（食品科学专业论文）法夫酵母新科斯糖的鉴定及相应产糖酶的研究.pdf

摘要 摘要 本论文以法夫酵母( x a n t h o p h y l l o m y c e sd e n d r o r h o u s ) 为出发菌株，以本研究室发明 专利一种低聚糖新科斯糖的发酵法生产方法【公开号c n l 8 7 3 0 1 6 a 的生产技术，发 酵生产低聚糖，对该低聚糖的结构进行分析，并对发酵过程中的酶初步分离，研究其性 质。 测定发酵液的酶活，其具有一定的糖苷酶活力。对发酵液中糖类物质高效液相色谱 分析表明，发酵液中可能存在新科斯糖。以蔗糖为底物，发酵液为酶源进行酶解反应( 温 度1 8 ( 2 ，p h 6 5 ) ，酶解产物的高效液相色谱分析表明其中蔗糖含量降低，新科斯糖的含 量增加，并同时伴随有葡萄糖和果糖的产生，初步说明发酵液中的产糖酶具有果糖基转 移作用。 采用高效液相n h 2 制备柱对发酵产物进行纯化制备，收集其中的一种主要的低聚 糖，对其进行质谱和1 3 c 核磁共振分析，解析两谱图表明，该低聚糖的分子量为5 0 4 d a ， 其结构为b d 呋喃果糖( 2 6 ) _ a d 吡喃葡萄糖( 2 1 ) b d 呋喃果糖，即为新科斯 糖。 采用硫酸铵沉淀，a k t a 蛋白纯化层析系统( d e a es p h e r o s ef f 层析柱) 层析对发酵 液中的酶进行初步分离，研究酶学性质。结果表明，该酶分子量约为7 0 5 4 2 d a ，酶解反 应的最适温度范围为1 8 3 0 ，且该温度范围内酶活稳定，随着温度的升高，酶活力迅 速下降，6 0 ( 2 完全失活。其最适p h 为6 5 ，p h5 - 6 5 范围内，酶活力稳定。研究了部分 化学物质对酶活力的影响，其中k + ( 2 m m o l l ) 对酶活力几乎没有影响，甚至具有激活 作用；c a 2 + 和m 9 2 + ( 2r e t o o l l ) 对酶活力影响不大，z n 2 + 和a 1 3 + ( 2r e t o o l l ) 对酶活力 有抑制作用。2m m o l l 的十二烷基磺酸钠( s d s ) 和脲对酶活力没有影响，但s d s 的 浓度增加到1 0m m o l l 时，对酶活力有较强的抑制作用。 关键词：法夫酵母新科斯糖酶 a b s t r a c t a b s t r a e t i nt h i sp a p e r ，o l i g o s a c c h a r i d e sp r o d u c e db yx a n t h o p h y l l o m y c e sd e n d r o r h o u s 嬲t h e s t a r t i n g s t r a i nw a s i n v e s t i g a t e da c c o r d i n g t ot h e p a t e n t s f o r i n v e n t i o n s , a o l i g o s a c c h a r i d e s - n e o k e s t o s ef e r m e n t a t i o np r o d u c t i o nm e t h o d s ” o p e n ，c n l8 7 3 0 16 a t h em a i n c o n t e n t si n c l u d e ：t h ea n a l y s i so ft h es t r u c t u r eo fo l i g o s a c c h a r i d e ，t h ep u r i f i c a t i o no fe n z y m e p r o d u c e di nt h ef e r m e n t a t i o np r o c e s s ，a n dr e s e a r c ho ni t sn a t u r e t h e r em a yb en e o k e s t o s ei nt h ef e r m e n t a t i o nb yh i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y a n a l y s i sa n dt h ea c t i v i t yw a sd e t e r m i n a t e di nt h eb r o t h ，ac e r t a i na c t i v i t y t h ep r o d u c t st h a t h y d r o l y z e db ye n z y m ei n c l u d es u c r o s e ，n e o k e s t o s e ，g l u c o s e ，f r u c t o s ea n do t h e r s c o m p a r e dw i t h t h em a t e r i a li nt h ef e r m e n t a t i o nb r o t h ，c