（食品科学专业论文）海洋细菌（Agarivorans+albus+YKW34）产生的褐藻胶裂解酶及琼胶酶的研究.pdf

海洋细菌( a g a r i v o r a n sa l b u sy k w - 3 4 ) 产生的 褐藻胶裂解酶及琼胶酶的研究 摘要 从韩国东海岸的蝾螺( t u r b i n i d a eb a t i l l u sc o r n u t u s ) 肠道中筛选出的菌株y k w - 3 4 ， 能够有效降解一些褐藻和红藻的细胞壁多糖。通过分析其1 6 sr r n a 基因序列，将该菌 株鉴定为a g a r i v o r a n sa b u s ，命名为a g a r i v o r a n sa l b u sy k w - 3 4 ( 中文名暂定为白色琼 胶贪食菌y k w - 3 4 ) 。a a l b u sy k w - 3 4 在其生长培养基m a r i n eb r o t h 中不产生多糖降解 酶；但在以多糖作为碳源的培养基中可产生1 种褐藻胶裂解酶和2 种琼胶酶。本研究旨 在对a a b u sy k w - 3 4 产生的褐藻胶裂解酶和琼胶酶进行生产优化、分离纯化、性质研 究及基因克隆，以便为两种酶的工业化应用提供理论依据和实践基础。 通过单因子和正交实验，对a a b u sy k w - 3 4 产褐藻胶裂解酶的培养条件进行了优 化。结果表明，其最适碳源为海带粉o 5 ( w v ) ，氮源为k n 0 30 1 ( w v ) ，最佳种龄为 1 2 h ，接种量为1 0 ，最适培养基初始p h 值为8 0 ，培养温度为2 5 0 c 。在上述条件下， l1 0 r p m 震荡培养4 8 h ，褐藻胶裂解酶产量达到最大值5 u m l 。在发酵培养基中添加过量 的多糖或单糖可抑制产酶；增加氮源的浓度或种类有利于菌株的生长，但也会抑制产酶。 通过聚醚酰亚胺沉淀，阴离子交换、疏水及凝胶过滤色谱，进行了a a b u sy k w - 3 4 产褐藻胶裂解酶的纯化。其回收率为7 ，纯化倍数为2 5 倍。s d s - p a g e 和凝胶过滤色 谱表明此酶由单一肽链组成，分子量为6 0 k d a 。等电聚焦实验表明其等电点为5 5 5 7 。 此酶的最适p h 为7 o ，在p h7 0 - 1 0 0 稳定；最适温度为3 0 - 4 0 0 c ，低于5 0 0 c 时稳定。 此酶具有钠钾离子依赖性。透析除去反应体系中钠，钾离子后，酶活力丧失；添加钠，钾 离子后，酶活力可完全恢复。此酶对还原剂如p 巯基乙醇和d t r 、金属离子络合剂如 e d t a 和e g t a 具有耐受性；变性剂如s d s 和尿素可使酶活力提高3 0 。底物专一性 实验表明，此酶能同时降解甘露糖醛酸和古罗糖醛酸片断。 通过单因子实验、p l a c k e t t - b u r m a n 设计及响应面设计实验，对a a b u sy k w - 3 4 发 酵产琼胶酶的条件进行了优化。单因子实验表明，最佳碳源和氮源分别为琼胶和酵母浸 膏，最适培养温度为2 5 0 c 。在此条件下，确定最适培养时间为1 2 h 。p l a c k e t t - b u r m a n 设 计表明琼胶、酵母浸膏及初始p i - i 三个因素对琼胶酶产量具有显著影响( 尸 0 0 5 ) 。响 应面设计实验确定此三个因素的最适水平为：琼胶0 2 3 ，酵母浸膏0 2 7 ，初始p _ h 为 7 8 1 。经优化后，琼胶酶产量由0 2 3 u m l 提高至0 8 7 u m l 。用活性染色法对琼胶酶进行 了原位测定，结果表明，琼胶酶为培养液中的主要蛋白质组分，其分子量约为5 0 k d a 。 离子交换色谱表明，a a l b u sy k w - 3 4 能产生两种琼胶酶，将其分别命名为a g a a 3 4 和a g a b 3 4 ，其中a g a a 3 4 产量为7 4 7 u i ，a g a b 3 4 产量为8 3 u 1 。a g a a 3 4 进一步通过 凝胶过滤色谱得以纯化。s d s - p a g e 和凝胶过滤色谱表明此酶由单一肽链组成，分子量 为5 0 k d a 。纯化的回收率为7 ，纯化倍数为2 5 倍。经测定，a g a a 3 4 的n 端氨基酸序 列为a s l v t s f e e a ，与糖基水解酶家族5 0 的琼胶酶相似；a g a b 3 4 的n 端氨基酸序列 为a d w d 舳i p a e l d a g ，与糖基水解酶家族1 6 的琼胶酶相似。a g a a 3 4 的酶学性质分 析表明，此酶的最适p h 为8 0 ，在p h6 0 1 1 0 稳定；最适温度为4 0 0 c ，在温度5 0 0 c 时稳定。m a l d i t o fm s 和1 3 cn m r 分析表明a g a a 3 4 的琼胶酶解产物为7 5 m 0 1 新 琼二糖和2 5 m 0 1 新琼四糖。薄层色谱表明此酶能将新琼四糖降解为新琼二糖。以琼脂 糖和新琼四糖为底物，此酶的催化效率分别为4 0 4 x 1 0 3 和8 1 x 1 0 2 s - 1 盯1 。