（食品科学专业论文）坛紫菜R藻红蛋白的分离纯化及其稳定性研究.pdf

浙江工业大学硕士学位论文 坛紫菜r 藻红蛋白的分离纯化及其稳定性研究 坛紫菜r 一藻红蛋白的分离纯化及其稳定性研究 摘要 本文研究了从坛紫菜中提取，分离，纯化r - 藻红蛋白的方法， 并对其稳定性进行了分析和探讨。 分别采用反复冻融法、渗透压破碎法、超声波破碎法提取坛紫菜 中r 藻红蛋白，研究结果表明反复冻融法在2 0 与4 之间，冷 冻时间为3h ，反复冻融6 次效果最好。 采用硫酸铵盐析法、结晶法及超滤法对坛紫菜r - 藻红蛋白进行 分离，结果表明，先用3 5 饱和度的硫酸铵盐析除去杂蛋白和部分 藻蓝蛋白，再用6 0 饱和度的硫酸铵沉淀r 藻红蛋白，此后利用超 滤进行脱盐并浓缩后，纯度达到1 8 0 。 通过一步羟基磷灰石法实现坛紫菜r - 藻红蛋白与r - 藻蓝蛋白及 别藻蓝蛋白的完全分离，使其纯度达到3 2 0 ，再经d e a es e p h a r o s ef f 离子交换柱纯化，纯度达到5 3 0 ，大于国际通用标准( 4 o ) 。其最 大吸收峰位于5 6 5n l t l ，室温荧光发射峰位于5 7 5n n l 附近。用脲对坛 紫菜r - 藻红蛋白纯品进行变性处理后，通过s d s p a g e 分析，坛紫 菜r 藻红蛋白含有仅，p ，丫三个亚基，分子量分别是1 8 0k d a 、1 9 0 k d a 和3 7 0k d a 。 对影响坛紫菜r - 藻红蛋白稳定性的诸多因素进行研究，结果表 明，坛紫菜r - 藻红蛋白在4 0 以下、可见光强2 0 0 0l u x 以内及p h 浙江工业大学硕士学位论文坛紫菜r - 藻红蛋白的分离纯化及其稳定性研究 5 o 8 0 条件下相对稳定，适宜对其进行加工，但时间不宜过长，其中 4 、p h7 0 的避光条件为保存坛紫菜r - 藻红蛋白的最佳条件，同时 研究发现坛紫菜r 藻红蛋白所含两种藻胆色素的热稳定性关系为： p u b p e b ；此外，坛紫菜r - 藻红蛋白中不宜添力 1 f e 2 + 、f e 3 + 、c u 2 + 等金属离子，也不宜添；b l - 孚l 糖，而c a 2 + 、m 孑+ 、z n 2 + 、1 v i l l 2 + x t j 其稳定 性影响较小，可以添加。研究中还发现坛紫菜r - p e 的浓度对其稳定性 无影响，甘油不宜作其保护剂，而硫酸铵可用作荧光保护剂，使其长 期储存。 关键词：坛紫菜，r - 藻红蛋白，提取，分离，纯化，稳定性 t h es t u d yo ns e p ara t i o n ，p i 爪i f i c a t l 0 n a n ds t a b i l i t yo fr p h y c o e r y t h r i n f r o mp o r p h y rah a i t a n e n s is a bs t r a c t t h i st h e s i ss t u d i e dt h ee x t r a c t i o n , s e p a r a t i o n ，p u r i f i c a t i o no f r p h y c o e r y t h r i nf r o mp o r p h y r a h a i t a n e n s i sa n di t ss t a b i l i t y t h r e em e t h o d s ( r e p e a t e df r e e z i n g - t h a w i n g ，u l t r a s o n i ca n dh 2 0 e x p a n s i o n ) w e r ea p p l i e d t oe x t r a c tr - p h y c o e r y t h r i n t h er e s u l ts h o w st h a t 3hf o rf r e e z i n gt i m ea n ds i xc y c l e si nr e p e a t e df r e e z i n g - t h a w i n gr e a c h e d h i 曲e s tp u r i t y ；t h e r e f o r ei ti st h em o s ts u i t a b l ee x t r a c t i n gm e t h o d p r e c i p i t a t i o n ，c r y s t a la n du l t r a f i l t r a t i o nw e r ec o m p a r e d t os e p a r a t e r - p h y c o e r y t h r i nf r o mr - p h y c o c y a n i na n da l l o p h y c o c y a n i n 3 5 a n d6 0 o f ( n h 4 ) 2 s 0 4f o rt w o - s t e pp r e c i p i t a t i o nw a sb e t t e