o n t e n to fs u c r o s ed e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y ，t h ec o n t e n to f n e o k e s t o s ei n c r e a s e d ，w h i l eg l u c o s ea n df i u c t o s ep r o d u c e d i tp r e l i m i n a r i l yn o t e st h eg l l z y m e p l a y sf r u c t o s e - t r a n s f e r d n gr o l e t h em a j o ra n ds p e c i f i co l i g o s a c c h a r i d e p r o d u c e db yx a n t h o p h y l l o m y c e sd e n d r o r h o u sw a s p u r i f i e db yh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) m e t h o d i t ss t r u c t u r ew a s i d e n t i f i e db ym a s sc h r o m a t o g r a p h y ( m s ) m e t h o da s s o c i a t e dw i ln u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e f n m r ) m e t h o d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h em o l e c u l a rw e i g h to fo l i g o s a c c h a r i d ew a s5 0 4 d a , a n di t ss t r u c t u r ew a s f l _ d f r u c t o f u r a n o s e ( 2 6 ) 一a - d - g l u c o p y r a n o s e ( 2 一1 ) 一b d f r u c t o f u r a n o s e ， n a m e l yc a l l e dn e o k e s t o s e t h ee n z y m ei nt h eb r o t hw a sp u r i f i e db yas u c c e s s i v ep r o c e d u r ei n c l u d i n ga m m o n i u m s u l f a t ep r e c i p i t a t i o n ，a k t ac h r o m a t o g r a p h yp r o t e i np u r i f i c a t i o ns y s t e mc h r o m a t o g r a p h y t h e p u r i f i e de n z y m e w a sc o n f i r m e dt ob eo n es u b u n i t b yd e n a t u r i n gp o l y a c r y l a m i d e e l e c t r o p h o r e s i s ，t h em o l e c u l a rw e i g l a tw a se s t i m a t e dt ob e7 0 5 4 1d a t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r e r a n g eo fh y d r o l y s i sr e a c t i o ni s18 - 3 0 。c ，w i t ht h et e m p e r a t u r ei n c r e a s i n g , t h ea c t i v i t yd e c r e a s e s q u i c k l y , c o m p l e t ei n a c t i v a t i o ni n6 0 c ，t h ee n z y m ei sf a i r l ys t a b l ei n18 30 。