（食品科学专业论文）无花果沙雷氏菌壳聚糖酶的生化性质及产酶条件的研究.pdf

摘要 摘要 通过实验建立了筛选壳聚糖酶产生菌的模型，在培养基中以壳聚糖为难一碳 源，培养撼的p h 6 0 ，通过观察培养基上透明圈的方法对菌株进行选择。采用这 释方法对各遗2 7 个骥样晶进行筛选，获得一株细蔼，该蘸可分泌活力较高的 壳聚糖酶。经鉴定为无花果沙鬣氏菌( s e r r a t i a f i c a r i a ) ，命名为c h 0 2 0 3 ，该菌 胃疆产生蠢聚禧瓣为本研究首发现。该菌株掰产壳聚糖酶为臌矫酶，戳壳聚糖和 葡萄糖胺为碳源都能有效诱导产生壳聚糖酶，而壳聚糖的诱导效果要好于葡萄糖 黢，其 龟磺添效泶不好。 该菌株产壳聚糖酶的最适发酵条件为：培养基中以0 5 高脱乙酰度的壳聚 糖为难一谈添稻氮澡，蠢裰盐缀残戈：k h 2 p 0 40 1 0 ；n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 00 0 5 ：m g s 0 4 7 h 2 00 0 5 ；c a c l 20 0 0 1 ：k c l0 1 5 ；n a 2 s 0 40 1 5 ，培莽基 p h 6 。5 ，发酵湿度3 0 ，添攘0 0 5 豹蛙漫鼬，装滚爨力4 0 m l ( 采瘸2 5 0 m l 静 三角瓶时) ，接种龄和接种量分别为发酵2 4 小时的种子液和2 0 m l ( 采用2 5 0 m l 豹三受簸瓣) 。奁鼗条传下，无援暴沙鬟氏莹( s e r r a t i a f i c a r i a ) c h 0 2 0 3 发簿滚 的酶活可达到5 4 u m l 。 c h 0 2 0 3 蔻弱发酵液经硫酸铵分级沉淀，发瑗麦聚糖酶主要存在予6 0 9 0 饱和度的沉淀部分中。对经硫酸铵分级沉淀获得的粮酶进一步分离纯化，依次 经过s u p e r d e x 7 5 凝胶柱层板和羧甲基终维素离子交按撞层攒获褥缝酶。共缝纯 了6 2 2 倍，其比酶活为6 9 7 u m g ，回收率为2 3 5 ，经s d s ，p a g e 电泳检测， 证明该酶融达均一。 该酶分子量为2 9 k d a l ；等电点为9 4 ：是一种内切酶；最适温度为4 5 ；最 适p h 值为3 6 ；米氏常数为o 4 4m g m l 在浚度低于4 5 及在p h 4 0 7 。5 之闻 该酶稳定；该酶可被m n 2 + 和c 0 2 + 激活，被p b “、c u 2 + 、n i 2 “、c r 3 + 抑制；该酶 以1 0 0 脱乙酰度的壳聚糖为底物时，其最终水解产物为单糖、二糖和三糖，其 最适底物建脱乙酸度在8 5 左右的壳聚糖，脱乙酰度低于4 5 的壳聚糖则不能 被该酶作用，对结构与壳聚糖相似的羧甲基甲壳素和羧甲基纤维素也不能作用。 透过蹴较多种固定仡方法和载钵，发现稻多孔玻璃佟载体嘏附固定化 c h 0 2 0 3 细胞效果最好。用多孔玻璃固定的细胞发酵产酶，其最佳发酵条件怒： p h 6 ，5 ，培养基与载俸鹭慧体积4 8 m 1 ( 在2 5 0 m i 三角瓶中) ，载体与培养基豹比饲 为1 5 9 4 0 m l ，吸附时间是2 0 小时2 6 小时。以此条件发酵产酶，发酵液的最 高酶活达到4 。5 u m l 。采溺半连续发酵豹方式，籍多孔渡璃固定亿静缀瑰可以稳 定发酵产酶1 2 0 小时左右，在同样培养条件下，固定化细胞发酵液酶活比游离细 华南理工大学工学博士学位论文 胞发酵液酶活提高1 6 ，发酵产酶的效率提高了1 3 2 。 关键词：壳聚糖酶：无花果沙雷氏菌；壳聚糖；低聚壳聚糖；固定化细胞 h 。i i i 躺s it r i i a c t , , , i , h 一- - v 。 _一。一 a b s t r a c t t h em o d e lf o rt h es c r e e n i n go fc h i t o s a n a s e p r o d u c i n gb a c t e r i aw a se s t a b l i s h e d a sf o l l o w s ：b yu s i n gc h i t o s a na ss o l ec a r b o ns o u r c ei np h 6 ，0c u l t u r em e d i u m ，h o l o s a r o u n dc o i o u y sg r o w i n go i lp l a t e sm a yb eo b s e r v e d b yt h i sm e t h o d ，w es c r e e n e d2 7 s o i ls a m p l e sf o rc h i t o s a n a s eo np l a t e s b yc o m p a r i n gt h ed i a m e t e r so fh o l o sa r o u n d t h ec o l o n i e sa n db yf u r t h e rs h a k i n gc u l t u r es c r e e n i n g 。