（食品科学专业论文）兽药及持久性有机污染物残留分析方法研究.pdf

摘要 试验以离子阱二级质谱( i t - m s m s ) 分析应用为基础，对动源性食品中二嗯英 类多氯联苯( d l p c b s ) 和两种糖皮质类激素( 氢化泼尼松p r e 及甲基氢化泼尼松 m p p ) 的提取和净化方法进行了研究，优化了目标物测定过程中的质谱条件；探讨 了气相色谱离子阱二级质谱法( g c i t - m s m s ) 与气相色谱一高分辨质谱法 ( 卸随屺一h rs ) 在分析食品中d l p c b s 时的准确度差异。 建立了固相萃取( s p e ) g c i t - m s m s 测定猪肉中p r e 及m p p 残留量的分析 方法和g c i t - m s m s 测定牛奶中种d l p c b s 残留的分析方法。p r e 和m p p 药物用 乙腈提取，c 1 8 柱净化，k 2 c r 2 0 7 氧化衍生，g c i t - m s m s 测定。考察了两种药物净 化时的最佳洗脱条件和氧化衍生条件：优化了碰撞诱导解离( c i d ) 条件，实验表明c i d 电压分别为1 0v 和1 2 5v 时p r e 和m p p 产生的子离子丰度最高；p r e 和m p p 添 加标准曲线线性相关系数均大于0 9 9 ，线性范围2 - 5 0r t g k g ；回收率介于5 6 - - - 8 4 之间：r s d 介于9 2 1 8 1 之间；检测限和定量限均为11 t g k g 和2i t g k g 。测 定d l p c b s 残留时，牛奶样品先经冷冻干燥、加速溶剂萃取( a s e ) 、多层硅胶柱净 化，最后用d b 5 毛细管柱分离、电子轰击电离源( 3 5e v ) 多反应监测模式检测并 用同位素稀释内标法定量( 定量离子为 m + 2 7 2 + j g lc m + 2 7 0 + ) ；试验着重考察了净 化时洗脱溶剂的最佳用量和m s m s 测定时的c i d 参数；结果表明的1 2 种d l p c b s 的标准曲线线性相关系数均大于0 9 9 9 9 ，线性范围0 2 - - 4 0 0n g g , 内标回收率范围 3 9 - - 1 2 9 ，相对标准偏差5 - - 2 2 ；方法检出限3 1 1 p g ( 以脂肪含量计) 。 确定了g c i t - m s m s 在分析食品中d l p c b s 残留时的定性参数和质谱条件，重 点探讨了实际样品( 河豚、鳗鱼、甜虾、鸡脂肪、奶粉、猪肠衣) g c i t - m s m s 测定 值与h r g c 阳踟s 测定值之间的准确度差异。样品采用a s e 提取、流体控制系统净化 ( f m s ) 及g c i t - m s m s 和阳婚c 删s 测定。两种方法测定值之间的回归方程和 相关系数：4 种非邻位取代二嗯英类多氯联苯( n o n - o r t h od l 广p c b s ) ，y - - - 0 7 8 1 5 x ， f = o 8 7 0 7 ；8 种邻位取代二嗯英类多氯联苯( o r t h od l - p c b s ) ，y = 0 8 0 7 3 x ，f = o 9 9 2 ； 样品中1 2 种d l - p c b s 总毒性当量( t o t a lt e q ) ：y = 0 5 1 8 1 x + 0 1 2 5 5 ，r z = 0 9 8 4 。g c i t - m s m s 和h r g c h r m s 的检测限分别为0 5n g k g 和o 1n g g g 。 关键词：食品：糖皮质类激素；二嗯英类多氯联苯；气相色谱离子阱二级质谱；气相 色谱高分辨质谱 s t u d yo nt h ea n a l y s i sm e t h o do fr e s i d u eo fv e t e r i n a r y m e d i c i n ea n dp e r s i s t e n to r g a n i cp o l l u t i o n a b s tr a c t t h ee x t r a c t i o na n d c l e a n - u pm e t h o do fc o r t i c o s t e r o i d sa n dd i o x i nl i k ep o l y c h l o r i n a t e d b i p h e n y l si na n i m a lf o o dw a ss t u d i e d ；p a r a m e t e r so fi o np r e p a r a t i o nm o d ew e r ed e v e l o p e d f o rt h ed e t e r m i n a t i o no ft w oc o r t i c o s t e r o i d sa s e x a m p l e a n d12d i o x i nl i k e p o l y c h o l o r i n a t e db i p h e n y l si nf o o ds a m p l e su s i n gi