c t h eo p t i m u mp h i s6 5 ，s t a b i l i t yo f a c t i v i t yi sa tp h5 - 6 5 皿ee f f e c to f k 十( 2 m m o l l ) o nt h ee n z y m ea c t i v i t yi s o n l yal i t t l e ，o re v e na c t i v a t e d c a + a n dm 矿十( 2 m m o l l ) h a v el i t t l ee f f e c to nt h ee n z y m e a c t i v i t y t h ee f f e c to fz n 2 + a n da 1 ”( 2 m m o l l ) o nt h ee 1 1 z y m ea c t i v i t yi si n h i b i t e d 2 m m o l lu r e a a n ds d sh a v er i oi m p a c to nt h ee n z y m ea c t i v i t y ，b u tw h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fs d si n c r e a s e d t olo m m o l l ，t h ee n z y m ea c t i v i t yi ss t r o n g l yi n h i b i t e d k e y w o r d ：x a n t h o p h y l l o m y c e sd e n d r o r h o u s n e o k e s t o s e e n z y m e i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 导师签名： 翌墨。5 望 日 期： 2d 口彦5 弓口 第一章绪论 1 1 低聚果糖概述 第一章绪论 低聚果糖l l j ( f i u e t o o l i g o s a c c h a r i d e ) ，又称寡果糖或蔗果三糖族低聚糖，广泛存在于 菊芋、大蒜、洋葱、香葱、黑麦、大麦、芦苇根、小麦、牛蒡、香蕉等植物中，商品低 聚果糖主要是靠微生物发酵来生产。 低聚果糖最早由日本明治制果公司研究开发，于1 9 8 4 年进入市场。日本厚生省已于 1 9 9 2 年批准低聚果糖为特定保健食品。因此，低聚果糖在日本被认为是食品，而并非食 品添加剂，并已在5 0 0 种以上的食品中使用。8 0 年代末，低聚果糖年产量已达至u 4 0 0 0 吨 以上，拥有世界上最大的低聚果糖商业市场，1 9 9 8 年预期含低聚果糖的各种产品在日本 的销售额将达5 0 亿美元。台湾糖业公司和幸贸公司开发的低聚果糖也已经商品化，含低 聚果糖的甜食、糕点、软饮料和饼干等在台湾保健食品市场很受欢迎【2 1 。在韩国，有三 星集团的长一制糖厂与日本明治制果公司协作生产低聚果糖，产品已用于饮料食品等。 在欧洲、荷兰、比利时、瑞典和英国等国的许多大学、研究机构都竞相开展有关低聚果 糖的研究，并且低聚果糖已被作为控制胆固醇水平的功能性甜味剂而广泛应用于许多食 品产品中。在美国，尽管美国食品药物管理局( f d a ) 的有关食品分类管理法规和条例 中尚未有功能食品的明确定义和界定，但低聚果糖对人体的有益作用正在日益引起美国 医药和食品界的认可和重视。从9 0 年代开始，美国国内对低聚果糖的研究激增，日本和 欧洲生产的低聚果糖在美国已被作为一种天然存在的营养补剂。从1 9 9 5 年开始，由美国 科罗拉多州的g t c 公司引进，加工后以片剂、胶囊、粉剂、口服液等形式正式在全美市 场上销售。在我国，低聚果糖开发起步较晚。魏远安已于1 9 9 4 年在国内最早研究低聚果 糖，此后无锡轻工大学和中国食品发酵工业研究所分别进行类似的研究【3 】，目前国内有 山东保龄宝生物技术有限公司和广东量子高科等多家公司研究开发了多种低聚果糖，作 为食品添加剂。 1 1 1 低聚果糖的结构 低聚果糖的结构式为：g f f n ；n = 1 3 ( g 为葡萄糖，f 为果糖) ，它是由蔗糖和1 3 个果糖基通过b 2 1 键与蔗糖中的果糖基结合而成的蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖及 其混合物【4 】，这种结构和组分的多样性导致其甜度、黏度、水分活性、吸湿性和生理功 能诸方面的不同。 蔗果三糖按照其果糖基与蔗糖分子的连接方式的不同分为三种类型。当果糖与蔗糖 分子中的果糖基1 碳位相连接便形成1 蔗果三糖( 1 k e s t o s e ) ，为1 f 型【5 】；当果糖与蔗糖 分子中果糖基6 碳位相连接便形成6 蔗果三糖( 6 k e s t o s e ) 为6 f 型。这两种蔗果三糖均含 有一个末端葡萄糖基和一个末端果糖基。当一个果糖基与蔗糖分子中的葡萄糖基6 碳位 相连接而形成的一种新型的蔗果三糖，即为新科斯糖( n e o k e s t o s e ) ，此种三糖分子的两个 江南大学硕士学位论文 末端组均是果糖基，为6 g 型。目前低聚果糖的1 f 型研究已较多，6 f 型的低聚果糖也受 到了关注，但是6 g 系列的低聚果糖的研究甚少【6 】。 