（食品科学专业论文）固态吸附搅拌棒气相色谱联用测定茶叶中咖啡因的方法研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生躲楣旅 帆蒯年6 月炒日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有税 保留送交论文的复印佟和磁擞，允许论文被套阅和借阅，w 以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意沈阳农姚大学可以用不同方式在不确 媒体上发表、传播学位论文的蠹容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 时间：涮年吉弼矽日 时间：) 。6年石月，己日 趿 以 摄 州 卧瞳、 饼缈 名 滋 辍 堡 篷 熬 程 研 别 沈阡i 农业大学硕士学位论文 摘要 蔡楚我国的佟统饮辩，嘲蹲鬻是其中的主要生物碱，麓含量高低标惑着茶时的优劣。 目前测定茶叶中咖啡因的方法比较多，但是样品处理比较笈杂，花费时间多，所以需要 建立一种蕊便的方法。本文建立了固态吸附搅拌棒技术( s 蛙卜b a rs o 礓l i v 。e ) ( t r a c l i o n ， s b s 坳与气褶色谱仅联嗣测定茶时中酶咖啡蹰含量的方法，与其他两种常规方法滗铰， 该方法简捷、快速，结果可靠。沈阳农业大学颈士学位论文 s 8 s e 技术遇j 霪自援拌实联对溶液串期蹲邋进芎亍啜辫，其啜辫量受终器条待影璃魄 较大，本文对萃激条件和解擀条锌进行俊纯，确定鹩最佳萃取条件为搅拌速度 6 0 0 r p 删饥n ，水溺温度3 0 ，举取时间3 0 m i n ；确定的最佳解析条件为解析温度为3 0 0 ，鳃叛射趣l o m i n 。 嗣时s 8 s e 技术与传统瀚有枕溶刹蕊取法- 气相色谱测定法及赢效液糟色谱法比较 测定了水仙绿茶和铁观音两种茶叶。三种方法测定结果表明水仙绿祭用搿效液相色谱法 测定结粜精密度r s d 为2 6 5 ，回收率舛3 ，最低检测隈4 9 6 8 孵确l ；褥传统气穗色 谱法的r s d 为3 6 5 ，回收率1 0 7 5 ，最低梭测限1 6 s 腿m l ：用s b s e 一气樱色谱法的 嬲转为9 2 7 ，回收率9 2 。1 4 ，最低捡淤羧0 ln g 魅l 。 锾淡密嗣藏效液籀色谱法瓣定鳃鬏s d 菇2 。9 舒，鏊l | 5 枣受l l o 3 | ，最低捡溅羧 4 5 9 9n 鬈熊己：嗣传统气穗色潦法溅囊的r s d 为4 。5 8 、豳蔽率lll 。7 3 ，最低检测漩 2 3 5 “m l ；用s b s e 气相色谱法测定的r s d 为1 0 9 6 ，回收率1 0 0 6 7 ，最低检测限 o 0 3 8n g m l m 对比兰种方法的测定结果可以看出s b s e 气相色谱法测定茶水中咖啡因含量与其 他索规方法檑比，回收率与零拨方法稠警，援跫精密度稿差些。娥主要越是这秘颈处 疆方法不耗费程餐套爨溶裁，绿惫臻绦，溺瓣藏奉 聚豢，掇终楚擎蒺行，觚摹酝到溺定 全逡程只嚣要掩意志，是健绕方法鹣l ，3 ，辘繁餐大鼙麓久力麴力，灏戳邃静臻豫、映 速鹃处理技术是2 1 世纪样龋颈处理搜术凝鼹酌必然趋势。 蓑键谰：茶针：咖啡困：固态吸附搅摔橼技术；反相高效滚相色谱法：稻色谱法 摘要 a b s t 聪l c t t e ai sat r a d i t i o n a lb e v e m g eo fo u rc o u n t r y ，t h ec a f ! f b i n ei s t l l em a i na l k a l o i da r n o n g m e m ，c o m e n tl e v e lo fm ec a 任b j n em a r k st h eq u a l i t yo ft h et e a t h e r ea r em q r em e t h o d so f d e t e m l i n i n gt h cc a 虢i n ei nt h et e aa tp r e s e n t ，b u tt h es a m p l et r e a u n e mc o u r s ei sm o r e c o m p l i c a t c dr e l a t i v e l ya 1 1 ds p e r l dt i m em o r e ，s or l e e dt os e tu pak i n do fs m l p l e 姐dc o n v e n i e n t m e m o d t h i st e x th a ss e tu pam e m o do fu n i t ea i l du s eo fs t i r _ b a rs o r p t i v ee x t r a c t i o n ( s b s e ) a i l dt h eg a s e o u sp h a s ec h r o m a t o g r a p h ( g c ) t od e t e n n i n