（微生物学专业论文）高产木聚糖酶芽孢杆菌的分离筛选及其酶性质研究.pdf

摘要 本研究采用粗木聚糖半纤维素为唯一碳源制作初筛培养基，以透明圈直径和透明 度为指标的筛选方法，从牛、羊瘤胃内容物、收获后玉米地秸秆周围的土壤、奶牛场 牛粪等样品中分离得到6 1 株产生明显透明圈的芽孢杆菌菌株；再通过摇瓶发酵，d n s 法检测酶活的复筛方法得到两株高产木聚糖酶的芽孢杆菌菌株l 2 1 9 和y 2 5 。经形态、 培养特征鉴别和生化鉴定，两株菌分别为短小芽孢杆菌( 丑p u m i l u s ) 和枯草芽孢杆 菌( 最s u b l i t i s ) 。 基于对木聚糖酶研究的需要，探讨了从玉米芯中提取木聚糖的工艺条件。综合蒸 煮法及碱提取法的优点，采用先蒸煮、后碱提取、再用酒精沉淀的方法，得到半纤维 素含量为6 3 4 ，提取率为2 7 6 的粗木聚糖产品。 菌株摇瓶发酵产酶条件的优化试验表明：l 2 一1 9 菌株以麸皮为最佳碳源，酵母膏 为最佳氮源；y 2 5 菌株以麸皮为最佳碳源，( n h ，) ：s 0 ，为最佳氮源。这两株菌的摇瓶发 酵培养基最适初始p h 值为5 ，0 ，在p h 值为7 ，0 时仍能分别达到最大酶活的9 8 2 和 9 7 5 。l 2 1 9 和y 2 5 菌株产酶活力随着装液量的增多而降低。 木聚糖酶粗酶液的基本性质为：l 2 1 9 酶液的最适反应温度为5 0 。c 、最适反应 p h 为7 0 ，酶液在p n 6 0 时稳定性最好，但在p h 4 o - 1 0 0 范围内相对酶活均在7 5 以上；y 2 5 酶液的最适反应温度为5 0 。c 、最适反应p h 为6 0 ，酶液在p h 6 o 时稳定 性最好，但在p h 5 0 - 9 0 范围内相对酶活保持在接近7 5 或以上，说明l 2 1 9 和y 2 5 菌株所产酶都能在较大p h 范围内保持稳定。l 2 1 9 和y 2 5 在4 0 * 0 以下热稳定性好。 木聚糖酶的s d s - p a g e 电泳和活性染色试验表明：对l 2 1 9 菌株发酵液取 5 0 ( n h 4 ) ：s o 。饱和度以下的盐析蛋白电泳分析，有5 条酶带，分别为1 1 5 k d 、1 5 4 k d 、 1 7 8 k d 、2 0 9 k d 、3 2 8 k d ，活性染色证明其中1 7 8 k d 、2 0 9 k d 和3 2 8 k d 三条酶带具 有木聚糖酶活性：对y 2 5 取6 0 ( n h 。) 。s o 。饱和度以下的盐析蛋白电泳分析，有6 条酶 带，分别为1 1 5 k d 、1 2 4 k d 、1 9 7 k d 、2 7 2 k d 、4 3 ，o k d 、4 6 8 k d ，活性染色证明其 中1 9 7 k d 和2 7 2 k d 两条酶带具有木聚糖酶活性。 安全性试验以小白鼠为实验动物，通过经口灌胃和腹腔注射两个途径对l 2 一1 9 和y 2 5 菌株进行急性毒性试验。灌胃组和注射组均健康存活，体重增加，与对照组相 比差异性不显著，证明l 2 - 1 9 和y 2 5 菌株对小白鼠安全无毒。 关键词：木聚糖木聚糖酶芽孢杆菌酶学性质 s e l e c t i o no fb a c i l l u ss p p o v e r p r o d u c i n gx y l a n a s e a n ds t u d i e so ne n z y m i cp r o p e r t i e s s i c h u a n a g r i c u l t u r a lu n i v e r s i t y y a a n , s i c h u a n , c h i n a , 6 2 5 0 1 4 a b s t r a c t x y l a n a s ep r o d u c i n gs t r a i n s ( b a c i l l u ss p p ) w e r ei s o l a t e df r o mr u m i n a lc o n t e n t si n b u f f a l oa n dg o a t i s o l a t e so fb a c i l l u ss p p w e r eo b t a i n e da n da s s a y e df o rt h ex y l a n a s e a c t i v i t yw i t ham e t h o do ft r a n s p a r e n tz o n e s l 2 1 9a n dy 2 5s t r a i n sp r e s e n t e dt h eh i g h e s t a c t i v i t yw e r es e l e c t e df o rf u r t h e ri n v e s t i g a t i o ni nd e t a i l a c c o r d i n g t ot h em o r p h o l o g i c a l a n dp h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ，t