（食品科学专业论文）发酵香肠中葡萄球菌、微球菌的分离筛选及应用.pdf

山东轻t 业学院硕上学位论文 摘要 本研究从自然发酵香肠中分离筛选葡萄球菌和微球菌菌株，评估木糖葡萄球 菌的发酵和益生特性，目的是筛选出适用于发酵香肠的优势菌株。并结合乳酸菌 制成混合发酵剂用于发酵香肠生产，评估发酵剂对发酵香肠中的微生物、物理化 学和感官特性变化的影响。主要结果和结论如下： 1 本研究从成熟阶段的发酵香肠中筛选出1 3 8 株菌，菌株经过生化鉴定显示 微球菌5 8 株，其中克氏微球菌3 8 株( 6 5 5 ) 。葡萄球菌8 0 株，7 3 株( 9 1 ) 凝 固酶阴性和脱氧核糖核酸酶阴性，其中有6 0 株属于木糖葡萄球菌( 8 2 2 ) 。微球 菌全部产色素，不符合发酵剂特点。菌种筛选主要从6 0 株木糖葡萄球菌中选择。 2 6 0 株木糖葡萄球菌经过硝酸盐还原酶等发酵特性实验初筛和生物胺检测、 乙偶姻检测、蛋白酶活性和脂肪酶活性测试实验复筛，筛选出符合条件的4 株菌。 3 研究所筛选出的4 株木糖葡萄球菌的益生特性，发现能够抵抗较强的酸性 环境和较高浓度的胆盐，2 株菌c 1 s 2 3 、c 3 r i o 产生细菌素。葡萄球菌与乳酸菌的 拮抗试验表明，木糖葡萄球菌c 1 s 2 3 、c 3 r i o 和乳酸菌1 l 没有拮抗性。 4 测试不同p h 值、温度、n a c i 浓度、亚硝酸盐浓度对木糖葡萄球菌c 1 s 2 3 、 c 3 r i o 菌株生长的影响，结果显示适合发酵香肠环境。 5 优选出的菌株木糖葡萄球菌c 1 s 2 3 ，c 3 r i o 和乳酸菌1 l ( 酸化菌株) 作为发 酵剂生产发酵香肠，主要研究发酵剂对微生物、理化和感官指标变化的影响。 6 微生物分析结果显示各组发酵和成熟期间乳酸菌始终处于支配地位。对照 组微球菌的生长明显受酸度或不能竞争过其它菌群的影响，生长受到了抑制，添 加发酵剂各组微球菌生长也受到一定的抑制，但由于接种量大，基本成缓慢增长 趋势。添加发酵剂各组肠杆菌菌落总数显著下降。 7 理化分析结果显示添加发酵剂各组p h 值显著低于对照，发酵三天达到最低 值，以后稍有回升。发酵剂的加入对水分活度、灰分含量的变化没有影响，使非 蛋白氮含量增加。发酵剂的加入对发酵香肠的质构有着显著的影响，在硬度、咀 嚼性和胶粘性方面要显著高于对照组。色泽差异显著，s l 和s 2 组亮度、红度要显 著高于对照组。结合感观评价，两组都可作为肉品发酵剂用于发酵香肠的生产。 关键词：发酵香肠；木糖葡萄球菌；筛选；益生性；理化变化 a b s t r a c t t h ea i m so ft h i ss t u d ya r et oi s o l a t e ds t a p h y l o c o c c ia n dm i c r o c o c c if r o mt r a d i t i o n a l s a u s a g e sa n d t od e t e r m i n et h em e t a b o l i c a n dp r o b i o t i cp r o p e r t i e s o fs e l e c t e d s t a p h y l o c o c c u sx y l o s u s ，i n o r d e rt os e l e c tp o t e n t i a ls t a r t e rc u l t u r e sf o rf e r m e n t e d s a u s a g e s a n de m p l o yt h em i x e d s t a r t e r sc o m b i n e dw i t h l a c t o b a c i l l u si nt h e m a n u f h c n l r eo ff e r m e n t e ds a u s a g e s ，i no r d e rt oe v a l u a t et h e e f f e c to ft h es t a r t e rc u l t u r e s o nt h ep h y s i c o c h e m i c a l ，m i c r o b i o l o g i c a la n ds e n s o r yp r o p e r t i e so ft y p i c a lf e r m e n t e d s a u s a g e s t h em a i nr e s u l t sa n d c o n c l u s i o na r ea sf o l l o w s ： 1 0 n eh u n d r e da n dt h i r t y e i g h ts t r a i n si s o l a t e dd u r i n gt h er i p e n i n go fa t r a d i t i o n a l f e r 埘【e n t e ds a u s a g 哆w e r ec h a r a c t e r i z e d f i f t y e i g h ti s o l a t e db e l o