ec o n t e n to fc a f f e i n ei nt l l et e a ， c o m p a r e d 、i mt w ok i n d so fo t h e rr n e 1 0 d s ，t 1 1 i sm e t l l o di ss i m p 】ea 1 1 dd i r e c t ，l 鹬t ，t h er e s u h i sr e l i a b l e s b s ea b s o r b sm ec a f f e i n ei nm es o l u t i o nt l l r o u g l lm i x i n go n e s e l ci t sa b s o r b i n g 锄。叫 i si n n u e n c e db ye x t e m a lc o n d i t i d nb i g g e r t h ec o n d i t i o no fe x t m c t i n ga n da n 甜y z i n ga r e o p t i m i z e di nt l l i st c x t ，t l l ed e f l n i t eb e s te x t r a c t i o nc o n d i t i o na r em i xs p e e d6 0 0 r p m m i n ，w a t e r b 砒t e m p e m t u r e3 0 ，e x 的c tt i m e3 0 m i n ；m ed e 五n i t eb e s ta 1 1 a l y n cc o n d i t j o ni s ：a n a j y z e t e m p e r a t u r e3 0 0 ，a 1 1 a l y z et i m elo m i n n a r c i s s u sg r e e nt e aa n dt i eg u a n y i na r cd e t e 珊i n e dr e l a t i v e l yb yt h r e ek i n d so fm e t l l o d 8 o fs b s ew i t ht r a d i t io | n a lo r g a l l i cs o l v e n te x 妇c t _ g ca n dh i g h e 陌c i e n tl i q u i dp h a s e 咖o m a t o g r a i i l ( h p l c ) a tt h es 锄et i m e m c r 。s u l to ft 1 1 r e ek i n d so fm e m o d si n d i c a t e s ： p r e c i o nr s di s2 6 5 t h a tt h e i s s u s 掣nt c ai sd e t e m l i n e dw i t l lh p l c ，r a t eo f r e c o v e “i s9 6 7 ：r s dw h i c hu s e s 也et r a d i t i o n a lg ci s2 6 5 ，r a t eo fr e c o v e r yi s9 9 5 ； r s dw h i c hu s e ss b s e g ci s9 ，9 8 ，r a t eo f r c c o v c r yi s1 0 0 6 r s di s2 9 6 t l l a tt i eg u a n y i ni sd e t e r 瑚i n e d 埘t hh p l c ，r a l e0 f c o v e f ) ri sl0 2 3 ； r s dw h i c hu s e st 1 1 en 翟d i t i o n a lg ci s2 6 5 ，r a t eo fr e c o v e f yi s9 7 。9 ；r s dw 1 1 i c hu s e s s b s e g ci s9 ，9 8 ，r a t eo f r e c 钾e r yi s1 0 0 。6 t h er a t eo fr c c o v e r y 州ms b s 飘- g ci se q l l a lt of o u t i n em e t h o d s ，p r e c i s i o ni s s l i g h t l y ai 瑚ew o r s et h r o u 曲r e s u l t so fd e t e h n 址m gm ec o n t e n to fc 8 娲i n e 派t e ab y3k i n d so f m e t h d s am a i no n et h a t 也i sk i _ 随0 f 辫e t r e 砒m o n tm e 幽o dd o e sn o tc o n s u m ea n yo f g a n i c s o l v e n t ，i t 主sg f e e ne n v 鼋f o l l m e n t a lp r o