海水中的常见 金属离子对a g a a a 4 的酶活力无显著影响。此酶对s d s 和尿素具有耐受作用；p 巯基乙 醇和d 1 t 可提高酶活力。 本研究建立了a a l b u sy k w - 3 4 的基因组文库，并从此文库中克隆出琼胶酶基因 ( a g a b 3 4 ) 。此基因长1 3 6 2 b p ，编码4 5 3 个氨基酸。根据同源性分析，判断其氨基酸序 列1 - 2 3 a a 为信号肽，2 5 2 9 7 a a 为糖基水解酶家族1 6 催化组件，3 1 6 - 4 5 2 a a 为碳水化合物 结合组件。成熟蛋白的分子量预测为4 8 ，6 3 7 d a ，等电点预测为6 3 4 。通过构建n 端包 含信号肽序列及c 端镶嵌6 个组氨酸的琼胶酶重组质粒，以大肠杆菌d h 5 a 为宿主对该 酶进行了重组表达。结果表明，重组琼胶酶( r a g a b 3 4 ) 可分泌至胞外，最高产量为 1 6 7 0 u 1 。r a g a b 3 4 可经亲和色谱进行一步纯化，回收率为8 0 ，纯化倍数为1 5 倍。 r a g a b 3 4 分子量为4 9 k d a ，其终产物为新琼四糖。其结构域及终产物表明其属于糖基水 解酶家族。1 6 成员。此酶的最适p h 为7 0 ，在p h5 0 9 0 稳定；最适温度为3 0 0 c ，在 温度5 0 0 c 时稳定。以琼脂糖为底物，此酶的比活力和催化效率分别为2 4 2 u m g 和 1 7 x 1 0 6 s - 1 m l 。此酶对e d t a 和e g t a 、s d s 和尿素及p 巯基乙醇和d t t 具有耐受性。 关键词：a g a r i v o r a n sa l b u s ；褐藻胶裂解酶；琼胶酶；优化；纯化：基因克隆 r e s e a r c ho na l g i n a t el y a s ea n da g a r a s ep r o d u c e db y a g a r i v o r a n s a l b u sy k w - 3 4 a b s t r a c t am a r i n eb a c t e r i u ms t r a i ny k w - 3 4t h a td e g r a d e st h ec e l lw a l lo fs o m es e a w e e di n c l u d i n g l a m i n a r i aj a p o n i c aa n dg e l i d i u ma m a n s i iw a si s o l a t e df r o mt h eg u to fat u r b a ns h e l l t h i s s t r a i nw a si d e n t i f i e d 鹳a g a r i v o r a n sa l b u sb a s e do n16 sr r n ag e n es e q u e n c ea n a l y s i s t h i s p a p e r d e s c r i b e st h eo p t i m i z a t i o no f p r o d u c t i o n ，p u r i f i c a t i o n , a n dc h a r a c t e r i z a t i o no fa na l g i n a t e l y a s ea n d a l la g a r a s e ，a sw e l la sg e n ec l o n i n ga n de x p r e s s i o no fa n a g a r a s ef r o mt h i ss t r a i n t h ee f f e c t so fm e d i u mc o m p o s i t i o na n dc u l t u r ec o n d i t i o no nt h ep r o d u c t i o no fa l e _ a t e l y a s eb ya a l b u sy k w - 3 4w e r ei n v e s t i g a t e du s i n gb a t c hs h a k ef l a s k s n oa l g i n a t el y a s ew a s p r o d u c e di nt h em a r i n eb r o t hm e d i u m a f t e ro p t i m i z a t i o n , t h ea c t i v i t yo ft h ea l g i n a t el y a s e r e a c h e d5u m 1 t h eo p t i m a lp r o d u c t i o nc o n d i t i o n sf o ra l g i n a t el y a s eb ya a l b u sy k w - 3 4 w e r e ：i n o c u l u mv o l u m e , 