（食品科学专业论文）大蒜素产率提高的酶调控技术研究.pdf

y 9 0 6 0 1 8 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行 科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮 助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本 声明的法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文 的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送 交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授 权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手 段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：兰! 堑 导师签名：撇 山东农业大学硕士学位论文 摘要 大蒜为百合科葱属多年生草本植物，含有丰富的营养物质且具有抗 肿瘤、保护心血管系统、降低血糖等功效。大蒜之所以具有广泛的药理 作用，原因在于大蒜含有的生物活性物质一含硫化合物。大蒜破碎后蒜 氨酸( s 一烯丙基一l 一半胱氨酸) 在蒜氨酸酶( e c4 4 1 4 ) 催化作用 下生成大蒜素，大蒜素生成产率与蒜氨酸酶的活性调控有密切联系，因 此首先围绕大蒜蒜氨酸酶的酶学性质展开研究具有十分重要的现实意 义。本试验以大蒜鳞茎为原料，经p e g 8 0 0 0 沉淀法、c o n a s e p h a r o s e 亲和层析柱法分离纯化出蒜氨酸酶用于性质的研究。研究不同金属离 子、甘油、l 一半胱氨酸、磷酸吡哆醛等对蒜氨酸酶活性的影响，采用 h p l c 法定量研究了破碎大蒜体系中蒜氨酸转化率，确定了提高蒜氨酸 转化率的因素，同时研究了有利于提高蒜氨酸转化率的因素对于大蒜素 产率提高程度的研究。主要试验结果如下： l 、蒜氨酸酶活性的影响因素分析研究表明大多数金属离子对蒜氨 酸酶活性有影响，其中m 9 2 十、f e 3 十、c a 2 十、f e 2 + 、m n 2 + 对蒜氨酸酶有明 显的激活作用，其中m n ”的激活作用最显著，1 0 m m o 儿m n ”可以将蒜 氨酸酶的活性提高2 8 4 倍。金属离子对蒜氨酸酶的激活作用在有甘 油、葡萄糖、蔗糖等多羟基化合物存在的条件下效果更好。c u 2 + 对蒜氨 酸酶有抑制作用。醋酸酐、l 半胱氨酸对蒜氨酸酶有抑制作用，辅酶磷 酸毗哆醛能提高蒜氨酸酶的活性。 2 、大蒜破碎体系中蒜氨酸转化率研究采用微波灭酶、水煮灭酶、 有机溶剂冷冻灭酶三种方法对大蒜中蒜氨酸进行提取。蒜氨酸的保留时 间为3 7 1 7m i n ，测得蒜氨酸的含量为：0 8 2 3 、0 7 3 0 、o 1 5 6 。同 时对大蒜破碎放置一天后体系中蒜氨酸的含量进行了分析，测得蒜氨酸 转化率仅为7 7 0 。通过向破碎的大蒜体系中添加5m m o l l 磷酸毗哆 醛可以将蒜氨酸的转化率由7 6 5 提高到8 7 5 ( 3 0 m i n 后测定) ， 0 ，1 衄o l l 的m n 2 + 可以将蒜氨酸的转化率提高3 3 3 。本法达到较高的 精密度( 0 8 3 ) 和回收率( 9 7 6 ) ，适用于大蒜中蒜氨酸含量的测 定。 大蒜素产率提高的酶调控技术研究 3 、大蒜素产率提高的研究首先研究确定了破碎大蒜体系中大蒜素 生成的最佳酶解温度为3 0 、时间为6 0 m i n 、p h 值为6 5 、料水比为 1 ：2 。将上述对蒜氨酸酶有激活作用、对于蒜氨酸转化率有提高作用的 因素添加到破碎的大蒜体系中考察其对于大蒜素产率的影响，研究表 明：0 0 0 1 l 叠大蒜的m n 2 + 能将大蒜素产率提高2 5 7 。o 2 5 m m o l 儋 大蒜的磷酸吡哆醛能将大蒜油的产率提高2 0 8 。 关键词：大蒜：蒜氨酸酶：蒜氨酸；大蒜素 山东农业大学顶士学位论文 a b s t r a c t g a ：r l i c ，4 肼小朋西比打ll - ，i st h ep e r e n n i a lh e r bo fl i l v 缸n i l y t h e s u l p h i d ei nt h eg a r l i ch a sd i s t i n c te f b c to fp h a r m a c o l o g ys u c ha st u m o u r c u n t e r a c t i n g ，v e i n - p r o t e c t i n g ，b l o o ds u g a r - r e d u c i n ga n ds oo n t h eg a r l i c a l l i i n a s e ( e c4 4 1 4 ) c a t a l y z e st h es y n t h e s i so fa l l i c 畦w h 砒1i st