t e c t i o n ，a tt l 址s a m et i m ei t s s ti sc h e a p i ti se a s yt o o p o 哪e ， i lo n l yn e e da b o u tl h 舶me x l r a c t i n g 埝d e t e 黜i 妇塔遮t h cw h o l ee o u r s e ，t l l i si sl 3 o f 撕et r a d i t i o n a lm c t h o d ，c 黼s a v eal a r g ea m o u 嫩o f m 8 l 攀o w e fa n 硅m 戳e f i 砖s ，s o ，t 撼s 烛越o f t e c h n o l og ) ro fe n v i r o n m e n “p f o t e c t i o na n d 如s tt r e a e 嫩i sl h ei n e v t a b l et f e n do ft 妊 p r e t r e a 姐e n tt e c h n i c a 王d e v e l o p m e n lo f t h es a m p l e 遮也e2 l s tc e n l w y ， k e yw o r d s ：t e a ；c a f f e i n e ；s t i 棚雒s o 嗽i v ee 嫩a 文o n ；r e v 娌s c 城出e f 羲c i e n 蕈l i 和d 掳8 s o c 虹o m a t o g r a m ；a a s e o u s 砖a s ed h o m 戤o g 阻m 沈阳农业大学硕士学位论文 第一章前言 1 1 研究的目的和意义 茶树是一种多年生山茶科植物，在我国种植已有数千年的历史，其芽时称为茶叶。 茶叶最早被用作药物使用，据现存最早的药物经典神农本草经记载：“神农尝百草， 臼遇七十二毒，得茶乃解”，久服茶能：“安神益气，轻身耐老1 安徽农学院，1 9 8 2 ) 。南 北朝时期的养生家陶弘景对茶曾有很高的评价，在其著作陶弘景新录f 又称名医 别录) 中言道：“茗茶轻身换骨，昔丹丘予黄山君服之”( 林治，2 0 0 0 ) 。这表示在南北朝 时期茶已经是长生仙药的代表。后来。随着茶叶的应用范围扩大，逐渐演变成保健饮品。 东汉的神农本草，唐代陈藏器的本草拾遗，明代顾元庆的茶谱等史书均详细 记载了茶叶的药用功效，但由于科技水平的限制，茶在药用上很大程度还属于经验性的。 随着茶叶生物化学研究的不断深入以及医学研究的参与，对茶叶的药用有效成分及其药 理功效有了本质的了解，茶业的开发和利用正受到国内外学者的广泛关注( 安徽农学院 1 9 8 2 ；s a v o i a j n e nh ，1 9 9 2 ) 。 近年来，随着人们对茶叶研究的深入，已在茶叶中鉴定出4 0 0 多种有机成分，并逐 渐分离出其包含的多种有效成分。茶叶中主要的活性物质有生物碱类、茶多酚、黄酮类 | 三l 及氨基酸、鞣酸等。生物碱是一类重要的生理生物活性物质，茶叶中含有含量较高的 咖啡因、萘碱等具有中枢神经兴奋作用的生物碱类化合物。 l ，1 1 咖啡因及其它活性物质韵功效 咖啡因( c a 疵i ) 是茶叶中主要的生物碱，又名咖啡碱，化学名l ，3 ，7 三甲基黄嘌呤， 为呈白色柔韧有绢丝光泽的针状结晶体，无臭、有苦味，露置干燥空气中有风化性，常 集结成团；熔点2 3 8 ，1 7 8 升华密度1 2 3 克厘米3 ( 1 9 ) 易溶于热水、毗啶、 四氢呋喃和乙酸乙酯，能溶于水、乙醇、丙酮和氯仿，微溶于乙醚和苯。水溶液对石蕊 试纸呈中性反应；化学结构式为； 咖啡因为碱性极弱的生物碱，和酸形成的盐亦极不稳定，溶于水或醇时，又会立即 分解，转化成游离的咖啡碱和酸。 分解，转化成游离的咖啡碱和酸。 严 。冷偶 笙二主萱童 一般茶叶中咖啡因的含量是1 4 ，是茶的风味的主要来源，它的含量高低标志着 茶叶品质的优劣( 陈莹，1 9 9 7 ) 。众所周知咖啡因是中枢神经兴奋剂，它能促进新陈代谢， 增强思维能力，增加肌力，减轻疲劳，解酒，同时还有利尿作用，解除人体内有害物质， 有助予人体对食物的消化( 薛秋和，2 0 0 5 ) ：茶叶中的咖啡因可使人精神振奋、性格开朗， 促进人体新陈代谢，在使胰岛素分泌增加等方面提供一定作用，因而，有人把它视为医 治糖尿病的辅助饮料( 戈佩贞。2 0 0 2 ) ，咖啡因阻断腺苷受体介导的内脏血管扩张，从而 治疗老年人或植物神经功能紊乱者的餐后低压( s h 印i m bt ea 1 1 9 8 9 ) ，还可促进脂肪分 解，增加集体产热，与麻黄碱和用可减轻限食或不限食者的体重，达到减肥效果。但是 咖啡因能促进钙的排出，容易引起骨质疏松症，另外，肝功能不健全者摄入大量咖啡因 又诱发脉搏加快、心律不齐等症的危险。对于婴幼儿来说，饮茶是没有好处的。因为咖 啡l 圈会使人的大脑兴奋性增高，婴幼儿饮茶后不能入睡，烦躁不安，心跳加快，血液循 环加快，心脏负担加重，茶水具有利尿作用，而婴幼儿的肾功能尚不完善，所以婴幼儿 饮茶后尿量增多。会影响婴幼儿肾脏的功能( c h o ioh e ta 1 1 9 8 8 ) 。 