（食品科学与工程专业论文）桑叶DNJ和多糖的提取分离及活性研究.pdf

桑叶d n j 和多糖的提取分离工艺及其活性研究 摘要 本论文研究了以桑叶为原料，水为溶剂，从桑叶中提取1 脱氧野尻霉素 ( d n j ) 和多糖，并对提取物进行纯化和降血糖功能性验证。 1 d n j 和多糖测定方法的研究。d n j 的测定方法为：以w a g e r 试剂为显 色剂，用紫外分光光度计扫描检测，得出其最佳吸收波长为2 8 4 n m 。多糖的 测定方法为：以葸酮一硫酸为显色剂，用紫外分光光度计在6 2 0 n m 处扫描检 测。 2 热水提取d n j 和多糖工艺的研究。实验表明d n j 的最佳提取工艺为： 料液比1 ：3 0 、物料粒径6 0 目、温度7 0 ，时间3 h ，d n j 的得率为0 0 8 8 ， 固形物中d n j 纯度为2 1 3 ；多糖最佳提取工艺为：固液比1 ：4 0 ，物料粒 径6 0 目，温度8 0 ，时间2 5h ，多糖的得率为2 2 7 ，固形物中多糖纯度 为2 8 7 。 3 超声波提取d n j 和多糖工艺的研究。在热水提取的基础上对桑叶追加 超声波强化处理，得出d n j 的最佳提取工艺为：超声功率1 2 5 w ，料液比 1 ：4 0 ，温度7 0 ，超声时间2 0 m i n ，d n j 的得率为0 0 9 2 ，固形物中d n j 纯度为2 7 4 ；多糖的最佳提取条件为：料液比1 ：3 0 ，温度8 0 ，超声功 率1 2 5 w ，超声时间4 0 m i n ，多糖的得率为2 5 2 ，固形物中多糖纯度为 3 6 6 。 4 不同季节的桑叶中d n j 和多糖的含量考察。实验结果表明：d n j 的 含量与生长的季节有关，3 5 月份的含量较低，6 月份逐渐增高，8 月份最高， 9 、1 0 月份又逐渐降低，说明d n j 的含量与气候有关，桑叶中d n j 的含量 可能是温度越高，含量越大；多糖的含量是随着月份的推移而增高的，1 1 月份的桑叶多糖含量较高。 5 大孔树脂吸附法纯化d n j 的研究。实验结果表明：纯化d n j 的最佳 工艺为：以d x a ，6 树脂装柱、p i l l 0 、原液浓度0 3 5 2 m g m l 、流速2 0 b v h 条件下吸附，8 0 乙醇溶液以2 5 b v h 的流速洗脱，解析率可达到8 5 5 。 通过纯化d n j 的纯度由2 1 3 增加到6 1 6 。 6 大孔树脂吸附法纯化多糖的研究。试验结果表明：纯化多糖的最佳 工艺为：以d x a 6 树脂装柱、p h 5 、原液浓度o 7 0 6 m g m l 流速2 0 b v h 条 件下吸附，以蒸馏水作为洗脱剂，2 0 b v h 的流速沈脱，解析率可达8 3 2 ， 多糖纯度由2 7 4 增加到7 1 3 。 7 桑叶提取液和多糖的降血糖活性的研究。实验以昆明种小鼠为试验对 象，采用四氧嘧啶造模，灌胃实验所得的桑叶提取液和桑叶多糖。结果表明： 桑叶提取液与多糖能有效降低糖尿病小鼠的血糖。 关键词：桑叶，d n j ，多糖，超声波，大孔树脂，降血糖活性 u s t u d yo n t h ea c t i v i t ya n de x t r a c t i o n o fd n ja n dp o l y s a c c h a r i d es f r o mm u l be r r yl e a v es a bs t r a c t t h e a c t i v i t y a n de x t r a c t i o no f 1 d e o x y n o ji r i m y c i n ( d n j )a n d p o l y s a c c h a r i d ef r o mm u l b e r r yl e a v e sw e r es t u d i e d t h em a i nc o n t e n t si n c l u d e t h ef o l l o w i n gs e v e na s p e c t s 1 t e s to fd n ja n dp o l y s a c c h a r i d e a p p l y i n gw a g e ra sc o l o r a t i o nl i q u i da n d t h es c a n n i n gi tu n d e ru vl i g h t ，t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h eo p t i m u ma b s o r p t i o n w a v e l e n g t hw a s2 8 4 n m p o l y s a c c h a r i d ew a st e s t e db ys u l f u r i ca c i de n t h r o n e m e t h o da n dt e s t e da t6 2 0 n mb yi ms i b l es p e c t r o p h o t o m e t e r s 2 e x t r a c t i o nd n ja n