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微生物学基础知识和药物敏感性试验,主要内容,微生物简介细菌的特点和结构细菌的分类与命名临床常见病原菌介绍细菌感染与人体防御抗菌药物敏感性试验细菌的耐药机制,什么是微生物?,微生物是指一切肉眼看不到或看不清楚，需要借助显微镜观察的微小生物。微生物包括：原核微生物：如细菌真核微生物：如真菌、藻类和原虫无细胞生物：如病毒,病毒,细菌,真菌,微生物的相对大小,真核细胞型,原核细胞型,电子显微镜,微生物的相对大小,肉眼,光学显微镜,可见范围,病毒,0.5-2m,微生物和人类的关系,维持自然界生态平衡食品酿造医疗制药维持人体正常功能：肠道特定情况下，某些微生物可以导致疾病条件致病菌,主要内容,微生物简介细菌的特点和结构细菌的分类与命名临床常见病原菌介绍细菌感染与人体防御抗菌药物敏感性试验细菌的耐药机制,细菌的特点,单细胞原核生物（没有真正的细胞核）光学显微镜下可见具有细胞壁通过细胞分裂进行繁殖：二分裂大部分可在生物体外独立生存适应能力极强从寒冷的冰川到酷热的温泉，从极高的山顶到极深的海底。,鞭毛,菌毛,芽孢,荚膜,特殊构造,细胞壁,细胞膜,核质,一般构造,核糖体,细胞质,细菌的结构,细菌基本结构：细胞壁,细胞壁细胞壁是位于细菌细胞膜外的一层坚韧而有弹性的膜状结构功能：维持形态、保护细菌、物质交换主要成分(革兰阳性菌与革兰阴性菌结构不同）肽聚糖磷壁酸（革兰阳性菌）外膜（脂多糖，革兰阴性菌）内毒素,细胞壁的结构,革兰阳性菌,革兰阴性菌,肽聚糖层厚,肽聚糖层薄,细菌基本结构：细胞膜,细胞膜位于细胞壁内侧，包绕在细菌胞浆外的具有弹性的半渗透性脂质双层生物膜。主要由磷脂及蛋白质构成。功能：物质交换、生物合成,细菌基本结构：细胞质,细胞质细胞膜包裹的菌体内部，即细胞浆内有多种重要结构，如核糖体、质粒核糖体：细菌蛋白质合成的场所质粒：双股环状的DNA，为染色体之外的遗传物质,细菌基本结构：核质,核质细菌的遗传物质：染色体功能：控制细菌的各种遗传性状、生长、繁殖、遗传和变异。,细菌特殊结构,荚膜,鞭毛,菌毛,芽胞,主要内容,微生物简介细菌的特点和结构细菌的分类与命名临床常见的致病菌介绍细菌感染与人体防御抗菌药物敏感性试验细菌的耐药机制,细菌的分类与命名,生物系统分类：界门纲目科属种动物界脊索动物门哺乳纲灵长目人科人属智人种命名：拉丁文双名法大肠埃希菌：Escherichiacoli金黄色葡萄球菌：Staphylococcusaureus,种名,属名,种名,属名,种名,属名,种名,属名,细菌的分类与命名,细菌的分类根据形态根据染色特性分类根据形态+染色特性分类根据生长要求分类其它分类方法,根据形态分类,大肠埃希菌,葡萄球菌,肺炎链球菌,根据染色特性分类,革兰染色法是细菌学中应用最广泛的染色可将细菌分成两大类：阴性和阳性原理阳性菌细胞壁结构致密且脂类含量低，乙醇不易透入，不易脱色阳性菌内核糖核酸可与结晶紫、碘结合成大分子复合物，不易脱色。阳性菌所带阴电荷比较多，与阳电荷的结晶紫结合紧密，不易脱色。,革兰阳性(紫色),革兰阴性（红色）,革兰染色法的意义,鉴别细菌了解细菌的致病特征不同的细菌具有不同的结构特点致病机制及表现亦不同选择用药针对革兰阴性菌的药物针对革兰阳性菌的药物,根据生长要求分类（一）,专性需氧菌：具有完善的呼吸酶系统，只在有氧环境下生长；如结核杆菌、霍乱弧菌和炭疽芽胞杆菌等专性厌氧菌：缺乏呼吸酶系统，只能在无氧环境中进行发酵脆弱拟杆菌、消化链球菌兼性厌氧菌：兼有有氧呼吸和无氧发酵两种功能大多数病原菌属于此类,生长是否需要氧气参与？