（食品科学专业论文）大豆蛋白性质的改造及改性蛋白在香肠中的应用.pdf

摘要 大豆蛋白性质的改造及改性蛋白在香肠中的应用 学科、专业：工科、食品科学 硕士研究生姓名：金牧 指导教n i 熊幼翎教授 摘要 入学时间：2 0 0 7 年9 月1 日 答辩时间：2 0 0 9 年1 2 月1 1 日 授予学位时间： 大豆分离蛋白( s p i ) 作为一种植物蛋白，具有较低的成本和较高的营养价值，常 作为食品配料广泛应用于肉制品加工中。但在实际的肉制品加工中，尤其是法兰克福香 肠的3 n - r _ 中，现有商业s p i 除了填充作用外，对肌肉蛋白凝胶的辅助与提高的积极作用 并不十分显著，甚至还有反作用。本论文主要探讨s p i 经过酶水解和交联改牲后功能性 质的变化及其对肌原纤维蛋白( m p i ) 凝胶性质和法兰克福香肠品质的影响，以期探索 出适合于法兰克福香肠的大豆蛋白的改造方法以及使用方法。该研究结果对于促进s p i 在香肠中的合理应用，改善香肠品质具有重要的实践意义，对于进一步认识s p i 与m p i 的相互作用有一定的理论价值。 论文以提高s p i 的凝胶性质和乳化性质为目标，将碱性蛋白酶( a l c a l a s e ) 水解和 谷氨酰胺转移酶( t g a s e ) 交联两种手段结合，对s p i 进行改造。通过考察s p i 及其水 解交联产物凝胶强度、乳化性、持水性等功能性质，以及改造产物的电泳、自由羧基变 化等结构信息，研究s p i 的改性效果。结果表明：大豆蛋白经过碱性蛋白酶水解、t g 交联处理后，性质有了显著改变。经过碱性蛋白酶水解的s p i ，在d h 5 以下，随着水解 度的增加，其乳化性不断提高，而乳化稳定性有不同程度的降低。将s p i 及其水解产物 采用t g 交联后，s p i 的交联产物的乳化性降低、乳化稳定性提高；而水解物的交联产 物的乳化性和乳化稳定性没有显著变化。s p i 经过碱性蛋白酶水解后成胶性能急剧下降， t g 可以显著提高s p i 的凝胶强度，但是对大豆蛋白水解产物的成胶性能没有帮助。酶 水解可以提高s p i 的抗氧化性，t g 对大豆蛋白及其水解产物的抗氧化性影响不显著。 对大豆蛋白改造产物的电泳和自由羧基含量研究说明了s p i 、s p i 水解产物以及水解后 再交联产物的分子量和分子量分布的变动，印证了上述蛋白性质结果的合理性。 接着论文将天然s p i 、s p i 水解物以及s p i 水解再交联后的产物加入到肌肉纤维蛋 白中，探讨在大豆蛋白肌肉纤维蛋白这个模拟体系中，对混合蛋白的流变学性质及热 诱导凝胶性质的影响。对于不使用t g 进行交联的肌肉蛋白大豆蛋白混合蛋白体系，大 豆水解蛋白以及水解再交联的大豆蛋白对于肉凝胶体系的作用优于天然未变性大豆蛋 白；与天然s p i 相比，经过水解交联改性的s p i 可以显著提高混合蛋白的乳化性与乳化 稳定性以及凝胶强度和弹性模量，例如在4 蛋白浓度下，以大豆蛋白：肌纤维蛋白1 ： 1 添加量添加了天然s p i 的混合蛋白相比，添加s p i 水解交联产物的混合蛋白的乳化性 和乳化稳定性分别提高了1 7 与6 7 。而对于使用t g 进行交联的混合蛋白体系，大豆 水解蚩白对于t g 的交联效果有显著的负面效应，纯肌肉纤维蛋白t g 交联后体系的凝 摘要 胶强度和弹性模量最强，而s p i 与肌纤维蛋白的混合体系其次，大豆水解蛋白则阻碍体 系的凝胶形成。 最后论文将经过改造的大豆蛋白应用与法兰克福香肠体系，探讨改性s p i 对法兰克 福香肠蒸煮损失、质构性质以及抗氧化能力的影响。结果显示添加s p i 水解交联产物的 香肠品质得到提升，蒸煮损失减少，储藏稳定性提高；混合体系中直接添加t g 后，未 变性s p i 与m p i 的混合蛋白的凝胶强度显著高于s p i 水解产物与m p i 的混合蛋白的凝 胶强度；在添加了大豆蛋白的香肠中再采用t g 处理，结果显示添加s p i 的香肠凝胶强 度显著强于添加s p i 水解产物的香肠，但香肠蒸煮损失效果相反。该结果进一步说明在 使用t g 的肉制品体系中，天然s p i 可以促进t g 对混合蛋白的交联效果，而s p i 水解 产物则不利于t g 的作用。 以上研究表明，s p i 水解产物和t g 不适合同时添加到法兰克福香肠体系中。该研 究结果对香肠的实际生产有一定的指导意义，对于进一步认识s p i 与m p i 的相互作用以 及t g 对于两者的作用机制有一定的学术价值。 