接受性，采 用发芽、去壳、温水浸泡和蒸煮可减少它的含量，但不能显著减轻胀气和肠胃不 适。完整的豇豆用3 0 的水浸泡1 6 h ，水苏糖减少2 6 3 ，棉籽糖减少2 8 ，而长 时间的浸泡会产生令人不适的异味。蒸煮5 0 m i n 能使水苏糖减少2 8 6 ，棉籽糖 浙江大学硕士学位论文第l 章文献综述 减少d 4 。尽管浸泡和蒸煮能减少低聚搪的含量，但这样处理过的豇豆磨成粉， 其颜色、质地、香味、商品性能都将受到负面的影响，而且还不能显著减轻胀气 和肠胃不适。豇豆粉在利用黑曲霉a 半乳糖苷酶制剂在5 0 。c 条件下处理2 h ，可将 其中8 2 3 的水苏糖、9 3 3 棉籽糖除去【6 2 1 。且酶处理的豇豆粉，由于酶的底物 专一性，它不影响其中的非q 半乳糖苷键结合的化合物，这些化合物的功能性将 不受到影响。试验结果表明豇豆经过酶法这一工艺处理，能有效控制肠道胀气引 起的不适的发生。 1 3 乳酸菌源a 半乳糖苷酶在豆乳中的应用 1 3 1 大豆酸乳研究进展 据专家预测，大豆将是2 1 世纪的维生素，是随着人口增加同时粮食短缺状况 下的粮食理想替代物，世界各国对大豆制品及其功能性成分都极其关注。大豆中 除含有优质蛋白质和植物油之外，还含有对人体健康非常有益的多种生理活性物 质，如大豆异黄酮、大豆磷脂、大豆皂甙、大豆多肽、大豆膳食纤维等。尤其是 豆乳因其价格比牛乳低廉而作为发展中国家乳糖不耐症婴儿和儿童的营养补充 物质，然而美中不足的是豆类所含的低聚糖如蜜二糖、棉籽糖、水苏糖和少量的 毛蕊花糖不能被消化吸收，却被人体肠道细菌发酵，引起嗝气、肠鸣、腹胀、腹 痛等症状，严重时引起渗透性腹泻。 在国外，关于以乳酸菌降解豆乳中的低聚糖的研究已有一些报道。如g a r r o 6 3 1 报道，用长双岐杆菌( b 咖咖6 口c 膪厂也加l o n g u mc r l8 4 9 ) 和发酵乳酸杆菌 ( l a c t o b a c i l u s f e r m e m u mc r l2 5 1 ) 5 晃和发酵( 1 ：1 ) 豆乳，培养4 h 后，豆乳中糖约降 低8 5 ，其中主要是蔗糖含量降低，水苏糖约降低7 1 。l eb l a n c 【川等利用能产 生a 半乳糖苷酶的工程乳酸菌降低豆乳中的不消化性低聚糖，首先筛选了来源于 植物乳杆菌( 口c f 0 6 订c f z 胁p 坛n f 口，“m ) a 一半乳糖苷酶的基因，选择乳酸菌( l a b ) 是因 为它们是存在于健康人体的天然微生物【6 5 1 ，找到了来源于植物乳杆菌a t c c 8 0 1 4 和豆科植物瓜尔_ g _ c y a r n o p s i t e t r a g o n o l o b a ( g u a r ) 的a - g a l 结构基因，将其克隆并在 乳酸乳球菌( l a c t o c o c c u s ，口c f 括) 中表达，基因产物在不同的细菌膜上进行优化，以 5 溴4 氯3 吲哚q d 吡喃型半乳糖苷( x a g a l ) 为生色底物，证明了0 【半乳糖苷 酶具有活性，同时进行了q 半乳糖苷酶菌株水解半乳糖和水苏糖效果的评价，实 验包括两方面：作为对豆乳发酵的菌株直接投入到豆乳中、菌株直接经口给予动 r 浙江大学硕士学位论文第1 章文献综述 物，结果表明，发酵后的豆乳能够消除肠胃胀气；锚锭在细胞壁上的a 半乳糖苷 酶在胃环境中可以释放出来，继续发挥酶解糖的作用，0 【半乳糖苷酶菌株无疑对 a 半乳糖苷酶起到保护作用。 1 3 2 大豆酸乳的开发现状及存在的问题 在许多国家中，将大豆作为食品已经有几个世纪之久。不经发酵而食用的大 豆食品主要有豆浆、豆腐等，作为霉菌发酵的有酱、腐乳和纳豆等。但是在东方， 大豆食品的乳酸菌发酵却未受到人们的重视，甚至研究工作者也没有给予应有的 注意。早在1 9 3 4 年和1 9 3 7 年就有关于大豆酸乳的报导，可是，直到1 9 4 0 年， g r a n a t a 才对豆浆中的乳酸菌培养进行了第一次系统的研究【碉。在国内，大豆作 为发酵制品主要是经过发酵后作为调味品，而对乳酸菌发酵大豆制品的研究同国 外的研究相比，起步较晚。目前，国内外在这方面的研究开发重点是： ( 1 ) 消除豆乳的豆腥味及苦涩味，破坏豆乳中的有害因子； ( 2 ) 提高乳酸菌在豆乳中的产酸速率。虽然豆乳中含有乳酸菌生长所需的营 养物质，但不含乳酸菌特别容易利用的乳糖。因此主要方法是通过在豆乳中加牛 乳、脱脂乳粉、乳清粉等来增加豆乳中的乳糖含量，提高乳酸菌产酸速率，缩短 凝乳时间； ( 3 ) 改善大豆酸乳的风味。普通发酵酸豆乳，风味不良，不易为人们所接受， 因此如何提高产品的可接受性能，则是该产品工业化生产中面临的重要问题。目 前解决的方法主要有：通过添加一些风味剂，如果料、果汁、香料等，加以掩 盖：通过菌种的新组合加以实现；通过添加一些添加剂，来阻断不良风味物 质的产生【6 7 1 目前国内外报道的文献资料大多以大豆为主要原料，经浸泡、磨浆、杀菌、 接种乳酸菌、发酵等工序加工制成的酸豆乳。t r i d j o k o t 6 8 1 的研究是采用大豆粕为 原料经浸滤去糖、蛋白质浸提、分离、调制、分装消毒、发酵制备的大豆酸乳。 而脱脂豆粉、大豆浓缩蛋白、大豆分离蛋白由于其生产成本以及其他技术问题而 一直未得到推广应用。豆乳发酵菌种可以从自然发酵豆乳中分离筛选，也可以从 生产酸牛乳的菌种中选取，由于后者方法简便易行，而且可靠，故多为人们所采 用。目前使用较多的菌种为乳酸菌，大多认为采用1 ：1 比例的保加利亚乳杆菌、 嗜热乳链球菌风味最佳。在豆乳中接种乳酸菌可把豆乳中的己醛等羰基化合物转 浙江大学硕士学位论文第i 章文献综述 化为有机酸而除