h em a i n 劬c t i o n a ln a v o rc o m p o n e n to ff r e s hg a r l i c t h ep r o d l 】c i n go fv o l a t i l e c o m p o u n d so fg a r l i ch i 出l yd 印e n d so nm ea c t i v i t yo fa l l i i n a s e ，s oi ti so f g r e a ts i g i l i f i c a n c et os t u d ym ep r o p e m e so fa l l i i n a s e a 1 l i i n a s ew a sp u r m e d s u c c e s s f u l l y 矗o m 丘e s hb u l b sb yu s i n gv a r i o u ss t e p si n c l u d i n gp e g 8 0 0 0 m e m o d ，a 街n i 衄c l l r o m a t o 冒a mo nc o n a s e p h a r o s e t h ee f 诧c to fd i f f e r e n t m e t a li o n s ，g l y p e r i n ，9 1 u c o s e ，l c y s t e i n e ，p y r i d o x a lp h o s p 王1 a t eo na 1 1 i i n a s e w a ss t u d i e d t h ec o n v e r s i o nm t i oo fa l l i mi i lb r o k e ng a r l i cw a ss t l l d i e db v m em e t h o do fh p l c n l ef a c t o r so fa d v a n c i n gc o n v e r s i o nr a t i oo fa l l i i n w e r ec o n f i r i n e d t h em a i ns n l d vr e s u l t sw a sa sf o l l o w s ： 1 m a i nf a c t o r sa f k c t i n gt h ea l “i n a s ea c t i v i t y i ts h o w e dt h a tm o s t m e t a li o n sh 甜e f 琵c to na i l i i n a s e ，帅o n go fw 1 1 i c ha c t i v a t i o ne f 琵c to fm g 甘， f e 3 十，c a 2 + ，f e 2 + ，m n 2 + w e r eo b v i o u s m n 2 + w a st 上l es t r o n g e s tf a c t o ra n dc o u l d a d v a n c e2 8 4t i m e s t h ea c t i v a t i o nw a sb e “e r 、j 山t h ee x i s t e n c eo f p o l y h y d r i cc o r n p o l l 1 出s u c ha sg i y c e 血1 ，斟u c o s e ，s u c m s e c u 什w a st 1 1 e i i l l l i b i t i v ef a c t o r a c e t i ca n h v 出i d ea 1 1 dl c v s t e i n ew e r ct h ei n l l i b m v ef k t o r s o fa l l i i n a s ea c t i v i t y p y r 讨o x a lp h o s d h a t ew a st h ea c t i v a t i o nf a c t o r 2 a a i l i i nc o n v e r s i o nr a t i oi nb r o k e ng a r l i c t h eq u a l i t a t i v ea 工l d q u a l 】t i t a t h ed e t e m l i n a t i o no fa 1 1 i i n i nt h eg a r l i cw a ss t u d i e db yh p l c m e m o d t h ea l l i i nc o m e n to f 鼬d i c 、v a so _ 8 2 3 ，o 7 3 0 ，0 1 5 6 r e s p e c t i v e l ye x 仃圮t e db yn l r e ee n z y m ei n a c t i v a t i o nm e 血o d s ，i n c l u d i n g m i c r o w a v e ，b o i l e dw a 把ra n dc 1 1 i l l e do r g a n i cs o l v e n t