（食品科学与工程专业论文）蝇蛆蛋白水解物的功能评价及固体饮料研制.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密 琶 如需保密，解密时间年 月日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同= l - 作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生始眠谁 帆研年z 月，日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存使用学位论文的规定”，印学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和 电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表传播学 位论文的全部或部分内容 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书 学位论文作者签名：导师签名： 狻文 签名日期：年月 日 签名日期：矽曰年多月砂日 摘要 家蝇( m u s c 口d o m e s t i c al ) 属昆虫纲、双翅目、家蝇科。国内外众多分析资料 表明：家蝇幼虫( 蝇蛆) 蛋白的营养成分全面，尤其以粗蛋白含量高、必需氨基酸 丰富为其特点。但蝇蛆蛋白的一些性质使它不利于直接生产加工，首先是蛋白的水 溶性差，溶出率低：其次是在加工过程中蝇蛆蛋白极易发生褐变并伴随有不良气味 的产生，降低了感官质量。为了很好的将家蝇蛋白这一新型蛋白质资源作为食品加 以开发利用，本课题旨在寻找一条有效的加工途径，将蝇蛆蛋白水解生成可被水溶 性好直接吸收利用的小肽，利用小肽生物活性及理化特性制备成固体饮料。主要研 究结果如下： 1 蝇蛆蛋白水解工艺的确定 本试验选用酶解法对蝇蛆蛋白质进行处理，运用5 种蛋白酶分别对进行水解， 利用感官评定和水解度两项指标，选择出一种最适宜该蛋白的水解酶碱性蛋白 酶。通过单因素试验和正交试验确定出蝇蛆蛋白的最佳水解条件为：酶解温度5 5 c ， p h 值7 6 ，酶与底物比为3 o ，料液比为1 ：5 ，水解时间为5 o h 。并且分析出影响 酶解水解度的主次顺序为：p h 值 e s 料液比 温度。 2 水解肽的营养功能和活性功能评价 安全急性毒理试验表明，蝇蛆蛋白水解物的l d 5 0 大于3 0 9 k g b w 。根据急性 毒性分级，该样品属无毒物质，可安全食用。 通过三十天喂养试验，对蝇蛆蛋白及其水解物进行了营养功能评价，结果如下： 低剂量组受试小鼠的相对生长率、日粮消耗量都比空白对照组要高，有显著差异。 对于蛋白质表观消化率，肽组各剂量与蛋白对照组相比有增高的趋势，但差异不明 显。中、低剂量组能有效增加小鼠体内乳酸杆菌的数目，降低了大肠菌群的增殖， 在促进机体内脏发育方面，低剂量组比空白对照组有极为显著的差异。 对蝇蛆蛋白抗疲劳功能评价试验中，中、低剂量的水解物能够显著延长小鼠力 竭运动时间，使体内的s o d 酶活力得到极为显著的提高，低剂量组还显著提高了体 内的c k 酶活力和l d h 酶活力，小鼠血液中的l i d 水平无明显差异。 3 水解产物后续处理与性质测定 本试验采取了活性炭吸附和酵母粉包埋、b 环状糊精包埋等三种方法，通过不 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 同试验条件的比较，选择出最佳的脱苦方法和脱苦条件：3 0 的b 环状糊精，温度 6 5 c ，时间4 0 r a i n 。后经过滤、冷冻干燥后得到了得率为7 0 5 、含氮物总量为7 7 8 的干粉，该粉拥有较好的吸水性、吸油性、保水性和水溶性。 4 蝇蛆蛋白水解肽制作饮料工艺 通过感官测定和沉淀指数等指标初步确定了固体饮料的配方：经3 o g 环状糊 精脱腥脱苦后的水解液，添加了0 1 的黄原胶和0 0 5 的海藻酸钠作为增稠剂使用， 蔗糖量添加量为1 7 6 5 ，柠檬酸添加量为o 2 9 ，添加0 1 的菠萝香精。 关键词：蝇蛆蛋白，水解，功能评价，小肽饮料，稳定性 兰主奎些查堂垫坚旦堡主兰堡丝苎 h o u s e f l i e s ，b e l o n g i n gt ot h ef a m i l ym u s c i d a eo fd i p t e r a h o u s e - f l i e sl a r v ai s a k i n do fh i g h l yn u t r i t i o u sp r o t e i nr e s o u r s ea n dt h ee s s e n t i a la m i n oa c i d sa r ec o m p l e t e t h e n u t r i t i o n a le v a l u a t i o no ft h ea m i n oi nh o u s e - f l i e sl a r v aw a st e s t i f i e d h a v i n gt h ee a s i l y a b s o r p t i o nc h a r a c t e r i s t i c ，t