1o ；i n o e u l u ma g e , 1 2h ；i n i t i a lp ho ft h em e d i u m , 8 0 ；c u l t u r e t e m p e r a t u r e ，2 5 0 c ；c a r b o ns o u r c e ，o 5 l a m i n a r i ap o w d e r ；n i t r o g e ns o u r c e ，0 1 k n 0 3 a l g i n a t ec o u l di n d u c ea l g i n a t el y a s ep r o d u c t i o 玛b u tn o ta se f f i c i e n ta sd i dl a m i n a r i ap o w d e r t h ea d d i t i o no ff u c o i d a n , c e l l u l o s e ，a n dg l u c o s eh a dn e g a t i v ee f f e c to nt h ep r o d u c t i o no f a l g i n a t el y a s e o t h e rk i n d so fn i 仃o g e ns o u r c e ss u c ha sy e a s te x t r a c t , b e e fe x t r a c la n dp e p t o n e a f f e c t e dp o s i t i v e l yt h e g r o w t ho ft h em i c r o o r g a n i s m , b u tn e g a t i v e l yt h ea l e g n a t el y a s e p r o d u c t i o n i na d d i t i o n , t h eo p t i m a lh a r v e s tt i m ew a s4 8hb a s e do nt h et i m ec o u r s eo fa l g i n a t e l y a s ep r o d u c t i o n a na l g i n a t el y a s e 、析廿lt l i g hs p e c i f i ce n z y m ea c t i v i t yw a sp u r i f i e df r o ma a l b u sy k w - 3 4b y i no r d e ro fi o ne x c h a n g e ，h y d r o p h o b i c ，a n dg e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h i e st oh o m o g e n e i t y w i t ha r e c o v e r yo f7 a n daf o l do f2 5 i tw a sc o m p o s e do fas i n g l ep o l y p e p t i d ec h a i n 、砘n l m o l e c u l a rm a s so f6 0k d aa n di s o e l e c t r i cp o 硫o f5 5 - 5 7 t h eo p t i m a lp ha n dt e m p e r a t u r e f o rt h ea c t i v i t yo ft h ea l g i n a t el y a s ew e r ep h7 0a n d4 0 0 c ，r e s p e c t i v e l y i tw a ss t a b l eo v e rp h 7 肚1o 0a n da tt e m p e r a t u r eb e l o w5 0 0 c t h ee n z y m eh a ds u b s t r a t es p e c i f i c i t yf o rb o t l l p o l y - g u l u r o n a t ea n dp o l y - m a n n u r o n a t eu n i t s t h e 蚝卅v a l u ef o ra l g i n a t e0 a e t e r o t y p e ) w a s 1 7 1 0 6s 。