t h ec o n v e r s i o nr a t i oo f a l l i i ni nt h eb r o k e ng a r l i cw a s7 7 o mo n ed a v ，n ec o n v e r s i o nr a t i oo f a l i i i nc o u l db ei m p r o v e do b v i o u s l y 丘o m7 6 5 t o 盯5 b ya d d i n g5 m m o l lp y r i d o 妇n ep h o s p h a t et ot h eb m k e ng a r l i c ( d e t e c t e di n3 0m i n u t e s ) n l ec 0 1 1 v e r s i o nr a t i oo fa 1 1 i i nc o u l db ei n l p r o v e d3 3 3 b va d d i n go 1 m m o l lm n 什t o 也eb r o k e n 鼬d i c ( d e t e c t e di n3 0m i n u t e s r ) t h i sm e t h o d r e a c h e dt oah i g h e rp r e c i s i o n ( 0 8 3 ) a i l dr e c o v e r y ( 9 7 6 ) a i l dc a i lb e a p p l i e dt od e t e 珊i n em ea l l i i nc o n t e n ti ng a d i c 3 大蒜素产率提高的酶调控技术研究 3 m a i nf a c t o r sa f 扎c t i n ga i i i c i ny i e l d 。t h ee f f e c to ft h ee n z y m a t i c r e a c t i o nc o n d i t i o n so na 1 1 i c i l ly i e l dw a se x a m i n e d ，m c l u d i n gt e 瑚l p e r a t u r e ， t i m e d hv a l u ea n df a t i oo fm a t e r i a lt ow a t e r t h eo p t i m a lc o n d i t i o n so f r e a c t i o nt e m p e r a t u r c ，t i m e ，p hv a l u e ，r a t i oo fm a t e r i a lt o 啪t e rw e r e3 0 ， 6 0 m i n ，6 5a n dl ：2r e s p e c t i v e l yt h ea u i i c i ny i e i dc o u l db ei m p r o v e d2 5 7 b ya d d i n g o 0 0 1 m m o 垤g a r l i c m n 2 十a n d2 0 8 b ya d d i n g0 2 5 m m o l g g a r l i cp y r i d o x i n ep h o s p h a t e k e yw o r d s ：g a r 王i c ；a l l i i n a s e ；a 1 1 曲；a l l i c i n 4 山东农业大学硕士学位论文 l 引言 1 1 大蒜概述 1 1 - 1 大蒜的化学成分 大蒜( 4 胛f “s 口f f v 跏l ) 为百合科葱属多年生草本植物的鳞茎，又名 葫蒜、葫、独蒜等。它原产于欧洲南部和亚洲西部，最早在古埃及、古 罗马和古希腊等地中海沿岸国家栽培；公元前1 1 6 年，由张骞从西域引 入中国陕诬汉中地区，以后遍及全国；9 世纪初传入日本；1 6 世纪前叶 扩展到非洲和南美洲，1 8 世纪后叶北美洲开始栽培，现在已遍及全世 界，我国的各省区多有栽培。 大蒜的化学成分较复杂，也较齐全，其中含有大量对人体有益的脂 肪、蛋白质、微量元素、氨基酸、维生素、硫化物等。不同产地的大蒜 都含有相同的化学成分，只是含量随产地、品种的不同有所差异。大蒜 中矿物质含量以磷最高，其次为镁、钙、铁、硅、铝和锌等，另外有机 锗和硒的含量也较高( 谢周芳，2 0 0 1 ) 。大蒜中氨基酸种类比较全，其 中精氨酸、赖氨酸、亮氨酸、缬氨酸的含量较高，蛋氨酸的含量较低， 白皮蒜的必需氨基酸含量低于红皮蒜，但氨基酸总量略高于红皮蒜( 谢 周芳，2 0 0 1 ) 。除上述化学成分外，大蒜中还含有多糖、凝集素( d a m t ，k 酣矗，1 9 9 8 ；s m e e t sk b f 以7 ，1 9 9 7 a ) 和些酶类( 如蒜氨酸酶、 过氧化物酶、y 一谷氨酰转肽酶等) ( c e c il n 甜以，1 9 9 2 ；程龙军 等，2 0 0 1 ) 。 1 1 2 大蒜的重要生理功能 从古至今，世界上许多民族如埃及人、犹太人、中国人、日本人、 罗马人就一直用大蒜治疗多种疾病。