茶多辩( t e ap o l y p h e n o l s ，即) 是茶卧药效豹主要活挫成分，占茶辞于质量携韵2 5 ， 其主要组分为j l 茶素( c a i 钯c h 娴，占其总量的g o 藏右( 李海波，2 4 ) a 作为一种炎然抗 氧化剂，w 清除活性氧自由基( 杜华华，许梓荣2 0 0 4 ) ：黄酮类化合物其有多种生理活性， 对治疗和预防心m 管疾病具有相当的功效；茶叶中的鞣酸有遏稠氧化脂的生成和消除活 性酶的作用，可使血篱保持弹性，因而可以脐中风和抗老化( 邹圣勤，2 0 0 4 ) 。 同时由于茶水中成分复杂，干扰物多。尤其熄另外两神生物碱茶碱和可可碱， 性质与期卅 因比较相似，容易对其定性定凝造成于扰嚣致结果误熬。所以器要建立一粒 塞接、篾便的方法来实对模拟泡萦方式，蠖测茶农中蛇嘲雌霞含爨，菇对不慰攮凝下的 溶出鬃镞一令完熬熬溽徐，才能使饮茶囊惩这到健身豹蠢黔，黠入秘正确建溺费、饮怒 荣冲有缀好鹃指导俸羯。 1 2 翻前测定咖啡因的主要方法 以前常用的分析测定方法是羹量法、碘量法、比色法，这些方法器有其特点。重辍 法是用氯仿抽提出一定量的咖啡因，经过称重求褥其重量。碘量法是在酸性条件下，加 标定过的碘液，使咖啡因秘碘结合成不溶的过碘化物，用淀粉游定溶液中剩余的含碘量， 缎换算求出峨哄因会擐。箍比色法馒用磷镪酸秘卿哄黢昼怨蜃，经毙色蕊爨麴啭题含螫。 这些方法虽然麓馕，艇因英灵敏发 燕褥逐渐被一些瑟瓣方法辩取代。避年来，已广泛应 4 沈阳农业大学硕士学位论文 用紫外分光光度法和色谱法测定茶叶中的咖啡因。 1 2 1 紫外分光光度法 该方法的原理是利用咖啡因结构上的嘌呤环具有共轭双键体系，具有独特的吸收光 谱。研究表明，咖啡因在2 7 2 2 7 4 姗范围内有最大吸收，其吸光值与咖啡因含量成线 性关系，可以以此分析定量。如沸水浴或回流抽提咖啡因，紫外分光光度法测定，但仅 抽提过程就需要l h ( h a 叭h o s ；m m e fd ，1 9 9 2 ) 。有研究通过或利用微波加热技术提高 抽提速度( 杨明，1 9 9 9 ) ，取得了比较好的效果，5 m i l l 内可一次性抽提2 0 个样品，提高了 分析速率，但是抽提得到的茶汤溶液需要多次稀释定容，很容易引进误差。u l l l a l l m r ( 1 9 8 7 ) 等人用氯仿回流提取，以氯仿为空白，在紫外2 7 6 n m 测定溶液的光密度值， 溶液中咖啡因的浓度在2 d o 肛咖l 范围内符合b e 盯定律。 另努还骞导数紫终分竞走度浚，宅是弱溪导数技零遗程努蠢纛浚分辑，薅决演会缓 分测定时的相互干扰，同时更有效地消除混浊液的散射影响、背景吸收，也可以提高光 谱分辨率，近年来此方法被广泛用于咖啡因的分析。g a r c i ac c 等人( 1 9 8 9 ) 用二阶导数 分必光度法测定了旗嘲# 和茶时浸掇羧孛斡冁疃 嚣禽爨，题最大波长2 擘2 。5 n m 和最小波长 2 7 2 。5 嫩豹测定麓傻来计算弼唪因的含量，霜氧纯镁帮c 勰z 试翔一巍干扰物质豹干扰。 邓建平( 邓建平，1 9 8 8 ) 等人采用一阶导数光谱法分析可乐型饮料中的咖啡因含量，有效地 消除了教堂色等物质的干扰。 l 。2 。2 色谱法 用予咖稚因的检测主要敝荣电动毛细管色谱( m e c c ) 、薄层色谱法( r r l c ) 、商效液糊 色谱法( 1 p l c ) 、舞气相甑谱法( g c ) 。 1 2 2 1 胶束电动麓纲管色谱法( m e c c ) 胶柬电动毛纲蛰色谱( 周骞豢等，2 2 ) 默十二烧基硫羧镳( s d s ) 胶索炎准强定糕， 2 0 珏挂地磷羧簸2 0 拄蹴。班，s 潞( p 弘l l 。，分嵩毫羝2 s o ，捡测波长2 8 翻旺考察了翔 曝毽及其9 静类钕携在胶束魄魂罨绸警经谱分离攘式下豹分离符为。实验绩采巍礤因岛 冀毽9 种类似物努鬻嫠好，稔密黻氇黼g 毽。 1 2 2 2 薄层色谱法盯l c ) 簿层色谱扫描法晟然比高效液掴色谱法灵敏度、分辨率差些，但操作简单快捷，常 用硅胶g ( 加上适鼍c m c ) 或硅胶g f 2 5 4 板，所用溶剂蘸统一般为甄仿、甲醇或苯加上 一定爨的骞槐酸如甲酸、乙酸、浓氮瘩、三己氨等，检溅鬻月紫终2 5 4 糯、3 6 踟懋。搬 苎二童堕童 杜利成( 2 0 0 0 ) 以无水乙醇抽提2 小时，在薄层板上以苯- 乙醚醋酸甲醇( 1 0 0 ：5 0 ；1 5 ： 1 1 为展开剂，根据r f 值和扫描的紫外光谱图定性，薄层扫描色斑面积定量。 1 2 2 3 高效液相色谱法( h p l c ) 液相色谱的应用大大提高了检测的灵敏度和速度( h a 他o m esb ，m i l l e rdj 1 9 9 2 ；r a m m a k r i s h mr s e ta l ，1 9 8 7 ) ，由于它专属性强、灵敏度高，可同时用于有关物质 的检测和含量测定，一般不受其他组分的影响。测定茶叶中咖啡因含量的国标方法就是 高效液相色谱法( 【g b 厂r8 3 1 2 2 0 0 2 】) ，该方比较成熟，将茶叶与氧化镁共同水浴2 0 m i n 后，过0 4 5 岬滤膜，以o d s - c 1 8 柱和3 ：7 的甲醇水溶液作流动相测定。