1 m 1 t h ee n z y m ea c t i v i t yw a sc o m p l e t e l yl o s tb yd i a l y s i sa n dr e s t o r e db ya d d i t i o n o f n a + o rk - t h eo p t i m a la c t i v i t ye x h i b i t e di n0 1mo fn a + o rk + t h i se n z y m ew a sr e s i s t a n t t od e n a t u r i n gr e a g e n t s ( s d sa n du r e a ) ，r e d u c i n gr e a g e n t s ( p m e r c a p t o e t h a n o la n dd t t ) ，a n d c h e l a t i n gr e a g e n t s ( e g t a a n de d t a ) e f f e c t so fm e d i u mc o m p o s i t i o na n dc u l t u r ec o n d i t i o n so na g a r a s ep r o d u c t i o nb ya a l b u s y k w - 3 4w e r ei n v e s t i g a t e di ns h a k ef l a s k s e f f e c t so fc a r b o na n dn i t r o g e ns o u r c e sa n dc u l t u r e t e m p e r a t u r eo na g a r a s ep r o d u c t i o nw e r ee v a l u a t e db yo n e - f a c t o r - a t - a - t i m ed e s i g n a g a r , y e a s t e x t r a c t ，a n d2 5 0 cw e r ef o u n dt ob em o s ts u i t a b l ef o ra g a r a s ep r o d u c t i o n t h em o s ti m p o r t a n t n u t r i t i o n a lc o m p o n e n t sa n dc u l t u r ec o n d i t i o n si n f l u e n c i n ga g a r a s ep r o d u c t i o nw e r es e l e c t e db y p l a c k e t t - b u r m a nd e s i g n a m o n gt h en i n ef a c t o r ss t u d i e d ，a g a r ，y e a s te x t r a c t ，a n di n i t i a lp hh a d s i g n i f i c a n te f f e c to na g a r a s ep r o d u c t i o n t h eo p t i m u ml e v e l so ft h e s ev a r i a b l e sw e r ef u r t h e r d e t e r m i n e du s i n gac e n t r a lc o m p o s i t ed e s i g n t h eh i g h e s ta g a r a s ep r o d u c t i o nw a so b t a i n e di n t h em e d i u mc o n s i s t i n go f0 2 3 a g a ra n d0 2 7 y e a s te x t r a c ta ti n i t i a lp h7 81 t h ew h o l e o p t i m i z a t i o ns t r a t e g yr e s u l t e di nt h ee n h a n c e m e n to fa g a r a s ep r o d u c t i o nf r o mo 2 3u m lt o o 8 7u m 1 t h ea c t i v i t ys t a i n i n go fc r u d ea g a r a s ep r e p a r a t i o na f t e re l e c t r o p h o r e s i sr e v e a l e dt h e p r e s e n c eo fa na g a r a s ew i t hm o l e c u l a rn l a s so f5 0k d a a ne x t r a c e u u l a rp - a g a r a s e ，a g a a 3 4 ，w a sp u r i f i e df r o ma a l b u sy k w - 3 4b yi o ne x c h a n g e a n dg e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h i e st oh o m o g e n e i t y 谢t l la r e c o v e r yo f3 0 a n daf o l do f1 0 a g a a 3 4w a sc o m p o s e do fas i n g l ep o l y p e p t i d ec h a i nw i t ht h em o