w os t r a i n sw e r ei d e n t i f i e d a sb a c i l l sp u m i l u sa n d b a c i l l u ss u b t l t i sr e s p e c t i v e l y b a s e do nt h es t u d yo fx y l a n a s e ，t h ee x t r a c t i n gm e t h o d sa n dc o n d i t i o n so fx y l a nf r o m c o r nc o bw e r ei m p r o v e d t h ev i r t u eo ft h ec o o k i n gm e t h o dw a si n t e g r a t e dw i t ht h ea i k a l i e x t r a c t i n gm e t h o d t h em a i np r o c e s so fe x t r a c t i n gc o n s i s t so fc o o k i n g ，a l k a l i n es o a k ，a n d d e p o s i t i n g t h ec o n t e n to f h e m i c e l l u l o s ei nt h ec r u d ex y l a np r o d u c t i s6 3 4 a n dt h er a t i o o f e x t r a c t i n gi s2 7 6 t h ec u l t u r ec o n d i t i o n st h a tc a ni n f l u e n c et h eg r o w t ha n de n z y m ep r o d u c t i o nw e r e i n v e s t i g a t e d t h eb e s tc o n d i t i o nf o rl 2 1 9p r o d u c ex y l a n a s ew e r ew h e a tb r a nu s e da s c a r b o na n dy e a s ta sn i t r o g e ns o u r c e w h e nw h e a tb r a nw a su s e da sc a r b o na n d ( n h 4 ) 2 s o a a sn i t r o g e ns o u r c e ，t h ex y l a n a s ep r o d u c t i o no fy 2 5r e a c h e dt h em a x i m a l b o t ht h es t r a i n s r e a c hm a x i m u ma c t i v i t ya ti n t i t i a lp h6 0a n de n o u g ho x y g e n t h ec r u d ex y l a n a s eo fl 2 1 9s t r a i nk e p tm a x i m a l l ya c t i v ea tp h 7 0a n d5 0 c ，b e s t a b l ea tp h 6 o ；a n dw a ss t a b l eo v e raw i d ep sr a n g eo f 4 0 1 0 0 t h ec r u d ee n z y m eo f y 2 5 s t r a i nk e p tm a x i m a l l ya c t i v ea tp h 6 0a n d5 0 c ，b es t a b l ea tp h 6 o ；a n dw a ss t a b l eo v e ra w i d ep hr a n g eo f5 0 9 0 t h ec r u d ee n z y m eo fl 2 1 9a n dy 2 5s t r a i n sa l lk e p ts t a b l e b e l o w4 0 ，她j s d s p a g ea n da c t i v i t ys t a i n i n ga n a l y s i sr e v e a l e dt h el 2 - 1 9a n dy 2 5s t r a i n sw e r e a b l et op r o d u c eac o n s i d e r a b l ea m o u n to fx y l a n a s ew i t hh i g hl e v e l so fa c t i v i t y t h e m o l e c u l a rw e i g h to f m a j o rp r o t e i n sa r ea b o u t1 7 8 k d 、2 0 9 k d 、3 2 8 k da n d1 9 7 k d 、 2 7 2 k dr