它是利用咖啡 因的甲醇溶液在2 8 6 i l i i l 下有最大吸收，吸收值大小与咖啡因浓度成正比定量的。国标方 法虽然比较成熟，但水浴过程中每隔5 i n i n 就要振摇一次，比较麻烦并且容易引入误差。 类似的还有丁明玉等( 1 9 9 9 ) 也是用反相高效液相色谱法( 丁明玉等，1 9 9 9 ) 测定茶水中的 嘌呤碱，使用o d s - c 1 8 柱，以5 0 甲醇一水作流动相，将茶叶在1 0 0 、9 0 、8 0 条件下浸泡l h 后取上清夜测定。得出结论沸水中溶出的咖啡因较多，浸出量占茶干重 的2 左右。功刀章等( 1 9 8 8 ) 取咖啡、红茶、绿茶的热水浸提液装入e x t r e l u t 柱，1 0 m i n 后用二氯甲烷淋洗，收集溶出液，色谱柱为l i c h m s o r bs 溉( 4 m m 2 5 0 m m ) ，流动相为水 饱和二氯甲烷：乙醇( 9 7 ：3 ) ，流速为l 胁氓波长为2 7 5 n m ，用紫外线检测法测定。 1 2 2 4 气相色谱法( g c ) 超临界流体萃取一g c ，m s ( 邱涤非等，1 9 9 5 ) 以c 0 2 加少量水为流动相，萃取时间为 5 m i n ，测定了龙并、珠茶、荣莉花茶中咖啡绷含激，r s d 8 5 。直接气相色谱法( 许庚琴 等，2 0 0 2 ) 是将茶叶用三氯甲烷浸泡2 4 h 后，潋超声波反复萃取、真空抽滤后，n 2 为载 气，稍f i d 检测器测定该方法相关系数为9 9 辨6 ，线性范丽为2 o o 9 0 0 丑1 9 ，l ，稔出澈 为2 m 班，图牧率9 6 7 。a d b e l - m 留e m ( a b d e l - m o e t ) r 毪m ，z e i t s c 赫矗，1 9 8 8 ) 以样 箍分拆柱为漩充辕，内装涂有3 甲基酸溺静硅藻土( 经酸洗和麓烷仡) ， 曩巴珑妥为内稀 物，检测嚣为擎国。静炳莹( 1 9 9 0 ) 肇l 孀氮磷检溺器对禽氮化合物的满选择往，对翔晦函 进行气耀色谱分耩，使磊该法，连续进样l 令， 踅器灵敏度不下降，基线不飘移，灞 定灵敏发魄标准方法离。 1 2 3 箕毽骞法 还窍一媸其它方法赐乎粕雌嚣熬溅定，铹熟翔接原子毅牧法【5 | 】、邋红箨分巍党菠 法( 丁守等，1 9 8 9 ；袁j l | 聪一郏，下门丸。1 9 9 7 ) 等，妇了宁等人( 1 9 8 9 ) 在1 3 2 4 0 瓤融波 沈阳农业大学硕士学位论文 长范围内用近红外分析法测定绿茶中的咖啡因获得满意效果。 目前使用s b 漏来吸附茶叶中的活性物质还未见报道，但是已经有入使用纤维针式 固相微萃取气相色谱联用来测定饮料和茶叶中咖啡因的含量，取得了不错的效果 ( h 删l 咖es ，m i l l e rd j 1 9 9 2 ；y a n gm j e ta i ，1 9 9 7 ) 。圊相微萃取是一种新的样品预处理技 术，本文将在1 3 节作详细介绍。这种方法是利用“相似相溶原理”，将涂有吸附剂的萃 取头直接插入茶水中，通过搅拌子搅拌加速咖啡因从茶水到萃取涂层的传质过程，吸附 达到平衡后将萃取头插入气相色谱进样口热解析，从而完成在线测定。 1 3 固态吸附搅拌棒技术介绍 从1 2 可以看出，至今为止咖啡因的主要测定方法样品预处理比较复杂，引进误差 大，特别是样品预处理过程中使用大量有机溶剂，对环境造成定污染，也不利于操作 人员的健康。样品预处理是分析的关键环节，也是最费时和劳动强度最大的步骤。样品 预处理的主要发展趋势是处理过程简单。引进误差小，检测限低，对样品的选择性好， 回收率高、绿色环保等，样品预处理对得到准确而又重现性好的结果非常重要，即使是 先进的分析设备，高效的柱子，完善的数据处理系统，都不能从一个制备不适当的样品 中得到满意的信息。而无溶剂样品预处理技术是当前的发展方向。固态吸附搅拌棒就是 新兴的绿色无溶剂样品预处理技术。 圈态吸腿搅拌捧燕固攘微萃取豹豹一秘，霾援微萃取( s o l 这魏a s e m i c r o e x t a c t i o b ，s p m e 是加拿大p a w l i s 碍n 般研究小缎于1 9 8 9 年酋次提出的一项毅型的 无潞剂化样照前处理技术( a o t h l 燃c 融a l ，1 9 9 2 ；b e l a r d ir 钟a “i s z y n h 1 9 8 9 ；l 0 t c h d ，1 9 9 2 ；p 僦e rdw p a w l i s z y nj ，1 9 9 2 ) ，目前已经实现商品化。s p m e 方法可用于气体、 液体和固体中的挥发性、半挥发性物质的翠取富集( k b u c h h o l z ，j p a w l i s z ”， 1 9 9 3 ；r b a l 删，j p 冉w l i s z y n ，1 9 8 9 ) ，这种技术既有固相萃取( s p e ) 操作简单、处理时间短、 样晶量小，裔选释往、成本低的优点，又避免使用大量常规溶剂，克服了回收率低，吸 辩藐道荔渚塞等映点。 