dp o l y s a c c h a r i d ew i t hh o tw a t e rf o r mm u l b e r r yl e a v e s t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h eo p t i m u mp a r a m e t e r so fe x t r a c t i o no fd n jw e r e ：s o l i d t ol i q u i dr a t i o1 ：3 0 ，s m a s hs t a t e6 0m e s h ，t e m p e r a t u r e7 0 a n de x t r a c t i n g2 5 h a c c o r d i n gt ot h ea n a l y s i so fe x t r a c t ，t h ey i e l do fd n jw a s0 0 8 8 ，t h ea m o u n to f d n jr e a c h e dt o21 3 t h eo p t i m u mp a r a m e t e r so fe x t r a c t i o no fp o l y s a c c h a r i d e w e r e ：s o l i dt o l i q u i d r a t i o1 ：4 0 ，s m a s hs t a t e6 0m e s h ，t e m p e r a t u r e8 0 ，e x t r a c t i n g2 5 h a c c o r d i n g t ot h e a n a l y s i s o fe x t r a c t ，t h e y i e l d o f p o l y s a c c h a r i d ew a s2 2 7 ，t h ea m o u n to f p o l y s a c c h a r i d er e a c h e dt o2 8 7 3 a nu l t r a s o n i c a s s i s t e de x t r a c t i o nm e t h o dw a ss t u d i e df o rt h ee x t r a c t i o no f d n ja n dp o l y s a c c h a r i d e t h eo p t i m u mp a r a m e t e r so fd n jw e r ea c h i e v e dw i t h t h eu l t r a s o n i cp o w e ro f12 5w ：s o l i dt ow a t e rr a t i o1 ：4 0 ，t e m p e r a t u r e7 0 ，a n d t h ee x t r a c t i o nt i m e2 0m i n t h ey i e l do fd n jw a so 0 9 2 a n dt h ep u r i t yo fd n j w a s2 7 4 a tt h e o p t i m u mp a r a m e t e r s t h eo p t i m u mp a r a m e t e r s o f p o l y s a c c h a r i d e sw e r ea c h i e v e dw i t ht h eu l t r a s o n i cp o w e ro fl2 5w ：s o l i dt o w a t e rr a t i ol ：4 0 ，t e m p e r a t u r e 8 0 ，a n dt h ee x t r a c t i o nt i m e4 0m i n t h ey i e l do f p o l y s a c c h a r i d e sw a s2 5 2 ，a n dt h ep u r i t yo fd n jw a s3 6 6 a tt h eo p t i m u m p a r a m e t e r s 4 s t u d yo nt h ec o n t e n to fd n ja n dp o l y s a c c h a r i d ei nm u l b e r r yl c a v ei n d i f f e r e n ts e a s o n s t h ef i n d i n g ss h o w e dt h a tt h ec o n t e n to fd n ji nm u l b e r r y l e a v e sv a r i e dw i t hs e a s o n s t h ec o n t e n tw a sl o w e rf r o mm a t c ht om a y ；f r o m j u n eo ni ti n c r e a s e ds l o w l y , r e a c h i n gt h eh i g h e s ti na u g u s t ；i td e c r e a s ei