e s p e c t i v e l y t h es a f et e s tw a sc a r r i e do u tb yd r e n c h i n ga n di n j e c t i n go fs u s p e n s i o no fl 2 1 9a n d y 2 5i n t oa b d o m e no f m i c e t 1 l er e s u l t ss h o w e dt h a tt h es t r a i nl 2 1 9a n dy 2 5w e r es a f et o m i c e ，a n dv e r yc l o s et ot h en o r m a lc o n t r o lg r o u pa n dp r o m o t e dw e i g h ts i g n i f i c a n t l y k e yw o r a s ：x y l a nx y l a n a s e b a c i l l u ss p p e n z y m i cp r o p e r t i e s t i 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学 位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名 冷e 山 湘6 年6 月2 - 0e l 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式 在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名：条b 孢j 导师签名 ( q 争劫 。细e 年6 月泖日 z o o ( ，年s 只2 ，也e l l 刖旨 1 1 木聚糖 1 1 1 木聚糖的性质 木聚糖属于半纤维素的一种，它是被子植物( 阔叶木和禾本科) 细胞壁中最主要 的半纤维素，含量仅次于纤维素，是自然界丰富的可再生资源之- - ”。半纤维素是植 物细胞壁中除纤维素、木素、果胶质、淀粉以外的一种重要多糖。存在于木质素和纤 维素的下面，起着黏合剂的作用，把木质素和纤维素紧紧拉在一起，共同构成细胞壁 的支持体系 2 1 。 半纤维素不是一种均一的聚糖，而是一群复合聚糖的总称，组成半纤维素的结构 单元( 糖基) 主要有：d - 木糖、d 一甘露糖、d 一葡萄糖基、d 一半乳糖基、l 一阿拉伯糖、4 一o 甲基一d 一葡萄糖醛酸基、d 一半乳糖醛酸基和d 一葡萄糖醛酸基等，还有少量的l 一鼠李糖 基、l 一岩藻糖基以及各种带有氧甲基、乙酰基的中性糖基。这些结构单元在构成半纤 维素时，若是由一种结构单元构成一种均一的聚糖，称为同聚糖；而一般情况下是由 2 4 种结构单元构成的不均一的聚糖，聚合度( 简称d p ，指多聚物中所含单体数) 较 低，一般不超过2 0 0 ，常见是8 0 一1 2 0 【3 】。 禾本科植物的半纤维素主要是木聚糖类，在这类植物中，己发现了不同分子特性 的木聚糖，如西班牙草中主要是只由木糖基构成的线状均一的木聚糖，热带草中主要 是高分枝度的木聚糖，禾草类中主要是阿拉伯糖一4 一o _ 甲基葡萄糖醛酸木聚糖州。 1 1 2 木聚糖的结构特征 木聚糖的主要成分是d 一木糖，能够被微生物细胞转化成为单细胞蛋白质和能量 来源的一种五碳糖。木聚糖的主链是由1 3 1 ，4 一糖苷键连接的吡喃木糖残基构成的半 纤维素，它们与纤维素分子间可以形成氢键。其种类因主侧链糖基上取代基团种类不 同而不同。同型木聚糖主要是由木糖残基构成，这种木聚糖在自然界不多见，仅见于 茅草、烟草和某些种子的外壳中( 如瓜尔豆种子壳) 。大部分木聚糖是异质多糖，即在 主链和侧链上含有不同的取代基团，主链上最常见的取代基团是乙酰基，阿拉伯糖基 和葡萄糖醛酸基 5 1 。 按照主链上取代基的特征，一般将木聚糖分为硬木木聚糖和软木木聚糖 6 - s ： 硬木木聚糖是高度乙酰化的，由o _ 乙酰基一o 一甲基葡萄糖醛酰木糖聚合而成，含 7 0 个以上的吡喃型木糖残基，以b 一1 ，4 - 葡萄糖苷键相连，每隔1 0 个木糖残基就有 i 个4 - o 一甲基葡萄糖醛酸基团位于其c 2 位。 软木木聚糖是非乙酰化的，代替乙酰基的是a - l 一呋喃型阿拉伯糖基，即由阿拉 伯一4 一o _ 甲基葡萄糖醛酰木聚糖残基聚合而成，聚合度、分枝均少于硬木木聚糖【9 1 。 4 - 0 - 甲基葡萄糖醛酸基的含量比在硬木木聚糖中的高，也位于木糖残基的c ：位。 此外，绝大多数木聚糖具有侧链，最常见的侧链是连接在木糖残基o - 2 或o _ 3 上 的呋喃阿拉伯糖。此外，常见的取代基还有乙酰基、阿拉伯糖基、葡萄糖醛酸残基、 阿魏酸、香豆酸等侧链基团【l “。木聚糖主链上发生阿拉伯糖基取代的程度、侧链的 多少，在很大的程度上决定了木聚糖的溶解性及其与纤维素结合的能力。 本文用作筛选产木聚糖酶菌株诱导物的玉米芯木聚糖属于软木木聚糖，即阿拉伯 - 4 - 0 - 甲基葡萄糖醛酸木聚糖【3 】。