s p m e1 支寒爨蓠考三释形式；毽括纤维锌式露糖敲萃取管谗e f 辨溉) ( b 积e l t 疑j 1 鳓7 ；b 鞍g 鞠& l 矗jj ，1 9 9 6 ；j i 黼。& m 。2 0 0 0 ；擞垤s s e 秘e ，髓毫l ，2 ，警痰器裾徽 萃取o n t u b es p m 聊( h a n sgjm o l ，e t 蚨1 9 9 3n 8 越l 2 0 0 2 ；s a i 幻x 武斌1 9 9 9 ) 和霆摆微摹 取搅拌棒技术( s b s e ) ( b a l t u s s e ne ，e ta l ，1 9 9 9 ；f h n kd 娃啦，2 0 0 3 ) 。f i b e rs p m e 的钋形如一 支微型避样器( 图1 1 ) ，由手柄m o l d 哪和萃取头( f j b e r ) 两部分组成( 见图1 ) ，它是在攀取 7 第一章前言 头表面涂上各种不同的固定液和吸附材料，根据相似相溶原理，萃取时通过搅拌子搅拌 加速传质过程来选择性的萃取痕量有机物，从而达到富集的目的，与传统的液一匿萃取 技术和液一液萃取技术相比更有无法比拟的优越性。 压杆2 倚体3 z 形槽4 俺体搅宙5 调节针头长度的定位器6 拉伸弹簧7 密封啊膜8 注射针管9 纤维连接管1 0 培融石 英纤堆 圈1 商品化同相徽萃取装量示意圈 f i g i 呲1 s c h e r n 舭i cd i g r a mo f s p m eb s m b l y s p 鹾e 淡是将终壤头煮接捶入滚体撑熬孛或黎器予鬈髂孛。这静方法逶合予洼净黪 液体样品和气体样品，如水样、白酒、饮料及空气中苯蒸物的举取测定a 疆稽徽萃取韵疆论是麓予待努辑物程样鑫蒸质窝攀取介质涂层) 乏闽鹣分配系数 正i s e r yr p 酬i s 犁n 。j 。1 9 9 7 ) 。在使用某种波体高分子涂爆进行萃取时，在萃取平糖状态 下和萃取前的待分析物的麝应保持不变，有下列关系： c 。致= o 搿c y l l 其中c 0 是样品中待分析物的初始浓度，gc ，分别是平衡时样晶中待分析物的浓度和涂 层串待分辑物翡浓旋，硌帮治分掰是涂糯俸积帮样晶体积。 设待分析物的爨与样晶中的分配系数为怂，攀取乎襁时进入涂层的分析物的量为扮， 则赫，= c 以 l - 2 辩一o y j l - 3 将( 1 2 ) ( 1 3 ) 带到( 1 w 1 ) 式，按理得： 拜一缘弼。玲擘+ 掰 l 一4 式( 1 4 ) 表明派层吸附的待分析物的基与样品中该物质的初始浓度之间里线性关系，( 1 - 4 ) 式中如果纷 黪玎，那么涂蘑萃取的被分析物的蟹留样品体积无关 弹一鼹已 l 一5 即分析物在样品中的浓度越高，达到平衡时涂层中被吸附的量越大，这是直接s p m e 的 定蠹蔹握。 攀取速度由分：l 阡物从样品基质到萃取涂层的传质过糨控制。但萃取涂层表面般附 有一层静壹永膜，分析耪穿过隶藤速到萃敬涂层的速度缀其缓撩，西j 琏：这一过程成为影 r 沈阳农业大学硕士学位论文 响直接s p m e 的关键步骤。通过搅拌破坏静止水层，可大大提高萃取速度。通常采用的 搅拌方式如磁力搅拌、超声搅拌等似o t l a g l ls ，p a w l i z y i lj 1 9 9 3 ) 。 与g c 、h p l c 、c e 、u v 等实现在线联用，广泛的应用于食品检验，农药分析，环 境监测，医药卫生等领域( 张道宁，吴采樱1 9 9 8 ；贾金华，何翊1 9 9 8 ) ，美国国家环境 保护局( e p m ) 已采取该技术作为测定水中的挥发性化合物( u s ae p ar n e t i l o d5 2 4 2 ) 和半 挥发性化合物( u s ae i ，ar n c m o d6 2 5 4 ) 的标准方法( 陈楚良1 9 9 7 ) 。 管内固相微萃取( i n 咖b es p m e ) 是将涂层涂在石英管的内表面，因此可以采取g c 毛 细管柱内涂萃取纤维的方法。管内s p m e 法分为两种；静态法和动态法，其主要区别就 是待测物是处于静态还是由外力驱动通过纤维管，两者均主要靠扩散被转移到吸附剂 上。管内s p m e 一般与，l c 联用，方法是将g c 毛细管萃取柱放于h p l c 自动进样阀 和取样针之间。用注射器吸入样品，当样品待测组分分配到毛细管内壁固定相上时，将 阀切换至取样位置，以适当溶剂解析后将解析溶剂转移到样品管中。在切换至进样位置， 样品管内溶液随流动相进入h p l c 柱。这种设计的优点是涂层方便易得，种类多样，易 于实现自动化，节省分析时间，比手动进样有更好的精密度。目前常用的g c 毛细管柱 涂层有：s p b - l ，s p b 一5 ，p t e - 5 ，s u p e l c o w a 】【，o m e g a w a ) ( 2 5 0 等( 马继平等，2 0 0 2 ) 。 微型固态吸附搅拌棒技术( g t i rb 甜s o r p t i v ee x 劬c t i ，简称s b s e ) 是1 9 9 9 年由p a t s a n d r a 提出并由g e r s t e lg i i f b h 公司商品化。