n i i i s e p t e m b e ra n do c t o b e r , w h i c hm e a n t t h a tt h ec o n t e n to fd n ji nm u l b e r r y1 e a v e s i sr e l a t e dt oc l i m a t ea n dt e m p e r a t u r ea n dt h a tt h ec o n t e n to fd n ji nm u l b e r r y l e a v e sw a sv a r i e dw i t hs e a s o n s t h ep o l y s a c c h a r i d ec o n t e n ti nm u l b e r r y1 e a v e si s v a r i e dw i t hs e a s o n st o o i t sc o n t e n ti n c r e a s e dw h e nt h et i m eg o e so n t h e h i g h e s tc o n t e n to fp o l y s a c c h a r i d e si nm u l b e r r y1 e a v e si nn o v e m b e r 5 t h ep u r i f i c a t i o no fd n jw i t hm a c r op o r o u sr e s i n t h er e s u l ts h o w e dt h a t t h e o p t i m u mp a r a m e t e r s w a s d x a 一6r e s i nl o a d e d c o l u m n ，p i l l0 ，研叮 c o n c e n t r a t i o no 3 5 2 m g m l ，a d s o r p t i o nv e l o c i t yo ff l o w2 o b v h ，8 0 e t h a n o l a n dd e s o r p t i o nv e l o c i t yo ff l o w2 o b v h t h ep u r i t yo fd n jw a si n c r e a s e df r o m 2 1 3 t o6 3 6 6 t h ep u r i f i c a t i o no fp o l y s a c c h a r i d e sw i t hm a c r o p o r o u sr e s i n t h er e s u l t s h o w e dt h a tt h eo p t i m u mp a r a m e t e r sw a s ：d x a - 6r e s i nl o a d e dc o l u m n ，p h 5 ， p o l y s a c c h a r i d ec o n c e n t r a t i o no 7 0 6 m g m l ，a d s o r p t i o nv e l o c i t yo ff l o w2 0 b v h ，w a t e ra n dd e s o r p t i o nv e l o c i t yo ff l o w2 o b v h t h ep u r i t yo fp o l y s a c c h a r i d e w a si n c r e a s e df r o m2 7 4 t o71 3 7 t e s ta n dv e r i f yt h eh y p o g l y c e m i ca c t i v i t yo fm u l b e r r yl e a v e s w ei n j e c t e d a l l o x a nt ot h ek u nm i n gm i c ea n dm a d et h e yb e c o m ed i a b e t e sm i c e t h e nw e g a v a g e dt h ee t x t r a c ta n dp o l y s a c c h a r i d e sf r o mm u l b e r r yl e a v e st ot h ed i a b e t e s m i c e t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h ee x t r a c ta n dp o l y s a c c h a r i d e sf r o mm u l b e r r y l e a v e sw a sa b l et or e d u c et h ed i a b e t i cm i c e sb l o o dg l u c o s el e v e l s k e yw o r d s ：m u l b e r r yl e a v e s ，d n j ，p o l y s a c c h a r i d e ，u l t r a s o n i c ，m