聚合度较低( 7 0 - 1 3 0d p ) ，分枝较少，是以d - p i t 哺式 木糖基以1 1 ，4 一糖苷键连接起来的长链作为主链，一般在c ：位置上连接有4 一o _ 甲基一 葡萄糖醛酸基或葡萄糖醛酸基支链，另外在主链糖基上连接有阿拉伯糖基支链，比例 为木糖基：阿拉伯糖基= 1 0 ：1 2 0 ：1 。具体化学结构如图l 所示。 黪? 曩鎏誊黪豢器 囊 一i j 。 确p 旗簟1 ；神獯帮l 蝴陋i 釉卅e 颦洳 、j 爹誉一参i i。ii 墨 。喾。警舔蟊蕈爹：螽蔺赫涵攀 ? 一t 。7 ；毒i i - j ，；i 。v - * i ；j p - 拉- x p 謦麟畦藕j ! l ；簟善，i 。 1 , 4 r a n n o , k 嚣控萎赫 i 一n 蠹h 一乱孵i 蛐拍舶ii 一涓投骺l i r b - u w w m u 4 - o m e l 6 y l 噜l l t a r e n o , + o - 甲m - 1 1 一嚣曩羞 图1 玉米芯木聚糖的化学结构1 1 1 】 f i g 1c h e m i c a ls t r u c t u r eo fc o r n c o bx y l a n 1 2 木聚糖酶 木聚糖酶属于水解酶类，是木聚糖的主要分解工具。木聚糖是一种杂合多聚分子， 结构变化很大，相应的木聚糖酶也不是单一的一种酶，而是一组可以将之降解成低聚 糖和木糖的复合酶系【1 2 】。 国外早在上个世纪6 0 年代就已开始对木聚糖酶的研究，已经从不同来源的微生 2 物中分离到大量不同类型，不同功能的木聚糖酶【1 3 】。微生物所产酶系差别较大，但 总体来说，作用于主链的主要有三种酶f 1 4 1 ：内切b 一1 ，4 - 木聚糖酶、外切b l ，4 一 木聚糖酶和b 一木糖苷酶。内切b l ，4 一木聚糖酶作用于主链上的木聚糖苷键，随机 切断主链内的糖苷键而生成分子量大小不同的寡糖。外切b 一1 ，4 一木聚糖酶主要是从 非还原性末端切下一个个单糖。b 一木糖苷酶则负责将木二糖水解成两个木糖单糖。 另外，木聚糖侧链不同的取代基还需要不同的特异性酶1 5 1 共同作用才能够将木聚糖 彻底水解成单糖，比如说阿拉伯糖苷酶f 1 6 1 、葡萄糖苷酶、乙酰木聚糖酶等等。 1 2 1 木聚糖酶的分类地位 1 9 9 3 年h e n r i s s a t 和b a i r o c h 1 7 1 根据酶的结构片断的同源性( h o m o l o g y ) 与疏水 性( h y d r o p h o b i cc l u s t e r ) 的不同，将糖苷酶分成不同家族，所有的木聚糖酶都属于 f i o 或c 1 1 族。 f t o 家族的木聚糖酶有一个纤维素结合域( c e l l u l o s e b i n d i n gd o m a i n ) 和一个 活性中心，中间通过一段很灵活的铰链区相连【1 8 1 。这个家族的木聚糖酶常常同时具 有纤维素酶活性，它们具有较大的分子量( 一般分子量大于3 0 k d ) ；对木聚糖的水解 速度快，水解产物为低分子量的寡糖( 聚合度i - 5 d p 左右) ，该族还包括对纤维素和木 聚糖都有水解作用的非特异的葡聚糖酶。 g 1 1 家族木聚糖酶专一性非常高，它们没有纤维素酶活性，因此它们是真正意义 上的木聚糖酶1 9 】。该族的木聚糖酶的分子量小，酶的同源性强，序列相同性从4 0 到 9 0 不等：但对木聚糖的水解速度相对较慢，水解产物为聚合度5 一i o d p 左右的木寡糖。 细菌和真菌都能产生第1 l 家族的木聚糖酶。 不同木聚糖酶分子在氨基酸组成数目上相差很大，但催化区在大小上比较一致 2 0 1 。同一族中的木聚糖酶催化区r 域具有较高的同源性，根据己知酶可以推测未知酶 的催化特性。木聚糖酶的多样性是与木聚糖结构多样性一致的2 1 1 。由于不同来源的 木聚糖的主链的聚合度不同，支链残基的种类、数量、长度以及在主链上结合位点的 不同，所以需要有不同类型的木聚糖酶专一性降解。从分子角度来讲，通常是由多个 基因表达为几种同工酶形式，也可能由单个基因通过转录后修饰产生多个不同产物所 致 1 9 , 2 2 1 。这些转录后修饰包括m r n a 的剪切，翻译后的糖基化、酰胺化修饰、亚基的聚 合等【2 2 】。 1 2 2 木聚糖酶的合成 大部分木聚糖酶属于诱导性酶，有效产生木聚糖酶的关键因素是选择合适的诱导 底物和最佳的培养基组成2 3 1 。如控制较高的c n 比，在培养基中加入半纤维素类物 质等。廉价的半纤维素物质如玉米秆、麦麸2 4 1 、米糠、蔗渣【2 5 1 和稻秆都是合适的选 择。 影响木聚糖酶产率的因素包括发酵条件和各种起关键作用的因子。各种因子对于 木聚糖酶的表达有综合效应，它们包括底物的可溶性，低聚木糖的释放速度、数量、 化学特性和所能够产生的木糖数量【2 6 1 。木糖可以起到碳源作用，但随着木糖的释放 累计又会对木聚糖酶的形成产生抑制。木聚糖酶与底物的结合紧密，在发酵过程中产 生的一部分木聚糖酶会结合在不溶性底物上而被丢失。此外，产木聚糖酶菌株的代谢 酶，包括蛋白酶和糖苷转移酶类，都会影响到木聚糖酶的产率。 