（食品科学专业论文）产葡聚糖明串珠菌的特性及其葡聚糖合成条件研究.pdf

摘要 选择分离自传统乳制品中的2 2 株革兰氏染色阳性、分解葡萄糖产酸产气的双球 状及链球菌，从中经蔗糖生成葡聚糖培养基筛选获得9 株产葡聚糖菌株，并对所获得 菌株进行一般生理生化性状及耐酸性特性分析的基础上，采用苯酚一硫酸法进行葡聚 糖产生量的测定，选择其中产量较高的d m l 2 2 菌株，对其进行了1 6 sr d n a 基因序 列分析和葡聚糖发酵条件的初步研究，结果如下： 经表型特征和生理生化学特征分析确定a y l 2 1 、a y l 2 2 、a y 2 5 1 、a y 2 5 2 、 q h 3 8 5 、q h 3 | 3 - 2 和w z 4 3 等7 株菌为肠膜明串珠菌葡聚糖亚种，d m l 2 1 和 d m l 2 2 等2 株菌为肠膜明串珠菌肠膜亚种。 所获得9 株明串珠菌均不能在p h 值为3 0 和3 5 的酸性环境中生长，但d m l 2 1 、 d m l - 2 2 、a y l 2 1 、a y l 2 2 、a y 2 5 1 、a y 2 5 2 和w z 4 3 等7 株菌能够在含o 8 胆盐的培养基中生长。 经单因素分析了氮源、碳源及盐类对葡聚糖生物合成量的影响。其中酵母粉、2 0 的蔗糖、柠檬酸钠和醋酸钠不仅能显著提高葡聚糖的生物合成量，而且能明显促进菌 体的生长；通过正交实验确定l e u c m e s e n t e r o i d e sd m l 2 2 优化培养基组成为：酵母 粉为2 0g ，l 、蔗糖为2 0 0g l 、柠檬酸钠为3g l 、醋酸钠为lg l 时，葡聚糖的生物 合成量为4 1 2 9 _ 0 1 5g l ，产量较原来提高1 4 倍。 单因素法分析了接种量、培养温度和初始p h 值对l e u c m e s e n t e r o i d e sd m l 2 2 生物合成葡聚糖的影响，并通过相应面分析法确定生物合成葡聚糖工艺优化参数为： 接种量3 5 、培养温度2 6 o 、初始p h8 0 时，葡聚糖的生物合成量为5 7 6 0 8 7 9 l 。 传统乳制品中分离获得的l e u c m e s e n t e r o i d e sd m l 2 2 生成葡聚糖能力较强，并 且其产量与已知产葡聚糖菌株相比较具有一定的潜在开发利用和研究的价值。 关键词：明串珠菌；葡聚糖；生成量；发酵 s t u d i e so nb i o l o g i c a lp r o p e r t i e so fl e u c o n o s t o ca n d f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o no fd e x t r a n a b s t r a c t i nt h i ss t u d y , l a c t o c o c c is e p a r a t e df r o mm i l kp r o d u c t si ni n n e rm o n g o l i aw e r e g r a m - p o s i t i v e ，h e t e r o f e r m e n t a t u r e ，c e l lo c c u r r i n gs i n g l y , i np a i r so ri n s h o r tc h a i n s d e x t r a nf o r m a t i o no fl a c t o c o c c iw a ss c r e e n e db yt h ef o r m a t i v eb r o t ho fd e x t r a nf r o m s u c r o s e t h eb i o l o g i c a lp r o p e r t i e sa n dt o l e r a n c eo fa c i da n db i l es a l to fs t r a i n sw e r es t u d i e d t h e p r o d u c t i o n o fd e x t r a nw a sa n a l y z e d b yp h e n o l s u l p h o a c i dm e t h o d p r i m a r y f e r m e n t a t i o n a lc o n d i t i o no fd e x t r a nw e r ea n a l y z e db yr e s p o n s es u r f a c em e t h o d a c c o r d i n gt ot h e i rc h a r a c t e r i s t i c so fm o r p h o l o g y 、p h y s i o l o g ya n db i o c h e m i s t r y , a y l - 2 1 、a y l - 2 - 2 