萃取固定相为商品化的聚二甲基硅氧烷 ( p d n s ) 橡胶管，套予中空玻璃或石英上。长度1 0 c n 卜3 o c m ，i d 3 m m ，它的使用寿命 可达3 0 次以上，其结构见图2 。萃取时吸附搅拌棒自身完成搅拌，这样就避免了在 f 岫r - s p m e 中搅拌子的竞争吸附，与其它s p m e 方法相比较能提高分析物的回收率， 降低分析物的检测限，扩大了分析的范围。缺点是体积大需要特殊的解析器，并要恒温 磁力搅拌器，涂层厚，传质慢，达平衡时间长，需要非平衡理论定量： 十唧卜鬻r ) 是c o 辑：待分析耪在涂层秘样品乏淘静分配系数 蠢：涂屡表面积 职 撇：分援物在撵晶露露定撩涂层中靛矮堂转移系数弘涂袋体积 “提取时阃h ：样晶体积c 样晶中待分析物的初始浓发) 9 整= 里璺堑童 对同一样品、同一固态吸附搅拌棒来说，提取时间一定的情况下，上述公式可以简化为： 聍2 珏叩d 1 - 7 b 是待分析物在涂层和样品基质中的分配系数，可以看出，待分析物的萃取量与其在样 品中的初始浓度成线性关系，这是直接定量的基础。 我们通常可以通过改变一定的外部条件来改善萃取效率。( 1 ) 搅拌：为促进样品均一 化，加速待测物从基质到萃取涂层的扩散速度，通常在萃取过程中对样品进行搅拌。( 2 ) 加温：升高温度能使待测物在基质和涂层之间的分配系数增加，从而增加萃取量。( 3 ) 加 无机盐：在水溶液中加入硫酸铵、氯化钠等无机盐至饱和，可降低有机化合物的溶解度， 是分配系数提高。( 4 ) 调节p h 值：萃取酸性或碱性物质时，通过调节样品的p h 可改善 组分的亲脂性，从而大大提高萃取效率。 萃取固定相的体积一般为5 5 2 5 0 此，比f i b e rs p m e 和一般的i n t u b es p m e 萃取 固定相体积大5 0 倍以上，因此富集倍数比较高，适合于样品中痕量组分的分析。 圈2 两品化s b s e f i 9 2 1 1 1 cc o m m c k i a l j 髓o f s b s e 3 12 玻璃保护层2 萃取撩层3 铁芯 图3s b s e 结构图 f i 9 3 s c h e m i c d i g r a m o f s b s e 在s b s e 接术串萃取固定楣的铡各十分麓要，由予萃取蔺定福钓膜层穰浮，稍籁过 程菲常霭难。褥蓠衙用萃取阖定相仪阪予商品仡的硅橡胶管上，还没有用其它方法糊备 爨3 em 黻上厚度函定褶涂层酌。本次实验掰采溺的搅猝榛是使用溶胶凝胶方法制备的 萃取瀚定相。它是含羟萋的甲基聚硪氧烧预聚物为基本骨粲，加入所需涂层主成分和无 税催纯箭等组成鹃溶狡溶液，沓温和条件下即可简便，快速的溃涂在纤维表面，形成凝 胶。在中溢条件下老纯，遴一步浓缩，胶联，形成网状高分子缩构。并牢话i 键台在纤维 i o 沈阳农业大学硕士学位论文 表面。它热稳定性好，使用寿命长，成本低，涂层表面能得到分子水平上的同一性，它 的表面呈现多孔结构，由于化学键合作用而使涂层对基体有强烈的粘附性是一种综合 性能很好的固定相涂层，不但可以增加样品的萃取容量，而且因与样品之间的接触面积 增加，还可以提高样品萃取的效率。通过对萃取固定相厚度扫描的电镜图可以得到固定 相的厚度大约为3 0u i n 。通过特定的解析装置可与其相色谱实现在线联用，该技术已成 功地应用于环境样品( l e o nv me ta l ，2 0 0 3 ；p o p pp b 叭e rc ，w j n i l r i c hl 2 0 0 1 ；v e r c a u t e r e n je ta l ，2 0 0 1 ) ，食品中污染物和农药残留的分析( s 卸d mpe ta l ，2 0 0 3 ；y l m gm - je ta l ，1 9 9 7 ) 以及生物样品的分析( h a w l l l o n es ，m i l l e rd 1 9 9 2 ) 。 可以说到目前为止分析技术已经日趋成熟，不同分析技术对同一组分得测定结果不 会有太大的差别，检测限的数量级也没有多少差异。能大幅降低检测限、提高精密度的 方法只能是通过改进样品预处理技术来实现。用s b s e 技术处理吸附茶水中的咖啡因与 其它传统方法相比有很大的优越性，它能提高分析物的回收率，降低分析物的检测限。 作者希望通过这次试验希望建立一种简便无污染的绿色检测技术，同时又有很好的准确 度，这是符合当前世界保护环境和可持续发展的大主题的，具有一定的科学意义和现实 意义。 1 4 试验方案设计 1 4 1 样品的选择 本实验选择了两种有代表性的茶叶水仙绿茶和铁观音作为实验材料。国际上较 为通溺之茶叶分类法，楚按不发酵茶、举发酵茶、全发酵茶来作简单分类。绿茶是不发 酵茶较必缨嫩，嘲喽毽鑫量毙较低，要求狰退葬重擦耪茶懿清香，滋噱淡雅鸯塞；铁观音 为半发酵茶，较为粗老，要求香味浓郁，茶水t b 应大一些，方可黯出铁观音的滋味。以 这两种茶叶为试材能较好的概括所肖茶叶的情况。 1 4 2 方法设计方案 l 。4 。2 。