h e s el o wp e p t i d es t i l lh a v em a n yg o o df u n c t i o n sc h a r a c t e r i s t i c a n dt h ep h y s i o l o g i c a la c t i v i t y t h e yc a nb eu s e dw i d e l yi nt h ef o o df i e l d t h ep a p e rw a s a i m e da ts t u d y i n gt h et e c h n i q u e so fe n z y m a t i ch y d r o l y s a t eo fh o u s e f l i e sl a r v a ，a n d a s s e st h eh y d r o l y s a t e s f u n c t i o n ，a c c o r d i n gt h a ts t u d y i n g t h ef o r m u l ao f p e p t i d e s b e v e r a g ei no r d e r t od e v e l o pt h en e w p r o t e i nr e s o u r s e 1 t h et e c h n i c so fh y d r o l y z a t i o n f i r s t ，t h ep e r f o r m a n c eo fe n z y m e sw a sc o m p a r e d w i t ht h ei n d e xo fd h a n dt h e s e n s o r ya s s e s s m e n t ，a l k a l i n ep r o t e i n a s ew a ss e l e c t e da st h es u i t a b l ep r o t e a s et op r e p a r e h y d r o l y s a t e s i m p l ef a c t o ra n a l y s i sa n do r t h o g o n a ld e s i g nb ( r 阿硒a d o p t e d t oo p t i m i z e t h ec o n d i t i o n s o f h y d r o l y s i s t h er e s u l t p r e f e r e du n d e r t h e c o n d i t i o n o f t e m p e r a t u r e 5 5 c ， p h7 6 ，r a t i oo fe n z y m et os u b s t r a t e ( e s ) 3 o ，r a t i oo fw a t e rt os u b s t r a t e ( w v ) l ：5a n d o p t i m a lt i m eo fh y d r o l y s i sw a s5h o u m t h ei - 9 ( 3 4 ) e x p e r i m e n ti n d i c a t et h a tt h eo r d e ro f i m p a n t a n c ei sp h e s w v t e m p e r a t u r e 2 t h ea s s e s s m e n to fn u t r i t i o na n da c t i v ef i i n c t i o n a f t e rt h ea c u t et o x i c o l o g i c a le x p e r i m e n t ，t h el d s oo fh y d r o l y s i so fh o u s e f l i e sl a r v a w a s 3 0 9 k g b w , a n di t si n n o x i o u s t h ei n t a k ea n da v o i r d u p o i sa f t e rt h r i t yd a y s f e e di n c r e a s e db a u e rt h a nt h eb l a n kb y f e e dl o wd o s a g e a l le x p e r i m e n tg r o u p sh a dt h eu p t r e n da b o u ta p p a r e n tp r o t e i nd i g e s t a n t r a t e ，t h ed i f f e r e n c eb e t w e e ne x p e r i m e n tg r o u pa n db l a c kw a sn o ts i g n i f i c a n t a f t e rf e e d t h el o wd o s a g ea n dm e d i u md o s a g e ，t h et o t a lc o u n t so fc o l i f o r mb a c t e r i ao ff e c e