n g e dt o m i c r o c o c c u s ， w i t ht h i n 、，e i g h ts t r a i n s ( s i x t y f i v ep o i n t 饥ep e r c e n to fm i c r o c o c c u s ) b e l o n g e dt o m i c r o c o c c u sk r i s t i n a e e i g h t ys t r a i n sb e l o n g e d t o s t a p h y l o c o c c u ss p e c i e s ，a n d s e n v e n t v t h r e es t r a i n s ( n i n t y - o n ep e r c e n to fs t a p h y l o c o c c i ) w e r ec o a g u l a s e 。n e g a t l v e a n d 眦c l e a s e n e g a t i v e ，a n di nt h e mt h e r ea r es i x t ys t r a i n sb e l o n g e d t os | 卵姆l o c o c c 蟠 x 1 ，胁淞a uo ft h em i c r o c o c c u sh a v ep i g m e n t ，d i dn o ta p tf o ru s i n ga ss t a r t e r s s 协n e r c u l t u r e sm a i ns e p a r e t e df r o ms i x t ys t r a i n so fs x y l o s u s 2 。i no r d e rt os e l e c ts t r a i n sa p tf o ru s e di nf e r m e n t e ds a u s a g e s ，s c r e e n i n gf i r s tp a s s e d t e c h n o l o g i c a lp r o p e r t i e s ，f o re x a m p l e ：n i t r a t er e d u c t a s e a n ds e c o n dp a s s e d d e t e c t l o no t b i o g e n i ca m i n ep r o d u c t i o n ，a c e t o i np r o d u c t i o n ，a s s e s s m e n to fp r o t e o l y t i ca c t i v i t y a n d l i p o l y t i ca c t i v i t y a tl a s t f r o ms i x t ys t r a i n so f s x y l o s u s ，w ei s o l a t e df o u rs t r a m s 3 s t u d y e dp r o b i o t i co ft h ef o u rs t r a i n s w ef o u n d t h a tt h e yc a nr e s i s t a n tt os t r o n g a c i d i ce n v i r o n m e n ta n dh i g h e rc o n c e n t r a t i o n so fb i l es a l t ，a n dt w os t r a i n sc 1s 2 3a n d c 3 r 1 0h a v eb a c t e r i o c i n a n t i b i o s i st e s tb e t w e e n l a c t i cb a c t e r i aa n ds x y l o s u ss h o w e d t h a t ：s x y l o s u sc 1 s 2 3a n dc 3 r 1 0 a n dl a b i1h a dn oa n t i b i o s i s 4 t h es t r a i n so fs x y l o s u sc 1s 2 3a n dc 3 r 10w e r ea l s ot e s t e df o rg r o w t ha b i l i t ya t d i f f e r e n tt e m p e r a t u r e s ，p ha n dn a c la n dn i t r i t ec o n c e n t r a t i o n s t h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h e yw e r es u i t a b l et om a k es t a r t e rc u l t u r e s 5 t w os t a n e r sf o 咖u l a t i o nw e r ed e v e l o p e dc o m b i n i n gt h ep