大蒜昧辛性温，有驱风、利尿、镇 咳、暖脾健胃、促进食欲、帮助消化、消渴止血、行气消积、解毒杀虫 等功效，特别引人注目的是其强烈的抗菌性和强壮作用( 加船is “ 矗，1 9 9 9 ；h a m sj c 酣口f ，2 0 0 1 ) 。此外，还有促进胆汁分泌、镇 痉、肠内杀菌的作用，可辅助治疗肠胃病、扁桃体炎、哮喘、风湿等 症。我国明代本草纲目记载，大蒜有散痛胂、除风邪、消毒气、去 风湿、疗疮癣、健脾胃、止霍乱、解瘟疫等功效。 大蒜索产率提高的酶调控技术研究 我国从5 0 年代开始对大蒜的化学成分、药理作用及临床进行研究， 并阐明了大蒜的多种有价值的药理作用。随着研究的深入，国内外学者 已研究证实了大蒜在抗凝血( 黄雅乐等，1 9 9 4 ) 、抗肿瘤( 高玉民等， 1 9 9 8 ) 、降血脂、降低血糖( 钱岳晟等，1 9 9 9 ) 、解毒、抗感染、抗氧 化、抗衰老( 张久亮等，2 0 0 2 ) 以及在保护肝脏、保护心血管系统、细 胞介导免疫、体液免疫调节( 叶海英等，2 0 0 3 ) 过程中起着十分重要的 作用。大蒜制剂对肺癌、胃癌、脑癌、肠癌、食道癌具有一定的治疗功 能，还有减慢心率、扩张毛细血管、降低血压等作用，并能降低血清胆 固醇、甘油三酯，从而防治动脉粥样硬化( t i l l ic m l j 酣d ，2 0 0 3 ；李 干红等，2 0 0 2 ；汪承亚等，2 0 0 0 ) 。另外，大蒜中的微量元素锗能把氧 元素供给机体，所以大蒜能消除疲劳，增强机体的体力和耐力。 1 1 2 1 抗菌作用 大蒜是种天然的广谱杀菌剂，己在临床上应用于治疗结核、痢 疾、疟疾等各种疾病。实验表明，它对多种致病菌均有不同程度的抑 制或杀灭作用，特别是对真菌的作用最强烈。如大蒜新素在l ：5 1 2 0 0 浓度即可明显抑制白色念珠球菌，在1 ：2 0 0 8 0 0 浓度可抑制新生隐球菌 ( 黄泰康，1 9 9 4 ) 。对青霉素、链霉素、氯霉索及金霉素耐药的细菌， 对大蒜仍很敏感( 高景昌，1 9 9 6 ) 。 1 1 2 2 增强机体免疫功能 大蒜能激活人体巨噬细胞功能。实验发现，大蒜注射液对小鼠腹腔 巨噬细胞吞噬机能有明显促进作用，而且淋巴细胞转化率和玫瑰花瓣状 反应均显著提高( 李峰，1 9 9 5 ) 。 1 1 2 3 抗肿瘤作用 大蒜不仅可直接杀伤肿瘤细胞，也能通过多种途径起到对肿瘤细胞 的间接杀伤作用。实验证明，大蒜油和大蒜素可提高肿瘤组织内c a m p 水平，抑制肿瘤组织过度增殖生长( 高玉民，1 9 9 3 ) 。大蒜可抑制致癌 物的代谢酶的活性，使致癌物的前体不能活化，亚硝酸盐是强致癌物亚 硝胺的前体，大蒜及大蒜素可抑制胃液中硝酸盐还原菌的生长( j u i l y a l l h o n 1 9 9 1 ) ；抑制硝酸还原酶的作用，从而降低胃液中亚硝酸盐的含 量，阻断亚硝胺的合成，起到对胃癌的预防和治疗作用( 梅行，1 9 8 5 ； 山东农业大学硕士学位论文 王美玲，1 9 8 2 ) ：大蒜具有增强巨噬细胞的抗肿瘤活性的作用，大蒜油 可使肿瘤内中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞增多，从而对癌细胞具有 直接杀伤作用( 邓启辉，1 9 9 8 ) 。 1 1 2 4 对心脑血管疾病作用 大蒜主要通过抗血小板聚集、增加纤维蛋白溶解系统活性、降血脂 与防治动脉粥样硬化等作用来抵抗心脑血管疾病。临床研究与流行病学 研究结果都证实了大蒜的降血脂和防治动脉粥样硬化作用( 刘萍， 1 9 9 9 ) 。高血脂可导致动脉粥样硬化，引起心脑血管疾病，大蒜索能降 低血清中甘油三醋和总胆固醇含量( 叶景华，】9 9 6 ) ，抑制动脉粥样硬 化灶的形成，提高血清中a 一脂蛋白的含量；大蒜提取物可明显抑制血 小板粘性，降低凝血因子的活性及血浆中丙二醛水平。从各个环节起抑 制血小板凝集的作用，降低纤维蛋白原含量，增加纤维酶活性( 叶景 华，1 9 9 6 ：张吟秋，1 9 8 4 ) 。 1 1 2 5 抗病毒作用 人巨细胞病毒感染，至今缺乏有效的防治措施，而大蒜新素在临床 上用于骨髓移植患者并发人巨细胞病毒感染有明显的预防和治疗作用 ( 孟月生，1 9 9 2 ) ；大蒜对脊髓灰质炎病毒9 0 的杀灭作用，而对一号 疤疹病毒、二号疤疹病毒、三号副流感病毒等则有1 0 0 的杀灭作用。 大蒜提取液有抗巨细胞病毒的作用。体外实验表明，对照组病毒病变严 重，而大蒜提取物1 ：2 5 稀释时能全部抑制病毒生长( 牟颖，1 9 9 4 ) 。 1 1 2 6 其它作用 除以上所列外，大蒜还具有降血糖、降血压作用( 韩那，1 9 9 2 ) ； 有抗氧化自由基作用( 蔡幼青，1 9 9 6 ) ；抗辐射、起细胞免疫和保护生 物膜等作用；在妇科用o 5 大蒜液5 m i n 能使阴道滴虫丧失活力( 沈联 慈，1 9 9 3 ) ；也可用于牙周病、鼻姻、感冒、慢性胃炎等疾病的预防和 治疗( 蔡幼青，1 9 9 6 ) 。 1 1 3 国内大蒜产业的现状 大蒜是我国特色的农产品资源和传统调味料，栽培历史悠久，载培 面积大，产量高，2 0 0 1 年我国大蒜栽培面积为4 8 9 2 万公顷，产量为6 6 0 万吨( 葛毅强等，2 0 0 3 b ) 。 