关键词：大豆分离蛋白；水解；交联；法兰克福香肠；质构；抗氧化 a b s t r a c t m o d i f i c a t i o no fp r o p e r t i e so fs o y p r o t e i na n dt h ea p p l i c a t i o n o fm o d i f i e ds o yp r o t e i ni ns a u s a g e s s u b j e c ta n ds p e c i a l i t y ：e n g i n e e r i n g ，f o o ds c i e n c e t i m eo f e n r o l l m e n t ：0 1 0 9 2 0 0 7 m a s t e rg r a d u a t es t u d e n t ：m uj i n t i m eo fd e f e n s e ：11 12 - 2 0 0 9 f a c u l t ya d v i s e r ：p r o f y o u l i n gx i o n g t i m eo f e o n f e r r i n gd e g r e e ： a b s t r a c t a san u t r i t i o u s ，l o w - c o s ta n df u n c t i o n a lf o o di n g r e d i e n t ，s o yp r o t e i ni st h em o s tw i l d l y u s e dp r o t e i ni np r o c e s s e dm e a t s b u ti t sr o l ei ns t a b i l i t ya n dq u a l i t yo fm e a t p r o d u c t si so f t e n l i m i t e db yt h ei n s u f f i c i e n ti n t e r a c t i o nb e t w e e ns o yp r o t e i na n dm u s c l ep r o t e i n t h eh i g h t h e r m a ls t a b i l i t yo fs o yp r o t e i np r e v e n ti tf r o mb e i n gd e n a t u r e du n d e rt h en o r m a lm e a t p r o c e s s i n gt e m p e r a t u r e t h i sw o u l da f f e c tt h ei m p r o v e m e n to fm e a tp r o d u c t s e n z y m eh y d r o l y s i si sac o m m o nm e t h o df o ra l t e r i n gt h ec o n f o r m a t i o no fs o yp r o t e i n e n z y m a t i ch y d r o l y s i sc a na l t e rf u n c t i o n a lp r o p e r t i e sa n dn u t r i t i o n a lv a l u eo ft h ep r o t e i n s a l c a l a s ei saw i l d l yu s e de n z y m ei nf o o di n d u s t r y i tc a nc l e a v eh u g ep r o t e i ni n t os h o r t p e p t i d e s t g a s ei sa l le f f i c i e n t l ye n z y m ei nc r o s s l i n k i n gp e p t i d e si n t ob i go n e s t h e c o m b i n a t i o no fa l c a l a s eh y d r o l y s i sa n dt g a s ec r o s s - l i n k i n gi ss u p p o s e dt oc r e a t ea g o o df o o d i n g r e d i e n ti ni m p r o v i n gt h et e x t u r ep r o p e r t i e sa n da n t i o x i d a n ta c t i v i t yf o rf r a n k f u r t e r a l c a l a s e h y d r o l y s i sd e c r e a s e d t h em o l e c u l e w e i g h t o fs p i ，d e d u c e ds u r f a c e h y d r o p h o b i c i t ya n dg e l a t i o ne i t h e rb u ti m p r o v e dt h ee m u i s i f y i n gp r o p e r t i e sa n da n t i - o x i d a n t a c t i v i t y t g i n c u b a t i o n i m p r o v e dt h em o l e c u l ew e i g h to fs p ih y d r o l y s a t e s ，s u r f a c e h y d r o l y s a t e ，g