,根据生长要求分类（二）,苛养菌是一类生长需要特殊营养物质的细菌，分离培养较困难。流感嗜血杆菌：需要X、V因子、二氧化碳肺炎链球菌：需要羊血、二氧化碳溶血性链球菌：需要羊血比较娇嫩、对干燥、对寒冷的抵抗力均较弱。培养条件：510CO2、35培养、2448h呼吸道其他快生长细菌的覆盖使分离率非常低非苛养菌对营养要求不高，基础营养成分即可。,生长是否需要特殊营养物质？,流感嗜血杆菌的卫星现象,其它分类方法,根据某些特殊的酶如是否产凝固酶：凝固酶阳性金葡菌、凝固酶阴性葡萄球菌根据是否溶血如溶血性链球菌根据免疫血清型如肺炎链球菌有多种血清型根据代谢特点如不发酵糖的非发酵菌,主要内容,微生物简介细菌的特点和结构细菌的分类与命名临床常见病原菌介绍细菌感染与人体防御抗菌药物敏感性试验细菌的耐药机制,临床常见的病原菌,金黄色葡萄球菌,革兰阳性球菌：葡萄球菌属,金黄色葡萄球菌凝固酶阳性溶血凝固酶阴性葡萄球菌凝固酶阴性某些菌株溶血,表皮葡萄球菌,革兰阳性球菌：链球菌,-溶血性链球菌：又称草绿色链球菌菌落周围有1-2mm宽的草绿色溶血环，环内红细胞未溶解，血红蛋白变成绿色。肺炎链球菌-溶血性链球菌菌落周围形成一个2-4mm宽、界限分明、完全透明的无色溶血环，也称乙型溶血。化脓链球菌-溶血链球菌：不产生溶血素，菌落周围无溶血环，也称为丙型或不溶血性链球菌。,革兰阳性杆菌,炭疽芽胞杆菌（炭疽病）炭疽芽胞杆菌能产生毒力很强的外毒素，由三种毒性蛋白即保护性抗原、水肿因子及致病因子所组成的复合体。引起皮肤炭疽、肺炭疽和肠炭疽,革兰阴性球菌,脑膜炎奈瑟菌：又名脑膜炎球菌可引起脑膜炎淋病奈瑟菌：又名淋球菌可引起淋病、新生儿淋菌性眼结膜炎,流脑患者的皮肤出血性瘀斑,革兰阴性杆菌肠杆菌科,肠杆菌科：多数是肠道的正常菌群，某些情况下可成为致病菌。可引起腹腔感染、肺炎、尿路感染、菌血症等肠杆菌科细菌主要包括：埃希菌属：大肠埃希菌克雷伯菌属：肺炎克雷伯菌肠杆菌属：阴沟肠杆菌变形杆菌属：奇异变形杆菌沙雷菌属摩根菌属志贺菌属：痢疾志贺菌沙门菌属：伤寒沙门菌引起医院感染的重要病原菌,革兰阴性杆菌：非发酵菌,一大群不发酵葡萄糖或以氧化形式利用糖、需氧或兼性厌氧、无芽胞的革兰阴性杆菌。假单胞菌属：铜绿假单胞菌不动杆菌属：鲍曼不动杆菌单胞菌属：嗜麦芽窄食单胞菌黄杆菌属：产吲哚黄杆菌引起医院感染的重要病原菌,其它革兰阴性杆菌,嗜血杆菌属流感嗜血杆菌呼吸道感染引起急性中耳炎、社区获得性肺炎等疾病非典型病原体：军团菌属嗜肺军团菌引起军团菌肺炎,非典型病原体：支原体,支原体：肺炎支原体、解脲支原体支原体介于细菌和病毒之间，能独立生活的最小微生物。无细胞壁可引起呼吸道感染、生殖道感染。,非典型病原体：衣原体,衣原体：肺炎衣原体、沙眼衣原体专性胞内寄生革兰染色阴性的杆状菌具有特殊的发育周期(原体和网状体)可引起肺炎、沙眼和生殖道感染,厌氧菌,是一群专性厌氧，必须在无氧环境下才能生长繁殖的细菌。根据能否形成芽胞，可将厌氧菌分成两大类。厌氧芽胞梭菌属无芽胞厌氧菌厌氧芽胞梭菌属：破伤风梭菌、产气荚膜杆菌、肉毒梭菌、艰难梭菌无芽胞厌氧菌：拟杆菌属、梭杆菌属、丙酸杆菌属、消化链球菌属等,36,细菌的鉴定,表型分类法以细菌的形态、结构、生理、生化和血清学反应等细菌的表型为主要依据分子生物学技术基因诊断依据分析DNA的碱基组成，基因片段的大小，与比较DNA的同源性关系，从而分析细菌DNA的亲缘关系。,37,菌种鉴定鉴定到种,根据纯分细菌的形态、菌落特征，特征性的生化反应，选择合适的细菌鉴定系统。