r o t e o l y t i c b u tn o t l i p o l y t i cs 驯z o s “sc 1s 2 3w i t ht h el a c t i ca c i db a c t e r i a 11 ( s t a r t e rs1 ) a n dt h e 量圳o s 姗 c 3 r 10w i t ht h es a m es t r a i no fl a b11 ( s t a r t e rs 2 ) w ee m p l o y e dt h e m i nt h e m a n u f a c t u r eo ff e r m e n t e ds a u s a g e s ，i no r d e rt oe v a l u a t et h ee f f e c to f t h es t a r t e r so n p h y s i c o c h e m i c a l ，m i c r o b i o l o g i c a la n ds e n s o r yp r o p e r t i e so f f e r m e n t e ds a u s a g e s 6 i i la l lt h es a m p l e sl a bd o m i n a t e dt h em i c r o f l o r af r o mt h eb e g i n n i n go ft h e t t f e r m e n t a t i o na n dr i p e n i n g ；g r o w t ho fm i c r o c o c c a c e a ei nc o n t r a ls a m p l ew a s i n h i b i t e d ， a p p e a r e dt ob es i g n i f i c a n t l ya f f e c t e db ya c i d i f i c a t i o no rb yt h ee n v i r o n m e n to fs a u s a g e a n dt h eg r o w t ho fm i c r o c o c c a c e a ei ns a m p l e sw i t hs t a r t e rs 1a n ds 2w a sa l s oi i l h i b i t e d b u tb e c a u s eo ft h eg r e a ti n o c u l a t i o nv o l u m e ，t h eg r o w t hw a s b a s i c a l l yi n c t e a s e ds l o w l v ： s a m p l e ss1a n ds 2s h o w e dar e d u c t i o nt i d ei ne n t e r o b a c t e r i a c e a eo v e r l es 锄ep e r i o d o f t i m e 7 p hv a l u eo fs a m p l es 1a n ds 2w a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h ec o n t r 0 1 a f t e rt h r e e d a y sr e a c h i n gt h el o w e s tl e v e l ，a n dl a t e rt h e r ew a sag r a d u a li n c r e a s e d i n o c u l a t e dw i t h s t a r t e rc u l t u r e sh a dn oe f f e c to nt h ew a t e ra c t i v i t ya n da s h ，a n dm a d et h ec o n t e n t o fn p n i n c r e a s e d a d d i n go fs t a r t e rc u l t u r e sh a ds i g n i f i c a n t l yi n f l u e n c e di nt e x t u r e nw a s s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e di nh a r d n e s s ，c h e w i n e s sa n dg u m m i n e s sc o m p a r e dw i t ht h e c o n t r o ls a m p l e b o t hs1a n ds 2e x h i b i t e d s i g n i f i c a n ti n c r e a s e si nl i g h t n e s sa n dr e d n e s s c o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o ls a m p l e f r o ms e n s o r ya n