a c r o p o r o u s r e s i n ，h y p o g l y c e m i ca c t i v i t y i v 桑叶d n j 和多糖的提取分离及活性研究 原创性声明及关于学位论文使用授权的声明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究做出 重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：缸至亟 日 期： 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解陕西科技大学有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权陕西科技大学可以将本学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：么乙播师签名：靼日期： 桑叶d n j 和多糖的提取分离及活性研究 1 绪论 桑叶，是桑科桑属植物桑树( m o r u s a l b al ) 的叶子，是一味传统的中药，也是国 家卫生部公布的药食兼用功能食品原料之一，分布于中国大部分地区，以江苏、四川、 浙江等地方产量较大l l j 。桑叶的药用首载于神农本草经。据神农本草经中品桑 根白皮中记载：桑叶，主除寒热、出汗。汁，解蜈蚣毒。 本草经疏载：“桑叶 味甘气寒性无毒，下气而益阴，又能除脚气水肿，利大小肠，除风。经霜则兼得天地之 清肃，故又得能明目而止渴；又能益血长发，凉血止吐血。本草纲目载：“时珍 日：桑叶乃手、足阳明之药。汗煎代茗，能止清渴。治老热咳嗽，明目长发。 现代中 医认为：桑叶生品长于疏散风热，清肝明目。常用于感冒风热，发热头昏，头疼，咳嗽， 咽喉肿痛及肝热目赤，涩痛，多泪。蜜桑叶其性偏润，多用于肺燥咳嗽，如用于外感燥 热和治疗温燥伤肺。现代科学表明，桑叶是上好的功能食品，它具有降压、降脂、抗衰 老、增加机体耐力、降低胆固醇、抑制血栓形成，抑制肠内有害细菌繁殖，抑制有害氧 化物形成，抑制癌症以及调节肾上腺素功能等功效，最突出的功能是缓解糖尿病。因此， 桑叶可以理解为含有生理和药理兼有活性成分的食品【2 j 。 有关专家分析指出：今后一段时期，研制开发桑叶保健食品具有广阔的市场。日本 科研人员认为1 3 j ，桑叶极有可能成为功能性食品原料。目前在日本已有桑叶面、含桑叶 的小甜饼上市，还设计将桑叶提取物作为糕点等食品的安全色素与强化剂【4 】。我国科研 人员及厂家积极合作研制开发桑叶保健品种及功能性饮料【5 j 。如桑叶速溶茶、桑叶八宝 茶、桑叶粉、桑叶晶、桑叶保健酒、桑叶口服液、桑叶珍珠粉蜜、桑叶可乐、桑叶花粉 蜜、桑叶汽水、桑叶面、桑叶糕点及桑叶膨化小食品等。从而增加了保健品和饮料的新 品种，解决了胃病和失眠症患者等不宜饮茶的问题，也满足了不同消费层次的需要。尤 其对中老年人及不宜饮茶的人提供了一种新型饮品，使其在饮茶过程中得到一定保健效 果。有利于养神保健，延年益寿。当前随着科技的进步，采用新技术改造并挖掘桑叶资 源的潜力已成为今后发展的趋势：桑叶作为食品、药品、化妆品的原料，进行对其有效 成分的分析提纯萃取是今后发展的重点，特别是对治疗糖尿病、高血压、癌症与艾滋病 的研究也成为热点。 现代医学对桑叶的成分进行了系统的研究【6 】，进一步证明了桑叶的药用与保健价值。 据专家分析检测，桑叶中含有蛋白质、脂肪、氨基酸、多糖、生物碱、多酚类、黄酮类、 胆酸、有机酸、叶酸、异槲皮素甙、多种维生素以及钙、磷、铁、锰等微量元素。中国 农业科学院蚕业研究所对桑叶的营养即保健作用研究表明：桑叶中含有水分7 5 2 2 、粗 碳水化合物1 6 9 2 ，这些成分有消除脚气、水肿，抑制盗汗以及减肥的功效。浙江医科 大药理实验室研究表明：桑叶具有稳定神经系统的功能作用，能减少或消除沉淀在肌肤 陕西科技大学硕士学位论文 或内脏中的脂褐质，从而改善肌体的功能。 1 1 桑叶的化学成分 1 1 1 桑叶蛋白质和氨基酸 桑叶含有具有较高的含氮量和粗蛋白量，其含氮量为3 3 4 3 ，粗蛋白约为 2 0 2 7 。桑叶中富含人体所需的1 8 种氨基酸，即亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙 氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、组氨酸、谷氨酸、门冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、脯氨 酸、丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、胱氨酸、蛋氨酸，其中前8 种是人体必需氨基酸。日本 野田信三【7 1 ，张传惠【8 j 分别对干桑叶和新鲜桑叶中氨基酸含量进行了测定。结果表明降 血压物质r - 氨基丁酸( g a b a ) 的含量达到2 2 6 m g 1 0 0 9 干叶。r - 氨基丁酸( g a b a ) ，是一种 天然、可抑制性神经传递物质的活性成分 9 1 ，作为一种生理活性成分，参与了脑循环生 理活动，介导了中枢神经系统6 4 以上的抑制性神经传导。