r ，t h ef i r s ts t e pt o r e m o v eo t h e rp r o t e i na n dt h es e c o n dt op r e c i p i t a t er - p h y c o e r y t h r i n ，a n d t h e nu l t r a f i l t r a t i o nw a sa p p l i e dt ow i p eo f fs a l ta n dc o n c e n t r a t e r - p h y c o e r y t h r i n ，w h i c hm a d e i t sp u r i t yr e a c h1 8 0 b a s e do no n e s t e ph y d r o x y a p a t i t ec h r o m a t o g r a p h ，r - p h y c o c y a n i n a n da l l o p h y c o c y a n i nw e r er e m o v e dc o m p l e t e l y , t h ep u r i t ya c h i e v e d3 2 0 ， a n da f t e rd e a es e p h a r o s ef f c h r o m a t o g r a p h ，i t sp u r i t yw a s5 3 0 ， e x c e e d4 0 ( i n t e r n a t i o n a lc o m m o ns t a n d a r d ) ，t h ep u r i f i e dr - p eh a d a m a x i m u ma b s o r p t i o np e a ka t56 5n m ，af l u o r e s c e n c ee m i s s i o np e a k a t 5 7 5n l n t h ep u r i f i e dr p ed e n a t u r e db yu r e a ，i t st h r e es u b u n i t sq ，p ，丫 w e r ec h e c k e db ys d s p a g e ，a n dt h em o l e c u l a rw e i g h t sw e r e17 0 ，18 0 a n d3 7 0k d ar e s p e c t i v e l y t h es t u d yo ni t ss t a b i l i t ys h o w st h a tr - p h y c o e r y t h r i nw a sr e l a t i v e l y s t a b l eu n d e rs u c hc o n d i t i o n sw h i c hf i t sf o ri t sp r o c e s sb u t n o tf o rl o n g ： t h et e m p e r a t u r er a n g e sf r o m4 t o4 0 ，p hr a n g e sf r o m5 0t o8 0 ， a n di nf a i n tl i g h tb e l o w 2 0 0 0l u x ，t h eb e s tc o n d i t i o n sf o rp r e s e r v i n gr - p e w a s4 ，p h7 0a n di nc o m p l e t e l yd a r k a n da r u l ew a sf o u n df o ri t s t w op h y c o b i l i n sa b o u tt h e i rs t a b i l i t yo nt e m p e r a t u r e ：p u b p e b t h e d e s 缸u c t i o ne f f e c t so ff e 2 + 、f e 3 + a n dc u 2 + o ni t ss t a b i l i t yw e r eo b v i o u s ， w h i l ec a 2 + 、m 9 2 + 、z n 2 + 、m n 2 + h a dn oa p p a r e n te f f e c t n oa d d i t i o no f l a c t o s en e i t h e r g l y c e r o lc a nn o tb eu s ea sap r o t e c tr e a g e n tw h i l e ( n i - 4 ) 2 s 0 4c a nb e u s e da saf l u o r e s c e n c e - p r o t e c tr e a g e n t k e yw o r d s ：p o r p h y r ah a i t a n e n s i s ，r - p h y c o e r y t h d n ，e x t