l e c u l a rm a s so f5 0k d a n - t e r m i n a la m i n oa c i ds e q u e n c i n gr e v e a l e das e q u e n c eo f a s l v t s f e e a , w h i c he x h i b i t e da h i g hs i m i l a r i t y ( 9 0 ) w i t ht h o s eo fa g a r a s e sf r o mg l y c o s i d eh y d r o l a s ef a m i l y5 0 t h ep ha n d t e m p e r a t u r eo p t i m ao fa g a a 3 4w e a ep h8 0a n d4 0 0 c ，r e s p e c t i v e l y i tw a ss t a b l eo v e rp h 6 o - 1 1 0a n da tt e m p e r a t u r eb e l o w5 0 0 c h y d r o l y s i so fa g a r o s eb ya g a a 3 4p r o d u c e d n e o a g a r o b i o s e ( 7 5m 0 1 ) a n dn e o a g a r o t e t r a o s e ( 2 5m 0 1 ) ，w h o s es t r u c t u r e sw e r ei d e n t i f i e d b ym a l d i - t o fm sa n d1 cn m r a g a a 3 4c l e a v e db o t hn e o a g a r o h e x a o s ea n d n e o a g a r o t e t r a o s ei n t on e o a g a r o b i o s e t h e 卅v a l u e sf o ra g a r o s ea n dn e o a g a r o t e t r a o s ew e r e 4 0 4 l 矿a n d8 1 1 0 2s - 1 m 一1 ，r e s p e c t i v e l y a g a a 3 4w a sr e s i s t a n tt od e n a t u r i n gr e a g e n t s ( s d sa n du r e a ) m e t a li o n sw e r en o tr e q u i r e df o ri t sa c t i v i t y , w h i l er e d u c i n gr e a g e n t s ( 1 3 - m e a n dd t t ) i n c r e a s e di t sa c t i v i t yb y3 0 a i b - a g a r a s eg e n e ，a g a b 3 4 ，w a sf u n c t i o n a l l yc l o n e df r o mt h eg e n o m i cd n ao fam a r i n e b a c t e r i u ma g a r i v o r a n sa l b u sy k w - 3 4 t h en u c l e o t i d es e q u e n c eo fa g a b 3 4c o n s i s t e do f13 6 2 b pa n de n c o d e dap r o t e i no f4 5 3a m i n oa c i d s t h ed e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c e ，c o n s i s t i n go f at y p i c a ln - t e r m i n a ls i g n a lp e p t i d ef o l l o w e db yag l y c o s i d eh y d r o l a s ef a m i l y1 6 ( o h - 1 6 ) d o m a i na n dac a r b o h y d r a t e - b i n d i n gm o d u l e ( c b m ) ，s h o w e d3 7 - 8 6 i d e n t i t yt ot h o s eo f k n o w na g a r a s e si ng l y c o s i d eh y d r o l a s ef a m i l y16 t h er e c o m b i n a n te n z y m e ( r a g a b 3 4 ) w i ma m o l e c u l a rm a s so f4 9k d aw a sp r o d u c e de x t r a e e l l u l a r l yu s i n ge