它能改善脑部的血液循环与 氧气供给、安定精神、促进长期记忆、改善神经细胞性老年呆痴、缓解脑血栓、脑动脉 硬化造成的头疼、耳鸣、降低血压、镇定神经、改善心律失常、改善和活化肾、肝功能。 g a b a 还具有降血压作用，其主要作用机制是作用于脊髓的血管运动中枢，有效促进血 管扩张，从而达到降低血压的目的。据报道，黄芪等中药的有效降压成分即为g a b a 。 最新的研究表明，g a b a 除具有降血压等作用外，还有精神安定，肾肌能和肝机能改善 作用，促进酒精代谢和高效减肥等活性，同时对脑血管障碍引起的症状，如偏瘫、记忆 障碍、儿童智力发育迟缓及精神幼稚症等也有很好的疗效i l o j 。目前g a b a 已经广泛地应 用于饮料、果酱、糕点、饼干、调味料等制品中。另外还有报道，应用生物技术制造的 高g a b a 饮料以及利用乳酸菌等制作的富含g a b a 的食品配料j ，均可直接作为或者 用于抗高血压、增进脑机能及肝功能的功能食品。 1 1 2 桑叶维生素 桑叶富含多种维生素，其含量不逊于鲜茶。野田信三等【7 】测定桑业桑叶中维生素含 量为视黄醛0 6 7 m g 1 0 0 9 、胡萝卜素0 6 7 m 1 0 0 9 、v b l 0 5 9 m g 1 0 0 9 、v b 2 0 5 9 m g 1 0 0 9 、 v p p l 3 5 m g l o o g 、v c 3 1 6 m g l o o g 。张传蕙【8 】对新鲜桑叶中的维生素c 含量进行了测定， 结果为每1 0 0 9 鲜桑叶含维生素c 6 5 m g 。 1 1 3 桑叶黄酮类 桑叶中黄酮类物质占0 1 0 3 ，最近，k i m 等【l2 j 从桑叶中分离到几种黄酮，分别 为堪非醇3 氧b 。d 吡喃葡萄糖苷( 紫云英苷) 、堪非醇3 氧( 6 ”氧乙酰基) d 吡哺葡 萄糖苷、槲皮素3 氧p d 毗喃葡萄糖苷( 芦丁) 、槲皮素3 氧一b d 吡喃葡萄糖苷、槲皮 素3 氧ad 毗喃葡萄糖基1 3 l 鼠李毗喃糖基p d 吡喃葡糖苷、槲皮素3 氧p d 吡喃葡 萄糖苷、槲皮素一3 ，7 二氧p d 吡喃葡萄糖苷和槲皮素。金丰秋 1 3 1 报道，每1 0 0 m g 干 桑叶中含异槲皮苷2 0 0 5 0 0 m g ，槲皮苷3 0 m g ，槲皮苦素1 0 0 m g 。黄酮类物质具有抗癌 2 桑叶d n j 和多糖的提取分离及活性研究 特性，它们的抗氧化特性以及吸收紫外线的能力、使得黄酮雷在癌变的各个阶段发挥作 用：d n a 损伤( 起使阶段) 、肿瘤生长( 生长阶段) 和细胞扩散( 增值阶段) 。具有治疗 心血管疾病的作用【l4 1 ，现代许多治疗这类疾病的药物都是基于黄酮类物质，如橙皮苷和 芦丁。 1 1 4 桑叶生物碱 生物碱是一类含氮化合物的总称，存在于生物体内( 主要是植物) ，结构复杂，具 有生理活性的含氮碱性物质。1 8 1 9 年，w w e i s s n e r 把植物中的碱性化合物统称为类碱 ( a l l i 1 i k e ) 或生物碱( a l k a l o i d s ) ，生物碱一名沿用至今。桑叶中含有丰富的生物碱，其中 1 脱氧野高尻霉素( d n j ) 是一种非常重要的生物碱，属于哌啶生物碱，其化学名称是3 ， 4 ，5 三羟基2 羟甲基四氢吡啶，是1 d e o x y n q i i r i m y c i n 的缩写。d n j 的化学分子式为 c 6 h 1 3 n 0 4 ，分子量为1 6 3 。d n j 首先由m y a g ii n 5 j 等从桑根皮中分离得到并定名为 “m o r a n o l i n e ”。这是d n j 作为天然产物首先被分离。y o s h i a k iy o s h i k u n ib 6 】从桑中分离出 了d n j 。a s a n o 【1 4 】等通过改变d n j 的提取和纯化条件，从桑叶中分离出多种多羟基生 物碱，包括d n j 、n 甲基d n j 、2 氧a - d 半乳吡喃糖苷1 d n j 、f a g o m i n e 、1 ，4 二脱 氧一1 ，4 亚氨基d - 5 可拉伯糖醇、1 ，4 二脱氧1 ，4 亚氨基( 2 氧吡喃葡萄糖糖苷) d 阿拉伯糖醇和1 a ，2 d ，3 a ，4 p 四羟基去甲莨烷等七种生物碱。 h o 【) h 图1 - 11 脱氧野尻霉素的结构式 f i g 1 - 1 t h es t r u c t u r eo f1 - d e o x y n o j i r i m y c i n 1 1 5 桑叶多糖 赵骏等【1 7 1 采用水提法提取桑叶中的多糖物质，产量为2 5 8 9 4 9 1 0 0 9 桑叶。张传剥8 】 等用制备法测定鲜桑叶的多糖含量，达到2 5 5 ，并对其化学成分进行了定性测定。 1 1 6 桑叶甾醇 对桑叶所甾醇进行研究，发现1 0 0 9 桑叶中有谷甾醇4 6 m g 、豆甾醇3 m g ，其谷甾醇 含量比绿茶( 每1 0 0 9 含甾醇1 3 m g ) 高3 - 4 倍。