r a c t i o n ， s e p a r a t i o n ，p u r i f i c a t i o n ，s t a b i l i t y 浙江工业大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行 研究工作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外，本论文 不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得浙江 工业大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出 重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的 法律责任。 储躲普前够 日期谚年r 肿日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密囱。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名：番憩 导师签名： 了五卜 日期：d 矿年多月乡。日 日期：谚年月多，日 浙江工业大学硕士学位论文 坛紫菜r - 藻红蛋白的分离纯化及其稳定性研究 1 1 藻胆蛋白概述 第一章文献综述 藻胆蛋白是红藻、蓝绿藻和隐藻中的“天线分子，它们能吸收光能并通过非 放射性过程将激发能传递到含有叶绿素的“反应中心 ，从而使海藻的光合作用得 以发生【1 1 0 对藻胆蛋白最初的研究主要集中在探讨其光合作用意义上，近年来发现， 藻胆蛋白在食品、化妆品、医药以及生物工程领域具有广阔的应用前景，因此， 如何获得生物活性较高的藻胆蛋白成为国内外研究的热点。 1 1 1 藻胆蛋白的来源及分类 藻胆蛋白( p h y c o b i l i p r o t e i n ) 是1 8 3 6 年e s e n b e c k 首次发现，并于1 8 4 3 年为k u i z i n g 命名的【2 】。它是海藻色素中除了叶绿素、胡萝卜素和叶黄素类油溶性色素之外的一 类水溶性并带有荧光的色素蛋白( c h r o m o p r o t e i n ) 。 藻胆蛋白是红藻( r h o d o p h y t a ) 、蓝藻( c y a n o p h y t a ) 、隐藻( c r y p t o p h y t a ) 和 少数甲藻( p y r r o p h y c e a e ) 中的捕光色素蛋白，可分为藻红蛋白( p h y e o e r y t h d n ， p e ，2 m a x - - 5 4 0 - 5 7 0n m ) 、藻蓝蛋白( p h y e o c y a n i n ，p c ，2 r n a x , - 一6 1 0 - - 6 2 0n m ) 、 别藻蓝蛋白( m l o p h y e o e y a n i n ，a p c ，2 r n a x , 6 5 0 - 6 5 5n m ) 和藻红蓝蛋白 ( p h y c o e r y t h r o e y a n i n ，p e c ，2 m a x - - - 5 7 0n m ) 四种【3 ，4 1 。 原来用c _ ，b 和r - 分别代表蓝藻门、红毛菜纲和红藻门的色素来源，由此以 藻胆蛋白类型来反映藻类的分类位置，如红藻门( r h y d o p h y t a ) 中含有的藻红蛋白 和藻蓝蛋白分别称为r - 藻红蛋白( r - p h y e o e r y t h r i n ，r - p e ) 和r 藻蓝蛋白( r - p h y e o c y a n i n ，r - p c ) 。红毛菜纲( b a n g i o p h y c e a e ) 的某些种，如紫球藻，似紫菜 ( s n u t h o r an a i a d u m ) 和索面目的繁花红线藻( r h o d o u h o r l a n f l o r i d u l u m ) 等的藻红 蛋白为b 藻红蛋白( b p h y c o e r y t h r i n ，b p e ) 。个别红藻含有b 藻红蛋白 ( b p h y e o e r y t h n n ，b - p e ) 。蓝藻中含有的藻红蛋白和藻蓝蛋白分别称为c 藻红蛋 白( c - p h y c o e r y t h r i n ，c p e ) 和c - 藻蓝蛋白( c p h y e o c y a n i n ，c p c ) 。红藻和蓝 浙江工业大学硕士学位论文 坛紫菜r 藻红蛋白的分离纯化及其稳定性研究 藻的不少种类还含有别藻蓝蛋白( a p c ) 【5 1 。现在这些字母只是用以表示具有不同 吸收光谱的色素类型。 r e u t e r 等t 6 指出藻胆蛋白按照光谱类型可以分为6 大类，分别是异藻蓝蛋白b ( a p b ) 、异藻蓝蛋白( a p c ) 、藻蓝蛋白( p c ) 、藻红蓝蛋白( p e c ) 、藻红 蛋白i ( p ei ) 和蓝藻中含有藻尿胆素的藻红蛋白i i ( p ei i ) 。