由细菌和真菌产生的木聚糖酶通常是诱导型的，但也有很少一些木聚糖酶是组成 型的。一般来讲，木聚糖酶的诱导是复杂的，其诱导水平也因微生物的不同而相差较 大 2 7 j 。一些曲霉属微生物在以松树木聚糖为诱导底物时，比使用其它来源的木聚糖 底物时所产生的木聚糖酶的稳定性要高 2 5 】。在有木糖存在时最p u n i l u s ， s t r e p t o m y c e sl i v i d a n s 和a u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n s 都会获得较高的木聚糖酶活性， 但是对于c y y p t o c o c c u sa l b i d u s ，木糖则会抑制木聚糖酶的合成，而对于耐热放线 菌而言，木糖则不影响木聚糖酶的合成28 1 。目前已经证实作为诱导物的低分子量物 质需要转移酶的作用才能被转送进入细胞质，因此诱导物的水平以及所需的转移酶量 都影响木聚糖酶的合成口9 1 。 此外，由葡萄糖引起的代谢阻抑是木聚糖酶合成中的普遍现象。木聚糖酶基因的 代谢阻抑似乎控制在两个水平，直接由基因转录阻抑和非直接的转录激活因子的阻 抑。当培养基中存在易代谢的碳源时，酶的合成会受到阻抑，表明酶的合成受到过渡 态调节物和代谢阻抑的控制 3 0 】。 1 2 3 木聚糖酶的催化反应机理【3 l 】 木聚糖酶的水解反应是典型的酸碱和亲核水解反应，根据产物构象的不同，木 聚糖酶降解木聚糖的催化反应可分为两大类，即保持异头构型的两步置换反应和形成 倒位异头构型的一步置换反应。 ( 1 ) 保持异头构型的两步置换反应 在木聚糖酶的活性中心可以结合6 个木糖苷残基，催化反应第一步是活性位点 的g l u 残基的羧基作为质子供体，将h + 提供给c i o h 键的0 4 上，这样c 1 0 4 、键断 裂，并产生具有环内正碳离子的中间过渡物。第二步产生的糖基片段从活性部位移去。 第三步正碳离子的形成促使初始还原糖的环发生变形，并通过与离子化的g l u a s p 的羧基的静电作用而稳定。第四步水分子从糖苷的氧侧进入，被第一步产生的离子化 的g l u 羧基解离，这导致o h 离子与正碳离子反应，同时g l u 的羧基重新质子化被还 原。这种机制中，质子化的g l u 先是作为普通酸催化剂，在反应中使h + 变为离子， 后作为普通碱催化剂，激活进入的水分子，因此，反应产物可保持异头构型。 ( 2 ) 倒位异头构型的一步置换反应 一步置换反应是由一个普通酸g l u ，一个普通碱g l u a s p 和亲核水分子的攻击 一次完成的。在这个过程中酸催化剂g l u 的c o o h 提供旷给以0 4 、，碱催化剂 g i u + a s p 。作用于亲核试剂h 2 0 ，使h 2 0 中o h 。与正碳离子作用，加入羟基，但羟基 的异头构型发生倒置。另外，产生的h + 通过扩散与离子化的酸催化剂结合，恢复质 子状态。 1 2 4 木聚糖酶的来源 木聚糖酶在自然界分布广泛，对于降解自然界大量的半纤维素起着重要作用【3 2 ”】。在海洋及陆地细菌、海洋藻类、真菌、酵母、放线菌和反刍动物瘤胃、蜗牛、甲 壳动物、陆地植物组织和各种无脊椎动物中都存在。目前，报道产木聚糖酶的微生物 多从木霉、曲霉、青霉、链霉菌等真菌及芽孢杆菌中分离得到，具体见表1 。 表1 产木聚糖酶微生物的多样性 t a b l e1 ：m u l t i f o r m i t yo f x y l a n a s ei nm i c r o o r g a n i s m 1 2 5 木聚糖酶的应用 木聚糖酶具有重要的应用价值，主要集中在饲料、食品和造纸工业方面。 ( 1 ) 在饲料工业中的应用 小麦、黑麦、稻谷、麸皮、米糠等饲料原料中存在大量的戊聚糖，这种非淀粉多 糖对动物消化吸收存在一定的抗营养作用，木聚糖酶是重要的非淀粉多糖降解酶，通 过大量降解其中的木聚糖起到促进消化吸收的作用。另外，饲料中添加木聚糖酶可以 降低肠道内容物的粘度，发挥促进生长和提高饲料转化效率的作用；能够提高内源性 消化酶的活性，促进养分的消化吸收；能减少肠道微生物的数量，减少疾病，利于健 康：能够破坏植物细胞壁结构，减少粪便，降低污染7 “。 木聚糖酶常应用于牛、羊、猪、禽类饲料。有报道称至2 0 0 2 年世界各国约8 0 的 肉鸡小麦基础日粮均添加木聚糖酶复合酶制剂，其效果与玉米一豆粕日粮相同【7 5 1 。目 前已有许多报道，木聚糖酶应用于畜禽生产中取得了良好的生产效果和经济效益。 在禽类饲料中的应用 c h o c t 和a n n i s o n 【76 】报道，在肉鸡的小麦饲粮中，阿拉伯木聚糖含量与表观代谢 能、氮沉积、饲料转化率和增重下降相关，含4 阿拉伯木聚糖的小麦日粮，使淀粉、 蛋白质和脂肪的消化率分别下降1 4 6 、1 8 7 、2 5 8 ，在添加木聚糖酶后，相应的 指标都得到了改善。试验表明小麦型日粮中添加木聚糖酶，肉鸡生长性能和饲料转化 率与玉米相同，甚至可超过玉米日粮。p a r t r o d g e 和w y a t t 7 7 悃不同比例的小麦代替肉 鸡日粮中的玉米而不加酶，当小麦用量达2 0 时，肠道粘稠度增加，但生产性能未受 到明显影响，到小麦用量达4 0 时，就出现了负效应，如在此水平加酶，肉鸡的增重 量仍能达到或超过玉米对照组。