a l y s i s ，i tw a ss e e nt h a tb o t hs t a r t e r c u l t u r e sc a nb es u i t a b l et ob eu s e di nf e r m e n t e d s a u s a g e s j k e y w o r d s ：f e r m e n t e d s a u s a g e ；s t a p h y l o c o c c u s x y l o s e ；i s o l a t i o n ；p r o b i o t i c ； p h y s i c o c h e m i c a lc h a n g e i i i 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文 中引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上 已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或 成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻工 业学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请 专利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时， 署名单位仍然为山东轻工业学院。 论文作者签名：垂亟硷日期：2 旦! 显年鱼月兰立日 导师签名：同期：蟹差年厶，_ 月二堡日 山东轻工业学院硕士学位论文 1 1 发酵香肠发展概述 第1 章绪论 1 1 1 发酵香肠的历史与分类 “发酵香肠 是欧洲大陆一种具有悠久历史的产品，并且在澳大利亚等世界 上其他地方越来越受到关注。其基本工艺流程包括：将瘦肉、肥肉与硝酸盐和亚 硝酸盐以及香料一起粉碎，添加糖、发酵剂和非动物蛋白等，混合后灌进肠衣， 经发酵、干燥2 个连续且独立的步骤，经过微生物发酵而制成的具有稳定的微生 物特性和典型的发酵香味的肉制品。盐的存在、水分活度的降低和氧气的排除使 耐盐乳酸菌成为优势菌，它利用已经存在和添加的糖产生乳酸，使p h 终值降到 4 5 5 5 ，从而诱导盐溶性蛋白变性成为可切割的凝胶结构。p h 的快速降低和较 低的水分活度保证了产品的稳定性和安全性。满足了这些基本的要求后，生产技 术可以灵活的改变，生产出多种不同的产品，这对产品的标准化和质量的控制带 来了很大的挑战。发酵香肠因技术的不同分成两大类： 北方类型产品：原料包括牛肉和猪肉，特点是成熟期相对较短，最长时间是 三周，包括明显分开的发酵期( 约3 天) 和干燥期。发酵温度一般不超过3 0 。c 。 一些产品，尤其在美国不进行干燥，只在发酵后进行巴氏杀菌i l 】。快速酸化至p h 低于5 和随后干燥过程中的干耗，保证了产品的安全性和货架期。烟熏用来增加 产品的特殊风味( 滋味和香气) 。 地中海或南方类型产品：是纯猪肉产品，其成熟期长达几个月。发酵在较低 温度( 2 0 2 5 ) 下进行，酸化p h 终值高于5 ，因此发酵速度很慢且与干燥过程没 有明显分开。除了典型的匈牙利香肠外，其他香肠都不用烟熏，产品的货架期主 要由干燥过程和低水分活度决定。 这些基本生产技术的变化可以生产出水分含量为2 5 一5 0 的产品1 2 j 。在所有类 型的产品中，由肉中自身组织酶和微生物酶活性引起的蛋白质、脂肪、糖的复杂 且相关的物理、化学和生物化学变化，对产品的安全性和感官质量起决定性作用。 我国的传统肉制品如腊肉、腊肠、火腿等，在加工过程中都存在不同程度的 微生物发酵作用，其中腊肠属于典型的发酵香肠。这些产品经微生物发酵和后期 成熟后产生了独具特色的风味品质，同时也拥有了良好的耐贮藏性。 1 1 2 国外发酵香肠的发展现状 在肉制品产业发达的国家，发酵香肠是一类重要的深加工肉制品。以前国外 也是采用传统方式生产，可是人们从这类传统产品中分离得到了性能优良的优势 微生物菌株，并对其进行了充分的研究，开发出了可以用于标准化生产的工业微 第1 章绪论 生物发酵剂，从而实现了产业升级。现在采用标准化工业生产模式，生产完全建 立在物理学、化学和其它相关科学的基础上，工艺参数可以做到完全量化，生产 工艺成熟，产品质量稳定。同时，拥有完善的加工设备，便于实现工业化生产， 产品生产周期短，消费量呈上升趋势。如荷兰发酵肉制品的销量最初为20 0 0 吨 年，近1 5 年提高到平均2 00 0 0 吨年的水平【3 】。意大利生产p a r m ah a m 的公司有 2 0 0 多家，年产量可达8 0 0 多万只，其中1 3 0 万只出口到法国、德国、比利时、美 国等4 0 多个国家，优质的p a r m ah a m 每公斤的价格在1 0 0 美元左右，产品附加值 高【4 1 。发酵香肠业己完成了从传统的自然发酵向定向接种培育的工业化生产的转 变。有资料显示，1 9 9 5 年欧盟范围内香肠的产量估计约为7 5 00 0 0 吨，在德国， 每年人均消费发酵香肠约为4 5 k g ，约占肉类总消费量的7 ，西班牙1 9 9 2 年发酵 香肠的产量为1 7 00 0 0 吨，占肉类总产量的1 8 。 