、a y 2 - 5 - 1 、a y 2 - 5 2 、q h 3 8 - 5 、q h 3 1 - 3 - 2 、w z 4 - 3w e r ei d e n t i f i e d t ol e u c o n o s t o cm e s e n t e r o i d e ss u b s p d e x t r a n i c u m ，d m l - 2 - 1 、d m l 2 2w e r ei d e n t i f i e dt o l e u c o n o s t o cm e s e n t e r o i d e ss u b s p m e s e n t e r o i d e s t os t u d yt h ea c i da n db i l es a l tt o l e r a n c eo f9l e u c o n o s t o cm e s e n t e r o i d e ss t r a i n s ，t h e r e s u l t ss h o w e dt h a t9l e u c o n o s t o cm e s e n t e r o i d e ss t r a i n sw e r ea b l et og r o wa tp h3 - - 3 5 a n dh a dt h eb e s ta n t a g o n i s t i cp r o p e r t i e si nb e s ts a l t a y i 一2 一i ，a y l 2 2 ，a y 2 5 1 ，a y 2 5 - 2 ， d m l 2 - 1 ，d m l 2 2 ，w z 4 - 3w e r ea b l et og r o wi n0 8 b i l es a l t t h ee f f e c to fc a r b o ns o u r c e 、n i t r o g e ns o u r c ea n ds a l to nt h ep r o d u c t i o no fd e x t r a n w e r ea n a l y z e d y e a s te x t r a c t ，s u c r o s e ，s o d i u mc i t r a t ea n ds o d i u ma c e t a t ec o u l dr e m a r k a b l y i n c r e a s et h ep r o d u c t i o no fd e x t r a n t h ec u l t u r em e d i u mo fl e u c o n o s t o cm e s e n t e r o i d e s d mi 一2 2w a so p t i m i z e db yo r t h o g o n a le x p e r i m e n t t h er e s u l tw a sa sf o l l o w s ：y e a s te x t r a c t 2 0e r e ，s u c r o s e2 0 0g l ，s o d i u mc i t r a t e3g la n ds o d i u ma c e t a t e1 g l t h ey i e l do f d e x t r a nw a s4 12 + 0 15g la n di m p r o v e d1 4f o l du n d e rt h eo p t i m u mc u l t u r em e d i u m t h ee f f e c to fi n o c u l u mc o n c e n t r a t i o n , i n c u b a t i o nt e m p e r a t u r ea n di n i t i a lp ho n d e x t r a np r o d u c e dw e r es t u d i e db ys i n g l ef a c t o ra n a l y s i s o p t i m a lp a r a m e t e r so ft h e f e r m e n t i n gp r o c e s so fd e x t r a nw e r ea n a l y z e db yr e s p o n s es u r f a c em e t h o d t h er e s u l tw a s a sf o l l o w s ：i n o c u l u mc o n c e n t r a t i o n3 5 ，i n c u b a t i o nt e m p e r a t u r e2 6 0 ，i n i t i a lp h8 0 0 t h ep r o d u c t i o no fd x t r a nw a s5 7 6 - 士= 0 8 7 g lu n d e rt h eo p t i m u