o nt r a pt a n d e mm a s s ( i t - m s m s ， f i r m i g a np o l a r i sq ) ；o p e r a t i n gc o n d i t i o n so fi o nt r a pt a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r yw e r e o p t i m i z e da n dc o m p a r i s o nb e t w e e nr e s u l t so b t a i n e db yi t - m s m sw i t l l1 1 i 曲r e s o l u t i o n m a s ss p e c t r o m e t r y ( h r m s ) w a s p u r s u e d s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ( s p e ) a n dg c - i o n - t r a pm s m sm e t h o dh a sb e e nd e v e l o p e df o r t h ed e t e r m i n a t i o no f p r e d n i s o l o n ea n dm e t h y l p r e d n i s o l o n er e s i d u e si nt i s s u e t h e c o n d i t i o n sf o re x t r a c t i o n ，c l e a n u po nc18c o l u m na n do x i d i z a t i o nw i t hk 2 c r 2 0 7o f p r e d n i s o l o n ea n dm e t h y l p r e d n i s o l o n ew e r ei n v e s t i g a t e d t h ev o l t a g e sf o r c o l l i s i o n - i n d u c e dd i s s o c i a t i o no f p r e d n i s o l o n ea n dm e t h y l p r e d n i s o l o n ew e r ei 0va n d i 2 5v s e v e r a l l y l i n e a rc a l i b r a t i o nc u r v e sw e r eo b t a i n e di nt h ec o n c e n t r a t i o nr a n g e sf r o m 2t o5 0 “g k gf o rp r e d n i s o l o n ea n dm e t h y l p r e d n i s o l o n e ( t h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t sw e r e a b o v e0 9 9 ) t h ea v e r a g er e c o v e r i e sf o rp r e d n i s o l o n ea n dm e t h y l p r e d r t i s o l o n es p i k e di n t i s s u eo f p o r k r a n g e df r o m5 6t o8 4 a n dt h e i rr e l a t i v es t a n d a r do x i d ew e r eb e t w e e n9 2 a n d18 1 t h el i m i t so fd e t e c t i o n ( l o d ) a n dt h el i m i t so f q u a n t i f i c a t i o n ( l o q ) o ft h e m e t h o dw e r e1 “g k ga n d 2 肛g k gf o r t h et w od r u g s a n a l y t i c a lp r o c e d u r eo fd i o x i nl i k e p o l y c h l o f i n a t e db i p h e n y l s ( d l p c b s ) r e s i d u ei nm i l kc o n s i s t e do fa s ee x t r a c t i o n ，l i p i d r e m o v a lw i t ha c i ds i l i c aa n d c l e a n u pu s i n ga n t h r o p o g e n i ci s o l a t i o nc o l u m np a c k e dw i t h m u l t i l a y e rs i l i c a t h ea n a l y t e sw e r es e p a r a t e db yd b 一5c h r