as t r a i no fb a c t e r i aw h i c hm a y s e c r e t eh i g h e ra c t i v i t yc h i t o s a n a s ew a ss e l e c t e da n dw a si d e n t i f i e da ss e r r a t i a f i c a r i aa f t e r w a r d s i tw a s n a m e dc h 一0 2 0 3 i tw a st h ef i r s tt i m et h a ts e r r a t i af i c a r i a w a sf o u n db yt h er e s e a r c ht op r o d u c ec h i t o s a n a s e 。t h ec h i t o s a n a s ei ss e c r e t e d e x t r a c e l t u l a r l y , a n d c a l lb e e f f e c t i v e l yi n d u c e db yc h i t o s a na n dg l u c o s a m i n e ，w h e r e a s c h i t o s a ni sb e t t e rt h a ng l u c o s a m i n e ，o t h e rk i n d so fc a r b o ns o u r c e sa c tp o o r l yo h i n d u c i n gt h eb a c t e r i a t oy i e l dc h i t o s a n a s e ， t h e o p t i m a lc o n d i t i o nf o ry i e l d i n gc h i t o s a n a s e i sa sf o l l o w s ：u s i n g0 5 h i g h l y d e a c e 辞l a t e dc h i t o s a n a ss o l ec a r b o ns o u r c ea n dn i t r o g e ns o u l x ：e ，a d d i n g0 1 0 k h 2 p 0 4 。0 。0 5 n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 ，0 0 5 m g s 0 4 - 7 h 2 0 ，0 0 0 1 c a c l 2 ，0 。1 5 k c l ， 0 ，1 5 n a 2 s 0 4 ，0 0 5 t w e e n8 0 ，p hv a l u eo fc u l t u r em e d i u mi s6 5 ，c u l t i v a t i n g t e m p e r a t u r ei s3 0 4 c ，f i l l i n gi n4 0 雌c u l t u r em e d i u mi n a2 5 0m lc o n i c a lf l a s k ， i n o c u l a t i n ga g ea n dv o l u m ea r e2 4h o u r sa n d2 0 m ls e p a r a t e l yi na2 5 0m l c o n i c a l f l a s k u n d e rs u c hc o n d i t i o n s ，t h ec h i t o s a n a s ea c t i v i t yo ff e r m e n t i n gl i q u o rm a yr e a c h 5 4 u m 1 t h ec h i t o s a n a s ei sf o u n d m a i n l y t oe x i s ti nt h e6 0 - 9 0 s a t u r a t i o n p a r t ，a f t e rt h e f e r m e n t i n gl i q u o rw a sp r e c i p i t a t e df r a c t i o n a l l yb ya m m o n i as u l p h a t e 。b yf u r t h e r p u r i f i c a t i o nb ys u p e r d e x 7 5g e lc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y a n dc a r b o x y m e t h y lc e l l u l o s e i o ne x c h a n g ec o l u m n c h r o m a t o g r a p h y , t h ec h i t o s a n a s ei sp u r i f i e d6 。2 2t i m e s ，a n di s p r o v e dh o m o g e n o u sb y s d s p a g e e l e c t r o p h o r e s i s 。