sc o u l d d e c r e a s e da n dt h ec o u n t so f l a c t o b a c t e r i u mi n c r e a s e ds i g n i f i c a n t a n dt h el o wd o s a g e h a d p r o m i n e n ts t i m u l a t i v ec f f e c to nb o w e l s g r o w t h i nt h ee x p r i m e n t a lr e s e a r c ho nh y d r o l y s a t e sa c t i v ee f f e c t , t h el o wd o s a g ea n d m e d i u md o s a g ec o u l dp r o m i n e n t l ye n h a n c et h ee x h a u s i v es p o r t st i m e ，a n dh a dp r o m i n e n t s t i m u l a t i v ee f f e c to ns o d t h el o wd o s a g eg r o u pa l s oh a dr e m a r k a b l ea d v a n c e d c k a c t i v ea n dl d ha c t i v e t h el dc o n t e n ti nb l o o dh a dp a r a l l e ll e v e l 3 m e t h o d so fd e b i t t e ra n dm e n s u r a t i o no fc h a r a c t e r s 3 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 a c t i v a t e dc a r b o na n dd i f f e r e n ts o r b e n t sw e r ec h o s e nt od e b i t t e r h y d r o l y s a t e e x p e r i m e n t a ld e s i g ni n c l u d e ds i n g l ef a c t o r , o r t h o g o n a ld e s i g n , c o m b i n a t i o na n a l y s i s t h e r e s u l ts h o w e dt h a tt h eo p t i m u mc o n d i t i o n sa n do p t i m u mm e t h o do fd e b i t t c e i n gp e p t i d ea s f o l l o w s ：b - c d 3 0 ，t e m p e r a t u r e6 5 1 2 ，t i m e ：4 0 m i n a t e rd i s p o s a l t h ew a t e r - s o l u b i l i t yo f h y d r o l y s a t e i sm o r eb e t t e rt h a nt h el a r v ap r o t e i n 4 t h es t u d i e so f p e p t i d eb e v e r a g e t h es t u d i e so fp e p t i d eb e v e r a g ew a sb a s c do nh y d r o l y s a t eo fl a r v ap r o t e i n ，a n dt h e c o n d i t i o n so fh o m o g e n i z a t i o ni s6 5 ，4 5m p a t h ef o r m u l ao fn u t r i t i v eb e v e r a g ew a s c o m p o s e do fx a n t h i ca c i d0 1 ，a l g i n a t eo 0 5 ，s u g a r1 7 6 5 ，c i t r i ca c i do 2 9 a n d p i n e a p p me s s e n c 宅o 1 u n d e rt h e s ec o n g d i t i o n st h es e n s o r yq u a l i t ya n ds t a b i l i t yo f p r o d u c t sw a so p t i m u m k e y w o r d s ：h o u s e - f l i e s l a r v a p r o t e i n ，h y d r o l y z a t i o n ，f u n c t i o n a s s e s s m e n t ， p e p t i d e s - b e v e r a g e ，s t a b i l i t y 4 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 第一章前言 1 研究的目的与意义 随着世界经济的高速发展，人民生活水平不断提高，食物需求持续增长，人 们对优质蛋白质的需求量也愈来愈大，蛋白质资源短缺已是当今世界，特别是发 展中国家普遍存在的问题。