如手工的API条和半自动的ATB肠杆菌科细菌：API20E非发酵革兰阴性杆菌：API20NE葡萄球菌属：SlidexStaphPlus、APIStaph链球菌属：SlidexStreptoKit、APIStrep奈瑟菌属、嗜血杆菌属：APINH厌氧菌：API20A,38,菌种鉴定鉴定到种,自动细菌鉴定/药敏仪VITEK2CompactBDPhoenixSystemMicroScanBIOMICV3微生物鉴定系统BIOFOSUN微生物鉴定系统鉴定到种葡萄球菌？金黄色葡萄球菌！,39,主要内容,微生物简介细菌的特点和结构细菌的分类与命名临床常见病原菌介绍细菌感染与人体防御抗菌药物敏感性试验细菌的耐药机制,41,42,感染和感染性疾病,感染：外源性病原微生物和内源性条件致病性微生物侵入宿主后，进行生长繁殖，释放毒性物质或致体内生态环境失调等引起机体的病理过程。如：炭疽病、结核病、脑膜炎、白喉、细菌性痢疾、病毒性肝炎等感染性疾病：病原体突破宿主的抵御功能，定植在机体的一定部位，增殖并扩散、蔓延、产生临床症状和疾病。,细菌的致病力,粘附细菌通过粘附与人体上皮细胞结合的过程（细菌入侵的第一步）荚膜细菌的特殊结构，可保护细菌、抗吞噬。产酶与侵袭力有关的酶：透明质酸酶、链激酶、链道酶等破坏机体组织保护菌体不被吞噬细胞吞噬的胞外酶毒素内毒素、外毒素,人体的防线,第一道防线,第二道防线,抗菌物质吞噬细胞的吞噬作用炎症反应淋巴结的过滤作用,第三道防线,体液免疫细胞免疫,宿主免疫力,非特异性免疫,特异性免疫,皮肤黏膜其他屏障,45,十九世纪德国医生郭霍在固体培养基上分离出的第一个纯培养的细菌-碳疽芽胞杆菌接种健康动物，引起同样的疾病，再从被感染的动物体内分离出同样的细菌，提出了证实微生物致病性的“郭霍定律”1882-1894期间分离出许多重要的致病菌，如结核分枝杆菌、霍乱弧菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、白喉棒状杆菌，被称为细菌学发展的“黄金时代”,感染和感染性疾病,主要内容,微生物简介细菌的特点和结构细菌的分类与命名临床常见病原菌介绍细菌感染与人体防御抗菌药物敏感性试验细菌的耐药机制,规范化的药敏试验方法-扩散法(纸片法),51,原理：将浸有抗菌药物的纸片贴在涂有细菌的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，因此敏感细菌在纸片周围一定距离内的生长受到抑制，根据抑菌圈的大小即可推知该药物的最低抑菌浓度（MIC）。,正确的接种菌量,扩散法：0.5麦氏浊度（1.5108CFU/ml）,52,Selectcolonies,Prepareinoculumsuspension,合适的培养基厚度,普通细菌MH琼脂培养基（MuellerHintonAgar）培养基厚度：4mm肺炎链球菌及其他链球菌5脱纤维羊血MH琼脂培养基嗜血杆菌属嗜血杆菌培养基（HTM）SR158添加剂,53,4.合适的培养条件,需氧菌：352，16-18小时嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌：20-24小时葡萄球菌：33-35，苯唑西林、万古霉素24小时肠球菌：万古霉素-24小时溶血性链球菌、肺炎链球菌、奈瑟氏菌属等：20-24小时,54,5.正确阅读结果（纸片法）,工具：游标卡尺，尺子光源：反射光、透射光阅读：药敏平皿背衬不反光的黑色背景用肉眼观察也可用机器阅读抑菌圈直径抑菌圈边缘微弱生长的、仅能在放大镜下才能观察到的细小菌落应忽略,55,阅读结果的正确光源,56,6.