e l a t i o n ，a n t i - o x i d a n ta c t i v i t ya tt h ef i r s tb e g i n n i n g a d d i t i o no ft gi n c u b a t e ds p i h y d r o l y s a t e sp r o m o t e dt h ee m u l s i o na c t i v i t ya n de m u l s i o n s t a b i l i t yi nt h em o l d e ns y s t e m i ta l s oa d v a n c e dt h et e x t u r ep r o p e r t ya n dw a t e rh o l d i n g c a p a c i t yo fm i x e dp r o t e i ne s p e c i a l l yw h e nt h er a t i oo fs p it om p ii s1 ：3 o nt h eb a s i so fw o r kb e f o r e ，t h ee f f e c to ft gc r o s s 1i n k e ds p ih y d r o l y s a t e so nt e x t u r e a n da n t i o x i d a n ta c t i v i t yo ff r a n k f a r t c r sw e r ei n v e s t i g a t e dd u r i n gr e f r i g e r a t e ds t o r a g eo v e l 7 d a y s t b a r sv a l u ew a sm e a s u r e dt oe v a l u a t et h ed e g r e eo fl i p i do x i d a t i o n b o t ha d d i t i o n s o fn o n h y d r o l y z e ds p ia n dh y d r o l y z e ds p ii nf r a n k f u r t e r sr e s u l t e di ns i g n i f i c a n tr e d u c t i o n s ( p o 0 5 ) c o m p a r e dw i t hc o n t r 0 1 t e x t u r ep r o f i l ea n a l y s i ss h o w e ds i g n i f i c a n ti m p r o v e m e n ti n h a r d n e s s ，s p r i n g i n e s s ，v a l u e so ft gc r o s s - l i n k e ds p ih y d r o l y s a t ea d d e ds a u s a g e sc o m p a r e d w i t hc o n t r 0 1 t h er e s u l ts u g g e s t e dt h a t2h o u r st gc r o s s l i n k e ds p ih y d r o l y s a t ee s p e c i a l l y w h e nd h 2 4a d d e ds a u s a g ew a st h em o s tp r o f i t a b l ep r o d u c t t gi n c u b a t e ds p ih y d r o l y s a t e sc o u l di m p r o v et h eq u a l i t yo ff r a n k f u r t e r sd r a m a t i c a l l y c o m p a r e dw i t hn a t i v es p ia d d e ds a u s a g e t h i sr e s e a r c hi sm e a n i n g f u lt om e a tp r o c e s s i n g f a c t o r i e s k e y w o r d s ：s p ih y d r o l y s a t e s ；t gc r o s s l i n k i n g ；f r a n k f u r t e r ；t p a ；a n t i o x i d a n ta c t i v i t y 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名：釜缓b 瓤：沁 。险 f 。 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、；1 2 编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签 名：仓投导师签名： 日 期： 1 引言 1 引言 1 1 立题背景及意义 大豆分离蛋白( s p i ) 作为一种优质的植物性蛋白，具有胆固醇含量低，营养价值 高等特点，备受消费者的青睐。