o m a t o g r a p h i cc o l u m n ，d e t e c t e d w i t hm u l t i p l er e a c t i o nm o n i t o r m o d e ( e i m t u v l ) a n dq u a n t i f i e du s i n gi n t e r n a ls t a n d a r d c a l i b r a t i o nc a l v eo fi s o t o p ed i l u t i o nt e c h n i q u e t h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t so fc a l i b r a t i o n s t a n d a r ds o l u t i o nw e r ea b o v e0 9 9 9 9f o ra 1 1t h ed l p c b s t h er e c o v e r i e sa n dr s d so f l a b e l e dc o m p o u n ds o l u t i o nw e r eo b t a i n e df r o m3 9t o12 9 a n df r o m5t o2 2 r e s p e c t i v e l y m e t h o dd e t e c t i o nl i m i t sr a n g e df r o m3t o11p g g ( f a 0w e r ee s t a b l i s h e df o r t h e12 d l p c b s o p e r a t i n gc o n d i t i o n so fi o nt r a pt a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r yw e r eo p t i m i z e da n d c o m p a r i s o nb e t w e e nr e s u l t so b t a i n e db yi t m s m sw i t hh i 曲r e s o l u t i o nm a s s s p e c t r o m e t r y ( r r m s ) w a sp u r s u e d d i o x i nl i k ep c b sw e r ee x t r a c t e df r o ms a m p l e sb y a c c e l e r a t e ds o l v e n te x t r a c t i o n ( a s e ) a n dp u r i f i e db yf l u i dm a n a g e m e n t ，s y s t e m s ( f m s ) b e f o r eq u a n t i t a t i v ea n a l y s i sw i t hi t m s m sa n dh r m s r e s p e c t i v e l y t h er e g r e s s i o nl i n e s a n dr e g r e s s i o nc o e f f i c i e n t so ft h er e s u l t sf o rt a r g e tp c b sa c q u i r e db yt h et w ot e c h n i q u e s a r es h o w e da sf o l l o w s ：4n o n - o r t h o c b s ，y - - - q ) 7 815 x ， 一= o 8 7 0 7 ；8o r t h o c b s ， y = 0 8 0 7 3 x ，= 0 9 9 2 ；t o t a lt e qo fm lt h et a r g e tp c b s ，y - - o 518 1x + 0 12 5 5 ，r = 0 9 8 4 t h e m e t h o dd e t e c t i o nl i m i t se s t a b l i s h e df o ri t - m s m sw a s0 5n g n c gw h i l eh r m sw a so 1 n k g k e yw o r d s ：f o o d ；c o r t i c o s t e r o i d a ；d l p c b s ：g c m s f m s ；h r g c - h l t m s d ir e c t e db y ：p r o f h ey i n f e n ( p h d ) p r o f z h o n g i k e ( p h d ) a p pi ic a n tf o rm a s t e rd e g r e e ：din gg a n g d o u ( m a s t e ro f e n g i n e e r i n g ) ( f o o ds c i e n c ea n de n g i n e e r i n g ，i n