我国是一个人口大国，蛋白质资源短缺状况尤其严重。 目前我国人均膳食中动物性蛋白质的摄取量与世界水平相去甚远，仅相当于经济 发达国家的1 5 1 8 。随着养殖业的密度增加，现有蛋白的安全性问题日渐突出。 近年来频繁暴发的禽流感与口蹄疫甚至疯牛病不仅造成全球性食品安全的恐慌， 而且给当事国和当事地区造成巨大损失；由于化学药物的过量使用，养殖的鱼类 也给人们的健康带来隐患。因此，寻求新的蛋白质资源已是摆在我们面前的一项 迫切任务。在分类上，由于昆虫与人类相隔甚远，患人畜共患病的可能性很小， 是一种较安全的食物资源。因此，具有诸多优势的昆虫蛋白就成为研究开发的热 点，其中家蝇幼虫( 蝇蛆) 蛋白又以其自身的优点成为新型蛋白资源的昆虫之首。 家蝇( m u s c ad o m e s t i c al ) 属昆虫纲、双翅目、家蝇科，分布范围非常广。 家蝇养殖最大的特点就是生长世代周期短，繁殖率特别高，在理想养殖条件下， 一对家蝇经过5 个月的繁殖，可以生产1 5 0 吨的蛋白质，便于人工控制，适于工 厂化生产。国内外众多分析资料表明：蝇蛆蛋白的营养成分全面，尤其以粗蛋白 含量高为特点。鲜蝇蛆中含粗蛋白1 5 6 2 ，干蛆粉与进口秘鲁鱼粉的粗蛋白含量 相当( 雷朝亮等，1 9 9 9 ) 。而且其富含必需氨基酸( 见表1 ) ，蝇蛆原物质和干粉的 必需氨基酸总量分别为4 4 0 9 和4 3 8 3 ，均超过f a 0 m ，h o 提出的参考值4 0 。 除此之外，蝇蛆中不仅含有丰富的钾钠钙镁等无机元素，还含有近2 0 种生命活动 所必需的微量元素( 王达瑞等，1 9 9 1 ) ，如铁、铜、锌、锰、磷、钴、铬、硒、硼 等，其中被益为“生命之花”的锌含量是蜂王浆的4 0 倍；此外维生素含量也十分丰 富，脂溶性维生素a 和维生素d 的含量较大，维生素d 的含量可以与鱼肝相比， 水溶性维生素b 族较丰富，特别是谷物中缺乏的b 2 与b 1 2 含量较高( 张泽生等， 1 9 9 7 ) 。近3 0 年来，由于蝇蛆具有很高的营养价值，又含有抗菌肽( 翟朝阳，1 9 9 6 ) 、 凝集素等特殊的活性成分，引起了各国科学家对蝇蛆中生物活性成分的研究兴趣， 对蝇蛆的利用己从动物饲料用途转向食品、医药、化妆品等高附加值用途的深层 5 - 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 次开发。 表1 - 1 几种氮源氮基酸组分分析( 雷朝亮等，1 9 9 9 ) t a b l e l - 1t h ec o n t e n to fa m i n oa c i d si nk i n d so fp r o t e i n s 是必须氮基酸 我国的经济速度发展迅速，人们生活水平不断提高，在营养健康方面也不断提 出新的要求，但是由于长期受传统观念的束缚和不正确观念的误导，日常生活中由 于能量摄入过多而诱发的“三高”疾病和以及由于蛋白质特别是优质蛋白缺乏导致 的疾病并存，这种现象已逐步成为人们不能再忽视的问题。人们对优质蛋白的注意 力开始集中，但是我国蛋白质短缺的状况在短期内将难以改变。蝇蛆蛋白除了作为 一种新型的优质蛋白质资源以外，还拥有其他的生理活性。将其开发为食品，走上 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 人们的餐桌，对于解决蛋白资源匾乏，减轻人畜共患病的威胁，提高人们生活水平 将具有重要意义。 蝇蛆蛋白虽然营养丰富，但它的一些特性不能满足直接加工的需要。蝇蛆在加 工过程中极易发生褐变并伴随有不良气味，降低了它的感官质量，不易为消费者。 另外，蝇蛆蛋白水溶性较差，增加了生产上的难度。因此改良蝇蛆蛋白的理化性状 成为开发蝇蛆蛋白的必经之路。本课题旨在寻找一条有效水解改性途径，将其水解 生成可被直接吸收利用的小肽，并研究其不同于蝇蛆蛋白的各项性质与功能，为生 产附加值高、市场前景广阔的昆虫蛋白产品提供理论依据，并迸一步开发出有益于 人体健康的产品，使之能够逐步在人类食物蛋白资源中占有一席之地。 2 蝇蛆蛋白利用现状 有关蝇蛆利用的研究，始于上世纪2 0 年代，早在1 9 1 9 年，l m d a n e r 就论证了 利用蝇蛆来处理粪便以获取蛋白质饲料的可能性；在上世纪5 0 年代初，世界许多 国家相继开始试验用禽畜粪便饲养蝇蛆，在降解粪便、净化环境，提供大量生物肥 料的同时，提出了以蝇蛆蛋白质作为饲料的可能( 王达瑞等，1 9 9 1 ) 。国内外对蝇 蛆的开发利用大多集中在开发蝇蛆粉作为饲料以替代鱼粉，进行畜禽鱼类等养殖， 均取得良好的效果( 何念群，1 9 9 1 ) ，先后有许多国家研究工业化养殖并成功地进行 大规模的蝇蛆生产如今，蝇蛆粉作为营养价值较高的饲料已具备了初步工厂化的 生产能力。 另一方面，家蝇在恶劣环境中强大的生存能力引起人们的注意，对家蝇体内免 疫机制的研究逐步成为一个非常活跃的领域。上世纪九十年代初，王远程等曾提取 了蝇蛆血淋巴及进行抗菌物质的诱导，在此基础上对家蝇免疫血淋巴抗菌物质的组 成进行了分析，并测定了各种理化特性( 王远程等，1 9 9 2 ，1 9 9 7 ) 。