mc u l t u r em e d i u ma n d f e r m e n t i n gc o n d i t i o n s l e u c m e s e n t e r o i d e sd m1 - 2 - 2 s e p a r a t e df r o mm i l kp r o d u c t sw e r ea b l et op r o d u c t d e x t r a n ，a n dt h ep r o d u c t i o no fd e x t r a nw a sh i g h e r t h e r e f o r e ，i th a sm o r ev a l u e sa n d p o t e n t i a ld e v e l o p m e n t k e yw o r d s ：l e u c o n o t o cm e s e n t e r o i d e s ；d e x t r a n ；p r o d u c t i o n ；f e r m e n t a t i o n d ir e c t e db y ：p r o f m e n g h eb ；ii g e a p p iic a n tf o rm a s t e rd e g r e e ：w eixia o y a n ( f o o ds c i e n c e ) ( d e p a r t m e n to f f o o ds c i e n c ea n de n g i n e e r i n g , i n n e rm o n g o l i a a g r i c u l t u r eu n i v e r s i t y , h u h h o t0 1 0 0 1 8 ，c h i n a ) 插图和附表清单 图1葡聚糖标准曲线2 3 图2 不同明串珠菌葡聚糖的生物合成量2 3 图3 d m l 2 - 2 的1 6 sr d n a 基因扩增电泳图- 2 4 图4d m l 2 2 的1 6 sr d n a 克隆子的筛选电泳图一2 5 图5 根据1 6 sr d n a 序列建立的系统发育树2 6 图6菌株d m l 2 2 的生长曲线及葡聚糖随培养基时间的产量变化2 7 图7不同氮源对葡聚糖产量的影响2 8 图8 蔗糖浓度对葡聚糖产量的影响2 9 图9盐类对葡聚糖产量的影响2 9 图1 0 因素与指标关系图3 1 图ll接种量对合成葡聚糖生物合成量的影响3 2 图1 2 培养温度对合成葡聚糖生物合成量的影响3 2 图13初始p h 对葡聚糖生物合成量的影响“3 3 图1 4培养条件对葡聚糖生物合成量影响相应面图立体图- 3 7 附图1 显微镜( 1 0 0 0 倍油镜) 下部分菌株照相图片4 8 附图2l e u c o n o s t o cm e s e n t e r o i d e sd m i 2 21 6 sr d n a 基因序列4 8 附图3 不同明串珠菌菌株从蔗糖转化为右旋糖酐的初筛图片4 9 表l 嗜热链球菌s 2 2 的e p s 生物合成量与初始p h 值的关系一8 表2菌株来源9 表3p c r 扩增体系1 4 表4明串珠菌的生化鉴定结果2 0 表5明串珠菌的糖发酵结果2 1 表6明串珠菌耐酸性的测定2 2 表7明串珠菌耐胆盐性的测定2 2 表8葡聚糖的分析结果一2 3 表9用于构建系统发育树的参考菌株2 5 表1 01 6 sr d n a 序列同源百分比一2 6 表1 1l 9 ( 3 4 ) 止交试验因素水平3 0 表1 2 l 9 ( 3 4 ) 正交试验设计及试验结果3 1 表1 3响应面实验的因素和水平3 3 表1 4b o x b e h n k e n 实验设计和实验结果3 4 表1 5 二阶多项式回归系数3 5 ， 2 3 4 5 6 7 8 9 m n 他 b h b m 他 侈 加 扒 丝 筋 m 巧 拍 勰 剪 引 弛 3 3 表1 6变量对应值的方著分析及显著性评价3 6 3 4 表1 7菌株编号的顺序”4 9 内蒙古农业大学 研究生学位论文独创声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的， 地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包 含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任 论文作者签名：熟! ：绥銎日期：竺兰生至璺t s 日 内蒙古农业大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解内蒙古农业大学有关保护知识产权的规定，即：研 究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属内蒙古农业大学本 人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为内蒙 古农业大学。