重要的质控菌,肠杆菌科细菌：大肠埃希菌ATCC25922非发酵菌：铜绿假单胞菌ATCC27853葡萄球菌：金黄色葡萄球菌ATCC25923肠球菌：粪肠球菌ATCC29212肺炎链球菌：肺炎链球菌ATCC49619嗜血杆菌：流感嗜血杆菌ATCC49247,57,58,CLSI文件：我国部颁标准,结果判断和报告：1株细菌1个药1个标准,用精确度为1mm的游标卡尺量取抑菌圈直径。通常采用CLSI公布的药敏结果判断标准，采用三级划分制。临床实验室标准化协会(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,CLSI是我国的部颁标准,59,肠杆菌科细菌判断标准,肠杆菌科细菌的抗菌药物选择,60,第一代,第二代,第三代,第四代,结果判断和报告,敏感（Susceptible）：当一种细菌引起的感染，用某种药物常规量治疗有效，这种细菌即对该药高度敏感。中度敏感（Intermediate）：当细菌引起的感染仅在应用高剂量抗菌药物时有效，或者细菌处于体内抗菌药物浓缩的部位或体液（如尿、胆汁、肠腔等）中时才被抑制，这种细菌对该药仅呈中度敏感。耐药（Resistance）：药物对某一细菌的药敏高于药物在血或体液内可能达到的浓度时，有时细菌能产生灭活抗菌药物的酶，则不论其MIC值大小如何，仍应判定该菌为耐药。例如产青霉素酶的金葡菌即应认为该菌对青霉素耐药。,61,稀释法的定义,以一定浓度的抗菌药与含有被试菌株的培养基进行一系列对倍数稀释，经培养后肉眼观察未见细菌生长管内所含的最低药物浓度为该药对该试验菌的最低抑菌浓度(minimalinhibitoryconcentration,MIC)稀释法的最大优点是可以精确测得药物最低抑菌浓度，但需耗费较多材料、人力和时间。,62,稀释法药敏试验的分类,因介质不同分为液体稀释法和琼脂稀释法。液体稀释法因容器不同分为试管稀释法和微量稀释法宏量：前者使用10mL的试管，体积至少为1ml；微量：后者使用U型微量板，体积0.1ml。微量稀释法的优点为试剂材料较节省，而且微量板中可预先配制好抗菌药和培养基，冷藏后一定时期内使用，较为方便。与试管稀释法相比，琼脂稀释法配合多点接种器使用，可同时进行大量菌株的药敏试验，实验结果重复性好，缺点是不能进行最低杀菌浓度MBC的测定。,63,药敏试验结果解释-药敏试验与临床的相关性,药敏试验对于预测临床疗效，选择有效的抗生素有指导作用.但药敏试验的结果与临床疗效并非完全符合报告的细菌是真正引起感染的致病菌吗？药敏试验结果是否可靠受多种因素影响药敏的判断标准合理吗？没有质量控制的药敏试验是不可信的影响抗生素作用的体内因素药物组织分布、细菌浓度、机体免疫,主要内容,微生物简介细菌的特点和结构细菌的分类与命名临床常见病原菌介绍细菌感染与人体防御抗菌药物敏感性试验细菌的耐药机制,84,细菌与抗菌药物的斗争历程,抗菌药物,细菌,85,DNA引导的RNA多聚酶,链霉素庆大霉素、妥布霉素（氨基糖苷类）阿米卡星蛋白合成（tRNA）莫匹罗星,DNA,RNA,核糖体,THFA,DHFA,PABA,DNA旋转酶（解旋、螺旋）,喹诺酮类,利福平,细胞壁,蛋白合成（50S抑制剂）,红霉素氯霉素克林霉素,蛋白合成（30S抑制剂）,细胞膜多粘菌素,氯霉素乙酰转移酶,细胞壁合成环丝氨酸万古霉素、替考拉宁杆菌肽青霉素类头孢菌素类拉氧头孢碳青霉烯类,叶酸代谢,甲氧苄啶,磺胺类药,周质空间,-内酰胺酶氨基糖苷类钝化酶,四环素大观霉素,细菌模式图,86,肝脏,心脏,脾,肺,攻击单一器官即可导致机体死亡,87,抗菌药物的作用机制,干扰细菌细胞壁的合成，使细菌不能生长繁殖。