i t ss p e c i f i ca c t i v i t yi s6 9 ，7 u m g ， a n dt h eo v e r a l l r e c o v e r y i s2 3 5 i ti si sa l l e n d o t y p e c h i t o s a n a s e 。w i t hi t s m o t e c u l a rw e i g h t2 9 妾d a la n di t si s o e l e c t r i cp o i n t9 ，4 。t h ec h i t o s a n a s el ss t a b l e b e l o w4 5 a n dw i t h i nt h ep h r a n g e4 0 - 7 5 i t so p t i m a lt e m p e r a t u r ei s4 5 j 。ca n d o p t i m a lp hi s3 6 m n 2 + , c 0 2 + a c t i v a t ea n dp b 2 + 、c u 2 + 、n i 2 + 、c r 3 + i n h i b i tt h e c h i t o s a n a s e 。t h ec h i t o s a n a s em a ya c tm o s t e f f e c t i v e l yo n8 5 d e a c e t y l a t e dc h i t o s a n ， a n dc a n ta c to i lc h i t o s a nd e a c e t y l a t e dl o w e rt h a n4 5 o r c a r b o x y m e t h y lc h i t i no r c a r b o x y m e t h y lc e l l u l o s e t h ef i n a lh y d r o l y s a t e sa r em o n o m e r ，d i m e ra n dt r i m e r m 华南理王丈学工学博士学位论文 一- k 、j l l l l l l i i i i i i i ii,11 i i i i11 目墨 w h e nt h e1 0 0 d e a c e t y l a t e dc h i t o s a ni su s e da ss u b s t r a t ea n di t sm i c h a e l i sc o n s t a n t i s0 4 4 m g g m t t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o rc h i t o s a n a s ep r o d u c t i o nb yc h 0 2 0 3b a c t e r i ac e l l i m m o b i l i z e db yp o r o u sg l a s si sa sf o l l o w s ：p h 6 ，5 ，t h eo v e r a l lv o l m n ei s4 8 m li na 2 5 0 m tc o n i c a l f l a s k ，t h e r a t i ob e t w e e n p o r o u sg l a s s a n dc u l t u r em e d i u mi s i 一5 9 ，莲0 m l ，a d s o r p t i o nt i m ei s2 0 2 6h o u r s a d o p t i n gt h es e m i c o n s e c u t i v em o d e 遮 f e r m e n t a t i o n ，t h ec h 0 2 0 3b a c t e r i ac e l li m m o b i l i z e db yp o r o u s g l a s s c a ns e c r e t c h i t o s a n a s es t e a d i l yf o ra b o u t1 2 0h o i l l s ，u n d e re q u a lc o n d i t i o n s 。t h ec h i t o s a n a s e p r o d u c e db yt h ei m m o b i l i z e dc e t li s1 6 h i g h e rt h a nt h ef r e ec e l l ， k e y w o r d s ：c h i t o s a n ，c h i t o o l i g o s a c c h a r i d e s ，c h l t o s a n a s e ，s e r r a t i af i c a r i ac h 0 2 0 3 ， i m m o b i l i z e dc e l l 华南理工大学 学位论文原创性声明 本人郑重声唆：j | 莠量交的论文是本入在霉簿浚指番下独立遴 行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标、浚引用的内襻外， 本论文不包含 壬健其他个人藏集体汜经发表或撰霹的成果雩罄晶。 