且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为内蒙古农业 大学学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电 子文档，允许论文被查阅和借阅学校可以公布学位论文的全部或部 分内容( 保密内容除外) ，采用影印、缩印或其他手段保存论文 论文作者签名：垄塾皇：歪至 7 ，1 f7 k 指导教师签名：羞么数疰 日 内蒙古农业大学硕士学位论文 1 1 前言 乳酸菌( l a c t i ca c i db a c t e r i u m ，l a b ) 是一种能够发酵利用碳水化合物并产生一定 量乳酸的细菌通称”1 。乳酸菌具有独特的生理生化学特性：利用糖类产生乳酸( d 型 和l 一型乳酸) ；分解蛋白质和脂肪能力弱；乳酸菌过氧化氢酶呈阴性；适宜在偏酸环 境中生长，产酸耐酸能力强。乳酸菌是一种兼性厌氧菌，适合于在微氧量或无氧的环 境中生长，在9 5 氮气+ 5 - - 氧化碳气体的环境培养为宜。乳酸菌存在于各种各样食 品及场所，如酸奶、乳酸饮料、乳酸菌饮料、奶酪等与乳有关的发酵食品；也存在于 我们想象不到的地方，如清酒、葡萄酒等酒精类饮料发酵期间未过滤得原汁中；用酒 糟酿造的甜酒、生面团、待制得酱、酱油等均已证实有乳酸菌存在啪。目前，自然界 已发现的这类细菌在分类学上现在划分至少有2 3 个属，在食品、医药等领域应用较 多的主要有7 个属。 明串珠菌是乳酸菌的一个属，是革兰氏阳性异型发酵葡萄糖生成d 乳酸和c 0 2 的球菌。研究证实，明串珠菌能发酵糖类产生多种酸和醇，具有高产酸能力、抗氧化 能力和拮抗致病菌等能力。目前，明串珠茵已被广泛应用于风味剂、血浆代用品，还 有望成为新型微生态制剂。明串珠菌产葡聚糖是最早被发现的微生物发酵产多糖菌 株，葡聚糖在医疗上十分重要，具有维持血液渗透压和增加血容量的作用；临床上常 用于由于失血、创伤、烧伤和中毒等引起的失血性休克。 1 1 明串珠菌属 1 1 1 明串珠菌属的分类 明串珠菌( l e u c o n o s t o c ) 是乳酸菌的一个属，其存在的生态环境较为宽泛，但主要 存在于植物的表面及根部。尽管鲜乳及某些乳制品当中也存在相当数量的明串珠菌， 但其原生环境仍然为植物材料，主要来源于牧场或加工环境中新鲜或发酵的植物材料 【3 】 o 由于其生理特性，明串珠菌在很大程度上与异型代谢的乳酸杆菌非常接近。但是， 由于明串珠菌的形态学特征，以及从葡萄糖代谢完全产生d 一乳酸的特性，又使其明 显区别于异型代谢的乳杆菌。目前，除形态学、糖发酵、生长特性等指示用于种的鉴 定外，基于进化关系，人们应用分子生物学证据，包括1 6 sr d n a 序列、2 3 sr d n a 序列和r p o c 基因( r p o c 是一种编码依赖d n a 的r n a 聚合酶b 亚单位的基因) 将原 明串珠菌属的种或亚种重新划分到三个属，即明串球菌属( l e u c o n o s t o c ) 、魏氏菌属 ( w e i s s e l l a ) 酒球菌属( o e n o c o c c u s ) 。 新的明串珠菌属由肠膜明串珠菌三个亚种和其它7 个种组成，包括冷明串珠菌 ( l e u c g e l i d u m ) 、肉明串珠菌( l e u c c a r n o s u m ) 、欺诈明串珠菌( l e u cf a l l a x ) 、 嗜柠檬酸明串珠菌( l e u c c i t r e u m ) 、阿根廷明串珠菌( l e u ca r g e n t i n u m ) 、假肠膜 明串珠菌( l e u c p s e u d o m e s e n t e r o i d e s ) 、乳酸明串珠菌( l e u c 1 a c t i s ) 。其中肠膜明 2 传统乳制品中产葡聚糖明串珠菌的性质及其葡聚糖合成条件研究 串珠菌又包括三个亚种：肠膜明串珠菌肠膜亚种( l e u c m e s e n t e r o i d e ss u b s p m e s e n t e r o i d e s ) 、肠膜明串珠菌葡聚糖亚种( l e u c m e s e n t e r o i d e ss u b s p d e x t r a n i c u m ) 和肠膜明串珠菌乳脂亚种( l e u dm e s e n t e r o i d e ss u b s p c r e m o r i s ) 。 魏氏菌属( w e i s s e l l a ) 由原来明串珠菌的类肠膜明串珠菌( l e u c p a r a m e s e n t e r o i d e s ) 现在重新定名为类肠膜魏斯氏菌以及原乳杆菌的几个种混淆乳杆 菌( l a c t o b a c i l l u sc o n f u s e s ) 现在定名为混淆魏斯氏菌( w e i s s e l l ac o n f u s e s ) ，绿色魏斯氏 菌( w e i s s e l l av i r i d e s c e n s ) 、坎魏斯氏菌( w e i s s e l l ak a n d l e r i ) 、微小魏斯氏菌( w e i s s e l l a m i n o r ) 和希腊魏斯氏菌( w e i s s e l l ah e l l e n i c a ) 等种构成。 