其后的分析表 明，是一些与抗菌相关的蛋白和多肽在共同作用，组建了完整的防御体系( 安春菊 等，2 0 0 4 ) 。蝇蛆体内抗病毒活性物质的研究也相应发展起来( 陈艳等，2 0 0 2 ) 。 将蝇蛆蛋白作为食品自古以来旱有记载。近年来，国内许多学者大力尝试开发 蝇蛆在食用及保健方而的应用技术，如蝇蛆活性粉、蝇蛆蛋白提取液、蝇蛆保健酒 等的研制和生产。以蝇蛆为原料进一步深度加工，开发出食品、营养品、保健品以 及医药用品等必将具有更加广阔的前景和更丰厚的利润。在这些方面，一些科研单 位和公司已经率先迈出了第一步，利用昆虫虫体制作复合氨基酸口服液( 李克斌， 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 1 9 9 4 ) ，对食用工程蛆营养活性物干粉生产工艺及相关产品配方等申请了专利( 雷 朝亮等，1 9 9 5 ) 。但总的来讲，在蝇蛆深加工方面，国内还没有出现大的公司和名 牌产品，家蝇广阔的开发前景和巨大的开发潜力还未完全展现。 3 昆虫蛋白水解技术研究 一般来说，蛋白质水解物是寡肽、小分子肽和氨基酸的混合物，具有比蛋白质 更优越的加工性能和营养特性。显示出更广阔的应用前景。狭义的蛋白质水解是指 以纯蛋白为底物，利用酸、碱、酶等作用使蛋白质得以完全或部分降解的过程。用 酸法和碱法水解蛋白质己有1 0 0 多年的历史，但由于水解时间过长，反应条件剧烈， 不仅生成的产物复杂，而且蛋白质的营养价值损失大，因此从上世纪7 0 年代起己逐 渐被蛋白酶水解所取代。相比之下，酶法水解效率高，反应条件温和，不易造成污 染，减少了酸碱成分在反应物中的残留，尤其是在营养成分的保留上有着不可比拟 的优势。 由于蚕业资源利用较早，随着开发研究的不断深入，蚕蛹蛋白水解技术研究取 得了长足进展。水解蚕蛹蛋白制备氨基酸有酸水解、酶水解、碱水解和发酵法等方 法( 林高堂等，2 0 0 6 ) ，前两种方法己应用于工厂化生产。酶水解方面，采用胰蛋 白酶进行单酶解( 熊愈辉，2 0 0 1 ) ，可得到1 8 种氨基酸的混合液；采用复合蛋白酶 和中性蛋白酶对蚕蛹蛋白水解的双酶水解中，在最佳条件下使水解度达n 2 7 3 6 ， 保持了蛋白的功能性，酸溶性肽得率为5 5 1 7 ( 赵鹏，2 0 0 5 ) 。 在昆虫蛋白水解方面研究的较多的还有黄粉虫幼虫蛋白( 陈杰林，1 9 9 9 ；崔蕊 静等，2 0 0 3 ) 和蚂蚁蛋白( 鲁晓翔等，1 9 9 7 ) 。水解时大都利用胰蛋白酶和木瓜蛋 白酶的单酶解或双酶复合水解法，在试验室中均取得了较好的水解效果。 4 小肽的生理功能研究 蛋白质是人体最重要的营养素之，其代谢方式、效率、途径一直为人们所关 注。理想蛋白质模型的建立，为人们进行饲料配合提供了理论依据，使动物对蛋白 质的利用效率大大提高了。但人们在后来的一些研究中发现，蛋白质在消化道中的 消化终产物大部分是小肽而非游离氨基酸，小肽能被动机体完整地吸收并以二、三 肽的形式进入血液循环( s m i t h n e w e y ，1 9 6 0 ) 。至此，小肽作为蛋白质代谢吸收的 一种方式才为人们逐渐接受。有证据表明，与游离氨基酸相比，小肽吸收具有吸收 快、耗能低、吸收率高等优势( g a n a p a t h y ，1 9 8 3 ) 。二者在动物体内具有相互独立 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 的吸收机制，互不干扰。这就有助于减轻由于游离氨基酸间相互竞争共同的吸收位 点而产生的吸收抑制作用，有利于蛋白质的利用。 小肽的生理功能主要包括以下几方面： 加快蛋白质合成：很多试验表明，以小肽形式提供部分或全部氮源时，蛋白质 沉积效率高于相应的合成氨基酸日粮和完整蛋白质日粮( e d m o n d s ，1 9 8 5 ) 。分别用含 小肽和游离氨基酸的日粮进行动物试验，含小肽日粮组小鼠体蛋白合成效率比含游 离氨基酸组高2 6 ( f n a b i k i ，1 9 9 0 ) 。这些结果一般被认为消化道中的小肽底物能够 增加肠道小肽载体对小肽和游离氨基酸的转运能力，提高血液循环中游离氨基酸和 小肽合成蛋白的能力( 田丽霞等，1 9 9 3 ) ，动物肝脏、肾脏、皮肤及其他组织也能 完整利用小肽。 提高矿物元素的吸收利用率：小肽可与钙、锌、铜、铁等矿物离子形成螯合物 增加其可溶性，利于机体吸收。有报道明确指出，肽有“走私”金属离子进入粘膜细 胞的能力( m e l l a n d e r ) ，位于5 圆环或6 圆环络合物中心的金属元素可以通过小肠绒 毛刷状缘，以氨基酸或欣的形式被吸收，能以小肽铁的形式到达特定的靶组织。能自 由地完整地透过成熟的胎盘( f o u a d ，1 9 7 4 ) 。 小肽中存在多种生物活性肽，如磷肽、阿片肽、内啡肽、促泌肽等，它们可在 消化过程中释放出来，促进消化道的蠕动，改善消化机能。同时小肽可直接作为神 经递质刺激肠道受体激素或酶的分泌( 乐国伟等，1 9 9 7 ) ，促进消化道内有益菌群 繁殖，提高机体免疫力。 但是，目前对小肽的认识还比较模糊，基础的理论研究以及相应的试验还较少， 从小肽理论研究到生产应用还有较大距离，目前在国外有关小肽营养的研究也都还 停留在试验室阶段。