大蒜索产率提高的酶调控技术研究 1 1 3 1 大蒜的传统加工产品 目前国内大蒜加工产品主要有脱水蒜制品，包括脱水蒜片、蒜粉、 蒜粒：保鲜产品( 包括保鲜大蒜、保鲜蒜米) ；速冻产品；腌渍产品 ( 包括腌渍蒜米、糖醋大蒜) 等。在我国大蒜加工和贸易中腌渍产品占 据了主要地位；而在国外高品质、高价值的大蒜贸易品越来越受到食品 工业的推崇并且发展迅速，这些在我国则刚刚起步。 1 1 3 2 大蒜油的制取工艺 目前大蒜油的提取方法主要有：水蒸汽蒸馏法；有机溶剂浸提法； 超临界流体萃取法( 以超临界c 0 2 为例) 三种。 水蒸气蒸馏法以水为提取溶剂( 林松毅等，1 9 9 7 ) ，在常压下或加 压下，加热提取天然有效成分，其操作简单，对一般较易提取的有效成 分适用，对热敏性的有效成分提取损失较大，得率较低，提取物的有效 成分不易分离出来。常用于提取天然产物中的可溶与水的有效成分如糖 类等。水蒸气蒸馏方法得到的产物大蒜油多是小分子易挥发性物质，风 味和质量远远不及鲜蒜( 晁芳芳等，2 0 0 3 ) 。 有机溶剂提取法( 陈雄等，1 9 9 9 ) 一般采用单一的或溶剂的混合做 浸提剂，在常温或低温条件下，经过一定的浸提时间来提取天然产物中 的有效成分，这种方法针对于天然产物中的有效成分的选择性提取，根 据不同的成分，选择不同的溶剂、不同的温度、不同的时间，以达到某 些成分的较高提取。提取物纯度相对于水蒸气提取法较高，此种方法适 用广泛，是传统的提取方法之。采用低温化学方法提取的大蒜风味物 质在化学组成上与水蒸气蒸馏法有很大的区别，其更多地保持了大蒜的 风味特点。 超临界流体提取法( 梁斌等，2 0 0 2 ) 是超临界流体萃取技术的应 用，它是利用流体( 溶剂) 在临界点附近某一区域( 超临界区) 内，与 待分离混合物中的溶质具有异常相平衡行为和传递性能，且它对溶质溶 解能力随压力和温度改变而在相当宽的范围内变动这一特性而达到溶质 分离的一项技术，处于临界压力和临界温度以上的流体具有特异增加的 溶解能力。超临界c 0 2 萃取法提取的大蒜风味物质在组成上与化学提取 山东农业大学硕士学位论文 法有较大的相似性。但目前尚没有见到短程分子蒸馏技术在大蒜风味物 采用水蒸气蒸馏法，其提取率仅为o 1 8 o 2 左右，尚不到理论 产量的l 5 ，分析原因可能与提取过程中蒜氨酸酶活性的变化对大蒜油 产生过程的影响有关，因此，研究蒜氨酸酶的性质及其活性调节控制， 对于提高大蒜油的提取率，具有重要的意义( 乔旭光等，2 0 0 l a ；乔旭 1 2 蒜氨酸酶在大蒜功能性风味物质产生过程中的作用 很多植物中都含有非蛋白质氨基酸作为其第二类代谢物质，这些非 蛋白质氨基酸经常作为某些植物的特征物质，s 烷基l 半胱氨酸亚砜就 蒜、洋葱等。百合科植物的特殊风味就是由于s 烷基l 半胱氨酸亚砜 口 ，2 0 0 2 ) 。百合科植物在未破碎前并没有特殊风味，而在组织受损或 破碎后，位于不同部位的s 烷基l 半胱氨酸亚砜在裂解酶的作用下产 生了特殊风味( e l l i n o r eg s “以，1 9 9 4 ) 。蒜氨酸酶( a l l i i n a s e ) 正是 这样一种酶，其在催化s 烯丙基l 半胱氨酸亚砜，即蒜氨酸( 舢l i i n ) 反应生成大蒜功能性风味物质的反应过程中起着重要的作用。大蒜的主 要功能性风味物质是含硫化合物，包括二烯丙基硫代亚磺酸酯、二烯丙 蒜氨酸 。a) o _ h 、0 _。 u 黑署对 f + | 1 磷酸吡多醛 m i l 大蒜素产率提高的酶训控技术研究 次磺酸 8 r 8 。h + n h 3 +h 】c 7 j 1 。 ( r ；c h h c h 2 一) o _ 2 烯丙基次磺酸a 持、a “ 湖+ 啪加乙睇八弧岛 八。 蒜素l 、一 兰! + 。，。八8 叶鞘 根 叶。可能是大蒜鳞茎蒜氨酸酶基因在鳞茎中高度表达，在 叶中表达较少，在根中不表达，但根中存在由另一种形式的蒜氨酸酶造 成的酶活( r a b i n k o va ，酊以，1 9 9 4 ) 。 1 3 3 蒜氨酸酶的高级结构 图2 蒜氨酸酶的四级结构 f i g 2q u a d r i l p 0 1 es t l u c t u r eo f a l l i i n a s e 黄色一n 端区域蓝色一a a l o l - 3 1 0 中心区域红色一c 端区域黑色一糖分子 y e 儿o w - nt e 删i n a lb l u e a a l oj 一3 l oc e n t e ra r e ar e d - ct e r m i n a lb l a c k _ s u g a rm o l e c u l e 通过对结晶蒜氨酸酶的x 衍射分析( k u 啪，e r e b ，2 0 0 2 ) ，得到了 关于其结构的信息。图2 是蒜氨酸酶的四级结构，蒜氨酸酶是由两个相 同亚基组成，彼此间存在1 8 0 0 的空间相对角度，每一个亚基均包括n 端区域、c 端区域、p l p 结合区域三部分。而作为酶活性中心的p l p 结 合区域是整个催化的场所，图3 是蒜氨酸酶的活性中心的氨基酸组成和 空间构像。 