酒球菌属现在仅有一个种：酒类酒球菌( o e n o c o c c u so e n i ) 。 1 1 2 明串珠菌属一般生物学特性 明串珠菌( l e u c o n o s t o c ) 作为乳酸菌的一个属，是一类不产生胞子，g + c 含量的 摩尔分数为3 8 4 5 的革兰氏阳性细菌，在自然生长环境中，明串珠菌细胞一般 呈现为对或短链状排列：在某些竞争性生长的环境中，细胞排列为较长的链，其细胞 大小为o 5 1 m v - - o 7 x 0 ，7 1 2 p m 。在琼脂平板上，明串珠菌呈现小的，灰色的、扁平 的菌落形态h 3 。可以在厌氧或有氧条件下生长，通常表现为过氧化氢酶阴性，不水解 精氨酸。明串珠菌大多数菌株的最适生长温度在2 0 - - - 3 0 之间，明串珠菌的发 酵类型是异型乳酸发酵，葡萄糖发酵生成d 一乳酸和二氧化碳晦1 ；可以进行柠檬酸代 谢，但它不能利用精氨酸产生芳香性物质。 1 ，1 3 明串珠菌属的应用 在乳品行业中，明串珠菌常用于发酵乳、黄油以及干酪的发酵生产过程。目前， 用于乳制品生产的明串珠菌可以通过磷酸转酮酶途径产生一定量的双乙酰等风味物 质和适量的c 0 2 气体。明串珠菌的其它功能特征包括延长货架期以及用特殊的活性 成分来制备功能性食品等。明串珠菌不仅在乳品行业中得到应用，在泡菜生产及肉制 品生产中也扮演着重要角色。 肠膜明串珠菌可发酵柠檬酸产生特征风味物质，如用肠膜明串珠菌、植物乳杆菌 等进行混合发酵，可以产生良好风味。黄业传等( 2 0 0 4 ) 通过对几种常见乳酸菌的发 酵特点的研究，筛选出适合发酵榨菜叶酸菜的发酵剂，得出最优混合发酵剂添加量的 质量分数为肠膜明串珠菌3 、短乳杆菌1 、植物乳杆菌1 ，可生产出质地和风味 俱佳的酸菜1 。 肠膜明串珠菌可以发酵蔗糖生产右旋黼一代血浆的主要成分。在人为控制下， 肠膜明串珠菌可发酵蔗糖以合成大量的葡聚糖，目前国内主要是应用高浓度的蔗糖为 主要成分的培养基，经肠膜明串珠菌发酵生产葡聚糖 1 。 近年来，以补充人和动物有益的活菌制剂来恢复肠道正常菌群的生态平衡，从而 内蒙古农业大学硕士学位论文 3 抵御病原菌定植侵袭的微生物治疗法正在引起愈来愈多研究人员的关注。研究证实， 微生态疗法对长期使用甚至滥用抗生素、激素、免疫抑制剂引起的肠道菌群失调，以 及菌群失调所致的多种病症都具有良好的治疗或辅助效果。肠膜明串珠菌发酵能产生 大量的有机酸、醇类及各种氨基酸等代谢产物，因此它具有拮抗致病菌、维持人体消 化道健康等多种生理功效和医疗保健功能嘲。 1 2 葡聚糖 乳酸菌胞外多糖( e x o p o l y s a c c h a r i d e s ，e p s ) 是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细 胞壁外渗于培养基中的一类糖类化合物嘲。乳酸菌分泌到体外的胞外多糖以荚膜和粘 液两种形式存在。荚膜多糖依附于细胞壁形成荚膜；粘液多糖则进入培养基形成粘液。 从化学组成上分类，胞外多糖又可进一步分成同聚多糖( h o m o p o l y s a c c h a r i d e s ) 和杂 聚多糖( h e t e r o p o l y s a c c h a r i d e s ) 两种类型。同聚多糖其构成单位只有一种单糖，如葡 聚糖、果聚糖、甘露聚糖等；而杂聚多糖由许多相同的糖单元构成的，每一个糖单元 中包含有两种以上的单糖，大多糖单元上含有支链n 。 葡聚糖( d e x t r a n ) ，是蔗糖经肠膜状明串珠菌发酵后生成的高分子葡萄糖聚合物 d 。它是最早发现的微生物多糖，也是世界上第一个工业化生产的微生物多糖，是较 早作为代血浆应用的微生物多糖。 葡聚糖的生产菌株很多，一般为肠膜明串珠菌( l e u o c o n o s t o cm e s e n t e r o i d e s ) 、肠 系膜状白捻珠菌( 三m e s e n t e r o i d e s ) 、聚糊精白念珠菌( 上d e x t r c u i n i c u m ) 、嗜柠檬酸 白念珠菌( 三c i t r t o v o r u m ) 、变异链球菌( s t r e p t o c o c c u sm u m n 括) 、乳杆菌属 ( l a c t o b a c i l l u s ) 中的某些乳杆菌及某些酵母菌属和枯草芽孢杆菌属。但是，据文献记 载以肠膜明串珠茵( l e u o c o n o s t o cm e s e n t e r o i d e s ) 的产量最高。 