寻找合理的小肽加工方法并降低加工成本目前仍在探索中。 5 蛋白水解物理化性质研究 蛋白质的功能特性定义：除了它的营养性以外的，影响利用它的所有食品或食 品成分的特性( m a h m o u c l ，l 9 9 4 ) ，包括如溶解性、粘性、乳化性、泡沫性、凝胶性 和风味特征等。蛋白水解产物主要功能特性与完整蛋白质相似，但由于酶水解使蛋 白质原本的构象构型发生变化，故水解物的特性不同于完整蛋白质。影响这些理化 性质最主要的因素是分子大小或水解度( m i c h e ll i n d e n1 9 9 6 ) ，另外，水解酶的 种类、完整蛋白质自身的物理化学性质和水解条件，也影响蛋白水解物的功能特性。 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 水解过程中，随着肽键的断裂，发生三个主要变化：( 1 ) 随着水解度的提高，可离解 的基团( n h 4 + ，c o o ) 数目的增多，导致了亲水性及净电荷数的增加，表现为水 解物溶解性大幅度提高；( 2 ) 多肽等大分子数减少，游离氨基酸和小肽的分子数增加， 表现为黏度降低、抗原性急剧降低、过敏成分减少或被除去( w i l l i a mj ，1 9 9 4 ) ；( 3 ) 分子结构改变导致埋藏的疏水的中心暴露到溶液环境中，导致起泡性增加( 赖小玲， 1 9 9 7 ) ，苦味出现( m a r r a y b a k e r ，1 9 5 2 ) 。 自从m a r r a y 和b a k e r 在1 9 5 2 年报道了蛋白质水解液中有苦味的出现，经学者 多年研究，现在一致认为苦味物质是来自于水解过程中产生的疏水性多肽。这些基 团由包裹变为暴露状态，与味蕾接触而产生苦味。在6 0 7 0 年代，大量苦味肽被 分离纯化，这些肽的链长可短至二、三个氨基酸残基，也可以长达数十个氨基酸残 基。许多报道都证实了多肽与苦味之间的相关性，其中包括著名的q 规则，该规则 包括两点；( 1 ) 多肽有无苦味可通过其平均疏水性q 值来预测，当q 值大于1 4 0 0 时 有苦味，而q 值小于1 3 0 0 时则没有苦味；( 2 ) 分子量低于6 0 0 0 道尔顿的肽可能有 苦味，而分子量大于6 0 0 0 道尔顿的肽则肯定没有苦味( n e y ，1 9 7 9 ) 。q 规则的出 现使多肽苦味的量度有了计算和评价的标准。后来，学者们又从分子结构方面对多 肽苦味进行了研究，发现多肽的苦味不仅与其疏水性有关而且与其中的亲水性基团 ( b e l i t z ，1 9 7 9 ) 和碱性氨基酸残基的存在与否有关。 6 蛋白水解物脱苦的研究 6 1 影响蛋白水解物苦昧物质的因素 一般认为，水解底物的种类，水解酶的种类和水解度的不同是影响蛋白水解物 苦昧物质的三个因素。 蛋白质平均疏水性越大或者疏水氨基酸的含量越高，其水解物产生苦味的可能 性就越大，且蛋白质平均疏水性越大，其水解苦昧亦越强。但是不能仅凭蛋白质的 疏水性来判断其水解物是否具有苦昧，还应当考虑其组成、结构等因素。有些蛋白 质，如大豆蛋白，疏水性虽然较低，但其水解物亦有很强的苦味( k u k m a n ，1 9 9 5 ) 。 由于蛋白酶具有专一性，因此不同蛋白酶对同一种蛋白质底物作用结果不同， 蛋白质水解物中多肽长度及结构组成也不同。有些蛋白酶能专一性地水解疏水性氨 基酸之间的肽键，这样就是疏水性氨基酸在不同多肽间分布，从而避免了多个相互 连结的疏水性氨基酸集中于同一个多肽中而使其具有较高的疏水性和苦味。 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 多肽的分子量及链长与其苦味形成有明显的相关性。一般认为，蛋白质水解度 与其水解产物苦味之间存在一个类似钟形曲线关系，所以可通过控制水解度大小来 控制水解产物苦味。但不同的蛋白质其自身性质不同。所以也会具有不同的合宜水 解度。 6 2 蛋白水解物脱苦的方法 通过选择底物蛋白、水解酶及控制水解度是降低苦味的有效方法，但有时受材 料和其它条件的影响，这种方法往往无法很好满足脱苦的要求，需要外加其他有效 的脱苦手段，常用的方法包括：选择性分离、掩盖、酶脱苦和微生物法。其中选择 性分离是利用酶解产物中不同多肽成分化学和物理性质( 如疏水性、分子量、等电点 等) 的差异，分别采用疏水性吸附( m a r r a y ，b a k e r ，1 9 5 2 ) 、有机溶剂萃取、等电 点沉淀、色谱分离( 层析柱分离) 、膜分离等方法将水解液中苦味肽予以选择性去 除。掩盖的方法是通过添加部分有机酸，如柠檬酸、苹果酸等，或其他可包埋苦味 集团的大分子物质进行脱苦处理。酶法的原理是利用外切蛋白酶( 氨肽酶、羧肽酶) 的作用将疏水性氨基酸残基从末端切掉，可使苦味减弱。微生物法也是通过微生物 自身产生的广谱酶系作用于蛋白水解物，达到一定的脱苦效果。 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 第二章蝇蛆蛋白水解工艺优化 第一次世界大战后，由于粮食不足，德国研究人员试图用昆虫来生产食品，开 创了昆虫食品的加工产业。如何更好地开发与利用昆虫中的蛋白源，使之成为食品 和医药工业中的重要原料( 向洋和徐向丽，1 9 9 9 ) ，是许多学者一直致力于研究的 课题。