1 2 山东农业大学硕士学位论文 图3 蒜氨酸酶的活性中心 f 电3t h ea c t i v ec e n t e ro fa l l i i n a s e 蒜氨酸酶催化底物蒜氨酸的过程，实际上就是作为辅酶的磷酸吡哆 醛亲电催化过程。磷酸吡哆醛与酶活性中心的赖氨酸共价的结合形成 s c 如丘碱，磷酸基通过与a a l 3 2 _ 1 4 3 形成的d 螺旋、心5 9 、t h f 2 4 8 、 s e r 2 5 0 和相邻亚基t ”9 2 的侧链形成非共价键而稳定，吡啶环被夹在 t n l 6 5 的芳香环和v a l 2 2 7 的异丙基之间。当底物进入活性中心时，p l p 与l v s 形成的s c h i f f 碱就自动分开，转而与蒜氨酸形成新的s c h i f f 碱。 目前对于蒜氨酸酶催化底物蒜氨酸的机理研究，主要还停留在以磷 酸毗哆醛为辅酶的催化过程：磷酸毗哆醛作为蒜氨酸酶的辅酶参与了整 个催化过程，磷酸吡哆醛首先与蒜氨酸酶活性中心的赖氨酸残基结合形 成一种sc h i f r 碱。当加入底物一蒜氨酸后，磷酸吡哆醛就与其形成一种 新的s c h i f r 碱键合。s c h i f r 碱是一种醛亚胺，在起催化作用时，底物一 磷酸吡哆醛的s c h i f f 键合的双键在转移位置后便形成一种酮亚胺，酶活 性中心的赖氨酸的碱基可能作为电子坑而促进醛亚胺一酮亚胺的转化， 然后被水解成磷酸吡哆胺和一个酮酸。第二个酮酸与酶一磷酸毗哆胺的 复合体起反应并产生第二个氨基酸以及重新生成酶一磷酸吡哆醛的复合 体。s c l l i 圩碱中的吡啶环可以起着一种“电子阱”的作用，这种电子阱 可以非常有效地稳定一个负电荷，底物氨基酸中手性碳周围的每一个基 团都可能断裂，并形成一个阴离子，其可以通过s c h i f r 的毗啶环来稳 大蒜紊产率提高的酶调控技术研究 定。酶活性中心的赖氨酸攻击底物氨基酸的h ，导致c - h 键的断裂。其 反应过程如下： h 、 = 日 惩一、一。一 扩。h _ _一“_ + ”、。 叩“捉”“贸叩飞x ” 1 4 本课题研究的目的、内容和意义 1 4 1 研究目的 ( 1 ) 通过研究蒜氨酸酶的性质，确定影响蒜氨酸酶活性因素。 ( 2 ) 通过研究破碎大蒜体系中蒜氨酸的剩余率，确定提高蒜氨酸转化 率的因素。 ( 3 ) 针对影响蒜氨酸酶活性以及蒜氨酸转化率的因素，确定提高大蒜 素的调控技术。 1 4 2 研究内容 ( 1 ) 蒜氨酸酶的激活抑制影响因素研究。 ( 2 ) 对破碎大蒜体系中蒜氨酸转化率的高效液相研究。 ( 3 ) 提高大蒜索产率的因素研究。 1 4 3 本课题的意义 中国是世界大蒜的主要产区之一，虽然中国大蒜的品质一直被国际 市场认可，但多年来中国大蒜主要以原料和初级加工产品面向国际及国 内市场，致使大蒜及其制品的附加值不高，也影响了大蒜产业的发展。 而近几年，由于人们对大蒜众多的药理作用及功能的普遍认可，大蒜功 能性风味物质的应用以及需求量也越来越大。面对加入w i 、o 后的新形 势和机遇，加快大蒜深加工技术的研究及产业化开发，研究新型功能性 1 4 。叠一鬻 山东农业大学硕士学位论文 大蒜制品的加工技术，保持我国大蒜产业在国际市场上的领先地位，已 成为大蒜产业当前迫切需要解决的问题，而功能性风味物质的提取，是 大蒜功能性产品开发的先导。因此，研究大蒜功能性风味物质提取过程 中提高提取得率的相关技术( 酶活性调控技术) 具有十分重要的现实意 义。 本课题主要是从离体蒜氨酸酶的激活及抑制角度，分析影响其活性 的内在及外界因素，以期为大蒜素的工业化生产产率的提高提高理论依 据及技术支持。 大蒜素产率提高的酶调控技术研究 2 材料与方法 2 1 试验原料 原料：鲜蒜鳞茎( 泰安种植) 购于山东农业大学农贸市场( 购后冷藏于4 冰箱中) 2 2 主要试剂 试剂名称生产单位 磷酸吡哆醛 s i g m a 公司 p e g 8 0 0 0 a m r e s c o 公司 p e g 2 0 0 0 0 m e r c k 公司 c o n a - s e p h a r o s ep h a r r n a c i a 公司 蒜氨酸 f 1 u k a 公司 c o n a s e p h a r o s e p h a l l n a c i a 公司 烯丙基溴 s i g m a 公司 2 ，4 二硝基苯肼上海试剂三厂 丙酮酸北京医药采购供应站 葡萄糖上海伯奥生物科技有限公司 蔗糖上海伯奥生物科技有限公司 甲醇天津四友生物医学技术公司 甲醇天津博迪化工有限公司 三氯乙酸 上海化学试剂采购供应站 三氯甲烷 天津博迪化工有限公司 冰乙酸 济南试剂总厂 无水乙醇山东省化工研究院 氯仿山东省化工研究院 甘油天津博迪化工有限公司 l 半胱氨酸 上海伯奥生物科技有限公司 乙酸酐 天津大茂化学仪器供应站 n a c l 天津大茂化学仪器供应站 k c l 天津大茂化学仪器供应站 纯级 生化试剂 生化试剂 生化试剂 生化试剂 生化试剂 生化试剂 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 色谱纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 山东农业大学硕士学位论文 c u c l 2 ( n h 