近年来，随着对大豆蛋白经济价值与功能特性的研究不 断深入，将大豆蛋白制品添加到肉制品中的应用也越来越广泛，同时添加的目的也由简 单的替代逐渐转变成合理利用大豆蛋白的功能特性。其中，如何应用大豆分离蛋白和其 他食品添加剂或配料来维持或提高肉制品应有的风味、质构、保水保油性、口感、延长 货架期等一直是肉制品加工中研究的重点。 目前，有关将s p i 作为功能性添加剂应用于肉制品加工的研究较多，大致可以分为 两类：一类是实验室提取的天然s p i ，另一类研究报道较多的是在肉制品中应用较广的 商业大豆分离蛋白，但是以上两种研究结果存在着严重的不一致性并有争议。例如， m a t u l i s ( 1 9 9 5 ) t 1 峙艮道，在法兰克福香肠中采用3 s p i 替代肉蛋白可以使肌肉凝胶的硬度 上升；c h i n ( 2 0 0 0 ) t 2 】的报道，在b o l o g n a 香肠中采用2 2 s p i 代替肉蛋白不影响肌肉凝胶 的强度；m c c o r d ( 1 9 9 8 ) 3 】报道，s p i 替代肉蛋白降低了肉蛋白的凝胶强度。由于不同s p i 生产商可能采取不同的生产工艺，在上述论文中也未标出所采用的s p i 的制备工艺以及 结构和性质参数，因此报道的s p i 对于肉制品作用的不一致性可以推测或理解为大豆蛋 白变性程度不同及结构不同导致的。 针对上述争论，现在已有一些学者开始研究改性s p i 在香肠中的应用，大部分研究 主要集中在热变性s p i 对于香肠品质的影响1 4 5 6 j 。目前，除了对s p i 进行热处理以外， 酶法改性作为另一种高效、绿色的手段也受到越来越多的推崇，然而将酶改性s p i 添加 入香肠中的应用研究还十分有限，f e n ga n dx i o n g ( 2 0 0 3 b ) 1 4 j 初步探讨了酶改性s p i 对于 改善香肠质构的可能性。其研究结果表明：恰当的酶改性条件可以改善香肠的质构。因 此本研究试图在酶改性s p i 应用于肉制品方面有所突破，进一步提高大豆蛋白在肉制品 应用中的价值。 本实验室的前期研究结果表明，大豆分离蛋白经部分水解后再经t g 交联可以有效 地提高s p i 的乳化性，本论文将在此基础上采用酶水解和酶交联的方式，研究不同水解 交联条件对s p i 乳化性、凝胶性及其他功能性质的影响，为进一步应用水解交联产物于 肉制品中提供理论基础。同时试验还将选择部分性质良好的水解交联产物，研究其与肌 原纤维蛋白( m p i ) 共同组成的模拟体系，并最终将模拟体系的结果应用到法兰克福香 肠中，以期进一步拓宽大豆蛋白在肉制品中的应用范围、提高应用价值。 本课题得到了国家“8 6 3 ”课题“植物源蛋白质性质的生物技术改良 ( 2 0 0 6 a a l 0 2 3 2 5 ) 和教育部新世纪优秀人才计划( n c e t - 0 7 0 3 7 7 ) 项目支持。 江南大学硕士学位论文 1 2 大豆蛋白及改性蛋白在肉制品中的应用 一般说来，肌肉蛋白凝胶形成过程分为三步：( 1 ) 高浓度盐对蛋白的增溶及肌原纤 维蛋白的解聚；( 2 ) 随着温度的升高，蛋白结构发生部分折叠；( 3 ) 通过氢键、二硫键、 静电相互作用力和疏水相互作用力等作用力的共同作用，使已经发生折叠的区域进一步 聚集，形成三维网状结构1 7 j 。肉制品的加工过程中，蛋白三维网状结构的形成，以及是 否能有效的包含油、水、等食品组分对于蛋白凝胶的结构、性质和最终产品的品质起着 至关重要的作用。 为了增加产品产出，降低生产成本，同时改善与产品质构相关的各项性质，肉制品 加工企业通常希望在产品配方中加入一定量的植物蛋白【引。大豆蛋白由于具有较高的营 养价值，丰富的功能性质，较低的成本，在肉制品加工企业中应用的最为广泛。同时大 豆蛋白所具有的低脂及低胆固醇特点，在消费者对健康食品需求不断上升的年代极大的 推动了食品加工企业对于大豆蛋白功能性质和新用途开发的深入研究，从而生产出更多 更加符合市场需求的产品，满足人们对于不断提高的物质文化水平的需要。 有关研究表明：大豆蛋白具有较强的凝胶性和乳化性，改善了产品的内部组织形态， 增加了产品的咀嚼感，提高了产品的营养价值【9 】；大豆蛋白具有的强保油性，减少了火 腿肠中瘦肉的添加，增加了肥肉的比例，改善了火腿肠的风味和口感，增加了产品的得 率i lu j ；大豆蛋白具有很强的保水性，减少了香肠制品在加工过程中的水分损失，有利于 保持肉汁，降低了香肠脱水收缩的程度，提高了产品的产率。上述研究表明，未变性大 豆分离蛋白的添加，有利于提高产品的产率，保持产品的风味，改善产品的乳化性、凝 胶性、保水保油性。但也有一些研究表明，未变性大豆分离蛋白的添加并未改善法兰克 福香肠的质构。例如：f e n g ( 2 0 0 3 b ) 4 j 报道添加2 s p i 的香肠的质构与未添加s p i 的香 肠的质构没有显著性差异；c h i n ( 19 9 9 ) 1 2 j 报道添加2 2 s p i 的香肠的硬度、弹性、咀嚼 性没有发生变化；m c c o r d ( 1 9 9 8 ) t m 报道，s p i 替代肉蛋白降低了肉蛋白的凝胶强度。