n e rm o n g o l i aa g r i c u l t u r a lu n i v e r s i t y ，h u h h o t 0 10 0 18 ，c h i n a ) 缩略语表 p r e ( p r e d n i s o l o n e ) m p p ( m e t h y l p r e d n i s o l o n e ) p o p s ( p e r s i s t e n to r g a n i cp o l l u t i o n ) p c d d f s ( p o l y 0 c h l o r i n a t e dd i b e n z o d i o x i n d i b e n z o f u r a n ) d l p c b s ( d i o x i nl i k ep o l y c h l o r i n a t e db i p h e n y l s ) s f e ( s u p c r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n ) a s e ( a c c e l e r a t e ds o l v e n te x t r a c t i o n ) g p c ( g e lp e n e t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y ) f m s ( f l l l i dm a n a g e m e n ts y s t e m s ) p l e ( p r e s s u r i z e dl i q u i de x t r a c t i o n ) s p e ( s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ) s p m e ( s o l i dp h a s em i c r o e x t r a c t i o n ) i a c ( i m m u n o a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y ) g c ( g a sc h r o m a t o g r a p h y ) m s ( m a s ss p e c t r o m e t r y ) h p l c ( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ) h r m s ( h i g hr e s o l u t i o nm a s ss p e c t r o m e t r y ) g c m s ( g a sc h r o m a t o g r a p h y - m a s ss p e c t r o m e t r y ) g c - i t m s m s ( g a sc h r o m a t o g r a p h y i o nt r a p - t a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r y ) e i ( e l e c t r o ni m p a c ti o ns o u r c c ) m r m ( m u l t i p l er e a c t i o nm o n i t o r ) s i m ( s e l e c t e di o nm o n i t o r i n gm o d e ) l o d ( l i m i to fd e t e c t i o n ) l o q ( l i m i to fq u a t i f i c a t i o n ) t e q ( t o x i c t i y ) t e f ( t o x i c i ye q u a l i t yf a c t o r ) s n ( s i g n a l t o - n o i s er a t i o ) r s d ( r r e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n s ) 氢化泼尼松 甲基氢化泼尼松 持久性有机污染物 二嚼英 二嗯英类多氯联苯 超临界流体萃取 加速溶剂萃取 凝胶渗透色谱 自动样品净化系统 加压液体萃取 固相萃取 固相微萃取 免疫亲和色谱 气相色谱 质谱 高效液相色谱 高分辨质谱 气相色谱质谱 气相色谱离子阱串联谱 电子轰击电离源 多反应监测 选择离子监测模式 检测限 定量检测限 毒性当量 毒性当量因子 信噪比 相对标准偏差 内蒙古农业大学 研究生学位论文独创声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢婀 地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包 含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意 申请学位论文与资料若有不实之处，本入承担一切相关责任 论文作者签名：j 盟日期： 