4 ) 2 s 0 4 n a h 2 p 0 4 2 王2 0 k 2 hp 0 4 3 h 2 0 c a c l 2 m g c l 2 6 h 2 0 m n c l 2 4 h 2 0 f e c l 2 f e c l 3 正己烷 硝酸银 浓硝酸 硫氰酸铵 硫酸铁铵 天津大茂化学仪器供应站 天津大茂化学仪器供应站 天津大茂化学仪器供应站 天津大茂化学仪器供应站 天津大茂化学仪器供应站 天津博迪化工有限公司 山东莱阳经济技术开发区精 细化工厂 天津大茂化学仪器供应站 天津大茂化学仪器供应站 天津市百世化工有限公司 天津市大茂化学仪器供应站 天津市凯通试剂有限公司 天津市四通化工厂 天津市河北海晶精细化工厂 2 3 主要仪器设备 名称型号 a d v e 咖e r 电子天平 r e 5 2 a a 旋转蒸发器 8 8 一l 型定时恒温磁力搅拌器 8 1 8 型台面式p h 测试仪 u v 一2 0 0 0 型分光光度计 u v 一2 1 0 2 p c 扫描型紫外可见 分光光度计 q l 9 0 l 旋涡混合器 f i n n p i p e t t e 数字式移液器 d h l a 电脑恒流泵 z 型层析柱 w a t e r s6 0 0 高效液相色谱仪 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 产地 奥豪斯国际贸易( 上海) 有限公司 上海亚荣生化仪器厂 上海司乐仪器厂 美国奥立龙公司 尤尼柯( 上海) 仪器有限公司 尤尼柯( 上海) 仪器有限公司 江苏海门市麒麟医用仪器厂 芬兰雷勃集团 上海沪西仪器厂 上海华美实验仪器厂 、a f e r s 公司 大蒜素产率提高的酶调控技术研究 冷冻离心机 s 0 2 11 9 多功能食品加工机 k d m 型可调控温加热套 恒温水浴锅 2 4 试验方法 2 4 1 蒜氨酸酶的提取纯化 上海安亭科学仪器厂 上海帅佳电子科技有限公司 山东郓城华鲁电热仪器有限公司 常州国华电器有瞑公司 2 4 1 1 蒜氨酸酶的提取( 秦晓春，2 0 0 4 ) 大蒜4 0 c 预冷一组织捣碎机捣碎一粗过滤一离心( 1 2 0 0 0 r p m ，4 0 m i n ) 一上清液中加p e g 8 0 0 0 搅拌均匀( 6 0 m i n ) 一离心( 1 2 0 0 0 r p m ，2 0 m i n ) 一取沉淀用缓冲液溶解一搅拌( 3 0 m i n ) 一离心( 1 2 0 0 0 r p m ，2 0 m i n ) 一 取上清液。 2 4 1 2 蒜氨酸酶的纯化( 高居易等，2 0 0 3 ) 提取的蒜氨酸酶过c o n a s e p h a r o s e 亲和层析拄，收集蒜氨酸酶活 性高的部分用于试验。 2 4 2 蒜氨酸酶的性质研究 2 4 2 1 酶活的测定方法( y o ok s 酊以，2 0 0 1 ) 2 4 2 1 1 制作丙酮酸标准曲线 准确称取1 1 0 m g 丙酮酸钠，溶解后定容于1 0 0 m l 容量瓶中，制成 o 0 1 m 0 1 几丙酮酸钠溶液。取7 只1 0 0 m l 容量瓶分别加入0 4 ，o 8 ， 1 2 ，1 6 ，2 0 ，2 4 ，2 8 m l 丙酮酸钠，用蒸馏水定容至1 0 0 m l 。分别从 各容量瓶中吸取4 m l 丙酮酸钠溶液加入7 支具塞试管中。然后各管分 别加入1 m lo 0 0 5 m o l l2 ，4 一二硝基苯肼溶液，2 5 0 c 反应5 m i n ；加入 5 m l2 5 m o l ln a o h 溶液，2 5 0 c 反应1 0 血n 。晟后在4 2 0 i l r l l 处比色，测 定各管溶液的吸光度。( 空白以蒸馏水代替丙酮酸溶液) 其标准曲线回归方程为：y = 5 7 5 2 5 7 x 一0 5 7 3 7 r = 0 9 9 9 6 + + y 一丙酮酸含量( h g ) x 一吸光度( o d ) 山东农业大学硕士学位论文 2 4 2 1 2 蒜氨酸酶活性的测定( 测丙酮酸法) 取底物o 5 ml ，加入o 5 i n l 酶液，反应1 m i n ，立即加入1 m l1 0 三氯乙酸终止反应，加入o 5 m l2 ，4 一二硝基苯肼反应5 m i n ，再加入 2 5 m l1 0 n a o h 反应l o m i n ，在4 2 0 n m 波长处比色测定o d 值。 酶活单位定义：在2 5 条件下，蒜氨酸酶催化的反应中，每分钟 产生l ”g 丙酮酸定义为一个酶活单位( 1 】i l i t ) 。 2 4 2 2 底物的提取和合成 ( 1 ) 天然底物的提取采用甲醇一氯仿一水浸提法( l a n c a s t e rj e 酣 耐，1 9 8 3 ：) 称取约1 0 9 完整的已去皮大蒜，加入5 0 m l 在2 0 0 c 保存的底物浸 提液中，一2 0 0 c 浸提2 4 h 。然后向浸提液中加入2 2 5 m l 氯仿、2 2 5 m l 水，置于分液漏斗中分层，取上层水相，浓缩至约2 0 m l 以完全蒸发水 相中的甲醇，最后补水至1 0 0 m l 。 ( 2 ) s 烯丙基半胱氨酸亚砜的合成( l a n c a s t e rj e 酊以，1 9 8 3 ) 准确称取盐酸半胱氨酸2 9 ，搅拌加入3 7 5 m l 乙醇中( 已加入2 8 m l 2 0 m 0 1 ln a o h 溶液) ，5 m i n 后加入2 2 m l 烯丙基溴。混合物用冰醋酸 调节p h 至5 2 5 ，在2 5 0 c 缓慢搅拌2 4 h ，4 0 c 冷却1 h 。过滤收集沉淀 ( 沉淀为s 一烯丙基一半胱氨酸) ，加入h 2 0 2 氧化，加乙醇收集沉淀。 2 4 2 3 蛋白质浓度的测定紫外吸收法( 汪家政等，2 0 0 0 ) 蛋白质浓度( m 卧n l ) = 1 5 a 2 8 0 o 7 5 a 2 6 0 2 4 2 4 不同物质对蒜氨酸酶活性的影响 ( 1 ) 不同金属离子对蒜氨酸酶活性的影响 为了测定不同金属离子对蒜氨酸酶活性的影响，取相同阴离子c l 。，而 阳离子不同的物质进行测定。 ， ( 2 ) 不同浓度m n 2 + 对蒜氨酸酶活性的影响 将l c l 2 加入蒜氨酸酶液中，使m n 2 + 的浓度分别达到2 5 、5 o 、 7 5 、1 0 、1 2 5 、1 5 、1 7 5 、2 0 、2 2 5 、2 5 m m o l l ，测定蒜氨酸酶的活 性。 ( 3 ) 甘油、葡萄糖、蔗糖对蒜氨酸活性的影响 大蒜索产率提高的酶调控技术研究 在酶液中分别添加甘油、葡萄糖、蔗糖、镁，浓度均为5 1 i n 0 1 l 进 行酶促反应，观察酶促反应速度。 ( 4 ) m g ”、甘油、对蒜氨酸酶的活性保持的影响 通过在酶液中分别加入m 矿+ 、甘油、m g ”+ 甘油各1 0 m m o l 几，连 续五天测其酶活的变化。 ( 5 ) 酸酐对蒜氨酸酶活性的影响 向纯化的蒜氨酸酶液中添加不同量的醋酸矸，观察酶活的变化。 ( 6 ) l 一半胱氨酸对蒜氨酸酶活性的影响 向纯化的蒜氨酸酶液中添加o 0 1 、0 1 、o 5 、l m m 0 1 l 浓度的l 一半 胱氨酸，观察酶活变化。 ( 7 ) 磷酸吡哆醛对蒜氨酸酶活性的影响 向提取纯化的蒜氨酸酶液中添加0 1 、0 - 2 、o 3 、o 4 、o 5 m m 0 1 l 浓 度的磷酸吡哆醛，观察其对蒜氨酸酶活性的影响。 ( 8 ) 酶促反应前后的蒜氨酸酶活性比较 反应前蒜氨酸酶的提取方法：参照方法2 4 1 1 ；反应后蒜氨酸酶的 提取方法：大蒜破碎后2 5 放1 h ，后续提取方法相同。 ( 9 ) 蒜氨酸酶液的紫外可见扫描光谱图 对纯化的蒜氨酸酶进行紫外可见扫描；向纯化的酶液中加入l 一半 胱氨酸再次进行紫外可见扫描，比较两次扫描图的差异。 2 4 3 大蒜中蒜氨酸的h p l c 定量研究 2 4 3 1 蒜氨酸标准溶液的配制 称取蒜氨酸( 纯度9 0 ) 1 0m g ，定容至1 0m l ，配制成浓度为 9 0 0 “m l 的蒜氨酸溶液。然后稀释配制成4 5 0 、3 0 0 、2 2 5 、1 8 0 、 1 5 0 、9 0 斗鲈n l 的标准溶液。 2 4 3 2 蒜氨酸的液相色谱分析条件 w a t e r s9 9 6 高效液相色谱仪 p h e n o m e n e xc 1 8 色谱柱( 2 5 0m m 4 6m m ；5 ou m ) w a t e r s 检测器，检测波长为2 1 4m 流动相：甲醇：水= 6 0 ：4 0 ；流速为o 8m l m i n 进样量1 0 l 。 2 0 山东农业大学硕士学位论文 2 4 3 3 精密度、添加回收率试验 ( 1 ) 精密度试验 吸取同一浓度的蒜氨酸标准溶液，重复测定5 次。 ( 2 ) 添加回收率试验 取蒜氨酸标准溶液，按高( 4 5 0p g m l ) 、中( 4 5 g m l ) 、低 ( 4 5 g m l ) 3 个浓度分别加入到已知样品浓度为4 5 斗m l 的溶液 中，吸取1 0h l 测定，重复3 次。 2 4 3 4 鲜蒜供试液的制备 ( 1 ) 微波灭酶后大蒜样品的制各( a ) 称取1 0 9 的大蒜，微波灭 酶5 m i n ，然后加5 0m l 水破碎，转移至1 0 0m l 容量瓶中并加水定容。 ( 2 ) 水煮灭酶后大蒜样品的制备( b ) 称取1 0 9 的大蒜，沸水煮 l o m i n ，然后加5 0m l 水破碎，转移至1 0 0m l 容量瓶中并加水定容。 ( 3 ) 有机溶剂冷冻浸提蒜氨酸样品的制各( c ) 参考文献( j a n e e l a l l c a s t e r ，1 9 8 3 ) ，称取1 0 9 大蒜。 ( 4 ) 未经灭酶处理的大蒜样品制备( d ) 称取l o g 的大蒜，加5 0 m l 的水破碎室温下放置1 d ，转移至1 0 0r n l 容量瓶中并加水定容。 ( 5 ) 大蒜加水破碎反应3 0 f n i n 样品的制各( e ) 称取l o g 的大 蒜，加5 0 m l 水破碎，室温下放置3 0 m i n ，然后煮沸1 0 m i n ，冷却后 转移至1 0 0m l 容量瓶中并加水定容。 ( 6 ) 大蒜加5 m m 0 1 l p l p 溶液反应3 0 i n i n 样品的制备( f ) 称取 1 0 9 的大蒜，加5 0 m l 的5 m m o l 几p