鉴于小肽在消化吸收方面优于蛋白质的特点，为了更好的节省利用蛋白质资 源，水解蛋白质的研究已经成为了食品蛋白质研究的一个热点。酶法水解效率高， 反应条件温和，不易造成污染，减少了酸碱成分在反应物中的残留，尤其是在营养 成分的保留上有着酸、碱水解法不可比拟的优势。如刘怀如等( 2 0 0 3 ) 采用碱法和酶 法提取黄粉虫( t e n e b r i om o l i t o rl ) 中的蛋白质，研究发现酶法提取得率高于碱法提 取得率。 针对蝇蛆蛋白的不良特性，本试验从选择最适宜水解酶开始，研究酶水解蝇蛆 蛋白的工艺。利用感官评定和水解度两项指标，确定最适宜水解酶和最佳水解条件 及工艺，使水解产物的风味和口感符合人们的饮食习惯。 1 材料与方法 1 1 试验材料和仪器设备 1 1 1 试验原料 4 日龄蝇蛆，华中农业大学昆虫资源研究所提供。 1 1 2 试剂 硫酸钾 氢氧化钠 硫酸铜 硼酸 茚三酮 磷酸二氢钾 磷酸氢二钠 磷酸二氢钠 浓硫酸 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 河南焦作市化工厂 武汉市江北化学试剂厂 河南焦作市化工厂 武汉市中南化工试剂有限公司 上海恒信化学试剂有限公司 中国医药集团上海化学试剂公司 上海新华化工厂 上海新华化工厂 武汉市中南化工试剂有限公司 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 浓盐酸 分析纯 亚硫酸氢钠分析纯 无水碳酸钠分析纯 碱性蛋白酶食品级 中性蛋白酶食品级 木瓜蛋白酶 食品级 复合蛋白酶食品级 胰蛋白酶食品级 酪蛋白 分析纯 酪氨酸 分析纯 钨酸钠分析纯 钼酸钠分析纯 1 1 3 仪器及设备 a l 2 0 4 型电子天平 a l p h a1 - 4l d 型真空冷冻干燥机 p h s - 3 c 型精密p h 计 凯氏定氮仪 电子恒温水浴锅 7 5 2 型紫外可见分光光度计 t g l - 1 6 b 型离心机 s h 乙3 型循环水真空泵 多功能粉碎机 1 2 试验方法 1 2 1 蝇蛆成分测定方法 1 2 1 1 水分含量测定 常压干燥法( 吴谋成，2 0 0 2 ) 1 2 1 2 粗蛋白含量测定 常量凯氏定氮法( 吴谋成，2 0 0 2 ) 1 2 1 3 粗脂肪含量测定 武汉市亚泰化工试剂有限公司 上海虹光化工厂 上海虹光化工厂 无锡星达生物有限公司 无锡星达生物有限公司 广西南宁庞博生物工程有限公司 广西南宁庞博生物工程有限公司 无锡星达生物有限公司 中国医药集团上海化学试剂公司 上海惠世生化试剂有限公司 天津光复精细化工研究所 天津光复精细化工研究所 梅特勒一托利多( 上海) 仪器有限公司 德国m a t i nc h r i s t 公司 上海雷磁仪器厂 武汉玻璃仪器厂 浙江余姚市检测仪表厂 上海光谱仪器有限公司 上海安婷科学仪器厂 河南省巩义科教仪器厂 荷兰飞利浦公司 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 索氏提取法( 吴谋成，2 0 0 2 ) 1 2 1 4 灰分含量测定 灰化法( 吴谋成，2 0 0 2 ) 1 2 2 酶水解蝇蛆蛋白方法 选择不同日龄的新鲜蝇蛆，用生理盐水浸泡1 h 左右，使体内的代谢废物尽可 能排净。滤干后放入沸水中热漂5 r a i n 后立即用冷水冷却至室温。 将冷却至室温下的家蛆体表水分吸干，称取适量加入一定比例蒸馏水中，添加 0 0 5 的护色剂，匀浆5 r a i n ，调节p h 。按适当比例加入蛋白酶进行水解，水解过程 中不断搅拌，隔1 h 做一次感官评定。5 h 后煮沸中止水解，补足水分，过滤取滤液， 测定水解度( d h ) ，d h 和感官评定两个指标综合考虑，选择出最佳水解酶。 根据以上方法，在其他条件相同的情况下，以水解度为指标，确定单因素最佳 条件，包括温度、p h 值、底物与蒸馏水的比例、蛋白酶与底物的比例和水解时间 等五项。 根据单因素试验结果，设计正交试验：选定a 温度( ) 、b p h 值、c 酶与 底物比( ) 、d 料也比( w v ) 等因素在3 个水平上进行b ( 3 4 ) 正交试验，比较 各因素对水解度影响程度的大小，确定最佳酶水解工艺。 表2 1l ( 3 4 ) 正交试验表头 t a b l e2 - 1t h ep r o j e c to ft h el 9 ( 3 4 ) e x p e r i m e n t 1 2 3 蛋白酶活力测定方法 福林酚法( 工业酶制剂通用试验方法q b t1 8 0 3 1 9 9 3 ) 酶活力定义：l g 固体酶粉( 或l m l 液体酶) ，在一定温度和p h 值条件下，l m i n 水解酪素产生耻g 酪氨酸为一个酶活力单位，以眺( m l ) 表示 1 2 4 样品水解度( d h ，d e g r e eo fh y d r o l y s i s ) 测定方法 取5 m l 水解上清液定容至1 0 0 m l ，采用茚三酮的方法测定其氨基酸的含量， 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 水解度按下列公式计算： 水解度c = 塑塑盖品黧鬻塑鱼量。 