1 1 3 国内发酵香肠发展概况 中国地域广阔，有很多名优的传统发酵肉制品，我国传统的腊肠属于发酵香 肠，我国与经济发达国家相比，以干腌自然发酵肉制品为主，对工业化微生物控 制生产发酵肉制品的研究起步较晚，尚处于实验室阶段，实际生产的品种很少， 或者说正处于腾飞之前的起跑阶段。 我国对发酵肉制品的研究进展由于多方面原因，大体上可划分为五个阶段： 即1 9 5 7 年前为第一阶段，以作坊式生产传统发酵肉制品为主，设备简单，卫生条 件差，无统一加工技术标准。1 9 5 8 - 1 9 8 4 年为第二阶段，以国家补贴的计划经济调 控为主要特征，逐步实现了发酵肉制品由作坊生产向规模化生产变化。1 9 8 5 1 9 9 0 年为第三阶段，随着改革逐步深入肉类及其肉制品经营由国家统一调控转变为由 企业自负盈亏为主，极少数企业振兴起来，大部分企业在等待观望中日趋衰落， 同时一大批新体制的企业加入肉类加工产业，呈现出勃勃生机。1 9 9 1 2 0 0 5 年为第 四阶段，在“十一五 期间，我国政府十分重视发酵肉制品的研究与开发，冷却 肉和发酵肉制品项目均列为国家重大科技攻关课题，中国农业大学、河南双汇集 团和中国科学院微生物所共同承担了国家科技部这一项目肉制品深加工关键技 术研究与产品丌发，不断吸取国外发酵肉制品工艺技术、结合我国发酵肉制品生 产与研发实际，努力探索现代发酵肉制品的规律。2 0 0 6 年以后为第五阶段，以大 型肉类产业骨干企业从事工业化微生物发酵控制生产发酵肉制品为特征，将实现 我国肉类产业的历史性跨越。肉类发酵剂生产与应用将加速发展和增长，并进一 步商品化【4 l 。 2 山东轻t 业学院硕l ：学位论文 1 2 香肠发酵剂的研究 1 2 1 香肠发酵剂的研究进展 传统发酵香肠的生产采用自然发酵，产品的品质依赖于自然环境中的微生物， 因此产品品质的均一性难以保证。将纯种微生物接种于发酵香肠大大提高了产品 的安全性和品质的均一性。1 9 2 1 年，有人接种纯种微生物生产发酵香肠获得成功； 1 9 5 5 年，n i v i n 首先将纯的微生物发酵剂大规模地用于发酵香肠的生产；1 9 6 0 年， 美国首先生产出商业发酵剂。从此，商业肉品发酵剂逐渐发展起来。己用于发酵 肉制品生产的微生物包括细菌，霉菌和酵母菌( 见表卜1 ) 。 表1 1 发酵香肠中的微生物 t a b l e1 1m i c r o b i o l o g yo f f e r m e n t e ds a u s a g e 酵母菌 y e a s t 法马塔假丝酵母( c a n d i d o f a m a t a ) 汉逊氏德巴利酵母( d a b a r y o m y c e sh a n s e n i ) 霉菌 m o u l d 纳地青霉( p e n i c i l l i u mn a l g i o v e n s e ) 产黄青霉( p e n i c i l l i u mc h a r y s o g e n u m ) 细菌 b a c t e r i a 乳杆菌属 l a c t o b a c i l l u s 嗜酸乳杆菌亿a c i d o p h i l u s ) 植物乳杆菌 p l a n t a r u m ) 清酒乳杆菌s a k e ) 乳酸乳杆菌 犯1 a c t i s ) 干酪乳杆菌c a s e o 短乳杆菌伍b r e v i s ) 弯曲乳杆菌( l c a r v a t u s ) 布氏乳杆菌( b u c h n e r i ) 香肠乳杆菌( l f a r c i m i n i s ) 盖氏乳杆菌g a y o n i o 戊糖乳杆菌( l p e n t o s u s ) 德氏乳杆菌d e l b r u e c k i ) 发酵乳杆菌( l f e r m e n t u m ) 甘露醇乳杆菌 ( 厶m a n n i t o p e o u s ) 片球菌数 p e n d i o c o c c u s 戊糖片球菌( p p e n t o s a c e u s ) 小片球菌( p p a r v u l u s ) 乳酸片球菌a c i d i l a c t i c i ) 乳球菌属l a c t o c o c c u s 乳酸乳球菌( 1 a c t i s ) 链球菌属 s t r e p t o c o c c u s 乳酸链球菌晖a c i d i l a c t i c i ) 双乙酰乳链球菌( d i a c e t y l a c t i s ) 葡萄球菌属 s t a p h y l o c o c c u s 木糖葡萄球菌( s x y l o s u s ) 肉葡萄球菌( s c a r n o s u s ) 微球菌m i c r o c o c c u s 变异微球菌( m v a r i a n s ) ；乳微球菌( m 1 a c t i s ) 放线菌a c t i n o m y c e t e s灰色链霉菌( s t r e p t o m y c e sg r i s e u s ) 3 第l 章绪论 ( 1 ) 酵母 发酵肉制品生产中使用酵母主要是用来改善产品的感官质量，它们可使产品 具有特征性的酵母味，对提高发色过程的稳定性也有好处。