g a l a n t e 等f 7 8 1 试验发现，1 3 一葡聚糖酶与木聚糖酶能 提高肉鸡、雏鸡和母鸡的饲料消化率、营养物质吸收率及日增重。d a n i c h e 等【7 9 】在高 戊聚糖含量肉鸡日粮中研究脂肪类型与酶添加量之间的关系时发现，每千克日粮中以 4 0g 大豆油与6 0g 牛油比例添加，添加木聚糖酶能有效地改善脂肪与脂肪酸消化率 以及能量转化率。朱元招等【】在对1 日龄樱桃谷肉鸭的饲养试验中发现，添加酶制 剂l ( 以b 一葡聚糖酶、木聚糖酶、蛋白酶与果胶酶为主) 和酶制剂2 ( 以淀粉酶、木聚 糖酶与蛋白酶为主) 的试验组比对照组的日增重分别高出5 5 7 和4 5 9 ，料重比分 别降低6 9 7 和4 8 3 ，稀粪率也均显著下降，而各组死亡率未见明显差异。j a n s s e n s 等【8 1 】在用酶制剂( 含木聚糖酶、b 一葡聚糖酶、果胶酶和半纤维素酶) 饲喂青年赛鸽时 发现，鸽子比普通家禽的效果更显著。 在猪饲料中的应用 木聚糖酶能降低猪饲料成本，减少饲料浪费。冯定远【8 2 】报道，在2 0 6 0 蚝生长育 肥猪的次粉或小麦日粮中添加5 木聚糖酶制剂可提高日增重和饲料转化率，降低腹 泻频率，健康状况明显改善。p r o k o p 8 3 】报道，木聚糖酶和蛋白酶组成的酶制剂应用于 仔猪，能提高仔猪日增重，降低仔猪死亡率，且能使蛋白质消化率提高3 ，氨基酸 浓度提高3 5 ( p 0 o i ) ，纤维消化率提高1 7 ( p 0 0 1 ) ，氮利用率提高1 0 ( p o 0 1 ) ， 蛋白质沉积率提高9 伊 o 0 1 ) 。d r e s c h e l 等【8 4 】报道，木聚糖酶和葡聚糖酶组成的酶制 剂，能使饲喂大麦型日粮猪的盲肠纤维消化率由7 提高到5 7 ，而盲肠蛋白质、纤 维及脂肪消化率的提高又使代谢能增加了大约0 5 m j k g 。这些结果显示，酶制剂能显 著提高大麦型日粮生长猪的消化能力和生长性能。g o l l n i s c h 等【8 5 1 试验发现，木聚糖酶 能和卑霉素一样降低回肠和结肠中的致病性大肠杆菌和c p e r 伍n g e n s 的数量。许梓荣 等【8 6 l 在研究木聚糖酶、葡聚糖酶和纤维素酶组成的复合酶制剂( g x c ) 对5 6 日龄仔猪消 化性能的影响时发现，在含3 5 麦麸的饲粮中添j j i g x c3 0 m g k g ，使干物质、粗蛋白 质、粗脂肪、粗纤维、粗灰分的表观消化率分别提高11 2 3 、1 0 4 9 、3 0 8 3 、6 6 1 3 、 2 9 4 4 ；肠内容物粘度、粪中大肠杆菌数和腹泻频率分别降低2 5 7 7 、8 8 5 1 、 7 2 0 3 ；胃、胰、小肠的相对重量分别降低9 4 8 、8 9 4 、7 2 9 ；十二指肠内容物 总蛋白水解酶和淀粉酶活性分别提高2 0 9 6 、5 6 6 ；小肠绒毛高度提高2 2 9 4 ，且 微绒毛较长，数量多，均匀一致。 在反刍动物上的应用 l e w i s l 8 7 1 对喂以7 0 ：3 0 的干草大麦日粮( 干粮质基础) 的育肥期阉公牛的研究发 现，外源酶直接使用于干饲料上可提高饲料转化率。b e a u c h e m i n 鹊1 发现对饲喂大麦 基础日粮的育肥期阉公牛使用以木聚糖酶为主的酶制剂可使饲料效率提高1 1 。 h r i s t o v 1 8 9 在对多源多糖降解酶的研究试验发现，羧甲基纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶、口- 葡聚糖酶可以通过反刍动物前胃并在小肠中促进营养物质的吸收，十二指肠消化液的 木聚糖酶活力比对照组高出近3 0 倍。a l l i s t e r t 9 町( 1 9 9 9 ) 在对大麦青贮饲料和苜蓿青 贮饲料为基础日粮的牛使用酶制剂时，表现出总体重和平均日增重的增加。z o b e l l t 9 1 1 使用外源酶对生长育肥牛生长性能和饲料效率影响的研究中发现，饲料酶对动物生产 和畜体品质无影响，能够提高饲料利用率。i - i r i s t o v i 吲( 2 0 0 0 ) 在添加外源多糖降解 酶( e d p e ) 的试验中，对饲以大麦日粮的8 头母牛进行观察发现，酶处理显著降低了 瘤胃的p r i 值，增加了氨态氮的浓度，饲料干物质有效降解率显著增加。e d p e 同时显 著增加了瘤胃液中的葡聚糖酶、甲基纤维素酶和木聚糖酶的活性，降低了瘤胃消化液 的粘稠度，但不影响瘤胃液中淀粉酶的活性。酶处理也不影响泌尿系统中尿囊素和尿 酸的分泌，或血中葡萄糖的浓度。 l e w i s t 9 3 】报道，纤维水解酶( 主要是纤维素酶和木聚糖酶) 添加于饲料中能够提 高泌乳早期和泌乳中期奶牛的泌乳产量。y a n g 9 4 】在对泌乳期荷斯坦牛饲以纤维水解 酶的试验中亦发现，添加酶可提高饲料消化率和产奶量。 