内蒙古农业大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解内蒙古农业大学有关保护知识产权的规定，即：研 究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属内蒙古农业大学本 人保证毕业高校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为内蒙 古农业大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为内蒙古农业 大学学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电 子文档，允许论文被查阅和借阅学校可以公布学位论文的金部或部 分内容，( 保密内容除外) ，采用影印、缩印或其他手段保存论文 论文作者签名：工型 指导教师签名：筮丛鏖乙 日 期： 内蒙古农业大学硕士学位论文 1 1 引言 近年来，农牧业快速发展，兽药、兽用添加剂、动植物激素等的广泛推广和应用， 使兽药残留成为社会关注的又一食品安全焦点，特别是违禁药物和滥用药物引起的食 品中毒甚至致死事件时有发生，进出口贸易受阻，因此世界各国都规定了在食用动物 和饲料中严禁使用的兽药，我国也有多部法规对此作出了明确的规定。但由于畜牧业 生产的集约化程度不断增加和现代饲料工业的发展，兽药的使用范围也在不断扩大， 伴随产生的食用动物的组织和产品中药物残留对消费者的健康和环境的潜在危害也 日趋严重。所以为了有效制止违禁药物的滥用，保护消费者健康和国家贸易不受损失， 消除贸易壁垒，建立有效的残留监控体系和检测方法是非常必要的。残留监控的措施 包括两个方面：制订最高残留限量( m r l ) 和设计残留分析方法。鉴于此，兽药残 留分析的研究已成为食品安全研究的热点之一，其中糖皮质激素类药物分析就是典型 的例子。由于作用时间长，具有很强的毒副作用，长期服用具有成瘾性，过多摄入糖 皮质激素可以引起水、盐、糖、蛋白质及脂肪代谢紊乱，表现为向心型肥胖、多毛、 无力、低血钾、水肿、高血压和糖尿病等。动物生长过程中过量使用这些激素会导致 其在动物源性食品中的残留，进而影响人类健康。因此，不同国家对动物源性食品中 糖皮质激素的最大残留量都做了规定。我国农业部文件动物性食品中兽药最高残留 限量( 农牧发【1 9 9 9 】1 7 号) 规定甲基氢化泼尼松在牛的肌肉、肝脏和肾脏中的最大 残留量均为1 0 昭k g ；氢化泼尼松在牛的肌肉、肝脏、肾脏和牛奶中的最大残留量分 别为4 嵋k g 、1 0 p g k g 、l o “g k g 和6 l a g 埏。但由于此类药物具有抗炎、抗过敏和 抑制免疫等多种药理作用而被滥用于食用动物。因而建立灵敏易行的检测方法对保障 动物源性食品安全具有非常重大的意义。 我国加入w t o 以后，以关税、配额、许可证等为特征的贸易保护措施受到了限 制。一方面发达国家的农产品大量涌入，严重冲击我国的农产品市场；另一方面，发 达国家利用他们的技术优势，以及熟悉w t o t b s s p s 协议和w t o 规则的优势，采 取各种手段，以种种名义实施新的贸易保护措施，限制我国产品出口，食品安全问题 就是非常重要的贸易保护手段之一。p o p s 公约签定后，随着欧美国家停止使用这 些持久性有机污染物以及这些物质在环境中的背景值逐渐降低，他们逐渐对进口商品 特别是食品采取相应的限制保护措施，欧盟、美国、日本等已制定了严格的持久性有 机污染物的残留限量标准。自1 9 9 9 年比利时二嗯英事件以后，作为毒性最强( 致癌、 致畸和致突变作用) 的持久性有机污染物，二嗯英类化合物污染问题更加受到国内外 的广泛关注。国际食品法典委员会已经建立了部分商品中二嗯英类化合物残留限量的 标准，欧盟也相继发布了一系列有关食品和饲料中二嗯英及二嗯英类多氯联苯残留限 量的法规和有关分析方法的要求( 2 0 0 1 2 3 7 5 e c ) 、( 2 0 0 2 7 0 e c ) 、( 2 0 0 3 5 7 e c ) ，同 时在2 0 0 6 年底实施了新的食品和饲料中二嗯英和多氯联苯最大残留限量标准，其对 食品中二嚼英类多氯联苯的限量标准为超痕量的p p t 级 t l ，见表1 。与其它有机物污染 2兽药及持久性有机污染物残留分析方法研究 物检测相比，食品中的二嗯英类化合物测定属超痕量、多组分和复杂基体分析，其检 测限低几个数量级，为p g g 或f 矽g ( 1 0 。2 w 1 0 。1 5 ) 。因此，二噫英类化合物分析方法 研究已变成了当今食品安全分析的又一热点，同时也是难点之一，能否对其进行灵敏 准确的测定已成为衡量一个国家环境监测和食品检测综合能力的重要指标，建立二嗯 英类化合物快速、灵敏、高通量分析方法已成为食品安全工作的迫切任务之一。 同时课题研究秉承国家自然科学基金“食品中持久性有机污染物的快速、超痕量 分析方法研究”课题( n o 2 0 4 7 5 0 5 1 ) 和国家质检总局“食品及包装材料中内分泌干扰 物分析方法研究”课题推动。该课题经两年攻关，已经建立了食品中二噫英及二嗯英 类多氯联苯残留的高分辨质谱快速检测方法，可将二嗯英类化合物分析周期缩短至两 天以内。