r u w a n 等 7 1 根据 吸收光谱的特点，又将r 藻红蛋白分为3 类，分别是双峰型r 藻红蛋白( 仅有4 9 8 n m 、5 6 5n l n 吸收峰，5 3 5n m 为肩峰) 、三峰型i 型r - 藻红蛋白( 有3 个完全的吸 收峰，分别位于4 9 8n i n 、5 3 5n m 和5 6 5n m ，而且4 9 8r i m 的吸收峰低于5 6 5n m 和5 3 5 n m 的吸收峰) 和三峰型型r - 藻红蛋白( - qi 型r 藻红蛋白类似，也有3 个完 全的吸收峰，但4 9 8n m 的吸收峰高于其他两个吸收峰) 。 1 1 2 藻胆蛋白的结构 1 9 2 8 年，l e m b e r g 首次证明藻胆蛋白是由辅基和脱辅基蛋白所组成的，辅基即 四吡咯结构的色基，称为藻胆色素( p h y e o b i l i n ) 或发色团( c h r o m o p h o r e ) 【5 1 。 o h e o c h a 、s c h r a m 和k r o e s 都分离到了游离的色基，并且发现c 藻蓝蛋白仅含 有藻蓝胆素一种色基。o e a r r a 毛e r - 藻红蛋白中除发现有藻红胆素外，还发现吸收 峰位于4 9 5n m 处的“藻尿胆素一，在室温下用浓硫酸处理很难将其从脱辅基蛋白 中去除。b r y a n t 等在藻红蓝蛋白仅亚基中发现了色基“p h y c o b i l i v i o l i n ，它的结构 于1 9 8 7 年l 圭i b i s h o p 等确定 g l 。g l a z e r 等【9 1 指出藻胆蛋白中这4 种色基，藻红胆素 ( p e b ) 、藻蓝胆素( p c b ) 、藻尿胆素( p u b ) 和p h y e o b i l i v i o l i n ( p x b ) 是同分 异构体，它们的差异仅在双键位置的不同( 如图1 1 所示) 。 现己利用氨基酸序列分析的方法研究了脱辅基蛋白与色基结合的位置，并且 发现所有的色基均是与多肽链中的半胱氨酸残基以硫醚键共价结合，迄今已发现 六种连接方式( 如图1 1 所示) 。半胱氨酸残基的存在是色基与脱辅基蛋白共价交 联的必要条件，但不是充分条件【l 。 目前主要通过扩射线衍射法解析藻胆蛋白晶体结构来认识藻胆蛋白的高级结 构，近年来主要表现在高分辨率晶体结构研究。蓝藻中藻蓝蛋白三聚体、藻红蛋 白三聚体、别藻蓝蛋白三聚体等高分辨率晶体结构已被测定【1 2 1 ，扫描隧道显微镜 ( s n v l ) 和原子力显微镜( a f m ) 也被用于研究藻胆蛋白结构i l 3 1 4 j 。 2 浙江工业大学硕士学位论文坛紫菜r 藻红蛋白的分离纯化及其稳定性研究 hhh c y s p u b 一 c y s - p e b c y s - p x b d ic y s - p e b c y s p c b 图1 1 载体蛋白与发色团的连接方式f l l j f i g 1 - 1t h ec o n n e c t i n gt y p eo f p r o t e i na n dc h r o m o p h o r e 林启山等【1 5 】指出每分子藻胆蛋白含二条多肽链a 和d ( 如图1 2 所示) ，其分子 量大约为1 7 1 8k d a ，每条多肽链含一个或多个共价连结的色基。藻胆蛋白通常以 ( ap ) 3 三聚体或( qp ) 6 六聚体状态存在。王广策等【1 7 】从藻胆蛋白中分离得到丫 亚基，其分子量为3 0k d a ，d a g n o l oe 等还发现了t 亚基【1 8 】。 藻胆蛋白三聚体呈圆盘状，厚度为3 0 a ，直径为1 2 0a 。下图即为藻蓝蛋白的 “盘状”示意刚1 9 1 。关于y 亚基的存在位置至今未有定论，大多数人认为它极有可 能存在于藻胆蛋白的中央空洞中，但缺少直接的实验证据【1 4 1 。g l a z e r 等【2 0 1 认为它的 功能可能类似于“钉子 将两个三聚体盘“钉”在一起。 张成武等【2 l 】指出藻胆蛋白的颜色并不单是由发色团决定的，如藻蓝蛋白和别 藻蓝蛋白均带有藻蓝胆素，但前者的最大吸收值位于6 2 0i l i l l ，而后者的却在6 5 0 姗。在藻胆蛋白中，每个发色团的光谱学特性受构象和环境影响很大。此外，ab 单体之间的相互作用也很重要。如单聚体c 【p 别藻蓝蛋白在6 1 5n m 处有最大吸收值， 而三聚体( ap ) 3 别藻蓝蛋白的最大吸收值位于6 5 0n m 处。 