酵母菌作为发酵剂主 要适合于干发酵香肠。汉逊氏酵母是常用的酵母菌。这种菌具有较高的耐盐性、 好气性以及较弱的发酵性。一般生长在香肠表面。通过添加此菌，可提高香肠的 风味，它没有硝酸还原作用，但是可以通过与乳酸菌、微球菌的联合作用，提高 产品品质【5 j 。 ( 2 ) 霉菌 在北欧，烟熏香肠最为流行，而在地中海和东南欧国家，霉菌发酵香肠是古 老传统且品质上乘的发酵肉制品。霉菌发酵肉制品具有独特的表面特性和风味， 其后期变化主要来自霉菌引起的蛋白质和月p 日- , 肪分解。霉菌生长对产品的进一步影 响是阻止氧气的渗入，防止产品发生哈喇味和颜色变化。然而，如果感染了“错 误 的霉菌，就会导致不合格的产品，增加了毒素形成的危险【6 】。因此，筛选不产 毒素的霉菌是十分必要的。 ( 3 ) 细菌 目前生产上使用较广泛的是细菌，主要指乳酸菌，微球菌和非致病性葡萄球 菌。 乳酸菌 在发酵肉制品中，乳酸菌的应用是发酵过程成功的重要因素，乳酸菌可用于 各种发酵香肠，并能满足加工过程中的许多要求。历史上，美国和欧洲对乳酸菌 的商业化应用方法进行了介绍。啤酒片球菌( 后来鉴定为嗜乳酸片球菌) 于1 9 9 5 年首先在美国得到应用，随着这种微生物作为发酵剂的成功应用，开发出了夏季 发酵香肠【7 一】。在欧洲首先作为发酵剂使用的是植物乳杆菌。植物乳杆菌和片球 菌一直是商业发酵剂中的必要成员。后来弯曲乳杆菌和米酒乳杆菌被共同作为肉 制品发酵剂【9 ，1 们。 微球菌 在肉制品发酵过程中，加入微球菌的目的不是为了快速产酸，这是因为微球 菌在发酵过程中产酸较慢。微球菌对肉的腌制有促进作用，可以利用它分解蛋白 质和脂肪及还原硝酸盐的能力，从而使产品形成腌制色泽和特征风味【l l 】。微球菌 科包括微球菌、葡萄球菌和动性球菌。微球菌m 5 5 是最早应用于商业的发酵剂， n i n i c a a r a 认为微球菌m 5 5 作为细菌发酵剂的商业化应用，其作用首先是提高颜色 的形成速度，降低p h ，在较短的时间内达到产品所要求的组织特性；其次，可降 低生产成本，控制病原微生物和腐败微生物的生长。通常情况下微球菌和葡萄球 菌共同存在于各种发酵剂中。这两种微生物具有硝酸盐还原酶活性，但没有亚硝 酸盐还原酶活性，此外，它们具有的过氧化氢酶、脂酶和蛋白酶活性，可确保产 4 山东轻工业学院硕士学位论文 品良好的风味 1 2 , 1 3 j 。 1 2 2 葡萄球菌和微球菌在发酵香肠中的作用 从种系发生的角度来说，微球菌和葡萄球菌同属于微球菌科，而且它们有一 些共同的栖息地，此外在香肠等发酵肉制品成熟过程中也有一些共同的作用4 。 微球菌和葡萄球菌本身产酸速度很慢，通常与乳酸菌混合使用，利用其还原硝酸 盐以及分解蛋白质和脂肪的能力，从而使产品形成良好的色泽和风味。肉品发色 机理：硝酸盐( n 0 3 一) 在酸性条件下，通过硝酸还原菌的作用，分解为亚硝酸盐 ( n 0 2 - ) ，亚硝酸盐与肉中的乳酸作用形成亚硝酸，亚硝酸不稳定，易分解成n o ， n o 与肉中的肌红蛋白( m b ) 反应生成亚硝基肌红蛋白( m b n o ) ，使肉呈现鲜艳的 玫瑰红色【1 5 】。葡萄球菌和微球菌正是这种降解过程的主要微生物，它们会产生硝 酸盐还原酶。据报道，在每克香肠中含有1 07 个肉糖葡萄球菌的情况下引， 1 8 和2 4 。c 分别可还原1 2 5 和2 0 0 m g k g 的k n 0 3 ( 分别相当于8 4 和1 3 5 m g k g 的 n a n 0 2 ) 。 另外，发酵过程中，有些乳酸菌会产生h 2 0 2 ，h 2 0 2 是强氧化剂，导致形成褐 色的高铁肌红蛋白和绿色的胆绿素，这两种颜色与肉中的红色结合在一起，形成 灰色色调，严重影响香肠的颜色。h 2 0 2 酶阳性的葡萄球菌能产生h 2 0 2 还原酶，将 h 2 0 2 分解为h 2 0 和0 2 ，从而阻断过氧化物的形成。所以过氧化氢酶对发酵香肠的 颜色也是很有利的。另外，过氧化氢酶对抑制腐败也起了重要的作用【1 7 】。 b e r d a g u e 首先提出，葡萄球菌而不是乳酸菌对于干香肠芳香气味的形成具有 优势作用【l8 1 。些研究也表明，发酵香肠的风味可以通过添加不同的葡萄球菌控 制【l9 。，如木糖葡萄球菌和肉糖葡萄球菌能够产生酯类和其他来自氨基酸的一些重 要风味物质。微球菌和葡萄球菌在发酵和成熟过程中能够产生降解蛋白质和脂肪 的酶，酶解的产物在干发酵香肠特征风味形成中起了重要作用【2 0 1 。在香肠成熟期 问，可溶性含氮化合物的浓度增加到肉中总氮的2 5 。部分游离氨基酸的释放就是 由于细菌蛋白酶的作用【2 。葡萄球菌属的微生物和肉中自身脂酶共同作用，参与 了脂肪的降解过程，对香肠中脂肪酸的释放产生了一定的影响【2 2 】。大量的脂肪酸 释放出来，进一步转化形成了甲基酮和醛，为肉制品提供了独特的风味。 总之，乳酸菌和片球菌在香肠发酵和成熟的最初阶段起了重要的作用，然而， 葡萄球菌和微球菌关系到最后产品的风味、香气和颜色的稳定性。 