1 2 1葡聚糖的结构与性质 葡聚糖是葡萄糖单元经脱水后所构成的高分子多糖化合物，分子式为( c 6 h l o o s ) n ， 结构式如下n 船。 葡聚糖主要由葡萄糖单体以0 【( 1 6 ) 苷键连接而成，同时还杂着不同程度0 【 ( 1 - 2 ) 、仅( 1 3 ) 和a ( 1 4 ) 苷键连接形成的分支结构n 羽。水解产物中可分离出不 同分子量的右旋糖苷，其中分子量是5 0 0 0 0 - - - - 9 0 0 0 0d a 的为中分子、2 5 0 0 0 - - - 5 0 0 0 0d a 的为低分子、1 0 0 0 0 - - 2 5 0 0 0d a 的为小分子、小于1 0 0 0 0 的为微分子。分子量在7 5 0 0 0 _ _ _ 2 5 0 0 0d a 范围时，作为医疗用药是极有价值的。 4 传统乳制品中产葡聚糖明串珠菌的陛质及其葡聚糖合成条件研究 葡聚糖呈白色粉末状，无臭、无味，易溶于水，不溶于乙醇；常温下稳定，加热 逐渐变色或分解n ”。葡聚糖水溶性好，小分子葡聚糖可溶于冷水，分子量在两万或两 万以上的可良好的溶于热水。在温和的酸性和碱性条件下是稳定的。 1 2 2 葡聚糖的合成原理 乳酸菌e p s 是由乳酸菌发酵产生分泌于细胞外的常渗入培养基中的一种糖类化 合物。细菌胞外多糖根据其所在位置，可分为夹膜多糖和粘液多糖。目前对夹膜多糖 的合成途径有一定的研究，但对粘液多糖的合成途径研究研究甚少，尤其是乳酸菌胞 外多糖。夹膜和粘液层的生理功能，主要是防护作用，保持适当水分，吸收金属离子， 并可抑制溶菌酶和防噬菌体作用等n 5 1 。 乳酸菌胞e p s 的生物合成因菌种不同而发生在不同生长阶段和环境条件下。按合 成位点和合成模式不同，乳酸菌胞e p s 的生物合成分两种类型，即位于细胞壁外的 同源多糖( h o m o p o l y s a c c h a f i d e ) 的合成与位于细胞膜上的异源多糖( h e t e r o p o l y s a c c h a r i d e ) 的合成n6 。 同源多糖指含有4 个亚基，如d 葡聚糖，主要由葡萄糖残基以0 【1 ，6 键连接， 同时在2 、3 、4 位有不同程度的分支；3 - d 葡聚糖，由葡萄糖残基以b 1 ，3 键连接， 以1 3 - 1 ，2 键形成分支；果聚糖，主要以b 2 ，6 键连接的d 果糖分子组成；聚半乳糖， 是由结构一致的重复单体以不同糖苷键连接组成的。 同源多糖如葡聚糖是胞外合成的。合成体系包含糖基供体( 蔗糖) 、糖基受体及 葡聚糖蔗糖酶( d e x t r a n s u c r a s e ) ，其合成途径如下n 引： ng f d t 5 1 f i f a n s l l r , _ f t l s t ,gll+nfn g 一夕g 拙+ n s u c r o 辩l d e x t r a n f r u c t o 嫩 在葡聚糖的合成中必须弄清楚的问题包括：单链或多链反应、启动子、主链延长 方向、链的终止、受体机制及支链连接方式等。葡聚糖合成的特点是：属单链反应机 制，以蔗糖为唯一底物，合成所需的能量来自蔗糖的水解而不是糖基核苷酸，不需 脂载体和独立的分支酶，所合成的葡聚糖分子量大。葡聚糖蔗糖酶是一个糖苷转移酶 ( 蔗糖一6 一葡萄糖基转移酶) ，它将供体( 如蔗糖) 的糖苷基团转移到受体，即正在延 长的葡聚糖主链上，蔗糖可启动其自身的多聚化反应。已从明串珠菌、链球菌属和乳 杆菌属的菌种中得到部分纯化的葡聚糖蔗糖酶，但尚不清楚该酶的专一性。 在蔗糖存在的情况下，葡聚糖蔗糖酶催化合成以0 t ( 1 6 ) 键连接的d 毗喃葡萄 糖基主链，同时产生不同程度的q ( 1 2 ) 、u ( 1 3 ) 、0 【( 1 - 4 ) 键连接的支链。支链的 连接程度主要取决于微生物菌株的不同n 钔。 1 2 3 葡聚糖的用途 内蒙古农业大学硕士学位论文 5 作为乳酸菌次级代谢产物的e p s 由于其潜在的生化意义和药理作用而越来越受 到研究者的关注。乳酸菌e p s 是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的粘液 ( s l i m e ) 或荚膜( c a p s u l a r ) 多糖( 统称e x o p o l y s a c c h a r i d e ，简称e p s ) ，其生物合成是 由糖基的供体、糖基的受体和糖基转移酶这三类分子协调完成的，和碳源的代谢密切 相关。 e p s 在食品上可以作添加剂和增稠剂；在工业上可以作凝胶过滤剂、优质凝胶、 化妆品、石油助剂、b 1 t 1 杀虫剂的增效剂。在医学上，e p s 的应用也很广泛，尤其 是葡聚糖。葡聚糖是一种完全由a - d - i i h 2 喃葡萄糖单体构成的同型胞外多糖，其糖苷键 的类型和每种类型的数量随不同的葡聚糖而变化，糖苷键的类型主要：( 1 ，6 ) 、( 1 ，4 ) 、 ( 1 ，3 ) 、( 1 ，2 ) 等4 种，由于不同碳源及产生酶的不同葡聚糖的结构不同。羽。