有 报道称：肌球蛋白是肌肉蛋白中与大豆分离蛋白发生反应的主要物质。肌球蛋白与1 1 s 在温度超过8 5 时开始反应，伴随着二硫键的生成，凝胶网络结构形成，其中主要是肌 球蛋自的重链与解离的1 1 s 间发生反应【5 j 。由于法兰克福香肠的中心温度只需要达到7 2 即可，并未达到7 s ( 7 5 ) ，1 1 s ( 9 0 ) 的变性温度，故在此温度下，天然s p i 的结 构并没有或只发生了很小程度的改变，从而使得s p i 与肌肉蛋白间的相互作用力8 b d , ， 不能改善香肠的质构1 5 ，。同时肌球蛋白与b 伴球蛋白在温度超过5 0 开始反应，此 反应阻止了肌球蛋白重链的自我聚集，降低了凝胶的强度 1 2 , 1 3 j 。 由于香肠加工中s p i 的需求量巨大，而学术界对于s p i 能否提高香肠品质褒贬不一， 因此再次引起了众多学者对s p i 尤其是改性s p i 研究的关注。目前研究较多的是热变性 s p i 对香肠品质的影响，报道称：在9 0 和9 5 条件下对s p i 进行热处理，7 s 发生变 性，1 1 s 的碱性和酸性亚基聚集程度降低，使得s p i 与肉蛋白问的相互作用增强，提高 了肉凝胶的弹性和强度1 5j 。酶水解改性s p i 对香肠品质的影响也有报道，但数量较少。 f e n ga n dx i o n g ( 2 0 0 3 a ) 1 6 1 称：酶水解可以对s p i 的功能性质进行修饰，在低水解度下s p i 2 1 引言 与m p i 能更好的结合，但是对于m p i 凝胶性和乳化性的影响受到水解酶种类的限制。 碱性蛋白酶的效果比风味酶的效果好。 酶水解由于其过程所需条件温和，有害副产物少，并且通过对酶解条件的控制可以 有效的控制蛋白质的水解度，甚至可以有目的的选择肽链断开的位置。这种强的可操作 性使其成为目前蛋白改性研究的主要方向之一。大豆蛋白由于其产量大，用途广，成为 了酶水解研究的主要对象【l 训。通常说来，酶水解可以改变蛋白功能性质以及营养价值。 其效果主要取决于酶的种类以及水解度的大小【l5 1 。目前已有大量文章对大豆蛋白酶改性 的效果进行报道：酶水解降低了大豆蛋白的豆腥味【l6 1 ，随着水解度的增加蛋白的溶解度 逐渐增加【l 。限制性酶水解( 水解度小于5 ) 增强了蛋白的乳化性【1 8 l 。此外，大豆蛋 白水解产物中的短肽还显示了较好的抗氧化性【1 9 1 。 法兰克福香肠属于乳化类肉糜制品，其制作原理即是用斩拌机将肉进行快速斩拌， 将蛋白质溶解出来，让脂肪粒悬浮于蛋白质溶液内，蛋白质形成的间质将脂肪粒包围， 形成保护膜，达到乳化的效果【2 0 j 。与天然s p i 相比，经过适度水解的s p i 乳化性得到提 高，但不产生苦味肽【1 8 , 2 1 】，是一种良好的乳化剂，因此对于提高法兰克福香肠的品质有 帮助【6 1 。 1 3 国内法兰克福香肠的研究进展 法兰克福香肠为低温乳化性肉糜香肠，此种香肠要求有良好的乳化性、持水性和凝 胶性。目前国内的法兰克福香肠在生产过程中通常添加较多的商业大豆蛋白用以提高其 乳化性和持水性，有的甚至直接添加乳化剂，但是使用效果都不理想，同时还有部分厂 家为了提高香肠的凝胶性直接在香肠罩添加t g 酶，t g 可以有效的提高蛋白的分子量， 促进蛋白间的相互作用。经t g a s e 交联的蛋白具有良好的乳化性，持水性和凝胶性【2 2 1 。 但是t g 酶在法兰克福香肠里的效果不稳定，导致香肠的品质难以控制。 因此，一种具有高溶解度、良好乳化性和持水性专门用于生产法兰克福香肠的大豆 分离蛋白越来越受到市场的重视。 1 4 研究目的及主要内容 本课题以s p i 及其水解交联产物与肌原纤维蛋白的混合蛋白为主要研究对象，研究 混合蛋白的流变学性质及凝胶强度、乳化性、持水性等性质。其目的在于讨论经过何种 处理的s p i 及何种t g 添加方式有利于提高肉蛋白的凝胶特性，从而应用于法兰克福香 肠中，得以提高s p i 在法兰克福香肠中的合理应用，重点考察法兰克福香肠质构的变化 及储藏稳定性。 论文主要研究内容如下： ( 1 ) 用酶水解和酶交联结合处理大豆分离蛋白，探讨酶改性对大豆分离蛋白乳化 性、凝胶性、抗氧化性的影响。 江南大学硕士学位论文 ( 2 ) 依据各改性s p i 功能性质的变化情况，选取最具代表性的改性s p i ，将其与 m p i 按不同比例混合，探讨混合蛋白的流变学性质、凝胶性能、乳化性能。同时考察 t g 以不同的添加方式添加到模拟体系中，对于混合蛋白流变学性质、凝胶性能的影响。 ( 3 ) 将模拟体系的结果应用于法兰克福香肠中，对香肠进行全质构、持水性、氧 化稳定性评价。 2 实验方法与材料 2 1 实验材料与试剂 新鲜猪里脊肉、大豆( 台湾2 9 2 品种) 、食盐、大豆油：市售； 正己烷、乙醇、氢氧化钠、硫酸铜、硫酸钾、酒石酸钾钠、氯化钠、牛血清白蛋白、 硫代巴比妥酸( t b a ) 、叔丁基羟基茴香醚( b h a ) 、三氯乙酸( t c a ) ：国药集团化学 试剂有限公司； 碱性蛋白酶：西格玛奥德里奇( 上海) 贸易有限公司； 谷氨酰胺转移酶( t g a s e ) ：泰兴一鸣生物制品有限公司。 