随着科技的进步，采用新技术改造、挖 掘桑叶资源的潜力已成为今后发展的趋势：桑蚕作为食品、药品、化妆品等原料，对其 有效成分进行分析、提纯和萃取将是今后发展的重点陋19 1 ，特别是治疗糖尿病、高血压、 陕西科技大学硕士学位论文 癌症与爱滋病的研究也将成为研究热点。 1 2 桑叶中的生物碱的研究现状 桑叶中的生物碱主要是1 脱氧野尻霉素( 1 一d e o x y n o j i r i m y c i n ，d n j ) 【2 0 。2 1 1 ，属于哌 啶生物碱，其化学名称为3 ，4 ，5 三羟基2 2 羟甲基四氢吡啶，分子是为c 6 h 1 3 n 0 4 。野 尻霉素首先由i n o u e 等作为抗生素从链霉菌中得到，d n j 是由野尻霉素氢化得到的。d n j 的来源有两大类：植物来源和微生物来源。含d n j 的植物有桑叶及桑根、野跖草 ( c o m m e l i n ac o m m u n i s ) ，风信子( h y a c i n t h u so r i e n t a l i s ) ，沙参属植物( a d e n o p h o r a t r i p h y l l a v a r j a p o n i a ) ，爵床科植物( j a c o b i n i as u b e r e c t ) 。含d n j 的微生物包括浅紫灰链霉素 g c 14 8 ( s t r e p t o m y c e sl a v e n d u l a eg c - 14 8 ) 和芽孢杆菌( b a c i l l u s ) 。y o s h i a k i 从桑中分离出 d n j t 2 2 1 。桑叶中含量为o 1 1 f 8 】，桑根中含o 1 4 。h a n gs u bk i m 等从野跖草中分离并 鉴定出d n j ，其中d n j 的含量为0 0 1 1 2 5 【2 3 j 。a s a n o 等从风信子鳞茎的甲醇提取物中 分离到d n j ，含量为0 0 0 1 2 t 2 4 1 。同时也有关于在沙参属植物【2 5 1 、爵床科植物、浅紫灰 链霉菌中分离出d n j 的报道。 1 2 1 桑叶中d n j 的提取方法 近年来，国内外对桑叶的研究日趋深入，但多见于药理，对其生物碱的提取分离及 纯化工艺报道甚少，仅欧阳臻【2 6 】对不同季节桑叶中1 脱氧野尻霉素( d n j ) 含量的测定 和胡军瑞【27 1 报道用微波萃取法提取d n j 的报道。尽管关于桑叶中生物碱的提取纯化工艺 的文献很少，但根据生物碱的一般提取方法和d n j 的特性，可采用溶剂法进行提取，其 在溶剂中的溶解度符合“相似相溶”原理。 ( 1 ) 传统的提取方法有【2 引 浸渍法：浸渍法是将处理过的药材用适当的溶剂在常温或温热的情况下浸渍以溶 出其中成分，该法一般在常温下进行，有利于热敏性物质的提取。其缺点是耗时长、效 率低，若用水做溶剂时易霉变。 渗漏法：渗漏法是不断往药材粗粉中添加溶剂使其渗过粗粉，从渗漏筒下端流出 浸液的方法。此方法浸出效果优于浸渍法，适用于有效成分含量低或贵重药材的提取。 其缺点是耗时长，用溶剂量大，操作麻烦。 煎煮法：煎煮法是将中药粗粉中加溶剂加热或煮沸，将中药成分提取出来的方法。 此方法的优点是操作简便，药品中大部分成分可被不同程度的提出，但挥发性和热敏性 有效成分不宜采用。 热回流法：热回流法是通过溶剂的蒸发与回流，使得每次与原料接触的溶剂都是 纯溶剂，从而大大提高萃取动力，达到提高萃取速度和效率的目的。其缺点是提取效率 低，热敏性成分不宜采用此方法。 连续回流法：连续回流法是利用索氏提取器，多次提取生物碱，可以反复利用溶 4 桑叶d n j 和多糖的提取分离及活性研究 剂。其优点是提取效率高，操作方便，但提取液受热时间较长，所以热敏性成分不宜采 用。 ( 2 ) 新技术的采用 微波提取法( m i c r o w a v ea s s i s t e de x t r a c t i o n ) 1 2 9 微波辐射过程是采用高频电磁波穿透溶剂，达到物料内部，物料吸收微波能，细胞 内部的压力超过细胞壁的膨胀承受能力，导致细胞破裂，胞内有效成分自由流出，在较 低温度下被溶剂捕获并溶解。另外，微波所产生的电磁场加速了被提取组分趋向溶剂界 面的扩散速率，缩短有效成分的分子有物料内部扩散到界面的时间，使得浸提速率加倍， 同时还降低了浸提温度，最大限度的保证浸提的质量。微波可以对体系中的一种或几种 组分选择性加热，故而可以使目标组分直接从基本上分离。微波法比传统浸提技术相比， 具有选择性好、萃取速度快、产品质量好，在实际生产中有安全节能的潜力。但是微波 法只是用于对热稳定的物质。 超声提取法( u l t r a s o n i ce x t r a c t i o n ) 3 0 】 超声波技术辅助提取的原理是利用超声波的空化作用使得生物细胞壁乃至整个生物 体破裂，由超声波产生的振动作用加强胞内物质的释放、扩散及溶解，从而将有效成分 提取出来。超声波最大的优点是简单快速、提取率高、低温提取，有利于有效成分的质 量保护。超声波提取是一个物理过程，在整个提取过程中无化学反应，对大多数有无有 效成分份生理活性不影响，且有效成分含量高，有利于进一步精制。 