葡聚糖 是一种具有重要医用价值的产品，如代血浆、免疫抗癌、预防高血压、动脉硬化、有 助于减肥、药物活性、临床使用，医药上葡聚糖应用的最初例子是作为人造血浆2 1 艘器】 1 2 4 葡聚糖的研究进展 到目前为止，国内外的学者都对产生葡聚糖的研究进行报道。h e n r i s s a tb 与 c o u t i n h op m ( 2 0 0 1 ) 等报道葡聚糖蔗糖酶能催化水解蔗糖使其葡萄糖基部分生成a - 葡聚糖链，但葡聚糖的结构与酶的种类有很大关系1 。h m o r i s a k i 与t i g a r a s h i ( 2 0 0 2 ) 等报道链球菌变异菌株产生葡聚糖是构成牙齿牙石主要成分，其是威胁牙齿的健康 的主要病原因素之一。v i n c e n t 与m o n c h o i s l 等研究了口腔链球茵与l e u c o n o s t o c m e s e n t e r o i d e s 产生葡聚糖蔗糖酶分享一个催化区域，其酶结构有很大得同源性。 t i g a r a s h i 与h m o n s a k i ( 2 0 0 2 ) 等研究发现s t r e p t o c o c c u ss o b r i n u s ，s t r e p t o c o c c u sd o w n e i 和s t r e p t o c o c c u ss a l i v a r i u s 的葡糖基转移酶与链球菌变异菌株的葡糖基转移酶拥有相 同的催化位点；同时用g l u 、a s n 、t h r 或v a l 代替，链球菌变异菌株的葡糖基转移酶 的a s p 3 8 5 导致其酶活性完全消失，而取代其他的a s p 不影响其酶活性。f r a n c i s c o j 与p l o um ( 2 0 0 2 ) 等报道了葡聚糖蔗糖酶合成葡聚糖的可能机理，蔗糖在葡聚糖蔗 糖酶的作用下将葡萄糖基部分以共价键的形式与葡聚糖蔗糖酶结合形成聚合体，然后 转移连接构成以洳( 1 6 ) 糖苷键为主链的葡聚糖同时释放出果糖地反应。蔡应繁与 叶鹏盛等报道，1 3 1 ，3 一葡聚糖酶能催化b 1 ，3 一葡聚糖多聚体( 大多数植物病原真菌细 胞壁的主要成份之一) 的水解，从而抑制真菌的生长与增殖。郑详建等报道了用还原 糖法和有色底物法测定b 一葡聚糖酶活力。王京杭与王强( 1 9 9 7 ) 研究了b 1 ，3 一葡聚糖 的结构与功能的关系担8 1 。但是，对于明串珠菌产生的以仅( 1 6 ) 糖苷键为主的葡聚 糖的含量以及影响其产量的因素和葡聚糖结构与功能的报道较少。同时，利用分子生 物学方法测定关键酶的基因组成及利用分子生物学方法提高酶活性以提高葡聚糖含 量是将来葡聚糖研究的热点。 6 传统乳制品中产葡聚糖明串珠菌的性质及其葡聚糖合成条件研究 1 3 影响胞外多糖产量的因素 到现在为止，己得到研究的生物合成e p s 的乳酸菌主要有：德氏乳杆菌保加利亚 亚种( l b d e l b r u e c c k i is u b s p b u l g a r i c u s ) 、瑞士乳杆菌( l b h e l v e t i c u s ) 、酒样乳杆菌 ( l b k e f i r a n o f a c i e n s ) 、干酪乳杆菌干酪亚种( l b c a s e is u b s p c a s e i ) 、嗜酸乳杆菌旺6 a c i d o p h i l u s ) 、嗜热链球菌( st h e r m o p h i o u s ) 、乳酸乳球菌乳脂亚种( l c 1 a c t i ss u b s p c r s m o r i s ) 、肠膜明串珠菌( l e u c m e s e n t e r o i d e ) 等啪1 。乳酸菌e p s 的合成受诸多因素 的影响，首先是遗传因素即菌株自身的影响，其次还受培养基的组成氮源、碳源和盐 类等其它营养物质，以及培养基初始p h 值、培养温度、培养时间、接种量等培养条 件的影响侧。 1 3 1 菌株遗传性状对合成胞外多糖的影响 对于不同的乳酸菌来讲，其e p s 的合成差异显著，但e p s 产量的不稳定性，起 源于菌株遗传特性的不稳定性。微生物合成e p s 主要可能有3 种方式：加速扩散、 活性传递、基因转移，这3 种方式都受到菌体自身的调节控制。研究表明，嗜酸乳酸 菌产e p s 的特性受大小不同的质粒控制，但这一表现型的调节机理还不十分清楚。 v e s c o v o ( 1 9 8 9 ) 等人发现干酪乳杆菌干酪亚种产胞外多糖特性是由一个4 5 m u 质粒 控制的，同时他们也发现产e p s 的德氏乳杆菌保加利亚亚种中不含质粒口。 1 3 2 培养基成份对合成胞外多糖的影响 乳酸菌合成e p s 受培养基营养成份影响很大。由于培养基类型不同所以e p s 的 产量也有所不同，对于合成和半合成培养基来讲，其产量从4 0 - 6 0m g l 不等，但以 脱脂乳作为培养基其产量范围从5 0 - - 4 2 5m e , l m 洲。 氮源对e p s 产量有显著影响。