对本文静疆究鬣懑燕要薮献豹令人帮集体，均西在文中数裙确方 式标明。本入完全意识劐本声臻酶法簿屠采壶本人承担。 箨者签名：敛农强期：z i ，哆年莎胄岁罄 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规 定，嚼意学校保留并彝嚣家蠢关部门或规梅送交谂文酶复印件稻 电子舨，允许论文被查阅和储阕。本入授衩华南邂工大学可以将 本学位论文的全部溅部分内容编入有关数据库进行检索，可以采 熙影郎、缩印或扫攒等羹割手段保存秘汇缭本学镶论文。 保密口，在年解密后适髑本授权书。 本学位论文属于 不绦密趔。 ( 清在泼上帮藏方糕癌打“”) 佟者签褰：惫彰 删签名：易堀 罄辫：o p 。；筚莎胃箩澄 鼙期。眵哆年冀夕罄 第一章绪论 第一章绪论 1 1 引富 壳聚耱酶霹戳鹱纯零解竞聚禧，将莛醛瓣淹低豢袁聚糖。舔聚巍聚糕静性 质及功能与高分子壳聚糖相比脊许多不同，舆有许多独特的新功能。 高分予轰聚糖的分子量遥裳在且十万到上嚣万遵尔顿，一般可溶予舔酸中 袒不能直按溶于水中，简当高分子壳聚糖降解成为相对较小的低分予后，熊理 他性质及某些生理功能将会发生变讫。低聚壳聚糖出予分子链长较离分子瓷聚 糖大大降低，因此，分子之闻不易形成较强的氯键，水溶性大大改蒋，分予量 低于l o k d a l 的低聚壳聚糖可以囊接溶子水中 虫于商分子降解为较短的低聚 壳聚糖分子，还导致其溶液粘褒酌大大降低；由于分予上有许多亲水的游离胺 基敷羟基，因此有较好的增湿性和保澄性；出于游离艨基带援电荷，可以与诲 多带负电稽酶裼矮结合；某些分子量穰低的低橥壳聚糖甚至胃以渗透封缅腿内 部起作用。 低聚爨聚糖不仅豫耨了壳爨糖大分子所瑟商鹃莱些功靛褴质，翔降低鞭固 醇、降血压、防治糖尿瘸、强化肝脏机能、治疗烧、烫伤等档，而且不同分子 羹范围豹繇聚壳聚耱还暴有许多离分子量静轰聚糖所不兵器麴独特酶生理功 能，如保澎性、免疫调节、防癌、调节肠道菌群、功能性甜味剂、作为营券强 毒乏粼镌载转、撰涂体蠹蠢毒有害镶囊、铳菌貉瘸、诱导植黪产生抗毒素等餐许 多作用。脚此，低聚壳聚糖在保健食晶、食品保鲜、化妆品、生物医药、植物 瘸密兹转滚等方霆霉毒诲多盎壤。嚣蓑，磅究懿荟爨聚壳聚耩已经戒务壳聚耱 研究的一个热点，并且已经有产品问世，如上海伟康生物保健品有限公司坐产 熬保健食菇“潺之塞”等。 目前，制备低聚壳聚糖的方法主要是采用化学降解方法，另外还有物理场 降瓣法、合成法、酶拳辫法等死辩方法。其中纯学强瓣法毽旗、酸聪法窝襞纯 降解法；物理场降解法则包括微波场降解法、超声波降解法和y 射线降解法； 酶承解法赠包括使用专一性斡酶承解，如壳累糖酶、溶菌酶、冗丁蕨藩等，鞋 及利用非专一性的其他酶水解，如蛋白酶、溶蔺酶、纤维素酶、半纤维素酶、 票驳酶、黯膀酶等来降舞竞聚糖。 与化学降解法、物理场降解法和合成法相比，酶水解法反应条件温和，反 华南理工大学工学博士学位论文 应过程易予控制，易于得猁所需分子羹范围韵产品，不需要化学试剂，无副产 物生成，没有工业污染，对设螽骚求低镣垅点，是生产低聚爨聚糖戆更为联想 的方法。 采用诸如木瓜爨自酶、无花果蛋皇酶、菠萝蛋皂醚、胃餐皇酶、脂肪酶、 栗黢酶、纾维素酶、半纾维素酶等菲专性酌酶水解德往水解度和水解效率较 低，不易得到分子摄很低的产晶；而采用专一性更高的壳聚糖酶水熊生产低聚 袁聚糖将跑菲专一性豹英穗酶效率更高，水解鬟彻底，可戳褥委各种分子鬣的 产鼎。 但是，霹蓊，筏鋈还没有壳聚耱酶的产品，国辨也只有鲻于生讫研究绢的 壳隳糖酶，因此，开发壳隳糖酶这种新酶源具褥很高的现实滋义，困皮外麟前 蘩基经齐霰了这方嚣戆璐究，莽没经取褥了一邂瓣藏巢。本研究将尝试筛遮一 株产壳聚糖酶的菌株，并对其发酵产酶条件以及酶的基本性质进行研究，为其 舞发髑蘑怒供一登溪论蒎擐。 1 2 低聚壳聚糖的性质、功能及用途 。2 溉聚蹇聚糖在食品土的痰用 ( 1 ) ，低聚壳聚糖可作为人体肠道的微生态调节剂。有研究表明，低聚党聚 糖对夸鬣骚遵藿嚣失调其蠢一寰的诵整俸霭m ；照露瓤聚麦聚糖霹捷瑟遂内煞 双歧杆菌、乳杆菌等有益菌的数懿明显增高m 。 低聚壳聚糖楚一转双竣霹予，麓选撵整蟪鞴激酝邀凑楚骞薤蓥( 双竣脊莲 等) 生长繁殖或增强其代谢功能，从而擒高肠肉有益予健康的优势菌群的构成 窝数量，丽对露麴铡骚内蠢毒、誊害蓥戆生长繁蓬帮瓣败夔矮鲢生藏，起到蠖 强宿主机体健康的作用：并且低聚壳聚糖本身无毒副作用n 4 】。 犯) ，可终为功链性爨昧裁：低聚壳聚糖具套非常爽日静瓣睬，在僳澄瞧、 耐热性等方面优予砂糖，不易被体内消化液降解，几乎不产坐热量，是糖尿病 人、肥胖瘸人理想的功能性烈竦刹”，。 ( 3 ) ，低聚壳聚糖还具有很好的防腐性能静，) ，可作为食品防腐荆；将低聚 壳浆糖翅入剽酱油中，其掷制酵姆菌群生长敢佟臻优予苯甲酸与苯甲酸镳，褥 显不影响酱泊的日游和颜饿“n ，。 囊聚糖的防腐性能与其分子援有关，有研究认为分子量槛1 5 0 0 左右鲍壳 聚稽瀚抗蓠活性最黼，大大高于裔分子的壳聚稽m 。亩予游离藏藻酌电离程度与 p h 值有关，因此，其抗菌滤性也同样与p h 值露关，在酸性条件下更有效n ” 。 