a n t u n o v i c 【9 5 】在研究多酶制剂对羔羊育肥和屠宰性能的试验中发现，以小麦、燕 麦、玉米的混合物添加由木聚糖酶、淀粉酶、n 蛋白酶、p 葡聚糖酶和纤维素酶组 成的多酶制剂与干草饲喂羔羊，试验组比对照组的混合物转化率高出1 8 ，干草转化 率高出5 6 ，日增重高出8 8 3 ，并且表现出良好的屠宰指数。 ( 2 ) 在造纸工业中的应用 在植物纤维中，木素和半纤维素之间通过醚键以木素碳水化合物复合体( l i g n i n c a r b o h y d r a r ec o m p l e x ，简称l c c ) 的形式存在。木素是原料和纸浆颜色的主要来源， 所以生产高白度的纸浆，必须除去木素。传统的造纸制浆工艺是利用烧碱等试剂蒸煮 麦草原料，再利用次氯酸进行漂白，在这个过程中排出大量致癌及剧毒有机物，污染 十分严重。1 9 5 6 年芬兰科学家发现用木聚糖酶处理纸浆，可以增加纸张白度，改善纸 张性能，降低漂白时含氯化合物的用量，加入木聚糖酶可以水解半纤维素，释放木素， 从而达到漂白的目的，减少环境污染，这一发现迅速应用于工业生产1 9 6 - 9 8 1 。 ( 3 ) 能源转化 现代能源短缺问题日益严重，植物纤维是地球上取之不尽的生物能源，将其转化 为乙醇作为工业生产直接利用的能源将具有巨大的经济效益，并且可以减少对环境的 污染，促进自然界碳素的循环。所以可以通过木聚糖酶等多种酶共同参与下使植物降 解为戊糖、己糖，再用其他菌株发酵生产乙醇，也有报道发现能把植物纤维直接转化 为乙醇的一些菌株 9 9 加1 1 。 ( 4 ) 功能性低聚木糖的生产 功能性低聚木糖是一类重要的功能性食品添加剂，具有不被消化性、无龋齿性、 可以促进人体对钙的吸收、具有显著的双歧杆菌增殖能力等多种生理功能，与其它功 能性低聚糖相比具有有效剂量低、酸碱稳定性好、选择性高等优点，目前己成为食品 工业上研究开发的热点。它是由2 7 个木糖残基以0 - 1 ，4 一糖苷键结合构成的低聚糖， 其中以木二糖、木三糖为主要有效成分。木聚糖酶作用于木聚糖的1 1 , 4 糖苷键，从 主链内部将其降解为聚合度较低的低聚木糖1 0 2 一1 。 1 3 产木聚糖酶芽孢杆菌的国内外研究现状 芽孢杆菌是一类广泛分布于自然界的微生物，它具有遗传背景稳定、营养要求低、 生长速度快等特点，在生物工业中得到广泛应用，因而利用芽孢杆菌产木聚糖酶的研 究更具潜力。 在国内，蔡敬民等【1 0 4 1 ( 1 9 9 6 ) 在安徽肥东县某稻田中分离得到一株芽孢杆菌l 2 3 ， 经3 7 c 培养5 0 h ，酶活为3 0 i u m l ，最适p h 值7 0 。孙迅掣1 0 5 1 ( 1 9 9 7 ) 从近2 0 0 份 土样中筛选出一株木聚糖酶高产菌株b a c i l l u s p u m i l u s h 一1 0 1 ，在适宜产酶培养基上培 养4 8 h 后，酶活达1 1 6 4 2 i u m l 。黄运红等 4 5 1 ( 2 0 0 2 ) 以蔗渣木聚糖为碳源，从甘蔗 根部泥土样品中分离得到一株蜂房芽孢杆菌( b a c i l l u s a l v e i ) ，振荡培养4 0 4 4 h 后， 发酵液中酶活力3 8 3 9 ，5 i u m l 。夏剑辉等【4 6 1 ( 2 0 0 3 ) 在优化工艺条件后发酵4 5 h ，该 菌产木聚糖酶活性最高可达7 4 4 7 i u m l ，比优化前提高9 4 。林捷等 1 0 6 ( 2 0 0 4 ) 在 土壤中分离到三株产木聚糖酶活较高的菌株l 0 6 ，l i o ，l 1l ，经鉴定均为芽孢杆菌。 后经紫外线( u v ) 、1 一甲基一3 一硝基1 一亚硝基胍( n t g ) 诱变筛选得到产木聚糖酶活 较高( 1 2 4 4 5 i u m 1 ) 的突变株l i o i g a 。 国外对芽孢杆菌木聚糖酶的研究开始的较早。主要应用于造纸、饲料、食品方面 和低聚木糖的生产。a n 3 a r eg e s s e s s e l l 0 7 】( 1 9 9 9 ) 以小麦麸皮作为底物进行固体发酵时， 芽孢杆菌a r - 0 0 9 f i 够产木聚糖酶活达7 2 0 u g ，木糖、乳糖、蔗糖和葡萄糖对木聚糖 酶的合成具有阻抑效应。l h a r b a k t ”1 ( 2 0 0 1 ) 通过小鼠的急性和亚急性口服毒性试验 对枯草芽孢杆菌表达的木聚糖酶用于烘烤工业操作助剂进行安全性评价，并对酶潜在 的致突变性和染色体畸变性在微生物和组织离体培养的条件下进行了测定，研究证实 没有致突变或染色体畸变的危险，生产这类木聚糖酶的机构已经被一些主要的全国性 的管理组织所接受并认为是安全的。j f i l i ox a n d r oh c c k 删( 2 0 0 3 ) 报道从亚马逊流域 分离得到的一株凝结芽孢杆菌，用豆渣作为底物固体发酵产木聚糖酶，该酶在较大的 温度范围( 4 5 7 5 c ) 和p h 范围( 4 5 1 0 0 ) 内保持较高酶活。l i c i al 锄a 4 7 1 ( 2 0 0 4 ) 自南极地带的靠近摩尔本山脉中心的地热土壤样品中筛选到一株分泌胞外木聚糖酶 ( 1 ，4 一d 一木聚糖酶) 和伊木糖苷酶的嗜热芽孢杆菌。 