n e o k e s t o s e 图1 - 1 不同结构蔗果三糖的分子结构式 f i g 1 - l m o l e c u l a rs t r u c t u r eo fd i f f e r e n tk e s t o s e s 1 1 2 低聚果糖的生理特性 固态低聚果糖为无色粉末，水中溶解性好，其甜度低，为相应蔗糖的3 0 左右，但 较蔗糖甜度清爽，吸湿性强，它的含水产品难于在空气中长期保存，而粘度比同浓度的 蔗糖溶液略大，热稳定性也较蔗糖高，当环境p h 为中性时，在1 2 0 条件下还非常稳 定，在酸性c o i l 3 ) 条件下，温度达到7 0 c 以后极易分解，稳定性明显降低。低聚果糖的 其它一些物化性质如溶解性、冰点、沸点和结晶点等都与蔗糖非常相似【_ 7 8 1 ，只是在p h 3 4 的酸性条件下加热易分解。 商业化的低聚果糖产品是葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖的混合物。 典型的低聚果糖产品有普通型( g 型) 与高纯度型( p 型) 两种。低聚果糖g 型和p 型 的甜度分别约为蔗糖的6 0 和3 0 ，它们均保持了蔗糖良好的甜味特性。 多数低聚果糖作为一种功能性食品配料，有其独特的生理特性，主要表现在【9 1 3 】： ( 1 ) 低聚果糖为双歧杆菌的增殖因子，为已确认的益生元。实验表明，人体摄取低聚 果糖后，体内的双歧杆菌数量可增加1 0 至1 0 0 倍，而双歧杆菌产生的有机酸使肠内p h 值降低，抑制肠道内沙门氏菌等腐败菌的生长，改善肠道环境，减少肠内腐败产物的产 生，发挥润肠通便作用，防止便秘 1 4 , 1 5 】。 大量的动物试验结果表明，双歧杆菌在肠道内大量繁殖能够起抗癌作用。这种抗癌 作用归功于双歧杆菌的细胞、细胞壁成分和胞外分泌物使机体的免疫力提高。例如喂养 定殖双歧杆菌单因子的无菌小鼠，要比未处理的无菌小鼠寿命长。低聚果糖具有整肠通 便的功能，它能使肠道腐败菌受到抑制，腐败产物显著减少并及时排出，因而可减少大 肠癌的发生。 ( 2 ) 低聚果糖不能被消化酶分解，在到达大肠后，随着低聚果糖被双歧杆菌发酵 2 第一章绪论 分解，释放出矿物质离子。众所周知，消化道的后半部分如盲肠、结肠等恰是矿物质元 素被吸收的重要场所。低聚果糖能促进机体对钙、镁、铁等重要矿物元素的吸收【1 6 】，还 能增加维生素的合成量，提高人体免疫力，甚至可以提高骨密度，这对防止骨质疏松具 有重要的意义。 ( 3 ) 引起龋齿的变异链球菌( s m u t a n s ) 不能利用低聚果糖作为能源，也不能将低聚果 糖转化成粘着性的葡萄糖，不提供口腔微生物沉积、产酸、腐蚀的场所( 牙垢) ，是一 种低腐蚀性的防龋齿甜味剂。因此不能形成齿垢，产酸的细菌也就无从附着，这就防止 了龋齿。 ( 4 ) 是一种水溶性的食物纤维，极易被肠胃吸收，只能通过大肠内双歧杆菌产生热 量，体内测定的低聚果糖热值仅为6 2 8 j g ，食用低聚果糖不会引起肥胖。 ( 5 ) 摄入体内的低聚果糖在消化过程中不被破坏，基本上不增加血糖，也不会导致 胰岛素的升高，对受胰岛素控制的肝糖原的合成也无影响。因此，低聚果糖可以作为糖 尿病和高血压患者的保健甜味剂。 ( 6 ) 临床实验表明，低聚果糖作为可溶性膳食纤维，可增强人体消化机能，如蛋白 质吸收，减少肝脏负担，有效地降低体内胆固醇，甘油三酯，游离脂肪酸和血糖数量， 消除和改善心血管病源，防止高血压、动脉硬化，预防癌症( 大肠癌、乳癌、子宫癌) 。 新科斯糖除了具有低聚果糖的生理特性外，尤其在双歧杆菌增殖方面表现更为优 越。2 0 0 0 年，s t e p h a n u sk i l i a n 1 7 】曾报道双歧杆菌能1 8 a 很j l , 好的利用新科斯糖在体外生长，效 果优于普通低聚果糖。2 0 0 7 年，张静娟等作过相似的研究，得到相同的结果。 1 1 3 低聚果糖的生产 低聚果糖有许多来源，主要来自植物( 菊，菊芋，大理花根，洋葱，大葱，韭菜以 及小麦等) 。1 9 5 0 年b a c o n 与e d e l m a n 1 8 1 及b l a n c h a r d 与a l b o n t l 明在研究酵母转化酶 ( i n v e r t a s e ) 时，分别独立地发现了该转化酶除了具有水解作用外，还具有转移作用。 蔗糖水解时产生了不等量的葡萄糖和果糖，除此之外，还生成了一些低聚糖，这些低聚 糖的结构后来得到了进一步确定，并被命名为蔗果三糖族低聚糖。1 9 5 2 年m a l l e y 【2 0 】 等用酵母转化酶作用于蔗糖，首先得到蔗果三糖。次年b a c o n 2 1 】和b e l l 用高峰淀粉酶作 用于蔗糖，产生了一系列低聚糖，从中析出异蔗果三糖( i s o k e s t o s e ) 。1 9 5 4 年g r o s s 等 从中又析出新蔗果三糖。目前低聚果糖的生产主要有以下几种方法： 1 1 3 1 酶解法 菊苣和洋蓟的块根中均含有大量的果聚糖。聚合度大于3 0 的果聚糖容易从溶液中结 晶析出，称为菊粉或者菊糖。菊粉经内切酶部分酶解后即可制得蔗果低聚糖和菊粉低聚 糖的混合物，再经精制处理后得到蔗果低聚糖和菊粉低聚糖产品。比利时o r a f t i 公司 已有以菊粉为原料生产的此类产品，商品名为r a f t i l o s e 和f i b r u l i n e 。 