辫子壳聚糖本身麓游离蒎基带有大鬣豹正电蘅，丽微生耪维施表丽带受电 荷，因此壳聚糖很容易被微生物吸附。壳果糖被吸附质，干扰了微生物细胞寝 瑟静带毫获态，导数缨魏澈透往蹭热，黥痰秘豢舞澄，往徽熏物死亡。雨霓短 链的低聚壳浆糖，尤其是7 糖及以上的寡糖，还可以进入微生物细胞内部，与 2 第蕈绪融 _ _ _ _ 自_ _ _ _ i q , l l 1 1 1 1i ! ! _ - e e _ d n a 结台，随亚m r n a 和鬣囱质的啦物含成，降低细胞的生命力f g l 。 ( 4 ) ，可以用于果蔬食品瓣儇鲜，起到僳漫、爝瀑积防疼作鼹m ，t s l 。舞聚糖 祷嗣燕低聚壳聚糖，国于有许多亲水的游离胺基殿籁基，对永有很高的亲和力 釉持水性。 莽j 瑙高分子魏壳聚糖藏骥性及低聚壳聚糖豹谦灞增漱骸，将这二者演合使 用，涂于水果蔬巢的装蕊，耐骆止水分蒸发鄹维生索c 等物质的损失，爨摄延 长货粱麓郴。低聚壳聚糖及巍黎糖商分子疑舆有鹃防腐毪熊还可以使桑蔬韵瘸 烂率明鼹下降l 。 在馒头孛嬲入l 璐巍聚耱，可浚农室溢陂霾l 葑天缳捺原状，稀一般馒头翠 已发干了。 5 ) t 诋聚巍聚耱胃键道铤黥蔽浚，效栗镪：巍藉、v c 更好。繇豢爨聚糖( n 3 7 ) 能减少灏便钙排泄，增加鼠股骨的骨折力。壳聚糖会减少钙的吸收，而低聚壳 聚耱鼙会爝懿锈鬻其它矿鹋鼷麓稷投辩，。 最近还有人研究用低聚筑浆糖作为钙、锌的载体，通j 蹬与钙、锌络台，制 备一嵇耨麓羚锈蛰锌羽。疆究袭鹱，舞聚耱与钙秽镩存一定蟾终会麓力，壤这 种络合物的生物活性尚待进一步研究1 9 1 。 1 ，2 ，2 僬聚壳凝糖在医药上斡应鬻 壳聚糖对人体细胞商良好的生物相容性与亲和性，壳策糖的单体与人体中 避臻爱鼗瓣擎髂致，与太髂缮整不会产雯黪斥反艨，无摭原嚣。这一独黪戆 性质使得它在阪药品中肖许多篥要的威用。 1 ) ，霹鞋撬鬻蔽体懿免疫力，增强久嚣羝筑爨落鼹力；低聚炎聚糖特疑是 低聚6 糖8 糟w 有效地活化人体淋巴细胞，增强人体抵抗瘸菌的能力。有关研 究裳鳃，低聚炎凝糖霹蠢效撼掇毫小鬣豹缎臆免疫凌缝秘锩液免疫功畿凇l 。 部分脱乙黼的壳聚糖，特冽是脱己酰度为7 0 的低聚荒聚糖能促进宿主对 大疑幸 蘧( ec o l i ) 和s e n d a i 痰毒艨染产生嚣专一憷戆抵拣。动楔试验表踞： 7 0 脱乙酰度的赢聚糖怒种免疫调节荆，可以激活豚鼠腹膜的甄噬细胞和中 性蓉伤缨艨，域鸯鞋抗体熬生成，挺离迟发型越敏爱应，增糖老鼠鼬缀鼹簿健， 诱哿如黼囱细胞、增激蠲子和干扰索的细稳分袭。( g l c n a c ) 6 矮裕强的抗念 珠壤活性。这种甲壳低聚糖邋过提商细胞免疫功熊箍对单接细胞增多性零斯特 蓠蒸有较鬣麓撺籍生长律霜。慧之，( g l c n a c ) 6 院( g l c n ) 6 辩体癍缁菌感染的 保护作用要强，黼( g l e n ) 6 的抗藏作用则较( g l c n a c ) 6 强。遮说明n 一乙醚穗 甏耱胺攀元滚深撼影酾嚣激滔免疫系统m ，。 ( 2 ) ，抑制瘸细胞的繁殖和扩散等作用。低粱壳聚糖可以明显提离荷瘸小鼠 荭缡藏免疫功能m 一。诋聚壳聚糖将爨楚祗聚6 糖8 糖可道逶滔亿莲懑细戆、 细胞毒t 淋巴细胞、n k 细胞和l a k 细胞达剐抑制癌细胞的粼殖和扩散来的作 华南理工大学工学博士学位论文 用。试验诚明，壳莱糖在浓度为6 4 m g l 时可增强n k 细胞的杀伤作用，9 6 m g l 时可增强l a k 缨腿杀伤佟用。另外，在p h 7 ，4 的体滚中，港巴细腿最活跃， 能畿接杀死癌细胞。但在癌细胞内及周围，由于癌细胞中的糖酵解作用的3 个 关键性酶一一二糖激酶、磷酸累糖激醚、丙酮跤激酶的活性根裹，会产生较多 豹酸，使褥p h 落偏商酸性，淋巴细胞功能迟钝，免痰功能下降。巍聚糖与胆 汁敬结合使人体瞧p h 傻偏于碱性，为淋巴缨腿攻击癌细胞创造适宜环境，从 而灞强入体免疫功能* * 。 壳聚糨还能够抑制燎细胞转穆。由于癌缨胞表醚比正常细胞具露更多的受 亳蕊，造成缀瑰袭匿电蓊不平赞，使癌纲稳静表蔼牯辩力降低，易通过盘鬻发 生转移。壳聚糖黼生物与细胞接触分予结合，封闭毛细血管内壁，使癌细胞不 裁缭台受体，敞蕊无法黏辫、转移，达爨治疗耱颈茨癌症静疆翡。 ( 3 ) ，减轻放化疗对患者的损害。癌症病人化疗时，烷化剂是很强的细胞毒 素秘覆，壳聚藜鼹寝辫这些褥震形残鬣台耨瑟簿窭髂井。蔽疗辩，放射线对癌 细胞、正常细胞均有杀伤作用，壳聚糖能保护正常细胞恢复。所以巍聚糖熊大 丈减轻敷、纯疗的毒囊露熙。舞聚耱在癌痉斡渗疗孛逐哥窝予增强拣瓣瘤药物 作用。将小分子抗肿瘤药载接到高分子载体壳聚糖上，通过水解或黼解药物与 载钵簧絮阏懿笾学键，麓之錾袭，释藏囊药耪，具有缓释、长效、低毒等傀壅 特憔1 2 3 】。 f | 喜，爨奏活健缀骢，接裁老徒，浚复个黎富功隧斡作惩。经婿究诞实， 低聚壳聚糖对植物神经岽统及内分泌系统有调节作用。低聚巍聚糖进入血脑屏 箨，缝骖复藿葬藏缀鼹，治疗膝婆绩；进入盘攀屡簿，磐复营葬装艨缨整，改 善酸性环境，促进性激素的分泌，恢复提高性功能；进入胎擞屏障，使胎儿健 康、强壮、皮肤兜溪等”。 甲壳綮在人体受伤部位能活化细胞，大量产生胶原纤维，胶原纤维可j 魏速 形成缝致驰皮默，健进伤i ：3 愈合，不会爨下瘛痕，在治疗烧揍、烫伤、钋佟、 加滤伤口愈台、止斑、消炎方面疗效独特。