3 浙江工业大学硕士学位论文 坛紫菜r - 藻红蛋白的分离纯化及其稳定性研究 ab 图1 - 2 ( a ) 伍亚基( b ) b 亚基的缎状示意图1 1 6 1 ，其中棒与球状物表示色基 f i g 1 - 2r i b b o nr e p r e s e n t a t i o no f ( a ) a - s u b u n i t ) 1 3 - s u b u n i t c h r o m o p h o r e sa r es h o w ni nb a l la n ds t i c kr e p r e s e n t a t i o n 图1 3 藻蓝蛋白啦b 3 三聚体“盘状”示意酬1 9 】 f i g 1 - 3t h es t r u c t u r e so fp h y c o c y a n i nc o m p o s e do f aa n dbs u b u n i t st of o r mc t 3 1 3 3 4 浙江工业大学硕士学位论文坛紫菜r - 藻红蛋白的分离纯化及其稳定性研究 当藻胆蛋白的多肽链呈线性延展时，就可以研究发色团在蛋白质上的连接位 置。别藻蓝蛋白含发色团的数目较少，连接在a 8 4 和p 一8 4 _ k ；藻蓝蛋白中三个发色 团连接在a 一8 4 、p 8 4 和b 1 5 5 _ k t 2 2 1 ；藻红蛋白有五个发色基团，分别连接在c 【8 4 、 q 一1 4 3 a 、p - 8 4 、p 一1 5 5 和p 一5 0 6 1 上，其中b 5 0 6 1 连接点可能是由于氨基酸取代 生成的【1 0 】；连接示意图如图1 4 。 a c 圃 图1 - 4 发色团在藻胆蛋白上具体连接位置的示意图【2 3 1 ，其中棒与球状物表示色基 f i g u r e1 - 4 p r o t e i n - - e h r o m o p h o r e ( s h o w ni nb a l la n ds t i c kr e p r e s e n t a t i o n ) i n t e r a c t i o n s 1 1 3 藻胆蛋白的能量传递 藻胆蛋自在生物体内以一定的顺序排列，组成藻胆体( 图1 3 ) 。藻胆体在内 囊体膜表面上规则地排列，藻胆体颗粒可能是椭圆形、半圆盘形或柱状，其大小 为7 1 0 6 1 5 1 0 6 d a 2 5 1 。 藻胆体的核心部位是别藻蓝蛋白，以别藻蓝蛋白为核心，向外放射状排列六 根由藻红蛋白和藻蓝蛋白组成的天线杆，在藻胆体内，能量传递的方向是藻红蛋 浙江工业大学硕士学位论文坛紫菜r 藻红蛋白的分离纯化及其稳定性研究 白一藻蓝蛋白一别藻蓝蛋白2 6 1 。各蛋白质之间由连接蛋白连接，这些连接蛋白除 了连接和固定藻胆体外，它们还调制藻胆蛋白最低激发单线态的能量。通过比较 从一种藻胆蛋白到另一种藻胆蛋白的能量转移动力学可以发现，离体的藻胆体完 全具有与在生物体内时一样的功能。 gv i o l a c e u s c p e g ( g l r l2 6 2 ) f d i p l o s i p h o ” c y t o p l a s m i cm e m b r a n e s a p c d o d e c 锄e r 艘h e r p c t r i m e r - p e t r i m e r o r o d l i n k e r r o d - c o r el i n k e r 刚护n o v e ll i n k e r 图1 - 3 藻胆体的结构示意图f 2 4 】 f i g 1 - 3t h es t m c 眦o fp h y c o b i l i s o m e 藻胆蛋白发色团的能量水平具有不平衡性，藻胆蛋白的所有发色团都是吸收 激发能，因此，蛋白的荧光产生自最大波长的吸收带。吸收光能再把激发能转移 给其他发色团的发色团称为供体，既吸收激发能又发荧光的发色团称为受体。稳 定的荧光发射几乎只能由受体产生。由化学的、晶体的和光谱学的数据可以确认 藻胆蛋白中的供体和受体，例如在藻蓝蛋白中，位于g t 8 4 和1 3 1 5 5 位的发色团是供 体，而位于p 一8 4 位的发色团是受体【2 7 1 。 在天线杆内，圆盘的形状保证了能量迅速地从供体发色团到受体发色团。藻 胆蛋白的相互位置和连接蛋白也使激发能从受体发色团传递到核心复合物。目前 对核心部分的组织结构还缺乏了解。 浙江工业大学硕士学位论文坛紫菜r - 藻红蛋白的分离纯化及其稳定性研究 1 2 藻胆蛋白的分离纯化研究进展 藻胆蛋白的纯度( 么删2 s o ) 一般分为三个等级：食品级 o 7 ，药品级 3 0 ， 试剂级 4 o f 2 s j 。藻胆蛋白的分离纯化仍是国内外研究的热点，目前主要集中在 r p e ，c p c ，b p e 和a p c 上。主要从提取原料、细胞破碎法和分离纯化三方面进 行阐述。 1 2 1 提取原料 藻胆蛋白的提取原料多用红藻与蓝藻，藻种不同所含藻胆蛋白的种类和含量也 不同。珊瑚藻为一种新型r - p e 提取原料， 的分离纯化【2 9 1 ；b p e 多从紫球藻中获得： r - p e 即为其主要蛋白，大大简化了后期 c - p c 可从席藻、鞘丝藻、束丝藻、颤藻 等新原料中分离得到【3 3 1 。s u n 等刚从嗜热蓝藻优雅粘囊藻中分离得到三种a p c ， 而g e 等【3 5 3 6 1 从蓝藻中克隆了a p c 基因，通过构建融合蛋白的方式，转入大肠杆菌， 得到了高效表达的重组别藻蓝蛋白( r e c o m b i n a n t a l l o p h y c o e y a n i n ，r a p c ) ，初步实 现了转基因方法生产藻胆蛋白。 