1 1 3 2 微生物酶转化生产 目前国内外大多数都是利用真菌生产的果糖基转移酶来进行低聚果糖的工业化生 3 江南大学硕士学位论文 产。发酵生产果糖基转移酶所常用的菌种有黑曲霉、出芽短梗霉和米曲霉等。选用微生 物发酵过程中产生的果糖转移酶的催化作用生成低聚果糖，分子间果糖转移反应分两步 进行，第一步生成果糖基酶复合体，释放出葡萄糖，第二步再由此复合物将果糖基转 移给水或蔗糖，生成果糖或三糖。在生成反应中，蔗糖作为供给体和接受体，在果糖转 移酶或呋喃果糖苷酶的作用下分解成果糖基或葡萄糖，果糖基再水解成果糖，产物为蔗 果三糖，蔗果四糖和蔗果五糖的混合物。 1 1 3 3 固定化酶法生产 用载体将产酶细胞进行包埋，得到固定化颗粒。将包埋产物与蔗糖或葡萄糖溶液反 应，得到低聚果糖溶液，固定化酶可重复使用，又便于连续化生产。将黑曲霉孢子与预 先灭过菌的海藻酸钠以一定的体积比混合，然后再在其中滴入氯化钙溶液，固化1 h 后 收集固定化增殖细胞颗粒。将颗粒填入反应柱，在5 0 6 0 以下，以一定的速率通入 5 0 蔗糖溶液，流出液经过脱色、脱盐、浓缩等工艺即可生产出液体低聚果糖。 1 1 3 4 固定化细胞法生产 固定化细胞法可连续生产低聚果糖，菌体内的酶被反复利用。日本和韩国的商品低 聚果糖都是采用该法来生产。日本，采用海藻酸钙凝胶包埋黑曲霉菌体来固定细胞；韩 国采用同样的方法，但所包埋的菌种是出芽短梗霉。固定化细胞通常装在柱状恒温反应 塔中，蔗糖溶液流过反应塔后产生低聚果糖。在5 0 下固定化细胞的稳定性为3 个月左 右。该方法可重复利用细胞内酶，减少发酵生产菌体的费用，降低生产成本。 1 1 3 5 共固定化酶与细胞生产 用酶法或固定化细胞法生产低聚果糖得到的低聚果糖含量并不高，约为5 0 6 0 。 原因在于酶法生产低聚果糖的同时生成了副产物葡萄糖，阻遏了蔗糖的进一步转化，因 而产品中含有相当量的葡萄糖和未作用的蔗糖。利用黑曲霉与其他酶( 异构酶、葡萄糖 氧化酶) 共包埋或协同作用的方法，在生产低聚果糖的同时，将副产物葡萄糖异构化或 氧化，从而解除了葡萄糖的抑制作用，得到了含量为7 5 的低聚果糖【4 】。 1 1 4 低聚果糖的应用 1 1 4 1 作为食品甜味剂 食品工业的迅速发展，对甜味剂的需求量越来越大。随着人们生活水平和生活质量 的提高，低糖、低脂、低盐、低热值的食品越来越受到人们的欢迎。低聚果糖作为低热 值甜味剂在食品中广泛地应用于酒、糖果、糕点、饮料、乳制品、调味品中【2 2 - 2 3 。功能 性低聚果糖的着色效果比蔗糖好( 蔗糖与蛋白质发生美拉德反应时，如操作不当，色泽 易变暗) 。因此，功能性低聚糖还可用于普通面包、水果面包、饼干、馅饼等焙烤食品。 另外，在面包等面食制品中添加适量功能性低聚果糖，能产生保湿作用，延缓淀粉老化， 防止食品变硬，使其松软可口，并延长其货架期。 4 第一苹绪论 1 1 4 2 在保健食品中的应用 服用低聚果糖可排除体内有害物质，减轻肝、肾等脏器的负担【2 4 】。因此，低聚果糖 在保健食品中应用非常广泛【2 5 1 。低聚果糖作为难消化、低热量食品添加剂，肥胖者、高 血压患者、甚至糖尿病患者均可安全食用。也可作为婴儿的食品基料，避免龋齿等疾病 的发生。用于老年食品，可防止骨质疏松，改善肠道功能。 1 1 4 3 辅助药品 高血脂患者连续食用低聚果糖，可降低胆固醇、中性脂肪、血糖值，并可抑制肠道 内沙门氏菌及腐败菌的生长，改进肠道功能，增进人体健康。如低聚果糖可添加到肠道 药物中，对肠炎有显著疗划2 6 1 。 1 1 4 4 饲料添加剂 早在6 0 年代，低聚果糖就被认为是一种免疫促进剂，具有提高动物机体免疫功能， 越来越多地出现在欧洲及世界其它地区生产的饲料中【2 7 1 。低聚果糖可以显著提高饲料转 化率，对猪、狗、羊等动物的肠菌丛和健康结果均有正效应，使动物的生长速度明显提 高，被称为原生素。低聚果糖保水性好，添加于饲料中可减缓饲料因吸湿而发霉、变酸， 其防霉性能好，可延长饲料保存期。 1 2 合成低聚果糖相关酶的研究 1 2 1 酶的名称 国际上对有关合成低聚果糖的酶类的命名仍有争议。一些文献采用 “b d f r u c t o s y l t r a n o s i d a s e 一词，酶分类号为e c 3 2 1 2 6 【2 8 】，该名称属水解酶类，易令 人误解为水解酶；其他的文献则采用“f r u c t o s y l t r a n s f e r a s e 一词，酶分类号为e c 2 4 1 9 ， 译为“果糖基转移酶。 1 2 2 酶的来源、反应机理及酶学性质 植物果糖基转移酶已经在许多高等植物中发现，目前已发现甜菜、洋蓟、洋葱、芦 笋、龙舌兰及菊苣等都含有该酶类，其研究较多的是洋蓟和芦笋的酶。洋蓟中的低聚果 糖的合成涉及2 种酶，即产生三糖( g f 2 ) 的s u c r o s e ：s u c r o s e 1 f - f r u c t o s y l t r a n s f e r a s e ( s s t ) e c 2 4 1 9 9 1 和产生多寡聚糖的f r u c t a n ： f r u c t a n 1 f - f r u c t o s y l t r a n s f e r a s e ( f f t ) e c 2 4 1 1 0 0 。