1 2 3 葡萄球菌和微球菌的筛选标准 一般发酵剂的菌种是从相应的自然发酵的产品中分离出来的，在肉品发酵条 件( p h 、a w 、温度、腌制剂) 下，发酵剂在经历尽可能短的停滞期后，应该能够以 适当的速度发挥它们理想的活性，发酵香肠中葡萄球菌和微球菌的筛选应该满足 以下条件1 2 3 j ： ( 1 ) 安全性 第1 章绪论 作为发酵剂菌种，必须对人体无害，应是革兰氏阳性非致病菌，不产内源毒 素，不产生物胺。 ( 2 ) 耐盐性 发酵香肠中食盐添加量通常为2 5 3 o ，在终产品中食盐含量高达6 ，故 筛选菌株必须有良好的食盐耐受性。 ( 3 ) 耐亚硝酸盐 发酵香肠( 干发酵香肠除外) 一般添加亚硝酸盐，添加浓度可达到1 5 0 m g k g ； 而干发酵香肠通常加入硝酸盐，添加量2 0 0 6 0 0m g k g ，甚至更高一些。但在加工 过程中，起发色和抑菌作用的主要是亚硝酸盐，筛选菌株必须有良好的亚硝酸盐 耐受性。 ( 4 ) 发酵葡萄糖不产气 如果产生大量二氧化碳，会影响香肠的结构致密性。 ( 5 ) 不产粘液 代谢产物如果有粘液状物质，会损坏香肠的内部组织状态。 ( 6 ) 不产h 2 s 该产物会影响产品的风味。 ( 7 ) 不分解精氨酸产氨 如果菌株具有脱氨酶，会在香肠发酵过程中产生氨气等不良气体，因此不产 氨也是保证香肠品质的重要因素。 ( 8 ) 有较高的硝酸盐还原能力 从现代发酵香肠加工工艺来讲，干发酵香肠，兼顾发色和风味两方面的因素， 主要添加硝酸盐，这就要求所选菌株具有良好的硝酸盐还原能力。 ( 9 ) 接触酶试验阳性 发酵香肠成熟过程中有些乳酸菌会产生h 2 0 2 ，影响产品的颜色和风味。过氧 化氢还原酶阳性菌株，把生成的过氧化氢分解成水和氧气。 ( 1 0 ) 所选菌株在其生长代谢过程中能使香肠产生良好的发酵风味 发酵香肠的风味组成非常复杂，它包括挥发性成分和非挥发性成分。从目前 的研究来看，发酵香肠的风味形成涉及到脂肪、蛋白质的降解和氨基酸的降解等。 微球菌和葡萄球菌是风味物质形成的主要菌系。 现阶段发酵剂的筛选研究应用的主要因素有： ( 1 ) 选择对人体健康具有重要生理促进功能的菌株，使发酵香肠具有更多的 功能性和改善香肠品质。 ( 2 ) 借助分子生物学的研究手段，发现和选择其他微生物中的优良性状基因 导入目标的发酵菌种中，从而培育优良的发酵剂。 ( 3 ) 筛选具有较强产生乳酸菌菌素能力的菌株作为发酵剂以延长产品的货架 6 山东轻工业学院硕七学位论文 期。 ( 4 ) 利用浓缩干燥或冷冻干燥技术制备一次性直投式发酵剂；以用微胶囊技 术将发酵剂微胶囊化，提高发酵剂的抗逆境性能，若加热或烟熏等。 1 3 益生菌简介 益生菌被定义为应用于动物及人体内，通过改善宿主体内的微生态平衡进而 促进宿主健康的单一或混合的活的微生物制剂。 1 3 1 益生菌的生理功能 近年来，益生菌的特殊生理活性通过发酵食品、微生态制剂等多种形式被广 泛的进行研究。资料表明，抗生素在治疗肠炎、感染等疾病时，除杀死致病菌外， 也破坏了肠道菌群的平衡，使消化、吸收受到干扰，产生腹泻，导致机体免疫功 能下降。摄入一定数量的有益微生物是改善肠道系统微生物菌群平衡和维持机体 健康的重要途径。数据显示，当摄入的益生菌活菌数高于1 0 6 c f u m l 时，益生菌 对人体健康具有明显的促进作用，主要体现在：调整肠道菌群平衡，抑制腹泻； 促进乳糖的消化吸收，缓解乳糖不耐症；增加乳中可消化性的蛋白质、维生素的 含量；降低血清胆固醇水平；抑制癌症的形成和发展；刺激免疫系统，提高免疫 功能；消除便秘；抑制妇女阴道炎症。 1 3 2 益生菌的种类 目前，我们常用的益生菌主要有双歧杆菌属( b i f i d o b a c t e r i u m ) 和乳杆菌属 ( l a c t o b a c i l u s ) ，随着对益生菌研究的不断深入，益生菌的种类也正逐步增加，其 应用范围也在进一步扩大。明串珠菌属( l e u c o n o s t o c ) 、丙酸杆菌属 ( p r o p i o n i b a c t e r i u m ) 、片球菌属( p e d i o c o c c u s ) ，芽抱杆菌属( b a c i l l u s ) 的部分 菌种( 株) 以及部分霉菌、酵母菌等也日益被用作益生菌。 1 。3 3 益生菌的选择标准 目前，有关益生菌及其产品开发的最大兴趣是分离和开发新的益生菌菌株。 然而，并非所有的双歧杆菌、乳杆菌菌株等都能够发挥益生作用，适宜于食品、 保健品和医药等制品的应用。不同的微生物菌种( 株) 所产生的健康效应都是不尽 相同的。理论上，益生菌菌株的选择应依据如下标准：( 1 ) 益生菌应该来自寄主， 理想的是来自健康人肠道的自然菌群；( 2 ) 能顺利通过消化道，尤其是在上消化 道极端条件( 高胃酸、高胆汁) 下具有较高的存活率；( 3 ) 具有对上皮细胞表面的 粘附力，能在消化道内定植；( 4 ) 能与寄主肠道内菌群竞争，并具有生存发展的 能力；( 5 ) 具有拮抗、免疫调节等有益于寄主健康的生理作用；( 6 ) 是非致病性 的，并且无毒素产生；( 7 ) 具有加工和贮藏中的稳定性，在加工和贮藏过程中， 应保持所有上述特性( 粘附、拮抗等) 。 