酶法【3 l j 酶法是应用纤维素酶、果胶酶等作用于植物材料，使细胞质及细胞壁中的纤维素、 果胶等物质降解，减小有效成分从细胞内想提取介质扩散的传质阻力，促进有效成分的 提取。酶法是一种无需特殊设备，完全适用于工业化生产的很有前途的新技术。但酶的 浓度、底物浓度、温度、酸碱度、抑制剂和催动剂对提取物的影响，有待于进一步的研 究。 超临界萃取技术( s u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n ，s f e ) 3 2 】 超临界萃取技术是以超临界流体为萃取剂，从中药材中萃取有效成分。由于流体在 超临界状态下兼有气液两相的双重特点，既有与气体相当的高扩散系数和低的黏度，又 有具有与液体相近的密度和对物质良好的溶解能力，这种溶解能力对体系压力与温度的 变化十分敏感，从而可以通过改变体系的压力和温度来调节组分的溶解度。超临界萃取 技术最大的优点可在近常温条件下提取分离不同极性不同沸点的化合物，几乎保留药材 红所有的有效成分，没有有机溶剂的残留。超临界萃取技术萃取的产品纯度高、提取率 高，且操作简单，节约能源。但高压技术和夹带剂的选择尚待进一步的研究。 陕两科技大学硕十学位论文 1 2 2 桑叶中d n j 的纯化方法 一般提取得到的生物碱粗提取液中，除了含有生物碱及其盐类以外，还会有大量的 脂溶性、水溶性的杂质，所以必须对其进行分离纯化。随着近年来研究的不断深入，许 多新技术已应用于生物碱的分离纯化工艺当中。 溶剂萃取法【3 3 1 有机溶剂萃取法适用于“相似相溶”原理。用于有机溶剂提取液时，减压回收溶剂，用 酸水溶解，并将不溶性杂质去除，再将溶液碱化，最后用有机溶剂进行萃取。有机溶剂 萃取技术是提取分离的经典技术，具有简单、快速的优点，但分离效率低、纯度小，溶 剂易污染环境，操作安全性差。 离子交换树脂法【3 4 】 离子交换树脂是通过静电吸引力和范德华力达到分离和纯化的目的。生物碱的纯化 多用阳离子交换树脂，其优点是设备简单、操作方便，生产连续化程度高，所得产品纯 度高，且成本较低，所以离子交换树脂在天然有效物质的分离纯化中得到广泛的应用。 大孔树脂吸附法【3 5 】 大孔吸附树脂在抗生素、氨基酸、维生素、蛋白质提纯以及生物制药等方面早已得 到应用。大孔树脂的吸附力是范德华力或氢键产生的结果，所以具有稳定性高、吸附选 择独特，再生简便、解析条件温和、使用周期长、宜于构成闭路循环、节约费用和流体 阻力小等优点。大孔树脂在天然产物分离纯化中有着广泛的前景，尤其是在水溶性成分 的分离中，显示出着越来越重要的作用。 超滤法【3 6 】 超滤十一膜为过滤介质，依靠一定的压力和流速，通过膜的筛分作用，在分子水平 上进行分离，迫使大分子杂质被截留，小分子的物质通过。超滤法的优点在于不耗费溶 剂，操作简单，生物碱损失小，纯化工序少。此方法近年来正逐渐地被用于中药成分的 分离、纯化、精制。 高速逆流色谱法【3 7 1 高速逆流色谱法技术是一种较新型的液液分配技术，其原理是基于组分在旋转螺族 管内的相对移动而互不混溶的两相溶剂问分部不同而获得分离。高速逆流色谱仪依靠聚 四氟乙烯蛇形管的方向性以及特定的高速行星式旋转所产生的离心力场作用，使无载体 支持的固定相稳定地保留在蛇形管内，并使流动相单相低速通过固定相，实现连续逆流 萃取法令物质分离的目的。最近研究表明，利用高速逆流色谱仪可以一次进样几十毫升， 可以一次分离近1 0 9 的样品，而且不需升温加热，也不需要精密的恒流泵。 1 2 3 桑叶d n j 及其衍生物的药理作用 ( 1 ) d n j 及其衍生物对病毒活性的抑制作用3 8 。9 1 6 桑叶d n j 和多糖的提取分离及活性研究 经f n j 对莫洛尼鼠白血病毒( m o lv ) 的抑制试验证明，d n j 具有显著地抗逆转录 酶病毒活性。其i c 5 0 为1 2 1 5 | lg m l ，且随着d n j 剂量的增大其抑制力增强【删。引起 艾滋病的h i v 1 病毒具有两个富含糖基化的环合蛋白g p l 2 0 ，g p l 4 0 ，其作用是介导病毒 与细胞表面受体分子接触并引起细胞融合形成和体细胞d n j 可以抑制这种酶，从而改变 h i v 在c d 4 + 培养细胞的感染力。在d n j 的衍生物中，n 甲基1 1 脱氧野尻霉素和n 丁 基1 1 脱氧野尻霉素对糖蛋白均有较强的抑制作用，通过改变g p l 2 0 的糖基化，n 甲基 1 1 脱氧野尻霉素可以阻断h i v 1 诱导的合体细胞的形成。 ( 2 ) d n j 及其衍生物的降血糖作用郴】 迄今为止；人们对桑叶降血糖作用机理的研究是从两方面展开的：一方面是从桑叶 成分对二糖类分解酶活性的抑制作用研究，另一方面从桑叶成分促进胰岛1 3 细胞分泌胰 岛素方面入手，综述了近年来研究人员对桑叶降血糖作用方面的研究进展【4 3 1 。研究结果 表明：桑叶的有效成分d n j 和桑叶甲醇提取物共存时，蔗糖吸收会受到抑制，显示桑叶 甲醇提取物对二糖类分解酶活性具有抑制作用；桑叶水提取物降低大鼠外周静脉血糖含 量，显示桑叶水提取物可抑制麦芽糖酶和乳糖酶的活性；桑叶粉对大鼠食后血糖升高有 明显的抑制作用；桑叶生物碱( d n j ) 降血糖作用机理有两种：一是抑制了a 糖苷酶活 性，二是促进胰岛素释放。