1 2 2 提取方法 1 2 2 1 冻融法 s o n i 等【3 2 】认为反复冻融法效果最好，最适操作温度是- - 2 5 冷冻，4 c 融解， 反复冻融四次可达最大提取率；而l i u 等【3 7 1 在低温与2 0 一次冻融多管藻提取 r - p e 。此外，m i l l 】( 0 v a 等【3 3 3 羽等还发现含盐的磷酸钾缓冲液提取的c - p c 纯度比不 含盐的要高。 1 2 2 2 超声波破碎法 b e n a v i d e s 等1 3 9 】采用超声波破碎法获得的紫球藻b p e 比渗透压破碎法要高。 g e 0 5 】等用超声波破碎大肠杆菌提取r a p c ，认为其效果较好，且放大倍数后，两者 无明显差异。但s o n i 等【3 2 】认为该法容易导致藻胆蛋白褪色及荧光淬灭。 该法常与其他破碎法结合。如c h c n 等 4 0 1 先将藻体反复冻融1 0 次，再用超声波 7 浙江工业大学硕士学位论文坛紫菜r - 藻红蛋白的分离纯化及其稳定性研究 处理，而p a t e l 等先用超声波破碎，再结合反复冻融法处理藻体。 1 2 2 3 渗透压破碎法 b 咖l e i o 等【4 l 】研究多种细胞破碎法后，发现醋酸钠缓冲液渗透压破碎法操作简 单，且效果仅次于冷冻干燥法和溶菌酶法，是最理想的细胞破碎法；而且高离子 强度溶液提取有利于提高后续工序中的回收率。s o n i 等【3 2 】亦认为渗透压破碎法和 反复冻融法效果相当，但该法使用的试剂可能会影响后期的分离纯化。s i l v e i r a 等 4 2 1 采用渗透压破碎法从螺旋藻中里提取c p c ，运用因子分析，得出最佳提取溶剂是 水，最佳料液比为0 0 8 幽叫，在2 5 下提取4h ，效果最好，提得的藻蓝蛋白纯度 达0 4 6 。n i u 等【4 3 】采用水提取r - p e ，2 4h 后纯度达到0 5 2 。 1 2 2 4 搅切法 该法的分离效果取决于搅切速度，高速分离效果好，但是容易导致蛋白变性， 操作方便但重现性不佳【3 2 】。r o s s a n o 等【2 9 1 用韦氏搅切器低温搅切3m i l l 提取珊瑚藻 中r - p e ，纯度为0 2 4 。 1 2 2 5 高压匀浆法 p a l i l 等陟删用2 0 0 4 0 0 耐的压力破碎藻体，提取的c p c 纯度高达1 o 1 0 4 。该法效果好，但用该法进行破碎的悬浮液要预冷，破碎后也应当立即冷却， 以免高温引起蛋白变性。 1 2 2 6 液氮研磨法 液氮研磨法有利于保持藻胆蛋白的生物活性，较为常用。s o n i 等1 先采用液 氮研磨藻体，待藻体呈冷冻粉末状，再置于缓冲溶液中融解，使细胞破碎，提取 的c p c 纯度达0 4 2 。 1 2 3 分离纯化 传统的藻胆蛋白分离纯化都是先经过硫酸铵盐析藻胆蛋白，再经过一系列的 浙江工业大学硕士学位论文 坛紫菜r - 藻红蛋白的分离纯化及其稳定性研究 层析柱组合纯化藻胆蛋白。近年来，不仅产生了一步层析法，简化了层析步骤， 还出现了新利凡诺法、双水相萃取法等新的分离纯化技术。 1 2 3 1 层析法 1 ) 凝胶层析法 凝胶层析法，多作辅助方法。如s o n i 等【3 2 1 用s 印h a d e xg 1 5 0 结合d b 墟c e l l u l o s e 柱纯化c - e c ；c h e n 等【柏1 先用d e a e s e 皿啪s e 层析，再用s e p b a c r y ls - 3 0 0 纯t c - e c ， 将纯度从4 6 9 提高到t 5 1 2 ；r o s s a n o 等 2 9 1 先用一步羟基磷灰石层析纯化r p e ，使 其纯度从0 2 4 提高到1 4 3 ，再经过s u p e r d e x7 5 柱，纯度高达6 6 7 。 2 ) 吸附层析法 常用羟基磷灰石( h a ) 法分离纯化藻胆蛋白，如b e n e d e t t i 等【3 l 悃一步h a 纯化 c p c ，纯度就达4 7 8 ；s o n i 等1 4 5 】采用一步疏水层析柱法纯化c p c ，使其纯度达到 4 5 2 ：g e 等【3 5 1 在应用p h e n y l 疏水层析单步纯化少量r a p c 不仅纯度高，回收率也较 高，而大量纯化时疏水层析需结合亲和层析才能得高纯度r a p c ，但回收率偏低； p a t i l 等圆采用炭柱纯化纯度为1 1 8 的c p c ，纯度达到2 5 8 ，若先用壳聚糖沉淀细胞 碎片再用炭柱处理，则纯度可达3 9 6 0 膨胀床工艺将固液分离、吸附、浓缩合成一体，无需去除藻渣或细胞碎片， 能实现藻胆蛋白的大量提取【4 l 4 3 。b e r m e j o 等f 4 1 l 比较提取b p e 的两种技术，超声波 破碎法结合硫酸铵盐析经d e a e - c e l l u l o s e 柱层析，需4 0h ，回收率只有3 2 ；而渗 透压破碎法结合膨胀床吸附再经d e a e - - c e l l u l o s e 柱层析，只需8 5h ，且回收率达 6 6 。 