残留检测方法标准是动物源食品中有机污染物和药物残留监控的技术支撑和 法定依据，而我国残留检测方面的工作起步较晚，相关检测方法十分匮乏，因此国家 对兽药和超痕量有机污染物检测技术研究以及它们引起的食品安全问题给与了大力 支持和关注，建立各种多残留检测和确证方法是保证我国人民的健康和消除贸易壁垒 的必要手段。为了课题的延续性和完善我国残留检测方法，构建食品安全的关键技术 体系，我们在对国内外需求和使用情况调研的基础上，确定对动源性食品中两种糖皮 质类激素的残留和二嗯英类多氯联苯残留检测方法展开研究。随着科学技术的发展， 残留分析技术也不断更新和进步，新的样品前处理技术更是不断涌现，仪器的灵敏度 差别也较大，新技术、新仪器在残留分析中的应用更引起分析工作者的高度关注。自 动化的前处理技术，如加速溶剂萃取技术( a s e ) 、凝胶渗透色谱( g p c ) 、全自动 样品净化系统( f m s ) 等已被应用到了新的前处理方法中。高灵敏的检测仪器，如 g c m s 、 玎? l c m s 、i c p m s 等的更新速度也是不容忽视的。同时由于我国各地区 检测的技术水平、仪器条件各不相同，所以我们研究了不同的前处理方法。对于超痕 量有机污染物和禁用药物在食品中的极低限量要求，考虑仪器性能和灵敏度，定性确 证和定量分析的要求，本研究采用g c m s m s 和g c h r m s 和为主要检测手段。 1 1 兽药残留、有机污染物与食品安全 兽药是指用于畜禽等动物的药物，它还包括能促进动物生长繁殖和提高生产性能 的物质。在我国，蜂药、蚕药及水产药也列入兽药管理f 2 】。食品中兽药残留立法委员 会( c o d e xc o m m i t t e eo nr e s i d u e so fv e t e r i n a r yd r u g si nf o o d s ，c c r v d f ) 认为广义的 兽药还包括加入饲料中的药物添加剂。兽药残留是指给动物使用药物后积蓄或贮存在 动物细胞、组织或器官内的药物原形、代谢产物和药物杂质。兽药残留的危害主要表 现在以下几个方面【3 1 ：( 1 ) 毒性作用( 2 ) 过敏反应( 3 ) 三致作用( 4 ) 导致病原菌 产生耐药性( 5 ) 对胃肠道菌群的影响( 6 ) 激素作用( 7 ) 对生态环境的毒理性 内蒙古农业大学硕士学位论文 3 表l欧盟规定食品中的二嚼英和二嚼英类p c b s 的最大残留限量标准( 以毒性当量计) t a b l elm a x i m u ml e v e l sf o rc e r t a i nc o n t a m i n a n t si nf o o d s t u f f sa si c g 锄l j $ d i o x i n sa n dd i o x i n - l i k ep c b sp r o m u l g a t e d b ye u ，e x p r e s s e di nw h o t o x i ce q u i v a l e n t su s i n gt h ew h o - t e f s ( 19 9 7 ) 注：以脂肪含量计的食品其脂含量应大于1 n o t e ：t h em a x i m u ml e v e l sa l en o ta p p l i c a b l ef o rf o o dp r o d u c t sc o n t a i n i n g 9 9 9 9 5 ) 。 固相萃取装置s u p d c o 公司 旋转蒸发仪e y e l a n - 1 0 0 型，日本t o k y o 公司 数字水浴锅e y e l as b 1 0 0 0 型，日本t o k y o 公司 漩涡混合仪m s l 型，i k a 公司 离心机2 1 6 型，s i g m a 公司 数字超声清洗仪k q 一5 0 0 d 型，昆山市超声仪器有限公司 氮吹仪( 日本e y e l a 公司) 精密电子天平( o 0 0 0 0 1g ) b t 2 5 s 型，北京赛多利斯仪器有限公司 电子天平( o 0 0 0 1g ) b s 2 2 4 s 型，北京赛多利斯仪器有限公司 振荡器s a3 0 0 型，y a m a t o 公司，日本 水浴锅s i g m a 公司 可调微量移液器b r a n d ( 2 0 2 0 0 此) ，德国 c 1 8 固相萃取柱( 3 m l ，5 0 0 r a g ) s u p e l c o 公司 2 1 4 溶液的配制 p r e 和m p p 标准储备溶液：分别准确称取p r e 和m p p 标准品各0 0 2 5 0g ，用少量 甲醇溶解，转移至2 5m l 容量瓶中，用甲醇定容到刻度，分别配制成1 0 0m g m l 一1 的 标准储备液，4 0 c 避光保存。 p r e 和m p p 工作标准溶液：分别准确移取一定体积的上述2 种标准储备液，用甲 醇稀释，分别配制成浓度为1 0 0 m g l - 1 、1 0 0 m gl 1 、1 0 0 m g l - 1 、5 0 0 陷l - 1 、2 0 0 “gl 1 单一药物工作标准溶液，以及浓度为1 0 0m gl - i 、1 0 0m gl - 1 、5 0 0 熠l l 、 2 0 0g gl 1 的混合工作标准溶液。 