生物碱( f a g o m i n e ) 可显著增加葡萄糖引起的胰岛素含量增加， 从而降低糖尿病小鼠的血糖。 研究表明桑叶的降血糖作用是通过两个途径实验的：一、通过桑叶生物碱d n j 对 二糖类分解酶活性产生抑制作用，从而抑制小肠对双糖的吸收，降低食后血糖的高峰值； 二、桑叶生物碱f a g o m i n e 及桑叶多糖促进：1 3 细胞分泌胰岛素，而胰岛素可以促进细胞 对糖的利用。肝糖原合成以及改善糖代谢，最终达到降血糖的效果如图l 一1 所示。 葡萄糖苷酶参与多种生物过程，如碳水化合物的消化，糖蛋白的生物合成等。d n j 是所有哺乳动物a 一糖苷酶的有效的抑制剂，它能通过降低碳水化合物的消化和葡萄糖的 吸收来降低食后高血糖。由于这一特性，d n j 可用于治疗糖尿病及糖尿病并发症，肥胖 症和相关的机能紊乱。 ( 3 ) d n j 对肿瘤转移的抑制作用【州8 】 t s u t o m ut s u r u o k a 等以小鼠1 3 1 6 肺黑色细胞肿瘤为模型，研究了与野尻霉素a 相 关的衍生物及其类似物的抗肿瘤转移活性，指出d n j 是野尻霉素的结构类似物，它对肿 瘤转移的抑制率是8 0 5 。d n j 抗肿瘤的机理可能是：d n j 通过抑制糖苷酶的活性在肿瘤 细胞表面产生未成熟的碳水化合物链，削弱了肿瘤的转移能力。这些表面活性发生改变 的肿瘤细胞被寄主免疫系统攻击而使这些肿瘤细胞不能结合到寄主细胞上。但其详细的 作用机理尚不清楚，有待于迸一步的研究。 总之，作为0 【糖苷酶的抑制剂，d n j 的多种功能在医学中的应用提供了一定的理论 7 陕两科技大学硕士学位论文 依据。但是由于d n j 在各种生物体中的含量非常低，所以怎样获得更多的天然d n j 成 为以后开发研究的一个重要方向。 1 3 桑叶中的多糖的研究现状 多糖【4 9 1 ( p o l y s a c c h a r i d e s ) ，是指由醛糖或酮糖通过糖苷键例相连接的一类天然大分 子聚合物。它来源广泛，可从高等植物、动物、微生物、地衣和海藻中【5 l 】获得。世界各 国十分重视糖类的研究。其中以日本、美国、德国、俄罗斯等国处于领先地位。日本学 者在常规化学方法的基础上，大量引进现代分子生物学技术，加强了对中药多糖活性决 定性的化学结构与功能关系的研究，在柴胡、当归等中药的研究方面有了一定的突破。 1 9 8 9 年日本创刊了糖科学与糖工程动态杂志，1 9 9 1 年实施“糖工程前沿计划”。我国 对多糖的研究起步比较晚，但在研究糖类的作用机理时，紧密与中医药理论相结合，进 展甚快。近2 0 年来，我国已分别从灵芝、黑木耳、茯苓、金针菇、魔芋、山药、芦荟、 香菇、银杏、人参、黄芪、枸杞、柴胡、当归、冬虫夏草、地黄等中分离出活性多糖。 然而与国外相比，我国对多糖的研究仍有一定的差距，积累的临床资料仍很缺乏，大部 分多糖尚处于实验阶段，因此有必要开展多糖的分离纯化、生物活性、化学组成和结构 分析等方面的研究工作，并对其进行化学修饰，研究多糖构效关系，寻找活性高，特别 是对肿瘤、艾滋病有疗效的多糖。 1 3 1 桑叶中多糖的提取方法 多糖是极性大分子化合物，大多采用不同温度的水、稀碱溶液提取，应尽量避免在 酸性条件下提取，以防引起糖苷键的断裂，降低得率。若用稀酸提取时，时宜短、温度 不宜超过5 0 c 。由于水提浴提取具有耗时长、效率低的缺点，而酸碱提取易破坏多糖的 立体结构及活性，现在有人采用酶法提取多糖，即采用复合酶热水浸提相结合的方法。 复合酶多用一定比例的果胶酶、纤维素酶及中性蛋白酶。此法具有条件温和、杂质易除 和提高得率等优点。 1 3 2 多糖的纯化及纯度测定 一般提取所得的多糖，含有蛋白质等杂质，故而需进行分离纯化。般首先利用多糖 难溶于有机溶剂的特性，用乙醇或丙酮进行反复沉淀洗涤，除去一部分醇溶性杂质，然 后用s e v a g e 法或三氟三氯乙烷法( 微生物多糖) 或三氯醋酸法( 植物多糖) 脱游离蛋白 质。小分子杂质的除去可以用透析法。除去这些杂质之后，可以采用部分沉淀法、金属 络合法、季铵盐沉淀法、甲醇分级沉淀法、离子交换柱层析法和制备性区域电泳等进行 纯化，但大多数采用d e a e 纤维素、d e a e 凝胶及其它凝胶柱层析法进行纯化，国外采 用l k b 柱层析系统。多糖的检测可用比旋度、示差折射及紫外检测等方法，也可以用苯 酚一硫酸法测定多糖。纯度的鉴定可以用超离心法、高压电泳法、凝胶过滤法、高效液相 法、示差折射法、紫外检测法等。 8 桑叶d n j 和多糖的提取分离及活性研究 1 3 3 多糖的药理作用 多糖作为药用t 5 3 1 始于四十年代。六十年代以后，多糖作为免疫促进剂5 2 1 而得到广泛 的应用。药用多糖能治疗多种免疫缺损疾病【5 4 1 ，如慢性病毒性肝炎网等，还具有治疗风 湿病【5 6 1 之类的自身免疫疾病及治疗使机体免疫系统受伤的癌症【5 7 l 的功效。现代研究表 明，多糖还具有抗肿瘤【5 8 】、抗感染例、抗消化性溃疡硎、降血糖血脂6 ，突出的抗病 毒活性6 2 1 。另外，多糖还可以诱导抗干扰素的产生【6 3 1 、促进核酸和蛋白质的生物合成【硎。 桑叶多糖中的主要降血糖成分是总多糖( t p m ) ，属n 糖化附c o n t a i n i n g