7 第1 章绪论 1 4 发酵香肠在成熟过程中的生化变化 1 4 1 碳水化合物和p h 值的变化 乳酸菌的大量生长繁殖，分解肠馅中的碳水化合物产生酸，使p h 降低。乳酸 茵发酵碳水化合物除产生乳酸外，也产生酒精、醋酸和其他挥发性有机酸。据研 究，发酵香肠在成熟的最初4 天，约有5 0 的葡萄糖被发酵，而主要产物约7 4 为 乳酸，2 1 变成了c 0 2 ，约5 为含碳化合物。 除有机酸的产生使p h 下降，香肠在 成熟过程中p h 的变化还受到蛋白质分解物的缓冲作用。因此，发酵香肠的p h 值 受乳酸、氨及水中溶质与蛋白质交互作用的影响1 2 4 1 。 1 4 2 脂肪水解及游离脂肪酸的形成 发酵香肠在成熟过程中脂肪会发生水解产生游离脂肪酸，游离脂肪酸会进一 步发生氧化，产生与风味有关的多种化合物。三酰甘油在发酵香肠成熟过程中的 水解过程为：三酸甘油首先被水解产生1 ，2 一二酰甘油和游离脂肪酸；然后l ，2 一二 酰甘油自发地形成1 ，3 一二酰甘油，1 ，3 一二酰甘油具有好的热力学稳定性；最后， 1 ，3 - - - 酰甘油进一步水解成单酰甘油和游离脂肪酸【2 5 1 。 1 4 3 含氮化合物的变化 发酵香肠在成熟过程中蛋白质也发生降解产生多肽，肽和游离氨基酸。游离 氨基酸又可被脱羧、脱胺或代谢，产生挥发性的醛、酮、酯等风味物质或生物胺。 香肠中粗蛋白含量的变化主要在成熟过程中的前1 4 - 1 5 天，总含量会下降2 0 4 5 。 有研究表明，干香肠在经过1 0 0 天成熟后，其中非蛋白氮( n p n ) 的含量可上升3 0 。 发酵香肠在成熟过程中核苷酸逐渐减少，核苷和碱基逐渐增加。 1 4 4 风味物质的形成 发酵香肠挥发性风味成分主要来于加入的香辛料，脂质的自动氧化和微生物 对脂类物质、蛋白质和碳水化合物的代谢。其中又以香辛料为主，约占5 1 以上1 2 引。 因此发酵香肠的风味主要取决于加工中所使用的香辛料( 大蒜、胡椒等) 。但源自 碳水化合物、蛋白质和脂类的挥发性成分对产品的风味有很大的影响作用。归纳 起来，香肠中的挥发性物质可分为九大类，包括脂肪烃、醛、酮、醇、酯、有机 酸、硝基化合物、其它含氮物和呋喃等其它一些挥发性物质。 发酵香肠在发酵、成熟干燥和贮藏过程中挥发性成分形成的方式有三种： ( 1 ) 非生物反应，如脂肪的自动氧化，斯特雷克尔氨基酸降解反应： ( 2 ) 组织酶催化的反应，如原料肉中的蛋白酶，脂肪水解酶； ( 3 ) 微生物酶的作用。 从总体看，脂类氧化能产生多种无分支脂肪族化合物，如烷烃、烯烃、醛、 甲酮、醇以及一些呋喃环，但其形成途径却并不完全相同。 脂质的自动氧化是醛类物质的主要来源，大部分无分支的醛来源于不饱和脂 8 山东轻工业学院硕上学位论文 肪酸的自动氧化。而这些醛类物质又可迸一步被微生物酶或原料肉中的酶氧化或 还原成有机酸或醇，酸和醇再形成发酵香肠风味所必需酯类物质。在众多的醛中， 通常以己醛的含量最多1 27 1 。 斯特雷克尔氨基酸降解反应( s t r e c k e rr e a c t i o n ) 和微生物对氨基酸的代谢是产 生醛类物质的另一途径。具有分支的醛，即2 一甲基丁醛和3 一甲基丁醛( 分别可还 原成相应的醇) 分别由异亮氨酸和亮氨酸通过斯特雷克尔氨基酸降解反应或微生 物的代谢活动( 脱氨、脱羧基作用) 产生。微生物对苯丙氨酸的利用可生成苯乙醛 2 8 1 o 发酵香肠中存在的酮类物质绝大多数是甲基酮。甲基酮由微生物分泌的脂肪 酸氧化酶系催化饱和脂肪酸经氧化产生酮酸，再经脱羧作用产生。酮主要在发 酵香肠成熟的后期产生。 除了醛在醇脱氢酶的作用下生成醇外，脂肪族直链醇一般来自脂过氧化物的 降解。 挥发性有机酸除了由醛氧化、糖发酵生成外，2 一甲基丙酸、2 一和3 一甲基丁酸 也可能通过s t i c k l a n d 反应，由氨基酸发酵生成。 酯是发酵香肠独特风味所必需的成分，发酵香肠中的酯大多为乙酯。由微生 物产生的酯酶催化醇、酸产生。酯的形成涉及到一系列复杂的反应过程，其可能 的途径为：醇一醛一酸一酯。 微生物发酵作用产生低分子量化合物，如双乙酰，一羟基丁酮，1 ，3 一和2 ，3 一 丁二醇，乙醛，乙醇和乙酸。 含氮化合物的产生机理目前还不清楚，推测腈可能在亚硝酸盐的参与下，由 脂类氧化产生的相应的醛产生【2 9 j ；硝基烷烃可能是由n 0 。和烃进行取代反应或由 n o ：与不饱和烃或脂肪酸进行加成反应而生成。 总之，发酵香肠挥发性风味成分的形成是一个非常复杂的过程，各种反应和 途径相互交错。如乙酸和乙醇，虽然主要来源于糖的发酵作用，但氨基酸和脂肪 的代谢也可产生；2 一和3 甲基丁酸乙酯的含量分别与2 一和3 一甲基丁醛的量成正比； 甲苯既来源于饲料，也可由苯丙氨酸产生；一些甲基化合物既可源于分支氨基酸 的降解，也可源于细菌细胞壁或不可皂化的脂类。 1 5 研究目的、意义及内容 1 5 1 课题目的及意义 选育优良的微生物菌种作为发酵剂是发酵香肠加工的关键，从传统发酵食品 中筛选和通过微生物育种改造菌种是研究的中心目标。当今的欧美国家，对微生 物发酵香肠的特性进行了较为深入的研究，己经完成了从传统的自然发酵向微生 9 第l 章绪论 物定向接种发酵的工业化生产的转变，发酵肉制品的生产已具备相当成熟的生产 工艺。国内从事肉制品加工的大型企业如双