酸性k 2 c r 2 0 7 溶液：取1 8m l 水置于5 0 m l 的比色管，加入2m l 浓硫酸，再加1 0g k 2 c r 2 0 7 充分溶解 o 2 0m o ll - 1n a a c 缓冲溶液( p h4 6 ) ：称取1 3 2gn a a c 至5 0 0m l 容量瓶中， 加水4 0 0m l 溶解，用0 1 0m o ll 1h c i 调节，加水定容至刻度。 1 0 n a 2 c 0 3 溶液的配制：称取n a 2 c 0 3 至1 0 0m l 容量瓶中，加水4 0m l ，充分溶 解再加5 0m l 定容nl o om l 18 兽药及持久性有机污染物残留分析方法研究 s p e 固相萃取柱淋洗溶液和洗脱溶液：将1 0m l 乙醇和9 0m l 水混合，即可得 到乙醇水( 1 ：9 ，v v ) 的s p e 柱平衡液：将1 0m l 丙酮和9 0m l 水混合，即可得到 丙酮水( 1 ：9 ，v v ) 的s p e 柱淋洗液，将4 0m l 甲醇和6 0m l 水混合，即可得到甲 醇水( 4 ：6 ，v v ) 的s p e 柱淋洗液。 2 2 实验方法 2 2 1 分析条件 2 2 1 1 色谱条件 色谱柱：t r 5m s 弹性石英键合毛细管柱( 3 0m x 0 2 5m i n x 0 2 5 岬) 程序升温条件：7 0 ( 1r a i n ) 2 5 。c r a i n 2 7 0 1 5 c r a i n 3 1 0 ( 2m i n ) 进样口温度：进样口温度2 8 0 载气：氦气( h e ，纯度 9 9 9 9 5 ) ，流速为1 0m l m i n 进样模式：不分流进样1 此 2 2 1 2 质谱条件 质谱仪：离子阱质谱 电离方式：电子轰击电离源( e i ，7 0e v ) ，离子源温度为2 0 0 传输线温度：2 8 0 质谱检测模式：全扫描模式和m s m s 扫描模式。在全扫描模式下，扫描的质量 数为5 0 - 4 5 0 a i n u ，溶剂延迟时间为l lm i n 。在m s m s 模式下，每种药物选择1 个母离 子即p r e 为m z1 6 0 ，m p p 为m z1 7 4 ；每种药物选择2 个子离子，即p r e 为r r d z1 3 1 和 m z1 4 5 ，m p p 为m z1 3 1 和m z1 5 9 为定性离子；每种药物选择一个定量离子即p r e 为r r d z1 4 5 和m p p 为r r d z1 5 9 ：氢化泼尼松和甲基氢化泼尼松碰撞诱导解离( c ) ) 电压 分别为1 0v 和1 2 5v 。 2 2 2 方法标准曲线的测定 用甲醇将氢化泼尼松和甲基氢化泼尼松的混合工作标准溶液稀释，配制成一系列 六个浓度： 1 0 0p gl l 、2 0 0p gl 1 、5 o o 肛gl l 、1 0 0t t gl l 、2 0 0t t gl - 1 和5 0 0t t g l 1 。采用优化的k 2 c r 2 0 7 氧化衍生化，反应物氮气吹干，加lm l 乙酸乙酯定容，取l 肛l 进样，用所建立的g c m s m s 方法分析，对色谱峰面积积分，每一浓度重复3 次， 取平均值，然后以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，分别绘制p r e 和m p p 的标准曲 线，求回归曲线和相关系数。 2 2 3 样品前处理振荡提取 称取l og 猪肉组织样品，置于5 0 蝴四氟乙烯离心管内，加a 1 5m lp h4 6 的醋 内蒙古农业大学硕士学位论文 1 9 酸一醋酸钠缓冲溶液，再加入2 0 0 l 酶解汁，振荡1 0m i l l 、超声1 5r a i n 后于6 0 水 浴中加热2h 。冷却后加入2 0m l 乙腈并振荡3 0r a i n ，以7 5 0 0r m i n 离心分离2 0m i n ，将 上清液转移至另一离心管内，加入8m l 正已烷、2m l - 氯甲烷后轻微振荡，再以4 5 0 0 r m i n 离心5r a i n ，然后移取中间层至比色管内并氮气吹干。将吹干后的药物用lm l 乙 醇涡动溶解，再加入9m l 水混匀，备过c 1 8 柱。 2 2 4o , s 固相萃取柱净化 c 1 8 柱分别用5m l 甲醇和5m l 水活化，5m l 乙醇和水( 体积比l ：9 ) 平衡，控 制流速为1 1 5m l m i n ，使上述样品缓冲溶液溶解液直接通过c 1 8s p e 柱，加入上述 乙醇上样溶液后，依次用5m l 水、5i n l 丙酮和水( 体积比l ：9 ) 、3m l 甲醇和水( 体 积比4 ：6 ) 和5m l 正已烷淋洗并弃去，再用2m l 乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液并用氮 气吹千。 2 2 5k 2 c r 2 0 7 氧化衍生 将上述吹干物质用1 0 0 “l 乙腈复溶，力nl o ol a l 酸性k 2 c r 2 0 7 氧化液并混匀，于6 0 水浴中加热1 8r a i n ，冷却后依次加a 2 0 0p l1 0 碳酸钠溶液、l m l 去离子水、3m l - - 氯甲烷，超声提取1 0r a i n 后于4 5 0 0r m i n 离心5m i n 。