损伤细菌的细胞膜，破坏其屏障作用。影响细菌细胞蛋白质的合成，使细菌丧失生长繁殖的物质基础。破坏核酸的代谢，阻碍遗传信息的复制。抑制细菌叶酸代谢等。,88,细菌主要的耐药机制,灭活酶与钝化酶的产生抗生素渗透屏障作用靶位结构改变,细菌代谢状态或营养缺陷细菌菌膜形成,X,外排,灭活,渗透障碍,靶位改变,89,细菌耐药的主要机制,灭活酶产生,抗生素靶位点改变,孔蛋白改变，细胞壁/膜通透性改变,90,喹诺酮类药物耐药基因,-内酰胺类药物耐药基因,91,多种抗菌药物耐药,主动外排,抗菌药物,D2孔蛋白缺失,MexA-MexB-OprM,碳青霉烯酶,Abs失活,胞内,周间隙,铜绿假单胞菌对碳青霉烯类的耐药机制,92,抗生素渗透屏障作用与外排泵,93,靶位结构改变,药物,细菌靶位,万古霉素敏感肠球菌,万古霉素耐药肠球菌,94,细菌利用酶系统，把对氨基苯甲酸合成叶酸，维持自身生长需要。磺胺类药物与氨基苯甲酸化学结构相似，当磺胺类药物浓度较高时，可深入细菌体内竞争二氢叶酸合成酶，生成异常的核酸拟似物，使细菌不能生成菌体所必需核酸而死亡。对磺胺类药物产生耐药性的细菌，可通过调整代谢环节，产生大量的对氨基苯甲酸(20-100倍)，抵消磺胺药对酶的竞争，从而使药物失去抑菌作用。,细菌代谢状态改变营养缺陷等,竞争力极强,95,内酰胺环,Penicillinase,内酰胺酶,灭活酶与钝化酶的产生,96,细菌菌膜形成,97,细菌的特殊状态,芽胞（Spore）某些细菌在一定环境条件下，在菌体内形成一个圆形或卵圆形小体。是细菌的休眠方式。多数芽胞形成是在营养缺乏时抵抗力强，对热、干燥、消毒剂等有强大的抵抗力。一般方法不易将其杀死，可耐100沸水煮沸数小时。最可靠的方法是高压蒸汽灭菌。以芽胞是否被杀死作为判断灭菌效果的指标。如炭疽芽胞杆菌破伤风梭菌,98,临床重要耐药细菌的检测,甲氧西林耐药葡萄球菌,MRSA：甲氧西林耐药金葡菌MethicillinresistantStaphylococcusaureus含mecA基因，编码PBP2aMSSA:甲氧西林敏感金葡菌MethicillinsusceptibleStaphylococcusaureus不含mecA基因，没有PBP2aMRCNS:甲氧西林耐药凝固酶阴性葡萄球菌Methicillin-resistantcoagulasenegativeStaphylococcusMSCNS:甲氧西林敏感凝固酶阴性葡萄球菌Methicillin-susceptiblecoagulasenegativeStaphylococcus,99,万古霉素不敏感金黄色葡萄球菌,VISA：万古霉素低度耐药MRSAvancomycin-intermediateStaphylococcusaureushVISA：异质性万古霉素低度耐药MRSAheterogeneousVancomycin-intermediateStaphylococcusaureusVISAVRSA：万古霉素耐药MRSAVancomycin-resistantStaphylococcusaureus,100,金葡菌对糖肽类抗菌药物的敏感性下降,101,1997年，日本报道了首例临床分离的金黄色葡萄球菌对万古霉素的MIC=8（Mu50）VISA/GISA,/ncidod/hip/Lab/Factsheet/gisa.htmHiramatsuet.al.JAntimicrobChemother.1997Jul;40(1):135-6.MMWRJuly5,2002:51(26):565-7andMMWROctober11,2002:51(40):902.,MultiplecolonialmorphologiesobservedfromMichiganVISAstrain.BothcoloniesshowedVAMIC=8withsamePFGEprofiles来自密西根的菌株，用PFGE检测是同源性的，但菌落形态呈现多样性。