s c h e r i c h i ac o l id h 5 aa sa h o s t t h ep u r i f i e dr a g a b 3 4w a sai b - a g a r a s ey i e l d i n gn e o a g a r o t e t r a o s e 州a 4 ) a st h em a i n p r o d u c t i ta c t e d0 1 1n e o a g a r o h e x a o s et op r o d u c en a 4a n dn e o a g a r o b i o s e ，w h i l ei tc o u l dn o t f t l r t h e rd e g r a d en a 4 t h em a x i m a la c t i v i t yo fr a g a b 3 4w a so b s e r v e da t3 0 0 ca n dp h7 0 i t w a ss t a b l eo v e rp h5 0 - 9 0a n da tt e m p e r a t u r eu pt o5 0 0 c i t ss p e c i f i ca c t i v i t ya n d 4 v a l u ef o ra g a r o s ew e r e2 4 2u m ga n d1 7 1 0 6s 1 m 1 ，r e s p e c t i v e l y t h ea c t i v i t yo fr a g a b 3 4 w a sn o ta f f e c t e db ym e t a li o n sc o m m o n l y e x i s t i n gi ns e a w a t e r i tw a sr e s i s t a n tt oc h e l a t i n g r e a g e n t s ( e d t a , e g t a ) ，r e d u c i n gr e a g e n t s ( d t t , 1 3 - m e ) ，a n dd e n a t u d n gr e a g e n t s ( s d sa n d u r e a ) k e yw o r d s ：a g a r i v o r a n sa l b u s ；a l g i n a t el y a s e ；a g a r a s e ；o p t i m i z a t i o n ；p u r i f i c a t i o n ；g e n e c l o n i n g 海洋细菌( 4 9 口r 加m n ，甜b 瓣y k w 二3 4 ) 产生的褐藻胶裂解酶及叠殷酶的研究 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：槲签字日期：o 毋年月f 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以 将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到 中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。 学位论文储虢似矿乡 导师粹 签字日期：o g 年6 月f 日 枷劈 签字日期：a 辟6 月 海洋细菌( a g a r i v o r a n sa l b u sy k w - 3 4 ) 产生的褐藻胶裂解酶及琼胶酶的研究 0 前言 o 1 立题目的及意义 广阔的海洋占地球总面积的7 1 ，其中蕴藏着巨量的生物资源，包括脊椎动物、无 脊椎动物、海藻、微生物。海藻是海洋中具有叶绿素，能进行光合作用生产有机物的自 养型生物，它们是海洋中的初级生产者。海藻的门类很多，主要分为四种：绿藻、蓝绿 藻、褐藻和红藻。海藻资源丰富且用途广泛。它们中的许多种类可供人类直接食用，如 紫菜、海带、石莼。海藻细胞壁中包含大量的藻胶多糖，这些多糖及其经过生化工艺处 理的产物被广泛用于食品工业、医药卫生和化妆品工业等行业中【。海藻的处理产物还 可以作为肥料和饲料添加剂用于农业生产。 我国的海藻资源非常丰富，是世界上最大的海藻生产国。我国的海藻产量占世界总 产量的6 0 以上，整个东南亚地区的海藻产量占到了世界总产量的9 0 。近年来，全 球海藻工业年使用海藻量( 湿重) 8 0 0 万吨，总产值达6 0 亿美元，其中作为食品直接食 用的海藻产值占5 0 亿美元【2 】。约1 0 0 万吨的褐藻和红藻用于褐藻胶和琼胶及卡拉胶的生 产，藻胶产量为5 5 万吨，产值达5 8 5 亿美元。褐藻胶的产值为2 1 3 亿美元，主要产自 褐藻门昆布属( l a m i n a r i a ) 和裙带菜属( u n d a r i a ) 植物；琼胶的产值为1 3 2 亿美元， 主要产自红藻门石花菜属( g e l i d i u m ) 和江篱属( g r a c i l a r i a ) 的植物；卡拉胶的产值为 2 4 亿美元，主要产自红藻门角叉菜属( c h o n d r u s ) 和麒麟菜属( e u c h e u m a ) 的植物。 