将下层有机相转移、氮气吹干， 加乙酸乙酯定容至lm l ，用于g c i t - m s m s 测定。 2 2 6 添加标准曲线的测定 分别准确移取氢化泼尼松和甲基氢化泼尼松准品储各液用甲醇稀释成1 0 0m g l - l 混合标液。再依次用甲醇稀释后添9 n 到1 0 0g 猪肉样品中，添加标准溶液浓度分 别为2 0 0 、4 0 0 、5 0 0 、1 0 0 、2 0 0 、5 0 0l a gl 1 ，涡动混匀，室温放置过夜，其中每 个添加浓度重复测定3 次。按照所建立的分析方法测定，取平均值，然后以添加的浓 度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标，分别绘制p i 冱和m p p 的添加标准曲线，求回归 曲线和相关系数。 添棚浓度= 鱼翌型馨掣 2 2 7 添加回收率和精密度的测定 按照上述2 2 6 的添加处理方法，在1 0 o og 猪肉中，获得浓度为5 、1 0 o o 、2 0 01 t g k g 一1 的添加样品，每个添加浓度重复测定6 次。按照所建立的分析方法测定，计算样 品中氢化泼尼松和甲基氢化泼尼松测定浓度，取平均值，利用实际测定浓度与添加浓 度的比值计算回收率，计算添加相对标准偏差。 2 0兽药及持久性有机污染物残留分析方法研究 添加网收率t ，= 蒜鬻糌蝴 2 2 8 检测限和定量限 氢化泼尼松和甲基氢化泼尼松的检测限是根据仪器的信号噪声芝3 ( s i g n a l t o n o i s er a t i oo f 3 ，s n 3 ) 来确定；定量限是根据仪器的信号噪声之l o ( s i g n a l - t o - n o i s er a t i oo f1 0 ，s n 1 0 ) 来确定。 2 2 9 实际样品的测定 对5 个北京地区购买的实际样品进行了测定，每个样品重复测定3 次。 2 3 实验结果与分析 2 3 1 氢化泼尼松和甲基氢化泼尼松g c i t m s 胱s 方法的建立 2 3 1 1 衍生物的确认 根据氢化泼尼松和甲基氢化泼尼松标准溶液的全扫描色谱图，得到两种药物衍生 化物的质谱图，并与化合物的n i s t 0 5 标准谱库检索结果相对照，确认氢化泼尼松和 甲基氢化泼尼松甾环结构上的3 ，1 1 位的o h 被氧化，生成羰基甾类衍生物。两 种药物衍生物的全扫描色谱图和相关的质谱图见图2 0 。一h 1 1 8 2 4 1 荒7 m 7o 删 ( m i n l i b ) p r e g n a - 1 4 1 0 的规定，确定l o q 均为2 0 $ t gk g - 1 ；按照s n 芝3 ，确定方法的l o d 均为1 0 鹏k g - 1 。其中添加浓度为2 o 鹏k g - 1 和1 0s t gk g 一1 的信噪比见图9 。 n l 二2 e o e 3 t i cl s r ：m 8 d a - c u r v 1o r t 1 15 7 1 3 4 7s m ：5 b o 5 0 产：+ cs r m 号弘o 驰，4 e o o m 搴a d t 3 - c u r v t1e m r n t z 2 = 1 1 篱5 t 2 ；- li ”o o ” f = ”8 ” ：亨詈誉蛊：雩三s o 。o 。1 m 5 s 8 。：昌- 。t 兽：3 拿 e 圈9 - 1 添加浓度为2 0p gk g - i 猪肉样品的s n f i g 9 - 1t h es no f 2 0p gk g - it a r g e ti n p o r ks a m p l e ：警2 。1 1 者苫翟盏4 15 n 0 5 7 是i 5 。0 8 - 1 r 3 并2 0 m 31 6 0o o ，3 口1 ? o j 燃z 免昙，訾争_ 1 5 0 1m s n t - a 5 6 e 2 、 m ，z _ 1 5 88 f - j _ 0 95 nf ：4 - cs 一，计 r o * 217 4o d e 司 o d 【 o o5 伽 3 2a o 1 6 85 0 一6 0 o o 17 35 0 - 1 7 4 5 0 lm 8 i c l 8a d c i - c i | r 、，e18 图9 - 2 添加浓度为1 0l a gk g - i 的猪肉样品的s n f i g 9 - 2t h es no f1 0p gk g - it a r g e ti np o 咄s a m p l e 2 3 4 5 实际样品测定 利用上述该方法对北京地区3 个随机购买的猪肉样品进行提取、净化、氧化， 气相色谱一二级质谱分析，未发现阳性样品。 3 牛奶中1 2 种二嚼英类多氯联苯的g c i t m s m s 测定方法研究 3 1 实验材料与设备 3 1 1 主要试剂 。葛暑乏口，薯夏 8晷薹薏趸 2 8 兽药及持久性有机污染物残留分析方法研究 1 3c 标记的d l - p c b s 标准溶液s e p a1 6 6 8l c s ，含1 2 种”c 标记的