m a r t h aa r g i i e l l o m o r a l e s ( 2 0 0 5 ) 等人比较了酪蛋 白、细菌蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉等作为氮源对肠膜明串珠菌发酵生产葡聚糖合成 量的影响，发现酵母粉作为氮源，葡聚糖合成量大洲。g a r c i a g a r i b a y ( 1 9 9 1 ) 认为 在l b d e l b r u e c k i is u b s p b u l g a r i c u s 菌株生长的牛奶培养基中加入酪蛋白能提高e p s 的产量和促进菌株生长汹1 。然而，后来的研究表明不同的菌株对营养的需求各不相同， c e m i n g ( 1 9 9 0 ) 等人发现奶酪蛋白能够刺激e p s 合成量的增加，但对于l b d e l b r u e c k i i s u b s p b u l g a r i c u s 菌株的生长没有影响口引。 碳源类型也一直是影响e p s 产量的一个重要因素。g a n c e l ( 1 9 9 4 ) 等口刀比较了蔗 糖、乳糖、葡萄糖作为氮源对st h e r m o p h i l u s 发酵生产e p s 合成量的影响，发现用乳 糖作为碳源时，e p s 生成量最大。而对于l a c t o c o c c u sl a c t i c 用葡萄糖比用果糖作为碳 源时e p s 的合成量大。t h e r m o p h i l u s $ 2 2 在含有葡萄糖和果糖的培养基上生长能够 产生更多的e p s ，但生长趋势较弱d 。实际上培养基的成分不仅影响e p s 的合成量， 有时也影响e p s 的分子量和糖基组成。d e g e e s t ( 1 9 9 9 ) 等人观察到增加初始培养基 内蒙古农业大学硕士学位论文 7 中复合氮源的浓度，高分子量的e p s 转变成低分子量的e p s ，即当细菌必需氮源浓 度升高时，所得e p s 的分子量减小嘲。但是有些研究者并没有发现乳酸茵菌株在不 同碳源的培养基中产生的e p s 的糖基组成发生了改变d 射。 其它培养基成份如矿物质、某些氨基酸、碱基和维生素，都可能影响乳酸菌e p s 的生物合成量。f m o z z i ( 1 9 9 5 ) 等人m 对干酪乳杆菌e p s 生物合成研究发现，在合 成培养基中添加o 5 醋酸钠、0 2 柠檬酸三钠、0 2 磷酸氢二钾、0 0 2 七水合硫酸 镁和0 0 0 5 四水合硫酸锰更有利于e p s 生物合成。酶在乳酸菌e p s 生物合成中起重 要作用，它们的活性也受许多因素的影响。例如人们己从鼠李糖乳杆菌菌株的e p s 合成中提取了糖源水解酶( g l y c o h y d r o l a s e ) ，该酶含有2 个组份：即a 葡萄糖苷酶和 b 葡萄糖醛酸糖苷酶。研究表明h ，a 葡萄糖苷酶在l i + 、n a + 、k + 、c a 2 + 、c 0 2 + 、m 9 2 + 作用下活性有所提高，h 9 2 + 、m n 2 + 、c u 2 + 和f e 2 + 可完全抑制a 葡萄糖苷酶的活性，而 z n 2 + 只对旷葡萄糖苷酶活性有轻微抑制作用。在m n 2 + 存在时，p 一葡萄糖醛酸糖苷酶 的活性完全受到抑制；而当h 孑+ 和f e 2 + 存在时，这种酶分别保留了1 9 和6 0 的活 性；当c u 2 + 存在时，8 一葡萄糖醛酸糖苷酶可保持7 2 的活性；其它的金属离子对于 其活性几乎没有影响。进一步的研究表明，尿素和d 1 v r 可抑制q 一葡萄糖苷酶活性。 如果培养液中含有2 一巯基乙醇时，则0 【一葡萄糖苷酶可以保持9 5 的活性，这意味着 巯基组分对旷葡萄糖苷酶上的活性位点会产生影响。2 一巯基乙醇的存在能轻微激活 p 一葡萄糖醛酸糖苷酶的活性，且d 一葡萄糖醛酸糖苷酶的活性不受尿素的影响，但d t t 会抑制b 一葡萄糖醛酸糖苷酶的活性。此外e d t a 对这两种酶的活性均有一定的抑制 作用。朱奇( 2 0 0 4 ) 等人1 研究了不同果汁对胞外多糖生物合成量的影响发现，在发 酵培养基中分别添加番茄汁、草莓汁、葡萄汁和苹果汁均能提高e p s 的生物合成量。 1 3 3 培养条件对合成胞外多糖的影晌 除菌种、培养基的组成成份外，培养温度、接种量、初始p h 值以及发酵时间等 发酵条件因素都会在很大程度上影响乳酸菌胞外多糖的生物合成量。 有很多微生物e p s 生物合成受培养温度的影响很大，培养温度的选择也是提高 e p s 生物合成量的重要条件之一。嗜中温乳酸菌在亚适宜条件下，可以产生最大量的 e p s 。嗜热性乳酸茵在其生长过程中，最大e p s 生物合成量条件与其最佳生长条件 基本一致m 1 。对保加利亚乳杆菌研究表明：该菌生物合成e p s 的最适发酵温度为3 8 ， 该值比其最适生长温度4 0 - - 4 3 略低，这可能是在此温度下，细菌生长温度较慢， 细胞壁合成也较慢，从而使很多的磷酸异戊二烯用于e p s 的生物合成，并有利于酶