2 2 主要仪器 a v a n t ij - 2 6x p 高速冷冻离心机 a r l 0 0 0 流变仪 b j r j 一1 2 t 台式绞肉机 b v p j 5 0 0 t s 真空包装机 b y x x 5 0 烟熏炉 c h r i s t 冷冻干燥机 c m 一1 4 斩拌机 c r 一4 0 0 便携式色差仪 d c i o - k i o 加热制冷循环器 d s 一1 高速组织捣碎机 j b 5 3 7 4 91 电子天平 j z 7 1 1 4 型粉碎机 k m o - 2 b a s i c 磁力搅拌器 n a n oz s 动态光散射仪 t a - x tp l u s 质构仪 t b 一4 6 灌肠机 t 1 8b a s i c 高速乳化均质机 u v 一2 8 0 0 h 紫外光可见光分光光度计 w h 一2 微型涡流混合仪 6 5 0 6 0 型荧光分光光度计 梅特勒一托利多a l 系列分析天平 梅特勒一托利多s e v e ne a s yp t l 计 机械搅拌器 美国b e c k m a n 公司 英国t ai n s t r u m e n t 公司 嘉兴艾博不锈钢机械工程有限公司 嘉兴艾博不锈钢机械工程有限公司 杭州艾博不锈钢机械工程有限公司 m a r t i nc h r i s t 公司 西班牙m a i n c a 公司 柯尼卡美能达公司 德国h a a k e - t h e r m o 公司 上海精科实业有限公司 梅特勒一托利多仪器有限公司 上海朝阳微电机厂 广州仪科实验室技术有限公司 英国马尔文公司 英国s t a b l em i c r os y s t e m s 公司 永康市泰宝电器五金厂 英国i k a 公司 尤尼柯( 上海) 仪器有限公司 上海沪西分析仪器j 一有限公司 日本日立公司 梅特勒一托利多仪器有限公司 梅特勒一托利多仪器有限公司 厂“州仪科实验室技术有限公司 4 2 实验材料与方法 2 3 实验方法 2 3 1s p i 的提取 l k g 大豆在2 5 * ( 2 烘箱里放置2 4 小时烘干，用磨粉机将其去皮粉碎。所得豆粉用正 己烷一乙醇( 3 ：1 ) 混合溶剂脱脂，自然挥干，所得脱脂豆粕用1 0 倍水溶解，然后用2 m 的n a o h 将p h 调至8 0 ，在室温下连续搅拌2 小时，并用2 m 的n a o h 将p h 保持在 8 o 。溶液用冷冻离心机在1 3 5 0 0 9 的离心力下离心2 0 m i n ，取上清液，用2 m 的h c l 将 p h 调至4 5 ，然后再用冷冻离心机在3 3 0 0 9 的离心力下离心2 0 m i n 取底部沉淀。底部沉 淀用1 0 倍的水复溶，并将p h 调到7 ，放入冷冻干燥机去除水分。所得到s p i 粉末用双 缩脲法测浓度，粉末经真空包装后放在4 冰箱中保存。 2 3 2s p i 的水解 将s p i 配成5 的水溶液，2 5 下搅拌3 0 m i n ，开启水浴，待蛋白溶液温度升至5 0 时用2 m 的n a o h 调节溶液p h 至8 o ，按酶底- - 1 1 0 0 ( v w ) 添加碱性蛋白酶，同时滴 加0 5 m 的n a o h 控制溶液的p h 始终在8 0 。通过p h s t a t 法计算获得所需要的水解度 ( d h ) 时需要滴加的碱的体积，实现对水解度的控制。当蛋白溶液达到目标水解度时 将溶液放在8 0 c 水浴中灭酶1 5 m i n ，待溶液完全冷却后，在2 5 0 0 9 的离心力下离心1 0 m i n ， 取上清液，密封，放入冰箱冷藏备用 2 3 3t g a s e 酶交联 蛋白液在5 5 水浴中放置1 5 m i n ，用1 m 的n a o h 或h c i 溶液调节蛋白液的p h 至7 0 。按1 0 u g 蛋白的量添加t g a s e 酶。分别反应0 ，o 5 ，1 ，2 ，3 ，小时后将蛋白液取 出放入8 0 水浴灭酶1 5 m i n ，冷却后密封放入4 冰箱储存。 2 3 4 热诱导蛋白凝胶的制作 将s p i ( 15 w v ) 溶解在纯水或2 0 m m 的c a c l 2 溶液中，用1 mn a o h 溶液将蛋白浆 的p h 调节到7 0 ，放入2 5 0 c 水浴中轻轻搅拌使其充分水合。1 h 后，取5 9 水合充分的 蛋白浆至定制的玻璃管中( 1 7 m mi d ) ，在8 0 0 9 的离心力下离心l m i n ，用铝箔纸将玻璃 管的上端封口，放入9 5 0 c 水浴中煮3 0 m i n ，然后在冰浴中冷却2 0 m i n ，最后放入4 0 c 冰 箱中过夜保存【2 1 。 2 3 5 肌原纤维蛋白m p i 的提取 冷冻猪里脊肉放入4 c 冰箱中解冻4 小时，去除脂肪和结缔组织，将碎肉切碎放入 烧杯中称重，加入4 倍体积( v w ) 的分离缓冲溶液( 0 1 m n a c l ，1 0 m m 磷酸三钠， 2 m m m g c l 2 ，1 m m e g t a ，p h 7 0 ) ，混合均与后倒入组织捣碎机中，制成均匀肉糜混合溶 液，形成的肉浆离心( 2 0 0 0 9 ，1 5 m i n ，4 c ) ，取沉淀。