海藻是一种美味的食品，但是由于人体内缺乏海藻细胞壁多糖降解酶，海藻的营养 价值未能得到充分的利用。多糖降解酶如褐藻胶裂解酶、琼胶酶和卡拉胶酶等可降解海 藻细胞壁的藻胶多糖生产不同聚合度的低聚糖 3 , 4 1 。这些低聚糖具有特殊的生化活性，可 用于功能食品、药品及化妆品工业。与未降解的藻胶相比，海藻低聚糖具有更高的经济 价值。多糖降解酶还可以用于生产海藻单细胞碎片( s c d ，s i n g l ec e l ld e t r i t u s ) 嘲。海藻 的细胞壁破损后，其细胞内部的营养物质可以被人或动物获得，海藻的营养价值得到了 进一步提高。此外，多糖降解酶还是重要藻类学和分子生物学的工具酶【6 】，用于海藻原 生质体的制备和琼胶电泳后中d n a 片段的提取。 由于海藻多糖降解酶有如此广泛的用途，近几十年以来，国内外的许多工作者开展 了海藻多糖的降解酶的分离纯化的研究工作。由于海藻存在于海洋环境，海洋微生物是 此类酶的重要来源。但是由于海洋环境的特殊性如较低的温度，导致海洋微生物产生的 海洋细菌( a g a r i v o r a n sa l b u sy k w - 3 4 ) 产生的褐藻胶裂解酶及琼胶酶的研究 海藻多糖降解酶热稳定性不好或活性有限。寻找性状稳定、高活力的海藻多糖降解酶仍 然是研究工作者的追求。进一步，如能应用基因工程技术，则能更加大量地表达所需要 的多糖降解酶，并更加方便地将其纯化。如果能用安全的工程菌株进行重组表达，则所 产酶为安全酶制剂【7 - 1 0 1 。用其降解海藻细胞壁，在生产低聚糖的同时，所得海藻破壁产 物的营养价值比未破壁的海藻能得以极大提高。 从韩国东海岸的蝾螺肠道中筛选获得的菌株a g a r i v o r a n sa l b u sy k w - 3 4 ，能够产生 褐藻胶裂解酶和琼胶酶，有效降解一些褐藻和红藻的细胞壁多糖。本课题拟从以下五个 方面对该菌株所产多糖降解酶进行研究： ( 1 ) 优化a a l b u sy k w - 3 4 培养基组成和培养条件，研究不同因素对褐藻胶裂解 酶产量的影响，确定最适的发酵培养条件。 ( 2 ) 分离纯化褐藻胶裂解酶，并对其基本酶学性质进行研究，确定酶的作用底物 及最适反应条件。 ( 3 ) 优化a a l b u sy k w - 3 4 培养基组成和培养条件，研究不同因素对琼胶酶产量 的影响，确定最适的发酵培养条件。 ( 4 ) 分离纯化琼胶酶，并对其基本酶学性质进行研究，确定酶的最适反应条件， 分析其产生的低聚糖的种类及分子量。 ， ( 5 ) 建立a a l b u sy k w - 3 4 的基因组文库，以大肠杆菌为宿主菌克隆多糖降解酶 基因，大量表达重组多糖降解酶，并进行分离纯化和酶学性质研究。 0 2a g a r i v o r a n s 属的微生物 o 2 1a g a r i v o r a n s 属微生物的基本性质 a g a r i v o r a n s 属的微生物为革兰氏阴性菌，杆状，细胞长1 5 - 1 9 p , m ，宽o 7 - 0 9 1 a m ， 一端有单鞭毛。a g a r i v o r a n s 属的微生物属于细菌界，变形菌门，丫变形菌纲，交替单 胞菌目，交替单胞菌科，a g a r i v o r a n s 属。目前该属只有一个种a g a r i v o r a n sa l b u s 。 a g a r i v o r a n s 属的微生物能够在m a r i n ea g a r 培养基平板上形成表面光滑的圆形薄菌落， 并以菌落为中心产生凹陷的菌圈，4 9 a r i v o r a n s a l b u s 菌落为白色。a g a r i v o r a n s 是2 0 0 4 年 建立的新属。日本科学家k u r a h a s h i 从海洋软体动物中发现了6 株a g a r i v o r a n sa l b u s 微 生物，并首次描述和命名了该属和该种【1 1 】。2 0 0 5 年另一日本科学家o h t a 从海洋沉积物 2 海洋细菌( a g a r i v o r a n sa l b u sy k w - 3 4 ) 产生的褐藻胶裂解酶及琼胶酶的研究 中分离出了a g a r i v o r a n ss p j a m b a l l 菌株【1 2 】，2 0 0 6 年韩国科学家l e e 从济州岛海水 中分离得到么妙i v d 阳加s p j a - 1 t 1 3 1 ，2 0 0 7 年中国科学家d u 从青岛近海海水中筛选得到 了a g a r i v o r a n ss p q m 3 5 t 1 4 1 。 7 o 2 2a g a r i v o r a n s 属微生物的产酶类型 a g a r i v o r a n s 属微生物命名依据是其具有琼胶降解( a g a r - d e v o r i n g ) 能力，因为该 属微生物能产生琼胶酶，在琼胶平板上生成凹陷的菌圈。