水溶性壳凝糖较商分子巍聚糖和甲 壳索更寿效潮l 。 ( 5 ) ，低聚壳聚糖对脂肪肝韵形成其有明显的预防作用，菠机理滁了减少脂 肪囊肠道的吸收外，还可能有保护艇脏，提裹胖抗氧化戆力，促进其对脂膜舱 氧化与转运功能韵作用m l 。 ( 6 ) ，低聚壳聚糖可以降低胖脏中膜嘲醇含爨。低聚壳聚糙可以吸收胆汁酸 和德使疆汁酸排出俸鲚，小肠内胆汁黢静藏少会导致翳雨强弱醇向疆汁簸转 化，从而降低肝脏中胆固孵的含辍n “。 f 7 ) ，低聚壳聚藉还可敬与碘貉合，该络舍携具有较好赫撺箴真麓鹃稳羯， 有撩作为种新的抗真菌翁物n l 。 4 第章绪论 另外，低聚壳聚耱还可以清除体内自由熬、并具有抗艾滋病的作用t 2 3 1 。 ，2 。3 低聚壳聚糖在化妆麓上的应是 ( 1 ) ，添加到护肤品中。低聚壳聚糖所其宵的优良的保濑增湿性能、成膜功 能、良好的透气性能使姆它在化妆晶上也有诲多应熙。低聚蠢聚糖与人体皮获 中存在的逶疆藤淑相似，其傈瀛增湿效果沈传统韵保湿剂f 如透明脯酸、甘油、 乳酸钠等) 更好1 1 2 1 ，并熙没有任何刺激性，在护趺化妆黯中添加一定量的低聚 壳聚耱，溉可孩游盘诧妆晶中水分的逸失，筏孀后又胃以调节皮获表面酌水分， 从而起到增湿保湿作用。 莪聚瓷聚鞭胃在皮获表嚣形残一层貘，可阻断域减弱綮拜线对皮簌的伤 害，而且，低聚溉聚糖良好的透气性又不影响皮肤排泄废物和毒素，本身所具 鸯靛薅蕊 # 焉运会撩裁或杀瑟震获表蕊翡有害徽皇耨，不会形藏糟藕。鬣聚壳 聚糖还有刺激皮肤细胞鞭生的作用u 。 霹为低聚蠢蘩糖分予较枣，更暴予被疫熬暖教，侄遗盛滚覆球，霆鼗，添 加低聚壳聚糖的护肤产晶可以通过毫孔直接渗透到皮肤内部，甚歪是细胞内 蒸，莛戮调理、绦护、滋灌痰蒎戆箨两一。 ( 2 ) ，用于洗发护发晶中。张聚糖的有机敞盐是阳离子电解质，溶于水，有 增穗、镙温、撼静毫箨麓。竞聚糖裁褥戆瘁熊，涂捧在头笈上影成一藤薄簇， 硬度适中风不发粘，该滕丝具有与头发亲和能大、光异味、无副作用，抗静电 效果爵，更曩予头发骧壤、定麓，美瓣毙泽捌。 1 2 4 低聚壳聚糖在农业上的应闱 f 1 ) ，植嫠瘸密的赛浍：诱器捷耱产生广谱抗注，增强穰物鑫身麓陆翌髓力， 抑制多种瘸源微嫩物的擞长。 低聚巍聚糖霹以诱导檀秘产生抗髅蛋自，惫摇檀梅撬嚣爨、甲蠢素懿、焘 聚糖酶、8 1 ，3 一葡聚糖酶等。植物抗毒素是一种低分子撬化合物，如隳黄 醚，具有爨显豹抗微生物活性，对攮物毒保护偿曩；露甲受索酶、毙聚糖冁褒 # 一1 , 3 一葡聚耱酶这些酶的底物甲壳索、壳聚糖和葡聚糖怒真菌细胞壁的主 要嬷分，泽壳素酶，特嬲是在8 1 , 3 一甍聚糖酶黪共同幸鐾怒下可在体外瓣劁 真觜的生陡”0 1 。 低聚党聚糖耀以诱姆植物产生本威素、惑创葡聚糖的形成。本旗素是出多 种苯基类两烷醇缔合而成的多聚物，是耩物维帮组织次生细胞壁韵主要组分，决 定缨胞壁的强度t 摹 1 刚性，它本身抗微生物的降娜；愈创葡聚糖是一攀申富含3 1 , 3 葡萄糖豹多糖，在德耪受剩病漂微生耪侵害时，常程销照闽沉积愈铆葡 聚糖，从弼将受越感染的部位与正常的细胞分割开，形成物理屏障，而起划抗 瘸俸藤m i 。 改变撼物的酚类代谢。低聚壳聚糖诱导缃胞中酚淡组成迅速变化，如苯丙 华南理工大学工学博士学位论文 烷、香豆酸和绿原酸等都明显增加。酚类即是杀菌物质，又怒木质綮的前体物 质，所以檀憋馋滤酪类增多，不瞧皂身霹以抗痪，嚣羹还可德健瘸骤侵染处本 质纯，因而使植物抗病能力增强m ，。 低聚强暴糖本身还对植物瘸原微生物有益接的挪制作鼷。研究发现，炎聚 糖对大多数真菌都有一定静抑制作用m j 。 低聚党聚糖迟对植物病毒、类病毒袁抑制俸鼹。爨聚糖蛉抗病锩 乍熙魁通 过宿主缩熊实现静，虽蠢聚糖静聚合程寝越高，箕抗瘸毒律髑也越强，值与其 脱己酰度关系不大，而脱氯基壳聚糖对t m v ( 烟草花叶病毒) 的抑制俸用比未经 穆镩戆壳聚耱聚合锈强。 ( 2 ) ，低聚壳聚糖可以作为新型植物生长调节荆。低聚壳聚糖可以促进檬物 生袭，爨离释予发芽率，疆离撬瘸茬。 袭迪红等人】的研究发现，用低聚巍聚糖处理水稻、玉米，出努率和产量 雾鞭显主舞。鼷轰浆耱楚疆冬夸凌辣子，哥蹭产5 3 0 ，品质氆有撬商， 如蛋白质增加3 3 6 ，湿衙筋增加2 1 5 ，于阐筋增加2 0 。刘和众用壳聚糖 舞主要残分耱9 3 4 增产裁浸漶骛泠萋静薯，壤终产鬟增燕2 0 。臻o 0 5 程 0 0 3 浓度的壳聚槠浸种，可分别使玉米增产1 4 8 和8 ，5 ，壳聚糖处理尉， 穗长、穗羲、薅越数稻菩糖重驽蠢提衰。羧串蒸壳聚耱辩玉米栈落串骞关酶( 磷 酸述原酶、谷氨酸脱氢酶、蛋白水解酶) 的活性有明恩影响，可显著提高孤米 转孑蘸发憝乳孛畦淀羧酶灌整及时绿豢含量，对穗子薅发及耪萤生长具有臻 显的生理调节作用。用水溶性壳凝糖处理小麦种子，w 促进小麦生长，增加分 蘖和露夔穗数，弗胃耱戳，j 、麦纹糖瘕的发生一。 1 3 低聚壳聚糖的制备方漶 。3 化学降簿法( 包捶酸鳃法鞠氯亿降艇法) ( 1 ) 酸解法 羧求解法制餐甲轰低聚糖臻究较旱。麦聚耱在强羧终燕下发生避烈降解， 但酸解的条件不易控制，选择性较差，分离纯化困难，且产鬣低。翻前，国外 工业生产是采用h c l 东绥法。 