万古霉素MIC8，确认为VISA,102,上海地区甲氧西林耐药葡萄球菌的检出率,超级细菌（Superbugs）PDR,103,MRSA、VRE、VISA、VRSA碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌（KPC、IMP、NDM-1)碳青霉烯耐药其它肠杆菌科细菌。,（是指对其有效治疗药物几乎均耐药的细菌）,主要超级细菌菌种：,104,耐甲氧西林葡萄球菌的检测（MRSA）,苯唑西林：1g/片金葡菌11-12mm凝固酶阴性葡萄球菌17mm4%NaCl-6g/ml苯唑西林盐平板培养条件：35，24-48小时结果：1个菌落生长，判定为甲氧西林耐药（MR）菌株头孢西丁：30g/片金葡菌22mm凝固酶阴性葡萄球菌24mm分子生物学方法：PCR扩增mecA基因,105,耐甲氧西林葡萄球菌的检测,苯唑西林和头孢西丁检测,苯唑西林盐平板检测,106,临床意义,107,MSSA(1495株)与MRSA(1916株)的耐药率（%）(CHINET2008),108,HLARE肠球菌的检测,HLARE：high-levelaminoglycosideresistane高水平氨基糖苷类耐药肠球菌120g/片庆大霉素K-B法药敏抑菌圈直径S10mmI=7-9mm(用稀释法确证)R=6mm临床意义HLARE菌株采用氨苄西林和氨基糖苷类抗生素的联合治疗无效,109,耐万古霉素肠球菌检测,万古霉素纸片扩散法含量：30g/片结果：透射光，抑菌圈内出现薄雾状或任何其他生长或抑菌圈14mm均表示耐药抑菌圈15-16mm为中度敏感，MIC抑菌圈17mm判定为敏感万古霉素耐药确证试验含6g/ml万古霉素的MH平板1-10l0.5MacFarlandStandard菌悬液35，24小时，1个菌落生长即判定为耐药分子生物学方法：VanA、VanB、VanC等基因,110,汪复：中国抗感染化疗杂志2005：5（1）：13,耐药肠球菌感染,耐万古霉素肠球菌属感染：新开发品种如利奈唑胺、奎奴普丁/达福普汀等，但后者对粪肠球菌无作用。根据药敏结果联合用药（磷霉素、利福平、氟喹诺酮类、米诺环素等）。磷霉素联合呋喃妥因可能对尿路感染有效,111,耐青霉素肺炎链球菌的检测,苯唑西林：1g/片抑菌圈直径20mm为青霉素敏感株（MIC2g/ml）抑菌圈直径19mm可能为青霉素耐药、中敏或敏感株，必须进行青霉素MIC测定。2g/mlS（PSSP）0.06g/mlS（PSSP）4g/mlI（PISP）8g/mlR（PRSP）0.12g/mlR（PRSP）,肺炎链球菌的耐药性,青霉素敏感肺炎链球菌：PSSPPenicillin-susceptibleS.pneumoniae青霉素MIC0.06ug/ml青霉素中介肺炎链球菌：PISPPenicillin-intermediateS.pneumoniae青霉素MIC0.125-1ug/ml青霉素耐药肺炎链球菌：PRSPPenicillin-resistantS.pneumoniae青霉素MIC2ug/ml青霉素不敏感肺炎链球菌：PNSP