以同样的条件再制备，离心两次， 再用0 1 m - n a c l 溶液离心两次( 2 0 0 0 9 ，1 5 m i n ，4 c ) ，得到肌原纤维蛋白分离物。所有工 作均在4 冷室里完成。 双缩脲法测定肌原纤维蛋白浓度，再用缓冲液( 0 6 m n a c l ，2 5 m m 磷酸缓冲溶液p h 江南大学硕士学位论文 7 o ) 将m p i 浓度校正到4 ( w w ) ，4 c 下储藏，4 8 小时内用完。 2 3 6 混合蛋白凝胶的制备 将浓度为4 的s p i 及其水解交联产物与m p i 按照1 ：1 ( w w ) 的比例混合，将混 合蛋白转移至定制的玻璃管中( 1 7 m mi d ) ，在8 0 0 9 的离心力下离心l m i n 去除气泡，用 铝箔纸将玻璃管的上端封口，放入超级恒温水浴中，从2 0 开始，以1 o m i n 的速度 升温，至8 0 ，取出后放置在碎冰中保存2 0 m i n ，然后转移至4 c 冰箱中保存过夜。 2 3 7 法兰克福香肠的制作 将新鲜的2 号猪肉用绞肉机分别将肥肉和瘦肉绞细，将肥肉、瘦肉、盐、水、碎冰、 蛋白按比例称好( 详见表1 ) 【2 3 1 。用斩拌机将其斩拌均匀，温度不超过1 5 ( 2 ，然后放入 自动灌肠机中灌肠，最后转移至烟熏炉中，先在6 0 c 下蒸3 0 m i n 再在8 5 。c 下蒸至中心 温度为7 2 * ( 2 。待香肠冷却到2 5 * ( 2 时，将其盛放到一次性餐盘中，并用保鲜膜包好，放 入4 冰箱保存。共有5 总不同的样品：( 1 ) 空白样，不添加蛋白；( 2 ) 添加不经过 水解和交联的s p i ；( 3 ) 添加不经过水解但是交联2 小时的s p i ；( 4 ) 添加水解度为 4 但不交联的s p i ：( 5 ) 添加水解度为4 且经过交联2 小时的s p i 。 表1 法兰克福香肠制作配方 t a b f o r m u l a t i o no ff r a n k f u r t e r su s e df o r t h ed i f f e r e n te x p e r i m e n t a lt r e a t m e n t s 配方中肥：瘦= o 4 2 9 。 2 。4 测定方法 2 4 1 丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 利用电泳分析方法检测蛋白质组分的变化。参考r a m i r e z s u a r e za n dx i o n g ( 2 0 0 2 ) t 2 4 】 的方法。分离胶和浓缩胶的浓度分别为1 5 和3 ，蛋白浓度为0 2 ，取l m l0 2 的 蛋白溶解在l m l 样品缓冲液中，得到蛋白的最终浓度为1 m g m l 。添加2 0 0 t l1 0 的d 一巯 基乙醇到蛋白液中，混匀后在沸水中煮3 m i n ，然后在室温中放置冷却，加入4 滴染色 液，混匀，每个蛋白加样黾为3 5 嵋。跑胶时先用2 0 m a 的电流，待所有条带进入分离胶 后将电流换成4 0 m a 。使用的仪器为m i n i p r o t e i n3c e l la p p a r a t u s ( b i o r a dl a b o r a t o r i e s ， 6 2 实验材料与方法 h e r c u l e s ，c a ，u s a ) 。将跑完的电泳胶放置到激光电泳条带扫描仪的中央，设定好扫描区 间，关上机盖，进行自动扫描并记录数据。 2 4 2 自由羧基含量检测 采用荧光法测定蛋白样品中的自由羧基含量1 2 5 1 。蛋白样品用双蒸水稀释到2 m g m l ， 然后用1 0 0 0 0 9 的离心力离心1 5 m i n ，取上清液。0 2 5 m l 的上清液与0 2 5 m l 的e d c h c i 溶液混合，其中，e d c h c i 溶液是用e d c 溶解在新鲜配制的1 0 0 m m ，p h = 4 7 5 的 t e m e d h c i 中配制而成的。混合液在3 0 的水浴中放置3 0 m i n ，然后用1 0 倍的水稀释， 取0 1 m l 与o 1 m l 的o p a 溶液混合、反应，再加8 m l 的水稀释后测定荧光强度，激发波 长和发射波长分别为3 4 0 n m 和4 5 5 n m 。 2 4 3 乳化性质的测定 参考f e n ga n dx i o n g ( 2 0 0 3 ) 1 6 1 的方法测定蛋白的乳化性。蛋白溶液用缓冲溶液稀释到 1 ，缓冲溶液为含有0 m 或0 6 m 的n a c i ，p h = 6 5 ，的o 1 m 的磷酸盐缓冲溶液。