盐酸降解法：髑浓盐酸降解壳聚糖，反应4 8 小时届，冷却，用舀醇洗涤， 经浓硫酸干燥，可制褥聚会度低予l o 螅低聚爨聚糖盐酸盐，健这种方法褥烈 的产晶分子激分布较宽j 。 氟化氢降解法：d e f a y e 等甩窳化氢降解壳聚糖，绔到较糍产量的三糖到十 糖，讴是最焉需要移走大餐的氟纯氢且避行迸步脱氟反应，觚而在实践中爱 到限制。而且化学艇应条件非常苛刻 3 4 1 。 黻一耍硝酸盐法：在酸经条件下，褥1 0 浓度静n a n 0 2 溶液楚毽壳累糖， 分子上的一n h 2 基因发生羹氮化反应而消除，分予断裂，得到链末端镫有醛撼 6 第一荜绪论 g _ _ e _ _ i i i i i i i i i i i i i i i i _ _ 目- - _ _ _ _ - 皇# 豹低聚耪。再以n a b h 4 溶液还原，可制得低聚壳聚糖 3 3 ，3 5 。 过醋酸法：焱接采用过醋酸降解蠢聚糖，或者以浓硫酸噱催位裁，溪避氧 纯氯氧仡醋酸酐，制得避醋酸，再加入到壳聚糖的醋酸溶液中迸行降解反应， 亦可锝到低聚壳聚糖m ，。 浓硫酸法：在无枫簸中掬入6 5 的浓硫酸降解糍聚耱，反应段时闻后， 再加入一定体积的m e c o h 2 s m 混合渡处理，露得剥低聚巍聚糖m 】。 2 裁纯箨解法 过氧化氢法：据文献报道，在壳聚糠溶波中加入适量的过氧化氮溶波，调 苓溶滚豹p h 蕊为3 5 ，在穰纯裁存在下逡行簿鹅；也可戳在碱缝承溶液中， 调节壳聚糖的p h 值为1 l 。5 ，温度为7 0 。c 左右，分批加入一定量3 5 的过氧化 氢滚滚遗括簿瓣艨应。这耱方法键各熬壳低聚糖懿平均分予爨为2 6 0 9 一，* 。严 淑兰等 y 7 ，优化了邀氧化氯法的反应条彳牛，认为最佳反应条件为：过氯化氢浓度 霹；聂痤滋囊5 0 ；爱癍辩瓣2 h ；乙酸滚菠4 5 。采爝避氧诧氢鬣铯簿瓣法 制备低聚淹聚糖，降解祭件中影响产物脱乙酰度的主薅因素为反应酸性介质乙 袋鲶浓囊；焉爱应辩霾变继薄产妨夔特注糖藏静影瘸最大。降释条搏霹露巍凌 影响产物的颜色。 过氧傀嚣一次氯酸镳法：在0 。0 0 4 一t 0 麓次氯酸镳及0 0 1 一3 5 豹过氧 化氯溶液中加入逑量盐酸，8 0 反应1 小时，然后用氯氧化钠中和，再经处理 曩露褥妥分予量势6 0 0 鲍低聚蠢聚糖1 3 3 1 。 过氧化氢一盐酸法：用适鬣稀盐酸溶解壳聚糖，然后加入氢氧化钠使篡成 兔懋浊滚，再热入遘氧缘氯，程7 0 ( 2 发痤降解轰累鞲，逛可貘壹接艇入2 8 的越氧化氯和浓_ 鑫艇酸在8 04 c 反感，得到低聚壳聚糖】。 n a b 0 3 氧化法：爆5 螅醋黢溶液溶解壳聚糖。攘入谗氍n a b 0 3 溶液，在 5 0 下搅拌反应8 小时，冷却腊，加入k o h 溶液调节p h 值至1 0 1 1 ，经离 心分离褥淡淀携，鼹去禽子水洗涤至中性，真空于燥矮可德烈平均分子蕊炎 8 8 0 0 的低聚壳聚耨 2 6 】。 1 。3 。2 物理场降解法 ( 1 ) 微波场辫解法 在甲爨素脱恐酸反应中采用微波，可以使脱乙酰反应与炎聚糖分子中糖瞢 键晌断裂丽时进行，这样可以簿低甲壳索脱乙酰化过程中静丽碱量，减少_ 擞产 成本，缩短生产周期 2 6 1 。 ( 2 ) y - 射线辩解法 y 射线法制舔甲壳低聚糖的研究也较多，这是一种制铸低分予量壳聚糖 翁骞效方法。壳聚糖在辐赛孛过程中糖替键将发裳瑟裂，低裁整豹辐射辞哥毽壳 聚糙的糖替键断裂，粘度发生较大的变化，使阁不同的辐射剂量可得到不同分 7 华甫理工大学工学博士学位论文 曩i l li l l l l i i i _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ e _ 子濑的产赫掰，。讴该法难黻得到分子最在4 0 0 0 0 以下的产品 2 6 j 。 ( 3 ) 超声波法 霜超声波降解壳聚糖，反戚温和，可以在低温下进行，鼠在降解过程中不 会发生n h 2 基被绦合的反应 2 6 1 。 侄这麓方法馥有一定豹蜀敲，如：徽波酶解的过程中容易发生交联反应； 超膨波降解只适合于在浓度极低的状态下进行 2 6 1 。 。3 。3 会成法 ( 1 ) 化学合成法 在台娥过程涉及基弱黥傈护帮羞霞兹脱去等过稳，步骤较旁复窳，大餐合 成兰糖以上的低聚体在实践上是不可取的 2 6 1 。 2 酶法台藏 酶法合成条件温和，且不需凝对羟熬进行保护。酶法合成的过程是低聚合 麦爨糖在酶瓣参与终雳下，延长藉链成蔻藏聚合痰菸辩繇聚壳聚糖。麸 n o c a r d i a o r i e u t a l i s i f 0 1 2 8 0 6 及t r i c h o d e r m a k d r 一1 1 中得到的甲壳素酶具有转糖 营佟震，爵戳峦g l c n a c ) , l 及( g i c n a c ) 5 粼蚕( g i c n a c ) 6 、( g | c n a c ) 7 。( g i c n a c ) 6 的产率可达到4 3 。另外溶菌酶也具有与甲壳索酶类似的转糖苷作用d 8 1 。 餐是霹葭合残法俱照予醭究玲段，辨镬或功，其应薅也只戆是爨羧在纂些 寡糖的合成上。 1 。3 。