3 ) 离子交换层析法 n i u 等t 4 3 1 用h a 柱和q - s 印h a r o s e 柱纯化r - p e ，得出h a 分离时间长，易使蛋白变 性；而离子交换柱虽然成本高，但有处理量大，分离时间短，效果好等特点。 现多采用一步离子交换层析法。p a t e l - 等t 3 0 i 用d e a e s e p h a r o s ec l 6 b 纯化 c p c ；l i u 等改变传统以离子强度作梯度洗脱的方法，根据r - p e 的等电点进行p h 9 浙江工业大学硕士学位论文 坛紫菜r 藻红蛋白的分离纯化及其稳定性研究 梯度洗脱，仅用步d b 咂s e p l a a r o s ef a s tf l o w 离子交换层析法，就使r p e 纯度从 1 4 0 2 提到了5 6 ，回收率达6 7 3 3 。 1 2 3 2 利凡诺( r i v a n 0 1 ) 沉淀法 利凡诺沉淀法能避免层析等繁杂步骤，提高效率3 3 , 3 s 。该法提取藻胆蛋白国 内未见报道。 m i n k o v a 等【3 8 】先在细胞破碎液中加入利凡诺( 2 乙氧基一6 ，9 - - - - 氨基吖啶) ，搅 拌过夜提得纯度为1 6 0 的c p c ，重复四次，使纯度提高到3 9 0 ，上清液经4 0 饱和 度的硫酸铵盐析后， s e p h a d e xg 2 5 柱除去利凡诺，使纯度达到4 1 0 ，再次以7 0 饱和度的硫酸铵盐析，纯度达到4 3 0 ，回收率为4 5 7 0 。m i n k o v a 等1 3 3 】还对该法进 行改良，使其能同时分离纯化c p c 和a p c ，首先用不含盐的磷酸钾缓冲液破碎细 胞，以促进利凡诺与粗提液的结合，减少利凡诺的处理步骤，彻底分离c p c 和a p c ， 提高c p c 的纯度和产量。用利凡诺一次沉淀后，取沉淀溶解于磷酸钾缓冲液中， 离心后再次取沉淀溶解于磷酸钾缓冲液中，重复1 0 次，使a p c 纯度从0 6 6 提高到 2 o o ，收集8 n t 0 次的上清液，用5 0 饱和度的硫酸铵盐析，取沉淀溶解后，用 s e p h a d e xg 2 5 柱层析，将蓝色洗脱液用5 0 饱和度的硫酸铵进行盐析，取沉淀溶 于磷酸钾缓冲液中，离心后即得富含a p c 的上清液，纯度为2 4 1 ，回收率为3 5 。 而c p c 仅存在于利凡诺一次沉淀的上清液中，用利凡诺二次沉淀后，用4 0 饱和 度的硫酸铵盐析上清液后，经s e p h a d e xg 2 5 柱分离除去利凡诺，c p c 纯度达到 4 2 0 ，洗脱后的蓝色组分用7 0 饱和度的硫酸铵盐析后，c p c 最终纯度达4 5 2 ，回 收率为5 5 。 1 2 3 3 双水相萃取法 该法是分离纯化藻胆蛋白的新技术，具有操作步骤少，时间短，回收率高等 优点，分离纯化的同时还能使藻胆蛋白在一相浓缩 3 9 , 4 4 1 。 b e n a v i d e s 等【3 9 】采用双水相萃取法分离b p e ，得出分离容器的高度和直径比会 影响两相形成的时间；当容器高度和直径比为0 5 ，以2 9 的聚乙二醇1 0 0 0 和9 的磷酸钾缓冲液形成双水相，在结线长为4 5 ，体积比为4 5 ，p h 7 0 时处理浓度为 4 0 的b p e 粗提液体可以使其纯度达n 3 2 ，回收率为9 0 。 1 0 浙江工业大学硕士学位论文 坛紫菜r 藻红蛋白的分离纯化及其稳定性研究 p a t i l 等【2 8 】采用1 2 2 8 的聚乙二醇和1 1 6 3 的磷酸钾缓冲液形成的双水相体 系对藻胆蛋白进行分离，研究发现，在p h7 2 时萃取c p c ，一次萃取后，其纯度 从3 9 6 提高到5 2 2 ，经双水相萃取的c p c 再经d b 址s e p h a d e x 离子交换柱纯化，达 到了6 6 9 。对双水相萃取过程进行放大，提取的c p c 纯度为5 2 2 ，回收率为6 6 ， 证实了该方法具有现实可行性。p a t i l 等也指出了双水相萃取法萃取c p c 的最佳条 件：聚乙二醇4 0 0 0 磷酸钾体系，两者体积比为0 8 ，结线长为3 5 5 3 ，体系p h 6 0 时为最优组合，通过超滤去掉聚乙二醇可使c - p c 的纯度达3 5 2 ，再次萃取可使纯 度提高到4 0 5 ，总回收率达8 5 f 删。 1 3 藻胆蛋白的生物活性 1 3 1 抗氧化作用 周站平等【徊认为藻胆蛋白清除自由基主要是由藻胆色素完成的。在光照下，藻 胆蛋白能够产生自由基，黑暗中，则能够清除自由基，因此，藻胆蛋白具有产生 和清除自由基的双重功能。在光照下，对藻胆蛋白进行变性，使其产生自由基的 能力消失，清除自由基的能力则明显增强。 1 3 2 提高免疫力 陈美珍等一7 】发现藻胆蛋白粗提物具有提高小鼠免疫能力和抗氧化作用。藻胆 蛋白能提高淋巴细胞活性，通过淋巴系统提高机体免疫力，增强机体的防病抗病 能力e 4 s l 。陈新梅等【4 9 】也认为藻胆蛋白具有增加淋巴细胞的免疫活性的功效，能增 强免疫系统，以抵抗各种疾病，防治肿瘤。