芦笋中低聚果糖的形成则涉及至少3 种果糖 基转移酶，即s u c r o s e ：s u c r o s e l f r u c t o s y l t r a n s f e r a s e ，6 g f f u c t o s y l t r a n s f e r a s e 和 1 f - f i - u c t o s y l t r a n s f e r a s e 2 鲫。利用从植物中提取的酶生产低聚果糖，产率低且受季节的限制。 研究结果表明，许多果糖基转移酶的微生物，同时产生水解酶，这些水解酶将降解 低聚果糖。产果糖基转移酶的微生物有多种，日本学者h i d a k a 等首先研究了黑曲霉菌 株的果糖基转移酶，然后又成功地应用于工业化生产低聚果糖糖浆。其他学者则分别发 5 江南大学硕士学位论文 现了一些可用于工业化生产的酶活力很高的菌株，例如米曲霉( 彳o y z a e ) ，出芽短梗霉 卅u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n s ) ，海枣曲霉( a s p e r g i l l u sp h o e n i c i s ) 和短梗帚霉( s c o p u l a r i o p s i s b r e v i c a u 凰) 【3 0 】等。 来源不同的果糖基转移酶的酶促反应机理可能也不同，在植物和某些微生物中，有 一系列的酶参与低聚果糖的合成反应，但对于微生物来说，催化反应的酶系相对要简单 些，如图1 2 所示。 函f 苇善一莘善g f 。苓善肼。 图1 2 合成蔗果低聚糖酶促反应机理 f i g 1 - 2r e a c t i o nm e c h a n i s mo fe n z y m a t i cs y n t h e s i s g - f ：蔗糖：g ：葡萄糖；f t a s e ：果糖基转移酶；g f 2 ：蔗果三糖；g e s ：蔗果四糖：g f 4 ：蔗果五糖 不同微生物来源的果糖基转移酶的性质有所不同，表1 1 中描述不同微生物来源的 果糖基转移酶的性质。 表1 - 1 不同来源的呆糖基转移酶的性质 t a b 1 - 1n a t u r eo ff r u c t o s y l t r a n s f e r a s ef r o md i f f e r e n ts o u r c e s 1 3 栅题的研究意义 新科斯糖不仅在龙舌兰属、紫苑科、风铃草科、百合目等植物中发现【3 引，它也是微 生物中的具有果糖基转移酶活性的酶发挥作用时的微小产物3 9 1 ，据报道【1 刀利用法夫酵母 在含有蔗糖的培养基中生长时，可生成新科斯糖且为主要的积累产物。 法夫酵母野生菌生长于落叶树伤口处渗出的黏液上，l u d i g 在十九世纪末的研究 究对此作了最早的极为有限的描述，并将之命名为r h o d o m y c e sd e n d r o r h o u s 【4 卜4 2 。真正 对其形态及性质作初步研究的是h e r m a nj a np h a f f 及其合作者，他们于1 9 6 7 1 9 6 8 年间 分别在日本h o k k a i d o 及h o n s h u 岛及美国阿拉斯加山区落叶树的渗出物中分离该酵母， 并将其命名为r h o d o m y c e sm o u t a n a e 4 3 1 。后来为了纪念p h a f f , 并使命名符合规则，将其 改为p h a f f i ar h o d o z y m a 。目前文献中l 而o d o n y c e sd e n d r o r h o u s 与1 7 z a f f i ar h o d o z y r r 雹 互用。 6 第一章绪论 目前，关于法夫酵母的研究主要集中其发酵生产虾青素的特性，如高产虾青素的菌 株选育【4 4 1 、发酵工艺研究【4 5 删、酵母细胞破壁【4 7 1 、色素提取【4 8 1 及虾青素的功能特性【4 9 】 等，而对它其他性能的研究报道较少。国外仅有k i l i a n ( 1 7 】曾采用x a n t h o p h y l l o m y c e s d e n d r o r h o u s ( p h a f f i ar h o d o z y m a ) 发酵生产低聚糖，其主要积累产物为新科斯糖。关于新 科斯糖结构的报道，主要是采取核磁共振分析从植物中提取的混合物的结构分析唧丑】。 1 9 5 0 年b a c o n 等发现了酵母转化酶( i n v e r t a s e ) 除了具有水解作用外，还具有转移 作用，且水解蔗糖得到了蔗果三糖族低聚糖；七十年代，比利时、日本即进行了酶法( 主 要为果糖基转移酶转化法) 生产超低聚果糖技术开发，成为国际先进生产技术的代表。 经过几十年的发展，低聚果糖的酶法生产技术日益成熟，其产量也在逐年快速增长。