9 m l 的蛋白溶液中加入3 m l 的玉米油，在1 7 5 0 0 r a d m i n 的速度下，乳化1 m i n ，乳化后的溶 液迅速转移到2 5 m l 的小烧杯中，用移液枪从烧杯底部取5 0 9 l 的溶液，用浓度为o 1 的 s d s 溶液稀释1 0 0 倍，混匀后在5 0 0 n m 的波长下测得吸光值，记为a 0 ，烧杯中的溶液 放置1 0 m i n 后再从烧杯底部取5 0 9 l 的溶液，用相同的方法测得吸光值记为a 1 0 。乳化 活性( e a i ) = a 0 ，乳化稳定性( e s i ) = ( a 1 0 a 0 ) 1 0 0 。 2 4 4 热诱导凝胶强度的测定 将样品从冰箱中取出，在2 5 0 c 水浴中放置l h ，测定时采用t a x t 2 质构仪，直径 为p 0 5 的探头，探头从凝胶表面丌始往下压5 m m ，探头测前、测后速度均为1 m m s ， 测定速度为0 5 m m s 1 5 j 。 2 4 5a b t s 自由基清除能力的测定 将7 m m 的a b t s 储存溶液与2 4 5 m m 的过硫酸钾混匀反应，并在暗中存放1 2 小时。 用0 2 mp h 为7 4 的磷酸钠溶液将a b t s 斗溶液稀释，并在7 3 4 n m 的波长下测吸光度， 要求控制在0 7 0 a ：0 0 2 。标准曲线是用1 0 9 l 不同浓度的t r o l o x 和9 9 0 9 l 稀释过的a b t s 斗 溶液反应得到的。样品值也是用相同的方法并且分别记录l 、2 、5 和1 0 m i n 的值，通过 标准曲线换算得到。 2 4 6 硫代巴比妥酸反应物( t b a r s ) 含量的测定 t b a r s 的测定按照k o n g 2 7 , 2 8 1 的方法稍作修改。大豆卵磷脂( 0 2 m g m 1 ) 在4 c 条 件下用超声将其分散在0 1 2 m 的k c l 和5 m m 的组氨酸缓冲溶液中( p h = 6 8 ) 。吸取5 m l 的脂质体和l m l 2 的蛋白溶液或水( 空白) ，以及0 1 m l1 0 m m 的氯化铁溶液，0 1 m l1 0 m m 的抗坏血酸溶液混合，在2 5 水浴中避光放置1 2 小时。 精确称取l m l 放置1 2 小时的溶液或o 4 9 肉放入2 5 m l 具塞试管中，依次加入3 滴 b h a 溶液，3 m l t b a 溶液，1 7 m l t c a h c l 溶液，混合均与后放入沸水中3 0 分钟，避光 江南大学硕士学位论文 自然冷却。取5 m l 上清液与5 m l 氯仿振荡1 分钟，放入离心机在3 0 0 0 9 的离心力下离心 1 0 分钟，小心吸取上层液体在5 3 2 n m 下测定吸收值，t b a r s 值按下列公式计算： t b a r s ( m g k g ) = ( a 5 3 2 厂w s ) 9 4 8 a 5 3 2 表示溶液在5 3 2 n m 下的吸光值 w s 表示样品的重量 9 4 8 是一个常量，由稀释因子和红色t b a 反应产物的摩尔消光系数得来 2 4 7 凝胶弹性模量g ，的测定 利用流变仪，仪器夹具采用正弦振荡函数测定s p i 与m p i 混合蛋白在程序升温和降 温过程中凝胶所产生的力学变化。使用直径为4 c m 的平板，混合蛋白加热温度以1 m i n 的速率从2 0 。c 升至7 54 c ，每个温度点间的平衡时间为2 0 s ，最大应变为o 0 2 ，单频频 率为o 1 h z ，狭缝为l m m 。在平板上盖好保护盖，滴加硅油，防止实验过程中水分蒸发 影响测定结果。 2 4 8 香肠的全质构分析( t p a ) 将香肠剥去肠衣后切成2 0 m m 高的圆柱体，在质构仪上以直径为3 6 m m 的探头压 缩两次，压缩比为6 0 ，压缩速度为5 0 m m m i n ，每个样品做6 次平行，取平均值。 2 5 统计分析 本实验所有数据均为2 次重复3 次平行。使用e x c e l 软件，利用f - 检验方法进行数 据显著性统计分析，确定结果之间是否存在显著性差异，利用s p s s 软件对实验结果进 行相关性分析。 3 结果与讨论 3 结果与讨论 3 1 酶水解酶交联处理对大豆分离蛋白功能性质的影响 采用碱性蛋白酶水解和t g 酶交联的方式对s p i 进行改造，以提高改性s p i 的功能 性质为目的，详细考察其乳化性乳化稳定性、凝胶性和抗氧化性的变化情况，并以此为 依据为改性s p i 和m p i 混合蛋白模拟体系的研究提供基础。 3 1 1 乳化性与乳化稳定性 从图1 ( a ) 中可以看出，天然s p i 的乳化性一般，经过碱性蛋白酶轻度水解后乳化能 力随着水解度的上升而提高；经过t g 酶交联的天然s p i 乳化性随着交联时间的增加而 降低；经过t g 酶交联的s p i 水解产物的乳化性随着交联时间的增加而增加，但并没有 呈现持续上升的变化趋势，而是在o 5 h 和l h 时略有波动。 从从图l ( b ) d p 可以看出，天然s p i 经碱性蛋白酶水解后，乳化稳定性在水解度为1 时升高，然后随着水解度的增加而降低；经过t g 酶交联的天然s p i 的乳化稳定性随着 交联时间的增加而降低；t g 酶交联对于s p i 水解产物的