l 反摆褰效滚壤色漤法测定茶瓣中襄搂因豹窘鬟 参考国家标凇【茶咖啡碱测定g b 厂r8 3 1 2 2 0 0 2 】对茶叶进行预处理，对色谱条件 进行优化选择，按最优化方案测定两种茶叶的咖啡因禽量。并考察方法的可靠性。 1 4 _ 2 2 溶剂萃取气稆色谱法建茶对中咖蠓因的禽量 袋鼹三氯甲烧壹接浸提热理茶时，驮巾摹取遗秘琏 霆，气程毯谱纹溅定，激终标法 定量褥出茶叶中咖啡因的含煮，考察方法的可靠性。 箜二皇堕童 1 4 2 3 固态吸附搅拌棒气相色谱法测定茶叶中的咖啡因 这个实验主要包括两个部分：样品的预处理部分和测定部分，流程图如下( 图4 ) 。 将茶叶样品按照一定比例沸水浴，真空抽滤除掉茶叶。然后将固态吸附搅拌棒放入 茶汤中进行搅拌，萃取，需要优化的条件包括： 1 ) 提取咖啡因条件的优化：咖啡因易溶于热水，影响其溶解量的因素有三个：茶水 比例、水浴温度、水浴时间。那么究竟在什么条件下才能将茶叶中的咖啡因完全萃取到 水中呢。这需要通过实验来确定。选择茶水比例分别为1 ：5 0 、l ：1 0 0 、i ：1 5 0 、1 ：2 0 0 来进行优化，水浴温度为1 0 0 、9 0 、8 0 、7 0 ，水浴时间为5 删n 、1 妇l i l l 、1 5 m i n 、 2 0 m i n 。固定其中两个因素对另外一个因素进行考察，将搅拌棒放入接在器相色谱进样 口的特制解析器中按下面优化好的条件进行热解析，最后确定最佳提取条件。 2 ) 萃取条件的优化：以咖啡因加标水溶液为实验对象，包括搅拌棒的转速、水浴温 度、萃取时间。提高转速能加速待测物从样品基质到萃取涂层的扩散速度，从而提高萃 取速率：从公式( 1 - 2 ) 可以看出，水浴温度越高，分配系数k 括越大，在相同时间内吸附 的待测物的量就越多；随萃取时问增长，萃取会逐渐达到平衡，但是由公式( 1 1 ) 可知， 只要每次试验的萃取时间固定，吸附的待测物质的量就是一定的，所以通过试验选区 个萃取时间使咖啡因的萃取量尽量多而又节省时间。 3 1 解析条件的优化：包括解析温度和解析时间。解析温度臻高于咖啡因的汽化温度一 同时又不能太高，以免导致萃取涂层的流失。在解析时间内要使萃取的咖啡因解析完全， 同时不髓时间过长，香贝u 会影响试验效率，同时萃取涂层流失影响谱图效果和定量结果。 掇取咖啡因搅拌萃取 康蛊矗 圈4 实骑流程田 f 遮i m l e p c c s s 鳓妇 4 ) 穷法译徐：萃凝结象嚣箩国捻测嚣溅定，井栎法裳量，考察君法靛蜀靠性包括准 确发、糙密度、灵敏发以及与实验) 、( 习懿结暴攘魄有释优越憔。 沈阳农业大学硕士学位论文 2 1 实验材料 2 1 1 试剂 咖啡碱标准样品 甲醇 三氯甲烷 氧化镁 乙酸 n ，n 二甲基酰胺 娃哈哈饮用纯净水 2 1 2 实验样品 水仙绿茶，铁观音 2 2 实验仪器 第二章材料与方法 色谱纯 色谱纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 s i 舯a 公司 s i g m a 公司 沈阳化学试剂厂 沈阳化学试剂厂 沈阳化学试剂厂 沈阳化学试剂厂 杭州娃哈哈集团 中国茶叶研究所提供 w a r 执n 气相色谱仪配f i d 检测器 ， r i a n 公司，美国 a g i l e n t 6 8 9 0 n 气相色谱仪配掰d 搬测器 安擒伦公司，荚国 高效液相色谱仪美国w 砒e s 公司 分析天平( 感量o 0 l m g ) 梅特勒- 托利多仪器有限公司 电子调温万用炉。一1 0 0 0 瓦，龙日市先科仅器公镯 瑶5 弹经石英毛懿管柱 3 0 m o 2 5 m m x o 2 5 社m ) 惠瞀公司，美国 d f 。l o l s 集熬臻整漩热熬磁力搅摔器巩义是荚裕玉华袄器厂 s 毯。掇疆繇承式寞空泵现义荚裕予华佼器厂 l 搬l 密瓣瓶武汉大学 自割热解援爨，囊制固态吸黔揽抟箨 2 3 色谱条件 滚攘色落：s * e 1 8 柱3 2 鞋瓿i 。莲。x 1 5 娩l l 珏，5 洋) ，滚淤辎v ( 水) ：v ( 零赘) ：v ( 乙 酸) - v ( n n 一二甲基醌胺，d m f ) _ 8 0 ：2 0 ：0 驰啦。2 5 ，煎谱柱遗为室涩，遴撵爨o 。5 珏l ，紫外捡 测器波长为2 7 0 n m 。 气棚色谱：为保 疆试验结果的可比性，设定溶期j 萃取- 气相色谱法驰s b s e 气耜色 谱法二者的色谱条件相同：h p - 5 弹性石英毛细管棱( 3 0 m x 0 2 5 m m o 2 s 弘m ) ，柱漩8 0 第二章材料与方法 ( 1 0 m i n ) 8 。椭m 、2 6 0 ( 2 0 m 蛐，冷柱头进样口，温度2 5 0 ，检测器3 0 0 ，h 2 做载气， 流量l m l m i n ，解析器温度2 6 0 。 2 4 方法原理与技术路线 2 4 1 方法原理 咖啡因易溶于热水，沸水冲泡茶叶，用涂有特定涂层的固态吸附搅拌棒将茶水中的 咖啡因萃取出来，经过热解析，便可通过载气将咖啡因吹入气相色谱中测定。在样品体 积、涂层体积、萃取条件固定的情况下，萃取量与待测物的初始浓度成正比，根据这个 原理采用外标法定量，保留时间定性。 一姿堕壅些盔堂翌圭兰垡鲨兰 2 5 实验方法 首先