此外，也有报道短小芽孢杆菌( b p u m i l u s ) ，环状芽孢杆菌( b c i r c u l a n s ) 产木 聚糖的研究h 们。 1 4 本研究的目的意义 本研究拟从富含木聚糖半纤维素的样品中分离筛选出高产木聚糖酶的芽孢杆菌 菌株，并对其酶学性质进行系列研究，为进一步开发成为动物微生态制剂提供基础材 料。拟以“酶工厂”的形式将其添加到非反刍类动物饲料中，在发挥微生态调整功能的 同时，提高麦类饲料原料的消化利用率，提高畜禽生产性能，从而扩大饲料原料来源， 推动我国畜禽养殖业发展。 o 2 试验材料 2 1 菌株 芽孢杆菌l 2 1 9 ：分离自水牛瘤胃内容物，本试验分离获得： 芽孢杆菌y 2 5 ：分离自山羊瘤胃内容物，本试验分离获得。 2 2 实验动物 1 8 2 2 9 健康小白鼠，购自四川农业大学实验动物房。 2 3 主要仪器 紫外可见分光光度计( u v - 2 1 0 0 p c 型，上海尤尼科公司) 、数显调温水浴振荡器 ( h z s - h 型，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司) 、微型漩涡混合仪( w h 一1 型， 上海沪西分析仪器厂) 、台式p h 一2 5 型酸度计( 成都方舟科技开发公司) 、台式微型高 速离心机( d g w - 9 9 型，宁波新芝生物科技股份有限公司) 、光学显微镜 ( c h 2 0 b m 伍2 0 0 o l y m p u so p t i c a lc o ，l t d ) 、低速离心机( l d 4 2 型，北京医 用离心机厂) 、数显恒温水浴锅( h h 一6 型，金坛市富华仪器有限公司) 、电子天平、 恒温培养箱( 上海市跃进医疗器械一厂) 、电热鼓风干燥箱( 上海市实验仪器厂) 、手 提式压力蒸汽灭菌锅( 上海华线医用核子仪器有限公司) a 2 4 培养基 l = 初筛培养基：( g d k 2 h p 0 42 0n h 4 n 0 3 2 0 酵母膏5 0半纤维素1 0 p h6 0 1 2 1 2 0 m i n 湿热灭菌 透明圈测定培养基：( 同上，半纤维素添加量为2 0 9 1 ) 复筛培养基( 摇瓶发酵培养基) ：( g 1 ) 麸皮3 0 k 2 h p 0 4 2 0 m g s 0 4 7 h z o 0 2半纤维素1 0 p h 6 0 1 2 1 2 0 m i n 湿热灭菌 种子培养基( 普通营养肉汤) ：( g n ) 牛肉膏3 5 9蛋白胨1 0 9 p h 7 0 7 21 2 1 3 0 m i n 湿热灭菌 m g s 0 4 7 1 - 1 2 0 0 2 琼脂0 9 n h 4 n 0 32 0 n a c l3 0 n a c i5 9 2 5 试剂 p h 4 0 6 0 的o 0 5 m o l l 柠檬酸钠缓冲液； p h 7 0 8 0 的0 0 5 m 0 1 l n a 2 h p 0 4 - n a h 2 p 0 4 缓冲液； p h 9 0 1 0 0 的0 0 5 m o l lg l y c i n - n a o h 缓冲液；d o s n a 2 h p 0 4 一n a h 2 p o a ( p h 7 0 ) 缓冲液： 1 的刚果红水溶液： l m o l l 的n a c l 水溶液： 柠檬酸缓冲液( o 0 5 m o f l ，p h5 3 ) 称取1 0 5 磬荇檬酸( c 6 h 8 0 7 h 2 0 ) 溶解于约8 0 0 m l 蒸馏水中，用l m o l l 的n a o h 将p h 值调至5 3 ，再用蒸馏水定容至1 0 0 0 m l ； 木糖母液o o m m o l l ) 准确称取i 5 9 木糖溶解于柠檬酸缓冲液中，定容至1 0 0 0 m l ，室温下保存； 木聚糖溶液f 0 0 1 9 m l ) 准确称取1 o g 木聚糖( s i g m a 公司) 加入8 0 m 1 预热至6 0 的柠檬酸缓冲液，再加热至 沸点，同时磁力搅拌直至溶解，室温放置过夜，用柠檬酸缓冲液定容至1 0 0 m l ； d n s 试剂1 0 9 】 称取2 0 0 0 93 ，5 一二硝基水杨酸溶解于1 5 l 蒸馏水， j 1 人3 2 0 9 n a o h 并溶解，然 后逐渐j i i k 1 0 9 苯酚，1 0 9 亚硫酸钠，6 0 0 9 酒石酸钾钠，加热至4 5 c ，使上述试剂完全 溶解，冷却后定容至2 0 0 0 m l ，室温存放在棕色瓶中，2 周后方可使用。 3 试验方法 3 1 粗木聚糖的制备 3 1 1 提取流程 将玉米芯洗净后晒干，粉碎过4 0 目筛，加5 倍体积水浸泡并在1 3 5 蒸煮3 0 m i n 预处理，使玉米芯充分溶胀，破坏木聚糖木素复合结构；过滤，滤渣用流水冲洗后 再用1 0 n a o h 在8 0 c 浸提2 h ( 固液比为l g ：1 5 m l ) ，过滤取滤液，用6 m o l l h c l ( 浓盐酸) 中和到p h 4 5 5 5