1 2 4 1 氨基酸含量测定方法 茚三酮法( 食品分析与感官评定，吴谋成，2 0 0 2 ) 氨基酸含量( ) = 丝兰掣x 1 0 0 式中：m 一从标准曲线中查得的样品中氨基酸的量，g ； n 一稀释倍数： m o - - 样品的质量，g 1 2 4 2 蝇蛆蛋白氨基酸总量含量测定方法 酸水解法( 王芙蓉等，2 0 0 5 ) 1 2 5 感官评定方法 感官评定由1 0 人组成的评定小组参加。 l 2 5 1 苦味评定方法 称取喹呤0 1 9 溶于5 0 r a l ，5 乙醇溶液中，从中取5 m l 溶液用蒸馏水稀释到 l o o m l ，得到1 o x l o - 4 9 m l 喹呤溶液，再进一步稀释，稀释倍数依次从1 1 0 ，制成 梯度浓度的喹呤溶液，相应苦味值分别定为1 ，2 ，3 8 ，9 ，1 0 ( 如表2 2 所示) 。 比较水解液的不同浓度喹呤溶液苦味，确定蝇蛆肽的苦味值。 表2 2 喹呤溶液浓度与苦味值的对应关系 t a b l e2 - 2c o n n e c t i o no fc o n c e n t r a t i o no fq u i n o l i n ew i t hb i t t e r n e s s 浓度( g m l ) 苦味值 浓度( g m l ) 苦味值 1 o o x l o 。410 1 7 x l 酽 6 0 5 0 x 1 0 42o 1 4 x 1 0 - 4 7 0 3 3 x l 酽3 0 1 2 5 x 1 0 4 8 o 2 5 x 1 0 44 0 1 1 x l 酽 9 0 2 0 x l 。0 4 5o 1 0 ： 复合蛋白酶 胰蛋白 酶。5 种蛋白酶中，木瓜蛋白酶的水解液腥味最小，苦味较大；中性蛋白酶的苦味 最小，腥味较大；复合蛋白酶最苦，胰蛋白酶和复合蛋白酶的腥味最大，碱性蛋白 酶水解液的腥味与苦味居中。以风味和水解度为综合指标选择碱性蛋白酶作为家蝇 蛋白的最佳水解酶。 2 3 4 不同酶解温度的影响 分别在4 5 、5 0 、5 5 、6 0 、6 5 下水解，其他条件相同。 4 0 3 5 3 0 古2 5 2 0 1 5 4 04 55 05 56 0 6 5 7 0 水解温度( ) 图2 1 水解温度与水解度的关系曲线 f i g 2 1t h ee f f e c to fh y d r o l y z i n gt e m p e r a t u r eo n h y d r o l y s i sd e g r e e 如图2 - 1 所示，随着温度升高，水解反应速度加快，当温度达到6 0 时，反应 速度达到最大，此时的水解度为3 4 7 3 ：当温度超过6 0 c ，水解度随温度的升高 逐步降低。因此，选择6 0 c 为碱性蛋白酶水解的最适温度。 2 3 5 不同p h 值的影响 使用精确p h 计，分别将匀浆液p h 调至6 8 ，7 2 ，7 6 ，8 0 ，8 4 进行水解， 其他条件相同。 如图2 2 所示，碱性蛋白酶的活性随着水解液p h 的升高而增大，在p h 7 6 左 右的情况下水解效果最好，使水解度达到最大值。因此，选择水解初始的最适p h 值为7 6 。 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 3 5 3 0 2 5 o 2 0 1 5 6 6 46 87 27 688 48 8 水解起始p h 值 图2 - 2 水解p h 与水解度的关系曲线 f i 9 2 , - 2t h e e f f e c to fp ho nh y d r o l y s i sd e g r e e 如图2 2 所示，碱性蛋白酶的活性随着水解液p h 的升高而增大，在p h 7 6 左 右的情况下水解效果最好，使水解度达到最大值。因此，选择水解初始的最适p h 值为7 6 。 2 3 6 不同料液比的影响 匀浆后的蝇蛆与蒸馏水分别在料液比( g m l ) 为1 ：3 ，1 ：4 ，1 ：5 ，1 ：6 ，1 ：7 的条 件下进行水解，其他条件相同。 1 52 71 3 3 7 料液比 图2 - 3 水解p h 与水解度的关系曲线 f i g 2 3e f f e c to fp h o nh y d r o l y s j sd e g r e e 如图2 3 所示，反应起始时，随着随料液比的增加，水解液中d h 增加，而当 料液比达1 6 时，反应速度达到最大。之后随着料液比的增加，水解液中d h 出现 下降趋势。综合考虑，确定碱性蛋白酶的最佳料液比为1 6 。 钙 弱 如 巧0 零 i o 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 2 3 7 不同酶与底物比的影响 分别在酶与底物比( g g ) 为0 3 5 ，o 7 ，1 4 ，2 8 ，4 9 的条件下进行 水解，其他条件相同。 6 0 5 0 g4 0 z 凸3 0 2 0 o1234 56 酶与底物比( ) 图2 - 4 酶与底物比与水解度的关系曲线 f i g 2 - 4e f f e c to fe so nh y d r o l y s i sd e g r e e 如图2 4 所示，水解液中d h 随着e s 的增加而增加