查询删p r o t k b 佃r e m b l 数 据库( h t t p ：w w w e x p a s y o r g ) 表明，目前数据库中有四个a g a r i v o r a n s 属微生物产生的 琼胶酶，其中两个酶的研究在文献中有报道。 a g a r i v o r a n ss p j a m b a l l 产琼胶酶是目前唯一的一个从原始微生物中分离出来 的琼胶酶f 1 2 1 。此琼胶酶纯化之后，编码此酶的基因在b a c i l l u ss u b t i l i s 中得以克隆，重组 琼胶酶得以表达和纯化。原始酶和重组酶的分子量均为1 0 5 k d a ，为p 琼胶酶。依据此 琼胶酶的氨基酸序列，此酶属于糖基水解酶家族5 0 ( g h 一5 0 ) 。从a g a r i v o r a n ss p j a l 的基因组d n a 中筛选出了琼胶酶基因，重组琼胶酶在大肠杆菌中表达和纯化【1 3 1 。重 组酶的分子量为1 0 9 k d a ，也属于g h 5 0 家族，为d 琼胶酶。另外的两个琼胶酶a g a d 0 1 和a g a d 0 2 均来源于a g a r i v o r a n ss p q m a s ，目前还没有在文献中得以描述。a g a d 0 1 和a g a d 0 2 在g e n b a n k 数据库中的序列号分别为e f 0 5 1 4 7 5 和e f l 9 9 9 0 8 。其分子量约 为1 0 6 k d a ，均为g h 5 0 家族的b 琼胶酶。 由于a g a r i v o r a n s 属是新建的属，在最新版的伯杰氏手册中没有对该属的描述【1 5 1 。 到目前为止，对该属微生物及其产生的酶类的研究均有限的。除琼胶酶外，无此属微生 物产生的其他酶类的报道。 o 3 褐藻胶及褐藻胶裂解酶 o 3 1 褐藻细胞壁的多糖组成 一， 褐藻种类繁多，分为3 6 5 个属，多于1 5 0 0 个种【1 6 1 。褐藻的细胞壁由纤维状骨架和 镶嵌期间的无定形基质构成。细胞壁分为两层，外层多糖组成为褐藻胶和岩藻糖胶，内 层多糖组成为纤维素、褐藻胶和岩藻糖胶( 图0 1 ) 。 海洋细菌( a g a r i v o r a n sa l b u sy k w - 3 4 ) 产生的褐藻胶裂解酶及琼胶酶的研究 外层细胞壁 内层细胞壁 胞外 褐藻胶及 岩藻糖胶 纤维素 脂质 蛋白质 蕊 暑 。 胞内 图o 1 褐藻的细胞壁结构。 f i g 0 1 c e l lw a l ls t r u c t u r eo ft h eb r o w na l g a e 【1 7 】 在亚洲国家中如中国、日本、韩国，褐藻是十分受欢迎的食品。从营养学的角度来 看，可食用的褐藻富含非淀粉多糖，即膳食纤维。海藻细胞壁多糖包括褐藻胶、岩藻糖 胶、纤维素均为膳食纤维。这些膳食纤维不能被人体消化，但它们对人体健康十分有利。 研究表明，膳食纤维对一系列疾病包括心血管疾病，结肠癌及肥胖等具有有效的防治作 用。 o 3 2 褐藻胶的结构及性质 。 hh 一 o n 图0 2 褐藻胶的结构。 f i g 0 2 s t r u c t u r eo fa l g i n a t e 褐藻胶( a l g i n a t e ) 是褐藻细胞壁的重要结构多糖，是由1 4 p d 甘露糖醛酸( m ； p - d m a n n u r o n i ca c i d ) 和1 4 0 【一l 古罗糖醛酸( g ；仅l g u l u r o n i ca c i d ) 两种单体组成的 线性无分支多糖( 图0 2 ) 。两种单体不是随机排列的，而是组成嵌段式聚合物如 m m m m m m 、g g g g g g 、g m g m g m g m ，按照一定规律排布形成线性的褐藻胶多糖分 子。重要的商品化褐藻胶来源于l a m i n a r i a 、m a c r o c y s t i s 和a s c o p h y l l u m 18 1 。不同藻体 海洋细菌( a g a r i v o r a n sa l b u sy k w - 3 4 ) 产生的褐藻胶裂解酶及琼胶酶的研究 来源于的褐藻胶的m 和g 比例差异很大，m a c r o c y s t i sp y r i f e r a 中褐藻胶的m g 值为 1 6 ，l a m i n a r i ah y p e r b o r e a n 中褐藻胶的m g 值为o 4 5 。褐藻胶与多价离子如c a 2 + 、 m g + 牢固结合，从而可形成特定的三级结构并可提高其对降解酶的抵抗能力。为满足 不同的应用要求，可以制备成不同聚合度为5 0 1 0 0 ，0 0 0 的褐藻胶多糖。褐藻胶可用于 众多的食品中，如挂面、米粉、面包、冰淇淋、水晶软糖、低脂食品、果酱、点心陷、 酿水榄、洋葱圈及宠物食品等。 o 3 3 褐藻胶裂解酶的研究进展 依据底物专一性，褐藻胶裂解酶( a l g i n a t el y a s e ) 分为甘露糖醛酸裂解酶( e c 4 2 2 3 ) 和古罗糖醛酸裂解酶( e c 4 2 2 1 1 ) 。此酶经