日本学者【5 0 】还曾证实藻胆蛋白能促进 动物对铁的利用，恢复造血功能，藻蓝蛋白具有较高的促红细胞生成素( e p o ) 活 性，它能直接刺激c f u e 的形成，对骨髓造血具有刺激作用。 1 3 3 抗肿瘤与抗炎症作用 王广策等发现r - p e 的p 亚基具较强的光动力学抗肿瘤效果。蔡心涵等5 2 1 也认为，藻胆蛋白具有抗肿瘤活性，黄蓓等嘲研究发现其对癌激光治疗有增敏作 浙江工业大学硕士学位论文坛紫菜r 藻红蛋白的分离纯化及其稳定性研究 用，能减轻辐射和盐酸苯合并对自红细胞和骨髓细胞的损伤，降低贫血程度。 1 3 4 促进细胞增殖 s h i n o h a r a 等【5 4 1 研究发现藻胆蛋白对人体细胞如r f m l 8 2 2 6 (种骨髓瘤细胞) 的生长有刺激作用，通过活性比较发现，刺激效应依序为a p c p c p e 。 1 4 藻胆蛋白的应用 1 4 1 光合作用的辅助色素 藻胆蛋白常作为光合作用的辅助色素，藻胆蛋白与植物光敏素在形态、结构、 组成以及光谱特征等方面均十分相似，而且在体外，可以诱导藻胆蛋白产生具有 类似于植物光敏素的光化学特征。因此，王广策等【5 5 】推测藻胆蛋白与光敏素之间 在功能上可能存在着某种关系，在一定的条件下，藻胆蛋白可能会发挥类似于植 物光敏素的功能。 1 4 2 光敏剂 光动力学治疗( p h o t o d y n a m i et h e r a p y ，p d t ) 即向肌体注射光敏剂，由于肿瘤 细胞与其亲和力高于正常细胞而滞留在肿瘤细胞中，经一定波长的光照射，使光 敏剂吸收光子跃迁至激发态后将能量传给周围的氧分子产生单线态氧，从而杀伤 肿瘤细胞。目前应用的光敏剂毒副作用大且价格昂贵【1 9 1 。 藻胆蛋白是一种新型的光敏剂，有光毒性而没有暗毒性，在人体内代谢快，能 选择性地破坏癌细胞，而不损害正常细胞t s r l ，藻红蛋白就是一种毒性较小，很有 前景的光敏剂，可望应用于肿瘤光动力治疗f 5 8 】。蔡春尔等【5 明指出作为光敏剂的藻 红蛋白必须是高纯度的，不能含有色素多肽，以免损伤正常细胞。 陈小强等【5 9 l 研究得出坛紫菜r - p e 、r - p c 和钝顶螺旋藻c - p c 的光动力作用对 乳腺癌细胞b c a p - 3 7 细胞具有显著杀伤，杀伤效果依次为：r - p e r p c c 。p c 。 1 2 浙江工业大学硕士学位论文坛紫菜r 藻红蛋白的分离纯化及其稳定性研究 1 4 3 荧光探针 藻胆蛋白是一类具有独特光学性质的新型荧光标记物，具有以下几种传统荧 光染料无法比拟的优越性【删。用藻胆蛋白制作的免疫荧光标记抗体，检测灵敏度 远高于传统的荧光标记物，可用于特殊分子定位和重要分子检测，包括s a r s 病 毒的免疫分子检测，能准确地诊断肿瘤、确定病变部位和病情轻重程度等【6 l 】，且 藻胆蛋白免疫荧光法具有荧光强度高、可长期保存且无明显衰减等特点【6 2 】。吴萍 等【6 3 朋】研究发现其在血清抗原的检测中具有灵敏度高、安全、快速的优点。 1 4 4 天然色素 藻胆蛋白作为天然色素添加到食品中，不仅是天然的增色剂也是营养剂【6 5 1 。 藻胆蛋白有很好的着色能力，如b p e 已成为具有较高商业价值的天然色素蛋白， 在食品、软饮料、化妆品和纺织品中广泛应用嗍。大日本油墨公司从螺旋藻中提 取藻蓝蛋白，商品名为“l i n a b l u e a ”，用作食物色素，也用于化妆品生产，产品 不仅在日本市场得到广泛销售，而且在美国保健品部门也已经把它列为安全性产 品嗣。 1 4 5 化妆品 藻胆蛋白具有清除超氧阴离子自由基和羟基自由基的功能。同样质量百分比 浓度的藻胆蛋白在清除超氧阴离子自由基和羟基自由基的效率上，比纯s o d 还要 高3 0 。在化妆品的应用中，除了作为色素外，还能显著地增强人体免疫功能， 具备出色的抗辐射、抗疲劳、抗衰老、抗氧化的功能。藻胆蛋白美容护肤在临床 应用的功效上，具体表现在以下几方面：修复细胞、嫩白肌肤、祛皱抗衰老、防 电磁辐射【醒】。 1 4 6 保健食品和药品 天然藻类本身就是一种优良营养保健食品，含有丰富的优质蛋白，人体必需 的不饱和脂肪酸及多种矿物质，具有补充营养，增强抵抗力的作用【6 9 】。而由藻胆 蛋白制成的食品和药品用于医疗保健，能促进动物血细胞再生，增进淋巴细胞活 浙江工业大学硕士学位论文 坛紫菜r - 藻红蛋白的分离纯化及其稳定性研究 性，提高机体免疫功能，更可防治癌症、溃疡和血栓等疾病7 0 1 。 1 4 7 其他 藻胆蛋白可作为功能因子用于特殊饲料中l 例。最新研究发现它在光学信息存 储与处理，快速光电探测、人工神经网络等方面也具有潜在的应用前景【7 。 1 5 本课题的研究目的及意义 藻胆蛋白广泛地应用于食品、医药和其他行业，r _ 藻红蛋白就是其中很重要 的一种，对r - 藻红蛋白分离纯化工艺的研究早就已经开展，但是国内起步较晚， r - 藻红蛋白的高效开发利用已成为当前研究的热点，但繁琐的分离纯化工艺使昂 贵的价格成为制约其开发利用的瓶颈，因此如何在分离纯化技术上取得突破极为 迫切。我国海藻资源丰富，坛紫菜产量较大，当前对坛紫菜中r 藻红蛋白的报道 寥寥无几，一般采用两步甚至多步羟基磷灰