4 酶水解法 ( 1 ) 非帑一性酶水解法 嚣蓠，瑟经发瑷3 0 多耱菲专一蛙熟酶洪水鲜嵬聚蕤，其孛，效巢较涤 显著的酶包括来自t r i c h o d e r m av i r i d e 以及a s p e r g i l l u sn i g e r 的纤维豢酶、来自 a s p e r g i l l u so r y z a e 缒半纤维素酶、来鑫a s p e r g i l l u sn i g e r 鲍果驳酶、采惫 a s p e r g i l l u sn i g e r 的脂肪酶、来自a s p e r g i l l u so r y z a e 的真菌蛋白酶、木瓜蛋白 酶、笼蓖暴爨自酶、菠萝蛋囊酶、霉蛋爨酶、溶蕊酶等1 3 9 m ，。这些酶降鼹底耀 韵模疏不符念米氏渤力学渺j 。 张用j 专一性酶水鹪嶷聚糖，从恧获攫低聚竞聚糖是尽魏舱研究热点，瞧 是颇燕前途的方向，在哥翦没有办法获褥大量谳廉价的专一往的壳聚糖酶韵情 况下，采用非专一性的各种酶降姆壳聚糖，无疑具有缀商的现实意义。国虑外 砉器跫经在这一方面徽了大惑豹研究工豫。但是，壳聚糖豹菲专一性酶承解韵许 多具体反应细节尚不清楚，有待进一步研究。 本蹑蛋鑫酶可鼹来承解壳聚耱，毽冀承解稳理有褥子进一步研究。与其它 酶相比，木瓜蛋白酶对壳聚糖的水鳃速率很快，且价格低，引超各研究者的注 意。程p h 3 ，翡条搏下零j 蒋本蕊蛋鑫酶进行裁餐撬模靛实验，平筠分子量为 ( 4 - - 7 ) t 0 5 的壳聚糖可以很容易地降解为分子爨1 0 3 1 0 4 之间的水勰产物， 第一牵绪论 遮正是食品及酾品行媳需要静产品。另外，也已经商固定化木瓜鬣白酶嫩产低 聚轰聚糖的研究，将本瓜蛋白懿露定凌甲意豢粉寒、壳聚糖姣氧化锯等载钵上， 水解壳凝糖或翠壳素。该酶在p h3 2 的乳酸溶液中驻示其激大活性，经适当控 制可得到所霰聚会度的产物。间时逆发现，这一酶髌过程不遵循麟单鲍黪键反 斑动力学模型。木瓜鬣自酶优先水解菇有较离聚合发的壳聚糖分子链r ”j 。 陈露等t ，研究了用中性礞国酶水解壳聚糖的过瑕，测试了酶发应的鼹逶湿 度窝最遗p h 藏，并骈究了该酶键反馥静动力学，与其谴入的研究结采不两韵 题，陈云的结果表明，该酶促反应符食米氏渤力学方程；黼且，鹣活性与底物 携虢乙躐度有缀大关系。毽趱申洼蛋囱酶承解壳豢精豹效聚并不很理想。 夏文水m 】研究了用嶷胚芽脂肪酶水解壳聚糖的反应过程，结聚表明，衰胚 露黪藤酶在徽鼗健条传下麓嚣鬻有效遮隶辩轰聚耱及萁掰擞粝，键反应过程不 符合普通的酶动力学模烈。但这种酶能快速降低壳浆糖溶液的粘魔，形成分子 袋分毒鞍蚜鸯瀚释缮产兹。 还肖研究卷研究了采用几种酶复禽作用水解壳浆糖，如h u z h a n g r 4 ，1 嚣研究 了凌纾缭豢骛、n 淀粉酶、蛋鑫酶蘩彝搀鼷于壳聚糖，萍裁露膜分离技零薅 反应中产生的低聚壳聚糖及时分离出来，获得3 糖1 0 糖的最大产率。慕魑非 专一注繇类隶解巍聚瓣辩具蠢怪蠢 擎麓，袋愆这些魏缀威复台酶，其泰解佟爰 比单一酶臻强。在适当的条件下，用遮些酶水解壳聚糖可以得到相对分予质量 低予3 0 0 0 懿鬣袋蘩”。 但魑，非专性的酶水解壳聚糖，往往很难得到高度水解的产物，例如具 鸯缀嘉畿瑗活性懿5 糠s 糖。要褥援这一类寡糖，需要褥专一镶更高嚣隶解 效率更高的酶类来水解。 2 ) 专一戆酶降熊法 专一性水解壳聚糖的酶包括溶馨酪、甲黉索酶、壳聚糖酶等。 溶麓懿( e 。c 3 2 。1 1 7 ) ：漤蕊酶广泛分舔在骞然器中，在毯携、撞物、徽 激物中都蒋遍存在。诚酶可以水解细翁肽聚稽的n 乙酰葡萄糖胺长镳的 1 ，4 。糖蛰键，e l l 予甲竞豢及壳聚糖与默聚撼黝续梅一p 分相似，因此，溶壤懿凰 栉胃戳水解甲巍索豹岱- l ，4 一糖营键。 从蛋漪中提取褥到的溶麓酶对甲巍素及党聚糖的降群方式与其它酶类蠢 所不同。姘究发蕊，嵬聚糖懿瓣乙酰程度及g i c n a c 、g l c n 攀钵韵分布照藩影 响溶菌酶对上述底物的水解。该酶可以将聚含度为1 0 0 0 的龆分脱矗酰壳聚糖 承解为聚合度霞约为l i 静产物。底躲鹣乙酰亿度越商，越容荔被溶蔼酶滴纯， 低浆多糖生成的最佳脱己酰度为7 0 。在被溶菌酶水解时，随者n 一乙酰化程 魔懿提囊，产耪聚合纛舞赢，产餐增瓣，毽凝会度大予6 游产物黪产量缯糯不 是很显著】。 9 华南瑷工大学工学博士举位论文 _ ii _ - _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ e 日- _ _ - e e _ _ _ _ 日_ - _ _ _ _ _ | _ _ - _ - _ _ _ _ _ - _ _ e | _ _ _ _ _ _ 目_ - 甲壳索酶( e c 3 2 1 1 1 ) ：该酶来源广泛，在许多植物、微生物中都存在，例 如在杆菌、链霉蘸、大多数真蘧中都鸯。甲壳素酶水勰甲壳索及壳蒙糖的效率 较其它酶炎高，遮是因为它与甲壳素有特异的作用位点，可以水解甲壳素中的 b - 1 , 4 糖静键。该酶可以降解部分或完全乙酸化的甲壳素，生成低聚壳聚糖， 但不能降解完全脱乙酰化的壳聚糖。该酶的底物特弊性是藤求水解的1 3 ，1 ，4 一 糖蒋键的掰侧至少有一侧是n 一乙酰葡强糖胺。甲壳索的乙嫩化程度对该酶水 解巍聚稽效率有较大影桐。一般认为，l o 3 0