而 目前，有关法夫酵母中产新科斯糖的相关酶的研究尚未见报道，对酶的性质一无所知。 法夫酵母发酵产生低聚果糖是否为新科斯糖，发酵液中的酶是否具有果糖基转移作用， 酶如何作用于蔗糖产生新科斯糖的机理以及酶的性质等等，需要进行更多的研究。 1 4 本课题的研究内容 本研究目的之一是对本研究室发明专利一种低聚糖新科斯糖的发酵生产方法 公 开号c n l 8 7 3 0 1 6 a 生产的低聚糖中的主要物质进行分离纯化，以鉴定法夫酵母所产的主 要低聚糖的结构。研究目的之二是，对法夫酵母产低聚糖相关的酶进行初分离，对其性 质进行研究。具体研究包括以下内容： 1 、对法夫酵母发酵生产的新科斯糖及发酵液中的酶进行初步分析； 2 、法夫酵母发酵生产所得低聚糖的结构分析； 3 、法夫酵母发酵生产新科斯糖相关酶的初分离及部分酶学性质的研究。 7 江南大学硕士学位论文 第二章法夫酵母新科斯糖及其相关酶的初步分析 2 1 引言 采用蔗糖为原料，酶法生产低聚果糖时，除得到低聚果糖，还有少量的果糖产生， 关于它的机理，有研究【5 2 】认为，是由于起催化作用的b 果糖基转移酶 ( b 丘- u c t o s y l t r a n s f e r a s e ，e c 2 4 1 9 ，f t s ) 是双功能酶，不仅有催化转移果糖基连到蔗糖上 产生低聚果糖的作用，还有催化转移果糖基连到水分子上产生果糖的作用，从而降低了 低聚果糖的含量。也有学者认为这两种作用分属两种酶完成，0 0 f t s 催化产生低聚果糖， 另一种酶b d 呋喃果糖苷酶( b d f r u c o f u r a n o s i d a s e ，e c 3 2 1 2 6 ，f f s ) 水解蔗糖和低聚 果糖产生果糖。 k i l i a n 首次采用x a n t h o p h y l l o m y c e sd e n d r o r h o u s ( p h a f f i ar h o d o z y m a ) 发酵生产低聚糖， 认为其主要积累产物为新科斯糖，但没有对它的结构和相关酶作进一步分析研究。因此， 本文对本实验室保藏的法夫酵母发酵生产的新科斯糖以及发酵液中是否具有相应的酶 进行初步探讨。 2 2 主要材料 2 2 1 仪器与试剂 酵母膏 蛋白胨 磷酸氢二钠 蔗糖 柠檬酸 琼脂 麦芽汁 脲 超净工作台 立式压力蒸汽灭菌器 冷冻离心机 高速离心机 摇瓶发酵床 高效液相色谱仪 示差折光检测 生化试剂 生化试剂 分析纯 分析纯 分析纯 生化试剂 自制 分析纯 s w c l 1f l s b 5 0 l 3 k 3 d t g l 1 6 g q y c 舫f e r s 6 0 0 2 4 10 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 苏州安泰空气技术有限公司 上海华线医用核子仪器有限公司 s i g m a 公司 上海安亭仪器有限公司 上海福玛实验设备有限公司 美国w a t e r s 公司 美国w a t e r s 公司 第二章法夫酵母新科斯糖及相关酶的初步分析 2 2 2 菌种 本实验室保藏的菌株：法夫酵母( x a n t h o p h y l l o m y c e sd e n d r o r h o u s ) 2 6 9 。 2 3 培养基 斜面培养基( g l ) ：蔗糖1 0 ，蛋白胨5 ，酵母膏3 ，麦芽汁3 ，琼脂1 7 ，自然p h ； 种子培养基( l ) ：蔗糖5 0 ，蛋白胨5 ，酵母膏3 ，麦芽汁3 ，自然p h ： 发酵培养基( g l ) ：蔗糖1 1 0 ，脲9 ，p h6 5 ( 磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液) 。 上述各培养基在1 2 1 ( o 1 1m p a ) 下灭菌2 0 分钟。 2 4 发酵培养方法 2 4 1 种子培养方法 2 5 0 m l 摇瓶中装2 5 m l 种子培养基，无菌操作，从斜面上挑一环菌体于培养基中， 2 2 ( 2 ，2 2 0 r m i n ，培养4 8 小时【5 3 1 。 2 4 2 摇瓶培养方法 无菌操作，离心收集的种子培养基的茵体，以6 9 l 的接种量接入发酵培养基，2 5 0 m l 摇瓶中装2 5 m l 种子培养基，2 2 0 r m i n ，1 8 c 摇瓶培养2 4 小时【5 3 1 。 2 5 发酵液制备 收集2 4 2 方法摇床培养获得的发酵液，发酵液以4 0 0 0 r m i n 冷冻离心1 0 分钟，得 到的上清夜为以下实验所采用发酵液( 4 保存) 。 2 6 酶活测定方法 酶活测定：采用3 ，5 二硝基水杨酸( d n s ) 比色法5 4 , 5 5 。 底物( 蔗糖) 浓度2 5 ( p h6 5 ) ，1 8 c 下与酶液( 发酵液) 以体积比1 ：1 混合3 0 分钟后，立即沸水浴中放置2 0 分钟，取0 5 m l 反应液加入1 5 m l 蒸馏水和1 5 m l 3 ，5 二硝基水杨酸试剂，沸水浴加热5 分钟，迅速冷却至室温，定容至2 5m l ，在5 7 5 n m 波 长下测定吸光度，根据葡萄糖含量标准曲线( 见附录图8 ) 测定还原糖的量。以未加入蔗 糖溶液的发酵液为对照。 上述条件下以每分钟每增加1l 上m o l 还原糖( 以葡萄糖计算) 所需的酶量为一个活 力单位( u ) 。 2 7 发酵液中新科斯糖和酶解产物的分析方法 将4 c 保存的发酵液与2 5 的蔗糖溶液( p h 6 5 ) 以体积比1 ：1 ，在1 8 下反应3 0 分钟后，立即沸水浴中煮2 0 分钟后，室温冷却，离心，0 4 5um 微孔滤膜过滤，得到滤 9 江南大学硕士学位论文 液，作为酶解产物分析使用；以未加蔗糖的发酵液作为对照，经过相同处理得到滤液， 分别高效液相法分析发酵液中新科斯糖和酶解产物。 高效液相条件：w a t e r s 6 0 0 高效液相色谱仪，配置w a t e r s 6 0 0 四元输液泵，2 4 1 0 示 差折光检测，7 7 2 5 i 进样阀，e m p o w e r 2 色谱工作站，色谱柱为s u g a r p a k l ，6 5 t u m i d 3 0 0m i l l ，试剂：乙醇，分析纯；水为超纯水。流动相为纯水，柱温8 5 ，流速0 4m l m i n ， 进样体积1 0i ll 。以蔗糖，葡萄糖和果糖作为参照。 2 8 结果与讨论 2 8 1 发酵液中新科斯糖的分析 图2 1 为原发酵液的高效液相谱图，图中各峰的保留时间、化学名及峰面积列出表 2 1 。 m r u 协 图2 - 1 发酵液的高效液相谱图 f i g 2 - 1h p l cs p e c t r u mo ff e r m e n t a t i o nb r o t h 表2 1 发酵液中各物质的峰面积 t a b 2 1p e a ka r e ao ff e r m e n t a t i o nb r o t h 由图2 1 中各峰的保留时间与蔗糖、葡萄糖、果糖的标准物质图谱( 附录图1 ，图 2 ，图3 ，图4 ) 中的保留时间对照可知，1 6 0 4 4 m i n ，1 3 1 1 6 m i n ，1 0 6 3 0 m i n 的峰分别对 应果糖，葡萄糖，蔗糖，6 3 9 8 m i n 为磷酸盐。根据本色谱条件下糖类出峰的一般规律， 推测9 0 3 9 m i n 对应的可能是新科斯糖，8 0 0 4 m i n 可能为其他多糖。说明发酵液中同时 存在蔗糖、葡萄糖、果糖、新科斯糖和其他多糖。 由峰面积比较( 表2 1 ) ，新科斯糖对应的峰面积较大，说明发酵液中主要糖类物质 为新科斯糖。根据文献报道和上述分析，可以推测，法夫酵母在发酵过程中能利用蔗糖 l o 第二章法夫酵母新科斯糖及相关酶的初步分析 主要合成新科斯糖。 2 8 2 酶的分析 2 8 2 1 酶活测定 按照2 5 的方法收集得到的发酵液进行酶活力测定，做三次平行，得到酶活力为( i i o 2 4 ) u m l ，说明在发酵液中存在具有酶活力的酶。为了进一步确证，进行酶解产物 分析。 2 822 酶解产物分析 图2 - 2 酶解产物的高效液相谱图 f i g 2 - 2h p l cs p e c t r u mo fh y d r o l y s a t e 表2 - 2 酶解产物中各物质的峰面积 t a b 2 - 2p e a ka r e ao fh y d r o l y s a t e 根据2 8 1 中所述的图谱分析思路，根据酶解产物的液相色谱( 图2 2 ) 可知，保留 时间为1 6 0 6 5 m i n ，1 3 1 3 0 m i n ，1 0 6 7 0 m i n ，9 0 5 7 m i n 的峰分别对应于果糖，葡萄糖，蔗 糖和新科斯糖，8 0 1 9 m i n 对应的是某多糖。 由图2 1 和图2 2 ，表2 1 和表2 2 比较可知，发酵液中添加蔗糖，3 0 分钟酶反应 后的产物中的主要糖类物质组成与原发酵液中的组成相一致，区别在于这些物质的含 量发生了变化。通过峰面积比较看出，与原发酵液中各物质的含量相比，酶解处理后 的发酵液中的葡萄糖、果糖和新科斯糖及多糖的含量分别增加了7 2 、3 9 、5 9 、5 4 。 其中，新科斯糖的含量变化较大。在进行酶反应前又向发酵液中加入了2 5 蔗糖溶液， 江南大学硕士学位论文 酶解反应后，蔗糖的含量与加入2 5 蔗糖溶液和原发酵液中蔗糖的总量相比降低了 2 2 。这可以说明其中的酶以蔗糖为底物，产生了新科斯糖、葡萄糖、果糖和多糖， 其中新科斯糖是酶反应的主要产物。 初步推测：发酵液中的酶能以蔗糖为底物，经过反应，合成新科斯糖和其他低聚糖， 其中新科斯糖是主要产物。根据文献【5 6 】中的报道，发酵液中的酶在合成新科斯糖过程中 很可能起到果糖基转移的作用。 经过上述分析，初步认为法夫酵母发酵生产新科斯糖的过程中，其中的酶具有果糖 基转移作用。 2 9 结论 通过以上分析，初步认为法夫酵母发酵生产的主要低聚糖可能为新科斯糖，发酵液 中含有具有果糖基转移作用的酶。 1 2 第三章法夫酵母新科斯糖的结构鉴定 3 1